CZ2002521A3 - Novel molecules resembling beta interferon - Google Patents
Novel molecules resembling beta interferon Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2002521A3 CZ2002521A3 CZ2002521A CZ2002521A CZ2002521A3 CZ 2002521 A3 CZ2002521 A3 CZ 2002521A3 CZ 2002521 A CZ2002521 A CZ 2002521A CZ 2002521 A CZ2002521 A CZ 2002521A CZ 2002521 A3 CZ2002521 A3 CZ 2002521A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- interferon
- polypeptide
- conjugate
- amino acid
- moiety
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/215—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Předkládaný vynález se týká nových konjugátů interferonu β, způsobu výroby těchto konjugátů a použití těchto konjugátů v lékařství, zvláště pro léčení roztroušené sklerózy.The present invention relates to novel interferon β conjugates, to a process for the manufacture of such conjugates and to the use of these conjugates in medicine, particularly for the treatment of multiple sclerosis.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Interferony jsou důležité cytokiny charakterizované antivirovými, antiproliferativními a imunomodulačními účinky. Tyto účinky jsou základem klinicky prospěšných vlastností, které byly pozorovány u řady onemocnění, včetně hepatitidy, různých druhů rakoviny a roztroušené sklerózy. Interferony se dělí na třídy typu I a II. Interferon β náleží do třídy interferonů typu I, která také zahrnuje interferony α, τ a ω, zatímco interferon γ je jediným známým členem odlišné třídy typu II.Interferons are important cytokines characterized by antiviral, antiproliferative and immunomodulatory effects. These effects underlie the clinically beneficial properties that have been observed in a number of diseases, including hepatitis, various cancers, and multiple sclerosis. Interferons are divided into classes I and II. Interferon β belongs to the type I interferon class, which also includes α, τ and ω interferons, while interferon γ is the only known member of a different type II class.
Lidský interferon β je regulační polypeptid s molekulovou hmotností 22 kDa, který se skládá ze 166 zbytků aminokyselin. Může být produkován většinou buněk v těle, zvláště fibroblasty, jako odpověď na virovou infekci nebo vystavení dalším biologickým vlivům. Váže se na multimerní receptory na buněčném povrchu a produktivní vazba na receptor vede ke kaskádě intracelulárních událostí, jejichž výsledkem je exprese inducibílních genů pro interferon β, který zase poskytuje účinky, které je možno klasifikovat jako antivirové, antiproliferativní a imunomodulační.Human interferon β is a regulatory polypeptide with a molecular weight of 22 kDa, consisting of 166 amino acid residues. It can be produced by most cells in the body, especially fibroblasts, in response to a viral infection or exposure to other biological influences. It binds to multimeric receptors on the cell surface and productive receptor binding leads to a cascade of intracellular events, resulting in the expression of inducible genes for interferon β, which in turn provides effects that can be classified as antiviral, antiproliferative and immunomodulatory.
Aminokyselinová sekvence lidského interferonu β byla ukázána vTaniguchi, Gene 10: 11 - 15, 1980 a v EP 83069, EP 41313 a US 4686191.The amino acid sequence of human interferon β has been shown in Taniguchi, Gene 10: 11-15, 1980 and in EP 83069, EP 41313 and US 4686191.
• · • · · · · ·• · · · · · · · · · · · · ·
Krystalové struktury byly uvedeny pro lidský a myší interferon β (Proč. Natí. Acad. Sci. USA 94: 11813 - 11818, 1997; J. Mol. Biol. 253: 187 - 207, 1995). Souhrnný článek byl publikován v Cell Mol. Life Sci. 54: 1203 - 1206, 1998.Crystal structures have been reported for human and murine interferon β (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818, 1997; J. Mol. Biol. 253: 187-207, 1995). A summary article was published in Cell Mol. Life Sci. 54: 1203-1206, 1998.
Dosud se uvádí poměrně málo variant interferonu β získaných metodami proteinového inženýrství (WO 9525170, WO 9848018, US 5545723, US 4914033, EP 260350, US 4588585, US 4769233, Stewart a další, DNA díl 6, No. 2, 1987, str. 119 - 128, Runkel a další, 1998, Jour. Biol. Chem. 273, No. 14, str. 8003 - 8008).To date, relatively few variants of interferon β obtained by protein engineering methods have been reported (WO 9525170, WO 9848018, US 5545723, US 4914033, EP 260350, US 4588585, US 4769233, Stewart et al., DNA Vol. 6, No. 2, 1987, p. 119-128, Runkel et al., 1998, Jour. Biol. Chem. 273, No. 14, pp. 8003-8008).
Byla popsána exprese interferonu β v buňkách CHO (US 4966843, US 5376567 a US 5795779).Expression of interferon β in CHO cells has been described (US 4966843, US 5376567 and US 5795779).
Redlich a další, Proč. Nati. Acad. Sci, USA, díl 88, str. 4040 4044, 1991, popisují imunoreaktivitu protilátek proti syntetickým peptidům odpovídajícím peptidovým řetězcům rekombinantního lidského interferonu β s mutací C17S.Redlich et al., Why. Nati. Acad. Sci, USA, Vol. 88, pp. 4040-4044, 1991, describe the immunoreactivity of antibodies against synthetic peptides corresponding to the peptide chains of recombinant human interferon β with the C17S mutation.
Molekuly interferonu β se zvláštním rozložením glykosylace a způsoby jejich výroby byly popsány v EP 287075 a EP 539300.Interferon-β molecules with particular glycosylation patterns and methods for their preparation have been described in EP 287075 and EP 539300.
Různé odkazy se zabývají modifikací polypeptidů konjugací polymerů nebo glykosylací. Polymerní modifikace nativního interferonu β nebo jeho varianty C17S byla popsána v EP 229108, US 5382657, EP 593868, US 4917888 a WO 99/55377. US 4,904,584 popisuje PEGylované polypeptidy se sníženým obsahem lysinu, kde alespoň jeden zbytek lysinu byl odstraněn nebo nahrazen jakýmkoli jiným aminokyselinovým zbytkem. WO 99/67291 popisuje způsob konjugace proteinu s PEG, přičemž se provede delece alespoň jednoho zbytku aminokyseliny na proteinu a protein se uvede do styku s PEG za vhodných podmínek pro dosažení konjugace proteinu. WO 99/03887 popisuje PEGylované varianty polypeptidů náležející do vyšší skupiny růstového hormonu, kde cysteinový zbytek byl nahrazen zbytkem neesenciální aminokyseliny umístěným ve specifické oblasti « · polypeptidu. Interferon β se uvádí jako jeden příklad polypeptidu náležejícího do vyšší skupiny růstového hormonu. WO 00/23114 popisuje glykosylovaný a PEGylovaný interferon β. WO 00/23472 popisuje fúzní proteiny interferonu β. WO 00/26354 popisuje způsob výroby glykosylované varianty polypeptidu se sníženou alergenicitou, který ve srovnání s odpovídajícím rodičovským polypeptidem obsahuje alespoň jedno další glykosylační místo. US 5,218,092 popisuje modifikaci faktoru stimulujícího tvorbu kolonií granulocytů (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) a další polypeptidy spočívající v zavedení alespoň jednoho dalšího uhlohydrátového řetězce ve srovnání s nativním polypeptidem. Interferon β se uvádí jako jeden příklad mezi mnoha dalšími polypeptidy, který je údajně možno modifikovat technologií popsanou v US 5,218,092.Various references deal with modification of polypeptides by polymer conjugation or glycosylation. Polymer modification of native interferon β or a variant of C17S has been described in EP 229108, US 5382657, EP 593868, US 4917888 and WO 99/55377. US 4,904,584 discloses PEGylated lysine-reduced polypeptides wherein at least one lysine residue has been deleted or replaced with any other amino acid residue. WO 99/67291 describes a method of conjugating a protein to PEG, wherein at least one amino acid residue on the protein is deleted and the protein is contacted with PEG under suitable conditions to achieve conjugation of the protein. WO 99/03887 describes PEGylated variants of polypeptides belonging to the higher group of growth hormone, wherein the cysteine residue has been replaced by a nonessential amino acid residue located in a specific region of the polypeptide. Interferon β is cited as one example of a polypeptide belonging to the higher group of growth hormone. WO 00/23114 discloses glycosylated and PEGylated interferon β. WO 00/23472 describes interferon β fusion proteins. WO 00/26354 discloses a method for producing a glycosylated variant of a reduced allergenicity polypeptide that comprises at least one additional glycosylation site as compared to the corresponding parent polypeptide. US 5,218,092 discloses a modification of the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) and other polypeptides consisting of introducing at least one additional carbohydrate chain as compared to the native polypeptide. Interferon β is cited as one example among many other polypeptides that are reported to be modified by the technology described in US 5,218,092.
Komerční preparáty interferonu β se prodávají pod názvy Betaseron® (označovaný také jako interferon β1^ který je neglykosylovaný, a který se vyrábí použitím rekombinantních bakteriálních buněk, má deleci N-koncového methioninového zbytku a mutaci C17S), a Avonex™ a Rebif® (nazývaný také interferon β1 a, který je glykosylovaný, vyrábí se pomocí rekombinantních savčích buněk) pro léčení pacientů s roztroušenou sklerózou, přičemž bylo ukázáno, že jsou účinné při snížení míry vypuknutí onemocnění, a u mnoha pacientů onemocnění po dlouhou dobu nevypukne ve srovnání s pacienty léčenými placebem. Navíc se sníží míra akumulace postižení (Neurol. 51: 682 - 689, 1998).Commercial preparations of interferon β are marketed under the names Betaseron® (also known as interferon β1), which is non-glycosylated and which is produced using recombinant bacterial cells, has an N-terminal methionine residue deletion and a C17S mutation, and Avonex ™ and Rebif® (called also interferon β1a, which is glycosylated, is produced by recombinant mammalian cells) for the treatment of patients with multiple sclerosis, which has been shown to be effective in reducing the rate of outbreaks, and in many patients does not develop for a long time compared to patients treated with placebo . In addition, disability accumulation rates will decrease (Neurol. 51: 682-689, 1998).
Srovnání interferonu β1 a β1 b z hlediska struktury a funkce bylo uvedeno ve Pharmaceut. Res. 15: 641 - 649, 1998.A comparison of interferon β1 and β1b in terms of structure and function has been reported in Pharmaceut. Res. 15: 641-649, 1998.
Interferon β je prvním terapeutickým zásahem, u kterého se ukázalo, že zpožďuje postup roztroušené sklerózy, recidvujícího progresivního zánětlivého degenerativního onemocnění centrálního nervového systému. Jeho mechanismus působení však zůstává z větší části nejasný. Zdá se, že interferon β má inhibiční účinky na proliferaci • ·Interferon β is the first therapeutic intervention that has been shown to delay the progression of multiple sclerosis, a relapsing progressive inflammatory degenerative disease of the central nervous system. However, its mechanism of action remains largely unclear. Interferon β appears to have proliferative inhibitory effects.
leukocytů a předkládání antigenů. Navíc může interferon β modulovat profil produkce cytokinů směrem k protizánětlivému fenotypu. Konečně může interferon β snížit migraci T-buněk inhibici aktivity matricových metaloproteáz T-buněk. Tyto aktivity pravděpodobně působí v souladu při ovlivňování mechanismu interferonu β v MS (Neurol. 51: 682 - 689, 1998).leukocytes and antigen presentation. In addition, interferon β may modulate the cytokine production profile towards the anti-inflammatory phenotype. Finally, interferon β can reduce T-cell migration by inhibiting the activity of matrix T-cell metalloproteases. These activities are likely to be consistent in influencing the mechanism of interferon β in MS (Neurol. 51: 682-689, 1998).
Navíc může být interferon β použit pro léčení osteosarkomu, karcinomu bazálních buněk, dysplasie čípku, gliomu, akutní myeloidní leukemie, mnohočetného myelomu, Hodgkinovy nemoci, karcinomu mléčné žlázy, melanomu a virových infekci jako je papilomavirus, virová hepatitida, herpes genitalis, herpes zoster, herpetická keratitida, herpes simplex, virová encefalitida, pneumonie způsobená cytomegalovirem a infekce rhinovirem.In addition, interferon β can be used to treat osteosarcoma, basal cell carcinoma, suppository dysplasia, glioma, acute myeloid leukemia, multiple myeloma, Hodgkin's disease, breast cancer, melanoma, and viral infections such as papillomavirus, viral hepatitis, herpes genosteris, herpetic keratitis, herpes simplex, viral encephalitis, cytomegalovirus pneumonia and rhinovirus infection.
S použitím současných preparátů interferonu β je spojena řada vedlejších účinků, včetně reakcí v místě vpichu, horečky, zimnice, bolestí svalů, kloubů a dalších příznaků podobných chřipce (Clin. Therapeutics, 19: 883 - 893, 1997).Current side effects of interferon β have been associated with a number of side effects, including injection site reactions, fever, chills, muscle, joint and other influenza-like symptoms (Clin. Therapeutics, 19: 883-893, 1997).
Navíc se u 6 až 40 % pacientů vyvíjí neutralizační protilátky proti interferonu β (Int. Arch. Allergy Immunol. 118: 368 - 371, 1999). Bylo ukázáno, že vyvinutí neutralizačních protilátek proti interferonu β snižuje biologickou odpověď na interferon β a způsobuje posun ke sníženému účinku léčení (Neurol. 50: 1266 - 1272, 1998).In addition, 6 to 40% of patients develop neutralizing antibodies to interferon β (Int. Arch. Allergy Immunol. 118: 368-371, 1999). The development of neutralizing antibodies to interferon β has been shown to reduce the biological response to interferon β and to shift to a reduced effect of treatment (Neurol. 50: 1266-1272, 1998).
Neutralizační protilátky pravděpodobně také brání terapeutické využitelnosti interferonu β ve spojení s léčením jiných onemocnění (Immunol. Immuther. 39: 263 - 268, 1994).Neutralizing antibodies are also likely to inhibit the therapeutic utility of interferon β in conjunction with the treatment of other diseases (Immunol. Immuther. 39: 263-268, 1994).
Při takovémto výskytu vedlejších účinků při používání současných produktů interferonu β, jejich spojení s častými injekcemi, rizikem vyvinutí neutralizačních protilátek snižujících požadovaný terapeutický účinek interferonu β, a možnost získat optimálnější terapeutické hladiny interferonu β za získání zvýšeného • · terapeutického účinku je zřejmé, že je nezbytné získat zlepšené molekuly podobné interferonu β.With such side effects occurring when using current interferon β products, combining them with frequent injections, the risk of developing neutralizing antibodies to reduce the desired therapeutic effect of interferon β, and the possibility of obtaining more optimal therapeutic levels of interferon β for increased therapeutic effect, to obtain improved interferon-β-like molecules.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Tato přihláška poskytuje zlepšené molekuly interferonu β, které poskytují jednu nebo více z výše uvedených požadovaných prospěšných vlastností. Popisují se zvláště konjugáty, které vykazují aktivitu interferonu β a obsahují alespoň jednu nepolypeptidovou část kovalentně navázanou na polypeptid interferonu β, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence lidského interferonu β standardního typu, kde tato aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID No. 2, v alespoň jednom aminokyselinovém zbytku zvoleném ze zavedeného nebo odstraněného aminokyselinového zbytku obsahujícího vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část. Konjugáty podle předkládaného vynálezu mají celou řadu zlepšených vlastností ve srovnání s lidským interferonem β, včetně snížené imunogenicity, zvýšeného funkčního poločasu in vivo, zvýšeného poločasu v séru a/nebo zvýšené biologické dostupnosti. Konjugát podle vynálezu tedy nabízí proti běžně používaným sloučeninám s interferonem β řadu výhod, včetně delšího intervalu mezi injekcemi, menšího výskytu vedlejších účinků a/nebo zvýšené účinnosti v důsledku snížení tvorby protilátek. Navíc je možno použitím konjugátu podle vynálezu dosáhnout vyšších dávek aktivního proteinu a tím účinnější terapeutické odpovědi. Konjugáty podle vynálezu navíc ukázaly podstatně sníženou zkříženou reaktivitu se séry pacientů léčených současně dostupnými produkty interferonu β, jak bude definováno dále.The present invention provides improved interferon β molecules that provide one or more of the aforementioned desirable beneficial properties. In particular, conjugates are disclosed which exhibit interferon β activity and comprise at least one non-polypeptide moiety covalently linked to an interferon β polypeptide comprising an amino acid sequence different from the wild-type human interferon β sequence, which amino acid sequence is shown in SEQ ID NO. 2, at least one amino acid residue selected from an introduced or deleted amino acid residue containing a non-polypeptide moiety binding group. The conjugates of the present invention have a number of improved properties over human interferon β, including reduced immunogenicity, increased functional half-life in vivo, increased serum half-life, and / or increased bioavailability. Thus, the conjugate of the invention offers a number of advantages over commonly used interferon β compounds, including a longer injection interval, fewer side effects and / or increased efficacy due to reduced antibody production. In addition, by using the conjugate of the invention, higher doses of the active protein can be achieved and thus a more effective therapeutic response. In addition, the conjugates of the invention have shown a significantly reduced cross-reactivity with the sera of patients treated with currently available interferon β products as defined below.
V jednom provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu první nepolypeptidovou část kovalentně navázanou na polypeptid interferonu β, jehož • · ·*·::.··:: ·*In one embodiment, the invention relates to a conjugate having interferon-β activity, which comprises at least one first non-polypeptide moiety covalently linked to an interferon-β polypeptide, wherein the interferon-β polypeptide has at least one first non-polypeptide portion thereof.
....................
aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném a alespoň jednom odstraněném aminokyselinovém zbytku obsahujícím vazebnou skupinu pro uvedenou první nepolypeptidovou část.the amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in at least one introduced and at least one deleted amino acid residue containing a linking group for said first non-polypeptide moiety.
V dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu první nepolypeptidovou část konjugovanou s alespoň jedním zbytkem lysinu polypeptidu interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném a/nebo alespoň jednom odstraněném lysinovém zbytku.In another embodiment, the invention relates to a conjugate with interferon β activity comprising at least one first non-polypeptide moiety conjugated to at least one lysine residue of an interferon β polypeptide, the amino acid sequence of which differs from the wild-type human interferon β sequence in at least one introduced and / or at least one the lysine residue removed.
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu první nepolypeptidovou část konjugovanou s alespoň jedním cysteinovým zbytkem polypeptidu interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od aminokyselinové sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom cysteinovém zbytku zavedeném do polohy, která je u lidského interferonu β standardního typu obsazena aminokyselinovým zbytkem exponovaným na povrchu.In yet another embodiment, the invention relates to a conjugate having interferon β activity comprising at least one first non-polypeptide moiety conjugated to at least one cysteine residue of an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β amino acid sequence in at least one cysteine residue introduced into a position that is occupied by an amino acid residue exposed on the surface of human wild type interferon β.
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu první nepolypeptidovou část, která jako vazebnou skupinu obsahuje skupinu kyseliny, kde tato skupina je konjugována s alespoň jedním zbytkem kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové polypeptidu interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném a/nebo alespoň jednom odstraněném zbytku kyseliny asparagové a/nebo kyseliny glutamové.In yet another embodiment, the invention relates to a conjugate with interferon β activity comprising at least one first non-polypeptide moiety comprising an acid group as a linking group, which group is conjugated to at least one aspartic acid or glutamic acid residue of an interferon β polypeptide having an amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in at least one introduced and / or at least one removed aspartic acid and / or glutamic acid residue.
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu molekulu polymeru a alespoň jednu cukernou část kovalentně navázanou na polypeptid • · interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu vIn yet another embodiment, the invention relates to a conjugate having interferon β activity comprising at least one polymer molecule and at least one sugar moiety covalently linked to an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in
a) alespoň jednom zavedeném a/nebo alespoň jednom odstraněném aminokyselinovém zbytku obsahujícím vazebnou skupinu molekuly polymeru, aa) at least one introduced and / or at least one deleted amino acid residue containing a linker group of a polymer molecule, and
b) alespoň jednom zavedeném a/nebo alespoň jednom odstraněném aminokyselinovém zbytku obsahujícím vazebnou skupinu pro cukernou část, za předpokladu, že jestliže je vazebná skupina pro molekulu polymeru zbytek cysteinu a cukerná část je cukerná část navázaná přes atom dusíku, cysteinový zbytek není vložen takovým způsobem, že dojde ke zničení místa N-glykosylace.b) at least one introduced and / or at least one deleted amino acid residue containing a sugar moiety, provided that if the polymer moiety is a cysteine moiety and the sugar moiety is a sugar moiety bonded through a nitrogen atom, the cysteine residue is not inserted in such a manner that the N-glycosylation site is destroyed.
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje polypeptid interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném glykosylačním místu, kde tento konjugát dále obsahuje alesoň jednu nePEGylovanou cukernou část navázanou na zavedené glykosylační místo.In yet another embodiment, the invention relates to a conjugate with interferon β activity comprising an interferon β polypeptide having an amino acid sequence different from the wild-type human interferon β sequence at least one glycosylation site introduced, wherein the conjugate further comprises at least one non-PEGylated sugar moiety bound to an established glycosylation site.
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje polypeptid interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu tím, že glykosylační místo bylo zavedeno nebo odstraněno prostřednictvím zavedení nebo odstranění aminokyselinového zbytku nebo aminokyselinových zbytků tvořících část glykosylačního místa v takové poloze, která je u lidského interferonu β standardního typu obsazena aminokyselinovým zbytkem exponovaným na povrchu.In yet another embodiment, the invention relates to a conjugate having interferon β activity comprising an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in that the glycosylation site has been introduced or removed by introducing or removing amino acid residue or amino acid residues forming a portion of the glycosylation site at a position that is occupied by an amino acid residue exposed on the surface of human wild type interferon β.
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje cukernou část kovalentně navázanou na ·· φφ ; ♦ · <In yet another embodiment, the invention relates to a conjugate having interferon β activity, which comprises a sugar moiety covalently linked to ·· φφ; ♦ · <
polypeptid interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom odstraněném místě glykosylyce.an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in at least one glycosylation site removed.
V ještě dalších provedeních se vynález týká prostředků a způsobů pro výrobu konjugátu nebo polypeptidu interferonu β pro pojužití v předkládaném vynálezu, včetně nukleotidových sekvencí a expresních vektorů kódujících polypeptid, stejně jako způsobů výroby tohoto polypeptidu nebo konjugátu.In yet other embodiments, the invention relates to compositions and methods for making an interferon β conjugate or polypeptide for use in the present invention, including nucleotide sequences and expression vectors encoding the polypeptide, as well as methods for making the polypeptide or conjugate.
V posledních provedeních se vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího konjugát podle vynálezu, konjugátu nebo prostředku podle vynálezu pro použití v lékařství, použití konjugátu nebo prostředku při léčení nebo pro výrobu léku pro léčení onemocnění.In recent embodiments, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a conjugate of the invention, a conjugate or a composition of the invention for use in medicine, the use of a conjugate or composition in the treatment or for the manufacture of a medicament for treating a disease.
Podrobný popis vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Všechny citované dokumenty jsou zařazeny jako celek odkazem.All documents cited are incorporated by reference in their entirety.
DefiniceDefinition
V souvislosti předkládaného vynálezu platí následující definice:In the context of the present invention, the following definitions apply:
Termín „konjugát“ (nebo zaměnitelně „konjugovaný polypeptid“) má označovat heterogenní (ve smyslu složené nebo chimérní) molekulu vytvořenou kovalentní vazbou jednoho nebo více polypeptidu na jednu nebo více nepolypeptidových částí. Termín kovalentní připojení znamená, že polypeptid a nepolypeptidová část jsou buď vzájemně přímo kovalentně spojeny, nebo jsou jinak nepřímo kovalentně navázány prostřednictvím vstupující skupiny nebo skupin, jako je můstek, mezerníková skupina (spacer) nebo propojovací skupina nebo skupiny, s použitím vazebné skupiny přítomné v polypeptidu. Konjugát je s výhodou rozpustný v příslušných ► 99 *9 9 • 9 • 9The term "conjugate" (or interchangeably "conjugated polypeptide") is intended to refer to a heterogeneous (in the sense of a composite or chimeric) molecule formed by covalently binding one or more polypeptides to one or more non-polypeptide moieties. The term covalent attachment means that the polypeptide and the non-polypeptide moiety are either directly covalently linked to each other, or are otherwise indirectly covalently attached via an accessing group or groups such as a bridge, spacer, or linking group or groups, using a linking group present in the of a polypeptide. The conjugate is preferably soluble in the respective 99 99 * 9 9 9 9 9
99
9999 koncentracích a za příslušných podmínek, tj. rozpustný ve fyziologických kapalinách jako je krev. Mezi příklady konjugovaných polypeptidu podle vynálezu patří glykosylované a/nebo PEGylované polypeptidy. Termín „nekonjugovaný polypeptid“ může být použit pro označení polypeptidové části konjugátu.9999 concentrations and under appropriate conditions, i.e. soluble in physiological fluids such as blood. Examples of conjugated polypeptides of the invention include glycosylated and / or PEGylated polypeptides. The term "unconjugated polypeptide" may be used to refer to the polypeptide portion of a conjugate.
Termín „nepolypeptidová část“ se používá pro označení molekuly, která je schopna konjugovat se k vazebné skupině polypeptidu podle vynálezu. Mezi výhodné příklady takové molekuly patří polymerní molekuly, cukerné části, lipofilní sloučeniny nebo organické derivatizující prostředky. Při použití v kontextu konjugátu podle vynálezu bude zřejmé, že nepolypeptidová část je navázána na polypeptidovou část konjugátu prostřednictvím vazebné skupiny polypeptidu.The term "non-polypeptide moiety" is used to refer to a molecule that is capable of conjugating to a binding moiety of a polypeptide of the invention. Preferred examples of such a molecule include polymer molecules, sugar moieties, lipophilic compounds, or organic derivatizing agents. When used in the context of the conjugate of the invention, it will be appreciated that the non-polypeptide moiety is attached to the polypeptide moiety of the conjugate via a polypeptide linker moiety.
Termín „polymerní molekula“ je definován jako molekula vytvořená kovalentní vazbou dvou nebo více monomerů, přičemž žádný z monomerů není zbytek aminokyseliny, kromě případů, kdy polymerem je lidský albumin nebo jiný protein, který se v plasmě vyskytuje ve větším množství.The term "polymer molecule" is defined as a molecule formed by the covalent bonding of two or more monomers, none of the monomers being an amino acid residue, except when the polymer is human albumin or other protein that is present in plasma in greater quantities.
Termín „polymer“ může být používán zaměnitělně s termínem „polymerní molekula“. Tento temín má zahrnovat uhlohydrátové molekuly navázané glykosylací in vitro, tj. syntetickou glykosylací prováděnou in vitro, která normálně zahrnuje kovalentní navázání molekuly uhlohydrátu na vazebnou skupinu polypeptidu, popřípadě s použitím zesíťujícího činidla. Uhlohydrátové molekuly navázané glykosylací in vivo, jako je N- nebo O-glykosylace (jak bude dále popsáno), se zde označují jako „cukerná část“. Kromě případů, kdy je počet nepolypeptidových částí, jako polymerní molekuly nebo molekul nebo cukerných částí v konjugátu výslovně uveden, každý odkaz na „nepolypeptidovou část“ obsaženou v konjugátu nebo jinak použitou v rámci předkládaného vynálezu se má vztahovat na jednu nebo více • ·*♦·The term "polymer" may be used interchangeably with the term "polymer molecule". The term is intended to include carbohydrate molecules linked by in vitro glycosylation, i.e., in vitro synthetic glycosylation, which normally involves covalent attachment of the carbohydrate molecule to a polypeptide binding moiety, optionally using a cross-linking agent. Carbohydrate molecules bound by glycosylation in vivo, such as N- or O-glycosylation (as described hereinafter), are referred to herein as the "sugar moiety". Except where the number of non-polypeptide moieties, such as polymer molecules or molecules or sugar moieties, in a conjugate is explicitly stated, any reference to the "non-polypeptide moiety" contained in the conjugate or otherwise used in the present invention is intended to refer to one or more. ·
- ** ·· * 9 9 9 • ♦ ♦ • · 9 • · · • · · · · · nepolypeptidových částí, jako jsou polymemí molekula nebo molekuly, nebo cukerné části v konjugátu.The non-polypeptide moieties, such as the polymer molecule or molecules, or the sugar moieties in the conjugate.
Termín „vazebná skupina“ má označovat skupinu aminokyselinového zbytku polypeptidů schopnou vázat se na příslušnou nepolypeptidovou část. Například pro konjugaci polymeru, zvláště PEG, je často používaná vazebná skupina ε-aminoskupina lysinu, nebo N-koncová aminoskupina. Mezi další vazebné skupiny polymeru patří skupina volné karboxylové kyseliny (například zbytek Ckoncové aminokyseliny nebo kyseliny asparagové nebo zbytek kyseliny glutamové), vhodně aktivované karbonylové skupiny, oxidované uhlohydrátové skupiny a skupiny merkapto.The term "binding moiety" is intended to refer to an amino acid residue moiety of a polypeptide capable of binding to a particular non-polypeptide moiety. For example, the ε-amino group of lysine, or the N-terminal amino group, is often used for the conjugation of a polymer, particularly PEG. Other polymer linking groups include a free carboxylic acid group (for example, a C terminal amino acid residue or aspartic acid residue or a glutamic acid residue), suitably activated carbonyl groups, oxidized carbohydrate groups, and mercapto groups.
Pro N-glykosylaci in vivo se termín „vazebná skupina“ používá v jiném než běžném smyslu pro označení aminokyselinových zbytků obsahujících N-glykosylační místo (se sekvencí N-X’-S/T/C-X”, kde X’ je zbytek aminokyseliny kromě prolinu, X” je jakýkoli zbytek aminokyseliny, který může nebo nemusí být identický s X’, a s výhodou je odlišný od prolinu, N je asparagin a S/T/C buď serin, threonin nebo cystein, s výhodou serin nebo threonin, a nejvýhodněji threonin). Ačkoli asparaginový zbytek N-glykosylačního místa je zbytek, na který se v průběhu glykosylace váže cukerná část, tato vazba nemůže být uskutečněna, pokud nejsou přítomny jiné zbytky aminokyselin N-glykosylačního místa. Jestliže je tedy nepolypeptidová část cukerná část navázaná přes N, termín „aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část“, jak se používá v souvislosti se změnami aminokyselinové sekvence rodičovského polypeptidů, je třeba chápat jako zbytky aminokyselin obsahující N-glykosylační místo, které se mění takovým způsobem, že N-glykosylační místo se buď zavede do aminokyselinové sekvence, nebo se z uvedené sekvence odstraní. Pro „O-glykosylační místo“ je vazebná skupina skupina OH serinového nebo threoninového zbytku.For in vivo N-glycosylation, the term "linking group" is used in a non-conventional sense to refer to amino acid residues containing an N-glycosylation site (with sequence N-X'-S / T / CX ", where X 'is an amino acid residue except proline "X" is any amino acid residue that may or may not be identical to X ', and is preferably different from proline, N is asparagine and S / T / C either serine, threonine or cysteine, preferably serine or threonine, and most preferably threonine ). Although the asparagine residue of the N-glycosylation site is a moiety to which the sugar moiety binds during glycosylation, this linkage cannot be realized unless other amino acid residues of the N-glycosylation site are present. Thus, if the non-polypeptide moiety is a N-linked sugar moiety, the term "amino acid residue containing a non-polypeptide moiety binding group" as used in connection with changes in the amino acid sequence of a parent polypeptide is to be understood as amino acid residues containing an N-glycosylation site in such a way that the N-glycosylation site is either introduced into the amino acid sequence or removed from said sequence. For the "O-glycosylation site", the linking group is an OH group of a serine or threonine residue.
* ··♦·* ·· ♦ ·
Termín „jeden rozdíl“ nebo „liší se od“, jak se používá v souvislosti s konkrétními mutacemi, má umožňovat další rozdíly přítomné ve sloučenině, kromě rozdílu ve specifikované aminokyselině. Například navíc k odstranění a/nebo zavedení aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část může polypeptid interferonu β obsahovat další substituenty, které nesouvisí s zavedením a/nebo odstraněním těchto aminokyselinových zbytků. Termín „alespoň jeden“, jak se zde používá pro nepolypeptidovou část, aminokyselinový zbytek, substituci atd., má znamenat jeden nebo více. Termíny „mutace“ a „substituce“ se používají zaměnitelně.The term "one difference" or "different from" as used in connection with particular mutations is intended to allow for other differences present in the compound, in addition to the difference in the specified amino acid. For example, in addition to removing and / or introducing amino acid residues containing a linker moiety for the non-polypeptide moiety, the interferon β polypeptide may contain additional substituents not related to the introduction and / or removal of these amino acid residues. The term "at least one" as used herein for a non-polypeptide moiety, amino acid residue, substitution, etc., is intended to mean one or more. The terms "mutation" and "substitution" are used interchangeably.
V předkládané přihlášce se používají názvy aminokyselin a atomů (např. CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, atd.) ve smyslu definovaném institucí Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org), přičemž tyto názvy jsou založeny na nomenklatuře IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (názvy zbytků, atomů atd.), Eur. J. Biochem., 138, 9 - 37 (1984), spolu s opravami uvedenými v Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). CA se někdy označuje jako Cct, CB jako Cp. Termín „aminokyselinový zbytek“ má označovat aminokyselinový zbytek ze skupiny alanin (Ala nebo A), cystein (Cys nebo C), kyselina asparagová (Asp nebo D), kyselina glutamová (Glu nebo E), fenylalanin (Phe nebo F), glycin (Gly nebo G), histidin (His nebo H), isoleucin (Ile nebo I), lysin (Lys nebo K), leucin (Leu nebo L), methionin (Met nebo M), asparagin (Asn nebo N), prolin (Pro nebo P), glutamin (Gin nebo Q), arginin (Arg nebo R), serin (Ser nebo S), threonin (Thr nebo T), valin (Val nebo V), tryptofan (Trp nebo W), a tyrosin (Tyr nebo Y). Terminologie používaná pro identifikaci poloh/substitucí aminokyselin je ilustrována následujícím způsobem: C17 (označuje polohu 17 obsazenou cysteinovým zbytkem v aminokyselinové sekvenci ukázané v SEQ ID No. 2). C17S (označuje, že cysteinový zbytek v poloze 17 byl nahrazen serinem). Číslování aminokyselinových zbytků se zde provádí vzhledem • ♦ · · ♦ · · • · · • · « ·· ···· k aminokyselinové sekvenci ukázané v SEQ ID No. 2. Termín „M1del“ se používá ve smyslu delece methioninového zbytku v poloze 1. Vícenásobné substituce jsou označeny znaménkem např.The present application uses amino acid and atom names (e.g., CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, etc.) as defined by the Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org), these names are based on the IUPAC nomenclature and symbolism for Amino Acids and Peptides (names of residues, atoms, etc.), Eur J. Biochem., 138, 9-37 (1984), together with the corrections listed in Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985) CA is sometimes referred to as Cct, CB as Cp The term "amino acid residue" is intended to mean an amino acid residue from the group of alanine (Ala or A), cysteine (Cys or C), aspartic acid. (Asp or D), glutamic acid (Glu or E), phenylalanine (Phe or F), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), lysine (Lys or K), leucine (Leu or L), methionine (Met or M), asparagine (Asn or N), proline (Pro or P), glutamine (Gin or Q), arginine (Arg or R), serine (Ser or S), threonine ( Thr or T), valine (Val no or V), tryptophan (Trp or W), and tyrosine (Tyr or Y). The terminology used to identify amino acid positions / substitutions is illustrated as follows: C17 (indicates position 17 occupied by a cysteine residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2). C17S (indicates that the cysteine residue at position 17 has been replaced with serine). The amino acid residue numbering is performed here with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2. The term "M1del" is used to mean a deletion of the methionine residue at position 1. Multiple substitutions are indicated by the sign e.g.
R71N+D73T/S znamená aminokyselinovou sekvenci obsahující argininového zbytku v poloze 71 asparaginem a substituci zbytku kyseliny asparagové v poloze 73 zbytkem threoninu nebo šeřinu, s výhodou zbytkem threoninu. T/S ve smyslu zde uvedené substituce znamená bud’ zbytek T nebo S, s výhodou zbytek T.R71N + D73T / S means an amino acid sequence comprising an arginine residue at position 71 with asparagine and a substitution of an aspartic acid residue at position 73 with a threonine or serine residue, preferably a threonine residue. T / S within the meaning of the substitution herein means either T or S, preferably T.
Termín „nukleotidové sekvence“ má označovat za sebou následující řadu dvou nebo více molekul nukleotidů. Nukleotidové sekvence může být genomická, cDNA, RNA, semisyntetická, syntetická nebo jakákoli jejich kombinace.The term "nucleotide sequences" is intended to refer to a consecutive series of two or more nucleotide molecules. The nucleotide sequence may be genomic, cDNA, RNA, semisynthetic, synthetic, or any combination thereof.
Termín „rodina sekvencí proteinu interferonu β“ se používá ve svém běžném významu, tj. pro označení skupiny polypeptidů, které mají dostatečnou homologii aminokyselinových sekvencí, aby bylo umožněno uspořádání a porovnání sekvencí, například použitím programu CLUSTALW. Rodina sekvencí interferonu β je dostupná například ze skupin PFAM, verze 4.0, nebo může být připravena použitím vhodného počítačového programu, jako je CLUSTALW, verze 1.74, s použitím přednastavených parametrů (Thompson a další, 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties a weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673 4680).The term "interferon β protein sequence family" is used in its common sense, ie to designate a group of polypeptides that have sufficient amino acid sequence homology to allow sequence alignment and comparison, for example using CLUSTALW. The interferon β family of sequences is available, for example, from the PFAM groups, version 4.0, or can be prepared using a suitable computer program such as CLUSTALW, version 1.74, using preset parameters (Thompson et al., 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680).
Termín „polymerázová řetězová reakce“ nebo „PCR“ obecně označuje způsob amplifikace požadované nukleotidové sekvence in vitro, jak se popisuje například v US 4,683,195. Obecně zahrnuje metoda PCR opakované cykly syntézy prodloužení primeru s použitím oligonukleotidových primerů schopných přednostně hybridizovat se vzorovou nukleovou kyselinou (templátem).The term "polymerase chain reaction" or "PCR" generally refers to a method of amplifying a desired nucleotide sequence in vitro, as described, for example, in US 4,683,195. Generally, the PCR method involves repeated cycles of primer extension synthesis using oligonucleotide primers capable of preferential hybridization to an exemplary nucleic acid (template).
·« ·· <· «·· <
.·· * © © * · ·. ·· * © © * · ·
- ? ♦ ♦ · • ♦ ♦·· • © © · ·· ···© ·©·© „Buňka“, „hostitelská buňka, „buněčná linie,, a „buněčná kultura“ se zde používají zaměnitelně, a všechny tyto termíny by měly být chápány tak, aby zahrnovaly potomky získané pěstováním nebo kultivací buňky. „Transformace“ a „transfekce“ se používají zaměnitelně pro označení způsobu zavádění DNA do buněk.-? "Cell", "host cell," cell line, "and" cell culture "are used interchangeably herein, and all of these terms would be used interchangeably. should be understood to include the progeny obtained by growing or culturing the cell. "Transformation" and "transfection" are used interchangeably to indicate the manner in which DNA is introduced into cells.
Termín „operativně spojený“ označuje kovalentní spojení dvou nebo více nukleotidových sekvencí provedené prostřednictvím enzymatické vazby nebo jinak, v takové vzájemné konfiguraci, že může probíhat normální funkce sekvencí. Například nukleotidová sekvence kódující presekvenci nebo sekreční úvodní sekvenci je operativně spojena s nukleotidovou sekvencí polypeptidu tehdy, je-li exprimována jako preprotein, který se účastní sekrece polypeptidu; promotor nebo zesilující sekvence (enhancer) je operativně spojena s kódující sekvencí, jestliže způsobí transkripci sekvence; vazebné místo ribosomu je operativně spojeno s kódující sekvencí, jestliže je umístěno takovým způsobem, aby byla umožněna translace. Obecně znamená termín „operativně spojený“, že propojované nukleotidové sekvence jsou souvislé, a v případě sekreční úvodní sekvence souvislé a ve správné fázi čtení. Propojení je uskutečněno vazbou (ligací) ve vhodných místech restrikčního štěpení. Pokud tato místa neexistují, používají se syntetické přizpůsobující oligonukleotidy (adaptory) nebo propojující skupiny (linkery) ve spojení se standardními metodami vytváření rekombinantní DNA.The term "operably linked" refers to the covalent linkage of two or more nucleotide sequences made through an enzymatic bond or otherwise, in such a mutual configuration that the normal function of the sequences may occur. For example, a nucleotide sequence encoding a presequence or secretory leader sequence is operably linked to a nucleotide sequence of a polypeptide when it is expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it causes the sequence to be transcribed; a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence when positioned so as to allow translation. In general, the term "operably linked" means that the linked nucleotide sequences are contiguous and, in the case of a secretory leader sequence, contiguous and in the correct reading phase. Coupling is accomplished by binding (ligation) at appropriate restriction cleavage sites. In the absence of these sites, synthetic oligonucleotides (adapters) or linkers are used in conjunction with standard recombinant DNA generation methods.
Termín „zavádět“ je primárně zamýšlen pro označení substituce existujícího aminokyselinového zbytku, ale může také znamenat vložení dalšího aminokyselinového zbytku. Termín „odstraňovat“ má primárně označovat substituci odstraňovaného aminokyselinového zbytku jiným aminokyselinovým zbytkem, ale může také znamenat vyjmutí (deleci) (bez substituce) odstraňovaného aminokyselinového zbytku.The term "introduce" is primarily intended to refer to the substitution of an existing amino acid residue, but may also mean the insertion of an additional amino acid residue. The term "remove" is intended primarily to mean the substitution of the removed amino acid residue by another amino acid residue, but may also mean removal (without substitution) of the removed amino acid residue.
4*444 * 44
• · 4 ·♦ 4444• 44444
Termín „imunogenicita“ používaný v souvislosti s danou látkou má označovat schopnost látky indukovat odpověď imunitního systému. Tato imunitní odpověď může být buněčná odpověď nebo odpověď zprostředkovaná protilátkami (viz např. Roitt: Essential Immunology (8th ed., Blackwell), kde se uvádějí další definice imunogenicity). Imunogenicita může být zjišťována jakoukoli vhodnou metodou známou v oboru, například in vivo nebo in vitro, například použitím testu imunogenicity in vitro popisovaného v části Materiály a metody, dále. Termín „snížená imunogenicita“ označuje, že konjugát nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu vytváří měřitelně nižší imunitní odpověď než referenční molekula, jako je lidský interferon β standardního typu, např. Rebif nebo Avonex, nebo varianta lidského interferonu β standardního typu, jako je Betaseron, přičemž měření se provádí za srovnatelných podmínek. Jestliže se odkazuje na komerčně dostupné produkty interferonu β (např. Betaseron, Avonex a Rebif), mají znamenat buď formulovaný produkt, nebo polypeptidovou část interferonu β (podle potřeby). Za normálních okolností je snížená reaktivita protilátek (například reaktivita proti protilátkám přítomným v séru pacientů léčených komerčními produkty interferonu β) ukazatelem snížené imunogenicity.The term 'immunogenicity' used in the context of a given substance is intended to refer to the ability of a substance to induce an immune system response. This immune response may be a cellular response or an antibody-mediated response (see, e.g., Roitt: Essential Immunology (8 th ed., Blackwell) for additional definitions of immunogenicity). Immunogenicity can be determined by any suitable method known in the art, for example in vivo or in vitro, for example using the in vitro immunogenicity assay described in the Materials and Methods section below. The term "reduced immunogenicity" refers to a conjugate or polypeptide of the present invention producing a measurably lower immune response than a reference molecule, such as a wild-type human interferon β, eg Rebif or Avonex, or a variant of a wild-type human interferon β such as Betaseron. the measurement is carried out under comparable conditions. When referring to commercially available interferon β products (eg, Betaseron, Avonex and Rebif), they are intended to mean either the formulated product or the polypeptide portion of interferon β (as appropriate). Under normal circumstances, decreased antibody reactivity (for example, reactivity against antibodies present in the serum of patients treated with commercial interferon β products) is an indicator of decreased immunogenicity.
Termín „funkční poločas in vivo“ se používá ve svém normálním významu, tj. jako doba, po kterou se zachová 50 % dané funkčnosti polypeptidu nebo konjugátu (jako je doba, po kterou je stále ještě přítomno 50 % biologické aktivity polypeptidu nebo konjugátu v těle/cílovém orgánu, nebo čas, ve kterém je aktivita polypeptidu nebo konjugátu 50 % počáteční hodnoty). Jako alternativa ke stanovení funkčního poločasu in vivo se může určovat „poločas v séru“, tj. doba, během které obíhá v plasmě nebo v krevním řečišti 50 % molekul polypeptidu nebo konjugátu, než dojde k jejich vyloučení. Určení poločasu v séru je často jednodušší než zjištění funkčního poločasu in vivo, a velikost poločasu v séru je obvykle dobrým ukazatelem velikosti funkčního poločasu in vivo. Alternativní • · termíny pro poločas v séru zahrnují „poločas v plasmě“, „cirkulační poločas“, „vylučování (clearance) ze séra“, „vylučování z plasmy“ a „poločas vylučování“. Funkčnost, která má být zachována, se obvykle volí z antivirové, antiproliferativní, imunomodulační aktivity nebo vazebné aktivity k receptoru. Funkční poločas in vivo a sérový poločas mohou být zjištěny jakoukoli vhodnou metodou známou v oboru, jak bude dále diskutováno v části Materiály a metody.The term "functional in vivo half-life" is used in its normal sense, ie, the time that 50% of a given polypeptide or conjugate is maintained (such as the time that 50% of the biological activity of the polypeptide or conjugate is still present in the body (target organ, or time at which the activity of the polypeptide or conjugate is 50% of the initial value). As an alternative to determining the functional half-life in vivo, the "serum half-life", i.e. the time during which 50% of the polypeptide or conjugate molecules are circulating in the plasma or bloodstream before elimination may occur. Determining the serum half-life is often easier than determining the functional half-life in vivo, and the magnitude of the serum half-life is usually a good indication of the magnitude of the functional half-life in vivo. Alternative • terms for serum half-life include "plasma half-life", "circulating half-life", "serum clearance", "plasma elimination" and "elimination half-life". The functionality to be maintained is usually selected from antiviral, antiproliferative, immunomodulatory or receptor binding activity. The in vivo functional half-life and serum half-life can be determined by any suitable method known in the art, as further discussed in the Materials and Methods section.
Polypeptid nebo konjugát se normálně vylučují působením jednoho nebo více retikuloendotheliálních systémů (RES), ledvin, sleziny nebo jater, nebo specifickou nebo nespecifickou proteolýzou. Vylučování, které probíhá v ledvinách, může být také označováno jako „vylučování ledvinami“ (renal clearance), a je uskutečňováno například glomerulární filtrací, tubulární exkrecí nebo tubulární eliminací. Za normálních okolností závisí vylučování na fyzikálních vlastnostech konjugátu, včetně molekulové hmotnosti, velikosti (průměru) (vzhledem k hranici glomerulární filtrace), náboje, symetrie, tvaru/rigidity, navázaných uhlohydrátových řetězců a přítomnosti buněčných receptorů pro protein. Pro renální vylučování se považuje za důležitou hraniční hodnotu molekulová hmotnost přibližně 67 kDa.The polypeptide or conjugate is normally secreted by the action of one or more reticuloendothelial systems (RES), kidney, spleen or liver, or by specific or non-specific proteolysis. Renal clearance may also be referred to as "renal clearance" and is accomplished, for example, by glomerular filtration, tubular excretion or tubular elimination. Normally, secretion depends on the physical properties of the conjugate, including molecular weight, size (relative to the glomerular filtration line), charge, symmetry, shape / rigidity, bound carbohydrate chains, and the presence of cellular protein receptors. A molecular weight of approximately 67 kDa is considered important for renal excretion.
Snížené vylučování ledvinami může být zjištěno jakýmkoli vhodným testem, například testem in vivo. Typicky se vylučování ledvinami stanoví podáním značeného (například radioaktivně nebo fluorescenčně) polypeptidového konjugátu pacientovi a měřením aktivity značky v moči shromažďované od pacienta. Snížené vylučování ledvinami se stanovuje vzhledem k odpovídajícímu nekonjugovanému polypeptidu nebo odpovídajícímu nekonjugovanému polypeptidu standardního typu nebo produktu komerčního interferonu β za srovnatelných podmínek.Reduced renal excretion can be detected by any suitable test, for example, an in vivo test. Typically, renal excretion is determined by administering a labeled (e.g., radioactive or fluorescent) polypeptide conjugate to a patient and measuring the activity of the label in the urine collected from the patient. Reduced renal excretion is determined relative to the corresponding unconjugated polypeptide or the corresponding unconjugated wild-type or commercial interferon β product under comparable conditions.
Termín „zvýšený“, jak se používá v případě funkčního poločasu in vivo nebo poločasu v séru, se používá pro označení, že příslušný poločas konjugátu nebo peptidu je statisticky významně zvýšený • 4 · • 4 · *· · · • 4 • 4 • · ··· 4444 • · 4 • 4 • 4 • 4 444 4 «4 *· ···· vzhledem k poločasu referenční molekuly, jako je lidský interferon β standardního typu (např. Avonex nebo Rebif), nebo nekonjugovaná varianta lidského interferonu β (např. Betaseron), přičemž stanovení se provádí za srovnatelných podmínek.The term "increased" as used in the case of functional in vivo or serum half-life is used to indicate that the respective half-life of the conjugate or peptide is statistically significantly increased. With regard to the half-life of a reference molecule such as wild-type human interferon β (eg Avonex or Rebif), or an unconjugated variant of human interferon β (eg Betaseron), the assay being performed under comparable conditions.
Termín „snížená imunogenicita a/nebo zvýšený funkční poločas in vivo a/nebo zvýšený poločas v séru“ má zahrnovat jakoukoli, dvě nebo všechny tyto vlastnosti. S výhodou má konjugát nebo polypeptid podle vynálezu alespoň dvě z těchto vlastností, tj. sníženou imunogenicitu a zvýšený funkční poločas in vivo, sníženou imunogenicitu a zvýšený poločas v séru, nebo zvýšený funkční poločas in vivo a zvýšený poločas v séru. Nejvýhodněji má konjugát nebo polypeptid podle vynálezu všechny tyto vlastnosti.The term "reduced immunogenicity and / or increased functional half-life in vivo and / or increased half-life in serum" is intended to include any, two or all of these properties. Preferably, the conjugate or polypeptide of the invention has at least two of these properties, ie decreased immunogenicity and increased functional half-life in vivo, decreased immunogenicity and increased half-life in serum, or increased functional half-life in vivo and increased half-life in serum. Most preferably, the conjugate or polypeptide of the invention has all of these properties.
Termín „s aktivitou interferonu β“ má označovat, že polypeptid nebo konjugát má jednu nebo více funkcí nativního interferonu β, zvláště lidského interferonu β standardního typu s aminokyselinovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 2 (což je zralá neboli maturní sekvence), popřípadě exprimovanou v glykosylující hostitelské buňce, nebo komerčně dostupných produktů interferonu β. Mezi tyto funkce patří schopnost vázat se na receptor pro interferon, který je schopen vázat interferon β a zahájit přenos intracelulárních signálů z receptoru, zvláště interferonový receptor typu I tvořený receptorovými podjednotkami IFNAR-2 a IFNAR-1 (Domanski a další, The Journal of Biological Chemistry, díl 273, No. 6, str. 3144 - 3147, 1998, Mogensen a další, Journal of Interferon and Cytokin Research, 19: 1069 - 1098, 1999), a antivirová, antiproliferativní nebo imunomodulační aktivita (která může být zjištěna testy známými v oboru, například uvedenými v následujícím popisu). Aktivita interferonu β může být testována metodami známými v oboru, jejichž příklady se uvádějí v části Materiály a metody, dále.The term "with interferon β activity" is intended to indicate that the polypeptide or conjugate has one or more functions of native interferon β, in particular human wild type interferon β with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2 (which is a mature or mature sequence), optionally expressed in a glycosylating host cell, or commercially available interferon β products. These include the ability to bind to an interferon receptor that is able to bind interferon β and initiate the transmission of intracellular signals from the receptor, particularly the type I interferon receptor formed by the IFNAR-2 and IFNAR-1 receptor subunits (Domanski et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, No. 6, pp. 3144-3147, 1998, Mogensen et al., Journal of Interferon and Cytokin Research, 19: 1069-1098, 1999), and antiviral, antiproliferative or immunomodulatory activity (which can be detected by assays). known in the art, for example as described in the following description). The activity of interferon β can be tested by methods known in the art, examples of which are given in the Materials and Methods section below.
Polypeptid nebo konjugát, který „vykazuje“ nebo „má“ aktivitu interferonu β, se považuje v tomto smyslu za aktivní, jestliže ukazuje • · ·· ·· * · · « ·* 9999 ·» 99 • 9 · • 9 • 9A polypeptide or conjugate that "exhibits" or "has" interferon β activity is considered to be active in this sense if it shows 9999 9 99 9 9 9 9
99
9999 měřitelnou funkci, například měřitelnou vazbu na receptor a stimulační aktivitu (například zjištěnou primárním nebo sekundárním testem popsaným v části Materiály a metody). Polypeptid s aktivitou interferonu β může být také označován jako „molekula interferonu β“ nebo „polypeptid interferonu β“. Termín „polypeptid interferonu β„ se zde primárně používá pro označení modifikovaných polypeptidů podle vynálezu (do kterých byly zavedeny nebo ze kterých byly odstraněny vazebné skupiny pro příslušnou nepeptidovou část).9999 measurable function, such as measurable receptor binding and stimulatory activity (e.g., as determined by the primary or secondary assay described in Materials and Methods). A polypeptide with interferon β activity may also be referred to as an "interferon β molecule" or an "interferon β polypeptide". The term "interferon β polypeptide" is used herein primarily to refer to modified polypeptides of the invention (into which binding groups for the non-peptide moiety have been introduced or removed).
Termín „rodičovský interferon β“ má označovat výchozí molekulu, která se podle předkládaného vynálezu zlepšuje. I když rodičovský interferon β může být jakéhokoli původu, jako je interferon z obratlovců nebo interferon savčího původu (například zdroje definované ve WO 00/23472), rodičovský interferon β je s výhodou lidský interferon β standardního typu, se SEQ ID No. 2, nebo jeho varianta. „Varianta“ je polypeptid, který se od rodičovského polypeptidů odlišuje v jednom nebo více aminokyselinových zbytků, normálně v 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselinových zbytcích. Příklady lidského interferonu β standardního typu zahrnují polypeptidovou část materiálu Avonex nebo Rebif. Příklad varianty rodičovského interferonu β je Betaseron. Alternativně může rodičovský polypeptid interferonu β obsahovat aminokyselinovou sekvenci, která je hybridní molekulou mezi interferonem β a dalším homologním polypeptidem jako je interferon a, a která popřípadě obsahuje jednu nebo více dalších substitucí zavedených do hybridní molekuly. Taková hybridní molekula může obsahovat aminokyselinovou sekvenci, která je odlišná ve více než 10 aminokyselinových zbytcích od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 2. Aby byla hybridní molekula využitelná podle předkládaného vynálezu, má aktivitu interferonu β (například ve stanovení sekundárním testem popsaným dále v části Materiály a metody).The term "parental interferon β" is intended to refer to a parent molecule that is improved according to the present invention. Although the parent interferon β may be of any origin, such as a vertebrate interferon or a mammal interferon (e.g., a source as defined in WO 00/23472), the parent interferon β is preferably a wild-type human interferon β with SEQ ID NO. 2, or a variant thereof. A "variant" is a polypeptide that differs from the parent polypeptide in one or more amino acid residues, normally in 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acid residues. Examples of wild-type human interferon β include the polypeptide portion of Avonex or Rebif. An example of a variant of parental interferon β is Betaseron. Alternatively, the parent interferon β polypeptide may comprise an amino acid sequence that is a hybrid molecule between interferon β and another homologous polypeptide, such as interferon α, and which optionally contains one or more additional substitutions introduced into the hybrid molecule. Such a hybrid molecule may comprise an amino acid sequence that is different in more than 10 amino acid residues from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2. To be useful in the present invention, a hybrid molecule has interferon β activity (for example, in a secondary assay as described in the Materials and Methods section below).
• · «♦ ♦··»• · ♦ · ·· »
Termín „funkční místo“ používaný u polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu, má označovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků, který je nebo které jsou nezbytné pro funkci, nebo se jinak účastní funkce, nebo účinnosti interferonu β, a tedy „jsou umístěny“ na funkčním místě. Funkční místo je například vazebné místo receptoru a může být určeno metodami známými v oboru, s výhodou analýzou struktury polypeptidu v komplexu s příslušným receptorem, jako je receptor interferonu typu I tvořený podjednotkami IFNAR-1 a IFNAR-2.The term "functional site" as used in a polypeptide or conjugate of the invention is intended to refer to one or more amino acid residues that are or are required for the function or otherwise participate in the function or efficacy of interferon β, and thus "are located" at the functional site. . For example, a functional site is a receptor binding site and can be determined by methods known in the art, preferably by analyzing the structure of the polypeptide complexed with a particular receptor, such as the type I interferon receptor formed by the IFNAR-1 and IFNAR-2 subunits.
Konjugát podle vynálezuThe conjugate of the invention
Jak je uvedeno výše, v prvním provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu první nepolypeptidovou část kovalentně navázanou k polypeptidu interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném a alespoň jednom odstraněném aminokyselinovém zbytku obsahujícím vazebnou skupinu pro uvedenou první nepolypeptidovou část.As mentioned above, in a first embodiment, the invention relates to a conjugate with interferon β activity comprising at least one first non-polypeptide moiety covalently linked to an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in at least one introduced and at least one a removed amino acid residue comprising a linking group for said first non-polypeptide moiety.
Odstraněním a/nebo zavedením aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část je možno specificky upravit polypeptid tak, aby byla molekula přístupnější konjugaci ke zvolené nepolypeptidové části, aby bylo možno optimalizovat strukturu konjugace (například pro zajištění optimální distribuce nepolypeptidových částí na povrchu molekuly interferonu β a tím například účinně stínit epitopy a jiné povrchové části polypeptidu bez podstatného narušení jejich funkce). Například zavedením vazebných skupin se polypeptid interferonu β posílí nebo jinak změní co se týče obsahu specifických aminokyselinových zbytků, na které se váže příslušná nepolypeptidové část, čímž se dosáhne účinnější, specifické a/nebo rozsáhlé konjugace. Odstraněním jedné nebo více vazebných skupin je možno zabránit konjugaci k nepolypeptidové části .·· ·· • · · I • φ * φφφφ «φ • · « • · ♦· ···· ·· ···· v oblastech polypeptidu, ve kterých je tato konjugace nevýhodná, například na aminokyselinový zbytek umístěný ve funkčním místě nebo v blízkosti funkčního místa polypeptidu (protože konjugace v takovém místě může vést k inaktivaci nebo snížení aktivity interferonu β získaného konjugátu v důsledku nesprávného rozpoznání receptoru). Dáíe může být výhodné odstranit vazebnou skupinu umístěnou těsně u jiné vazebné skupiny, aby se zabránilo heterogenní konjugaci k těmto skupinám.By removing and / or introducing amino acid residues containing a non-polypeptide moiety binding moiety, the polypeptide may be specifically tailored to make the molecule more accessible to conjugation to the selected non-polypeptide moiety to optimize the conjugation structure (e.g. thereby effectively shielding epitopes and other surface portions of the polypeptide without substantially disrupting their function). For example, the introduction of binding moieties will enhance or otherwise alter the interferon β polypeptide in terms of the content of specific amino acid residues to which the particular non-polypeptide moiety binds, thereby achieving more efficient, specific, and / or extensive conjugation. By removing one or more linking moieties, conjugation to the non-polypeptide moiety can be avoided. where such conjugation is disadvantageous, for example to an amino acid residue located at or near the functional site of the polypeptide (since conjugation at such a site may lead to inactivation or decrease of interferon-beta activity of the obtained conjugate due to improper receptor recognition). It may further be advantageous to remove a linking group located adjacent to another linking group to avoid heterogeneous conjugation to these groups.
Je třeba rozumět, že aminokyselinový zbytek obsahující vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část, ať už je odstraněná nebo zavedená, se volí na základě povahy nepolypeptidové části, a ve většině případů na základě použité metody konjugace. Jestliže je například nepolypeptidovou částí molekula odvozená od polyethylenglykolu nebo molekula odvozená od polyalkylenoxidu, aminokyselinové zbytky schopné fungovat jako vazebné skupiny mohou být zvoleny ze skupiny zahrnující lysin, cystein, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou a arginin. Jestliže je nepolypeptidovou částí cukerná část, je vazebná skupina místo glykosylace in vivo, s výhodou místo N-glykosylace.It should be understood that the amino acid residue containing the non-polypeptide moiety, whether removed or introduced, is selected based on the nature of the non-polypeptide moiety, and in most cases, the conjugation method employed. For example, if the non-polypeptide moiety is a polyethylene glycol-derived molecule or a polyalkylene oxide-derived molecule, the amino acid residues capable of functioning as linking groups may be selected from the group consisting of lysine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, and arginine. If the non-polypeptide moiety is a sugar moiety, the linking moiety is a glycosylation site in vivo, preferably an N-glycosylation site.
Jestliže se má zavést nebo odstranit z polypeptidu interferonu β podle předkládaného vynálezu vazebná skupina pro nepolypeptidovou část, poloha v polypeptidu interferonu β, která se má modifikovat, se vhodně volí následujícím způsobem:If a non-polypeptide moiety is to be introduced or removed from the interferon β polypeptide of the present invention, the position in the interferon β polypeptide to be modified is suitably selected as follows:
Tato poloha se s výhodou nalezne na povrchu polypeptidu interferonu β, výhodněji obsazeném aminokyselinovým zbytkem, který má více než 25 % svého postranního řetězce vystaveného rozpouštědlu, s výhodou více než 50 % svého postranního řetězce vystaveného rozpouštědlu. Tyto polohy byly identifikovány na základě analýzy 3D struktury molekuly interferonu β, jak se popisuje dále v části Metody.This position is preferably found on the surface of an interferon β polypeptide, more preferably occupied by an amino acid residue, having more than 25% of its solvent-exposed side chain, preferably more than 50% of its solvent-exposed side chain. These positions were identified by analyzing the 3D structure of the interferon β molecule as described later in the Methods section.
····
Σ * · « • · 9 • *··* • · · ·· ··«·9 · 9 9 * 9 * 9 9 9 9
··
9· ·*··10 · · * ··
Alternativně nebo navíc se poloha, která má být modifikována, identifikuje na základě analýzy skupiny sekvencí proteinu interferonu β. Konkrétněji může být modifikovaná poloha taková poloha, která je obsazena u jednoho nebo více členů skupiny jiné než rodičovský interferon β, aminokyselinovým zbytkem obsahujícím příslušnou vazebnou skupinu (jestliže se má vložit tento aminokyselinový zbytek), nebo která je u rodičovského interferonu β, ale nikoli u jednoho nebo více dalších zástupců této skupiny, obsazena aminokyselinovým zbytkem obsahujícím příslušnou vazebnou skupinu (jestliže se má takový aminokyselinový zbytek odstranit).Alternatively or additionally, the position to be modified is identified by analyzing the sequence of interferon β protein sequences. More specifically, the modified position may be a position that is occupied by one or more members of a group other than the parent interferon β, an amino acid residue containing the appropriate binding group (if the amino acid residue is to be inserted), or one or more additional members of this group, occupied by an amino acid residue containing the appropriate linking group (if such amino acid residue is to be removed).
Pro zjištění optimální distribuce vazebných skupin se vypočte vzdálenost mezi aminokyselinovými zbytky umístěnými na povrchu molekuly interferonu β na základě 3D struktury polypeptidu interferonu β. Konkrétněji se určí vzdálenost mezi uhlíky CB aminokyselinových zbytků obsahujících tyto vazebné skupiny, nebo vzdálenost mezi funkční skupinou (NZ pro lysin, CG pro kyselinu asparagovou, CD pro kyselinu glutamovou, SG pro cystein) jednoho a uhlíkem CB jiného aminokyselinového zbytku obsahujícího vazebnou skupinu. V případě glycinu se namísto CB používá CA. U polypeptidové části interferonu β konjugátu podle předkládaného vynálezu je jakákoli z uvedených vzdáleností s výhodou větší než 8 A (0,8 nm), zvláště více než 10 A (1 nm), aby se heterogenní konjugaci zabránilo nebo aby se omezila.To determine the optimal distribution of the linking groups, the distance between the amino acid residues located on the surface of the interferon β molecule is calculated based on the 3D structure of the interferon β polypeptide. More specifically, the distance between the carbons of the CB amino acid residues containing these linking groups, or the distance between the functional group (NZ for lysine, CG for aspartic acid, CD for glutamic acid, SG for cysteine) of one and the CB carbon of another linking group containing amino acid residue. In the case of glycine, CA is used instead of CB. For the polypeptide portion of the interferon β conjugate of the present invention, any of these distances are preferably greater than 8 A (0.8 nm), particularly more than 10 A (1 nm), to prevent or reduce heterogeneous conjugation.
U polypeptidové části interferonu β konjugátu podle vynálezu byly dále s výhodou odstraněny vazebné skupiny umístěné v oblasti vazebného místa receptoru interferonu β, s výhodou substitucí aminokyselinového zbytku obsahujícího takovou skupinu.Further, in the polypeptide portion of the interferon β conjugate of the invention, the binding groups located in the region of the interferon β receptor binding site are preferably removed, preferably by substituting an amino acid residue containing such a group.
Ještě další obecně použitelný přístup pro modifikaci polypeptidu interferonu β je odstínit, a tím zničit nebo jinak inaktivovat epitop přítomný v rodičovském interferonu β, konjugací s nepolypeptidovou částí. Epitopy lidského interferonu β mohou být identifikovány použitím metod známých v oboru, které jsou známé také jako mapování • *··9 ·· • · * · • · · • · 9 • · · ·· ··»· . ·· ·· • · » * *· ···· epitopů, viz např. Romagnoli a další, J. Biol. Chem., 1999, 380 (5): 553 - 9, DeLisser Η. M., Methods Mol. Biol., 1999, 96: 11 - 20, Van de Water a další, Clin. Immunol. Immunopathol., 1997, 85 (3): 229 - 35, Saint Remy J. M., Toxicology, 1997, 119 (1): 77 - 81, a Lan D. P. a Krokhen C. W., Curr. Opin. Immunol., 1993, 5 (2): 268 - 71. Jeden způsob spočívá ve vytvoření knihovny typu phage display (tj. využitím předkládání peptidů na povrchu tága) exprimující náhodné oligopeptidy složené například z 9 aminokyselinových zbytků. Protilátky lgG1 ze specifického antiséra proti lidskému interferonu β se čistí imunoprecipitací a reaktivní fágy se identifikují imunitním přenosem (immunoblotting). Sekvenováním DNA vyčištěných reaktivních fágů je možno určit sekvenci oligopeptidu a následně lokalizovat tuto sekvenci na 3D struktuře interferonu β. Alternativně mohou být epitopy identifikovány metodou popsanou v US 5,041,376. Tímto způsobem identifikovaná oblast na struktuře se skládá z epitopu, který může být zvolen jako cílová oblast pro zavedení vazebné skupiny pro nepolypeptidovou část. S výhodou se stíní nepolypeptidovou skupinou podle předkládaného vynálezu tři nebo čtyři epitopy lidského rekombinantního interferonu β (popřípadě obsahující mutaci C17S). Podle jednoho provedení má konjugát podle vynálezu alespoň jeden odstíněný epitop ve srovnání s lidským interferonem β standardního typu, popřípadě obsahující mutaci C17S, včetně jakéhokoli komerčně dostupného interferonu β. Konjugát podle vynálezu obsahuje s výhodou polypeptid, který je modifikovaný takovým způsobem, aby odstínil epitop umístěný v blízkosti aminokyselinového zbytku Q49 a/nebo F111. To je možno provést zavedením vazebné skupiny pro nepolypeptidovou část do polohy umístěné v blízkosti (tj. v rámci čtyř aminokyselinových zbytků v primární sekvenci nebo do vzdálenosti přibližně 10 Á (1 nm) v rámci terciální sekvence) zbytku Q49 a/nebo F111. Vzdálenost 10 A (1 nm) se měří mezi uhlíky CB (v případě glycinu CA). Vkládání tímto specifickým způsobem se popisuje v následujících částech.Yet another generally applicable approach for modifying an interferon β polypeptide is to shield and thereby destroy or otherwise inactivate the epitope present in the parent interferon β by conjugation to the non-polypeptide moiety. Human interferon β epitopes can be identified using methods known in the art, also known as mapping. See, e.g., Romagnoli et al., J. Biol. Chem., 1999, 380 (5): 553-9, DeLisser. M., Methods Mol. Biol., 1999, 96: 11-20, Van de Water et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 1997, 85 (3): 229-35, Saint Remy JM, Toxicology, 1997, 119 (1): 77-81, and Lan D. P. and Krokhen C. W., Curr. Opin. Immunol., 1993, 5 (2): 268-71. One method is to create a phage display library (i.e., utilizing the presentation of peptides on the cue surface) expressing random oligopeptides composed, for example, of 9 amino acid residues. IgG1 antibodies from a specific antiserum against human interferon β are purified by immunoprecipitation, and reactive phages are identified by immunoblotting. By sequencing the DNA of purified reactive phages, the sequence of the oligopeptide can be determined and subsequently located on the 3D structure of interferon β. Alternatively, epitopes may be identified by the method described in US 5,041,376. The region identified in this way on the structure consists of an epitope that can be selected as a target region for the introduction of a non-polypeptide moiety binding moiety. Preferably, the non-polypeptide moiety of the present invention is shielded by three or four epitopes of human recombinant interferon β (optionally containing a C17S mutation). In one embodiment, the conjugate of the invention has at least one shielded epitope as compared to wild-type human interferon β, optionally containing a C17S mutation, including any commercially available interferon β. Preferably, the conjugate of the invention comprises a polypeptide that is modified in such a way as to shield an epitope located near the amino acid residue Q49 and / or F111. This can be accomplished by introducing a non-polypeptide moiety linker at a position located near (i.e., within the four amino acid residues in the primary sequence or at a distance of about 10 Å (1 nm) within the tertiary sequence) of Q49 and / or F111. The 10 A (1 nm) distance is measured between CB carbons (in the case of glycine CA). Inserting in this specific way is described in the following sections.
• ·• ·
- 22 V případě odstraňování vazebné skupiny se příslušný aminokyselinový zbytek obsahující tuto skupinu a zabírající polohu definovanou výše s výhodou substituuje odlišným aminokyselinovým zbytkem, který neobsahuje vazebnou skupinu pro dotyčnou nepolypeptidovou skupinu.In the case of removal of a linking group, the respective amino acid residue containing this group and occupying the position defined above is preferably substituted with a different amino acid residue that does not contain a linking group for the non-polypeptide moiety in question.
V případě zavádění vazebné skupiny se zbytek aminokyseliny obsahující takovou skupinu zavede do této polohy s výhodou substitucí aminokyselinového zbytku, který zabírá tuto polohu.In the case of the introduction of a linking group, an amino acid residue containing such a group is introduced into this position, preferably by substituting an amino acid residue that occupies this position.
Přesný počet vazebných skupin dostupných pro konjugaci a přítomných v polypeptidu interferonu β závisí na účinku, který má být konjugací dosažen. Dosažený účinek závisí například na povaze a stupni konjugace (například identitě nepolypeptidové části, počtu nepolypeptidových skupin, které jsou nezbytné pro konjugaci polypeptidu nebo které mohou s polypeptidem konjugovat, na kterém místě by mělo ke konjugaci dojít nebo kde by se mělo konjugaci zabránit). Například jestliže se požaduje snížená imunogenicita, počet (a umístění) vazebných skupin by měl být dostatečný pro odstínění většiny všech přítomných epitopů. Toho se normálně dosáhne, jestliže se stíní větší část polypeptidu interferonu β. Účinné stínění epitopů se za normálních okolností dosáhne, jestliže je celkový počet vazebných skupin dostupných pro konjugaci v rozmezí 1 až 10 vazebných skupin, zvláště v rozmezí 2 až 8, jako je 3 až 7.The exact number of binding groups available for conjugation and present in the interferon β polypeptide depends on the effect to be achieved by conjugation. The effect achieved depends, for example, on the nature and degree of conjugation (e.g., the identity of the non-polypeptide moiety, the number of non-polypeptide moieties that are necessary to conjugate the polypeptide, or which may conjugate to the polypeptide at which point conjugation should occur or prevent). For example, if reduced immunogenicity is desired, the number (and location) of binding groups should be sufficient to shield most of the epitopes present. This is normally achieved when a larger portion of the interferon β polypeptide is shielded. Effective epitope shielding is normally achieved when the total number of linking groups available for conjugation is in the range of 1 to 10 linking groups, especially in the range of 2 to 8, such as 3 to 7.
Funkční poločas in vivo je mj. závislý na molekulové hmotnosti konjugátu, a počet vazebných skupin nezbytných pro dosažení zvýšeného poločasu tedy závisí na molekulové hmotnosti příslušné nepolypeptidové části. V jednom provedení má konjugát podle vynálezu molekulovou hmotnost alespoň 67 kDa, zvláště alespoň 70 kDa, při měření metodou SDS-PAGE podle Laemmli, U. K., Nátuře, díl 227 (1970), str. 680 - 85. Interferon β má molekulovou hmotnost přibližně 20 kDa, a proto je pro dosažení požadovaného účinku nutných dalších přibližně 50 kDa. Ty mohou být získány například • · pomocí pěti molekul PEG 10 kDa nebo dalšími zde popisovanými způsoby.The functional half-life in vivo is inter alia dependent on the molecular weight of the conjugate, and thus the number of linking groups necessary to achieve an increased half-life depends on the molecular weight of the respective non-polypeptide moiety. In one embodiment, the conjugate of the invention has a molecular weight of at least 67 kDa, particularly at least 70 kDa, as measured by SDS-PAGE as described in Laemmli, UK, Nature, Vol. 227 (1970), pp. 680-85. Interferon β has a molecular weight of about 20 kDa, and an additional approximately 50 kDa is required to achieve the desired effect. These can be obtained, for example, using five PEG 10 kDa molecules or other methods described herein.
Aby se zabránilo příliš velkému porušení struktury a funkce molekuly rodičovského lidského interferonu β, celkový počet aminokyselinových zbytků, které se podle předkládaného vynálezu mění (ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 2), typicky nepřevyšuje 15. Polypeptid interferonu β s výhodou obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se odlišuje v 1 až 15 aminokyselinových zbytcích od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 2, jako např. v 1 až 8 nebo ve 2 až 8 aminokyselinových zbytcích, například v 1 až 5 nebo v 2 až 5 aminokyselinových zbytcích, od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 2. Normálně tedy polypeptid interferonu β obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 2 liší v 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 aminokyselinových zbytcích. Výše uvedená čísla s výhodou reprezentují buď celkový počet zavedených, nebo celkový počet odstraněných aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro příslušnou nepolypeptidovou část, nebo celkový počet zavedených a odstraněných aminokyselinových zbytků obsahujících tuto skupinu.In order to prevent too much disruption of the structure and function of the parental human interferon β molecule, the total number of amino acid residues that vary according to the present invention (as compared to the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 2) typically does not exceed 15. The interferon β polypeptide preferably it comprises an amino acid sequence that differs in 1 to 15 amino acid residues from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2, such as 1 to 8 or 2 to 8 amino acid residues, for example 1 to 5 or 2 to 5 amino acid residues, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. Thus, normally the interferon β polypeptide comprises an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2 differs in 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid residues. The above numbers preferably represent either the total number of introduced or total removed amino acid residues containing a linking moiety for a particular non-polypeptide moiety, or the total number of introduced and removed amino acid residues containing this moiety.
U konjugátu podle vynálezu je výhodné, jestliže je příslušnou nepolypeptidovou částí obsazeno alespoň přibližně 50 % všech konjugovatelných vazebných skupin, jako je alespoň přibližně 80 %, a s výhodou všechny tyto skupiny. Ve výhodném provedení tedy obsahuje konjugát podle vynálezu např. 1 až 10 nepolypeptidových částí, jako je 2 až 8 nebo 3 až 6.In the conjugate of the invention, it is preferred that at least about 50% of all conjugatable linking groups, such as at least about 80%, and preferably all of these groups, are occupied by the respective non-polypeptide moiety. Thus, in a preferred embodiment, the conjugate of the invention comprises, for example, 1 to 10 non-polypeptide moieties such as 2 to 8 or 3 to 6.
Konjugát podle vynálezu má jednu nebo více z následujících zlepšených vlastností:The conjugate of the invention has one or more of the following improved properties:
snížená imunogenicita ve srovnání s lidským interferonem β standardního typu (např. Avonex nebo Rebif) nebo Betaseronem, • ·decreased immunogenicity compared to wild-type human interferon β (eg Avonex or Rebif) or Betaseron;
např. sníženou o alespoň 25 %, jako alespoň 50 % a výhodněji alespoň 75 %;eg, reduced by at least 25%, such as at least 50%, and more preferably at least 75%;
zvýšený funkční poločas in vivo a/nebo zvýšený poločas v séru ve srovnání s lidským interferonem β standardního typu (např. Avonex nebo Rebif), nebo s Betaseronem;increased in vivo half-life and / or increased serum half-life compared to wild-type human interferon β (eg, Avonex or Rebif), or Betaseron;
snížená nebo žádná reakce s neutralizačními protilátkami pacientů léčených lidským interferonem β standardního typu (např. Rebif nebo Avonex) nebo Betaseronem, například snížení neutralizace o alespoň 25 %, jako je o alespoň 50 % a s výhodou o alespoň 75 %;decreased or no response to neutralizing antibodies of patients treated with wild-type human interferon β (eg Rebif or Avonex) or Betaseron, for example a reduction in neutralization of at least 25%, such as at least 50% and preferably at least 75%;
velikost antivirové aktivity konjugátu podle vynálezu nemusí být kritická a může být snížená (například až o 75 %) nebo zvýšená (například alespoň o 5 %), nebo může být stejná jako aktivita lidského interferonu β standardního typu (např. Avonex nebo Rebif) nebo Betaseronu;the magnitude of the antiviral activity of the conjugate of the invention need not be critical and may be reduced (e.g., up to 75%) or increased (e.g., at least 5%), or may be the same as that of wild-type human interferon β (eg Avonex or Rebif) or Betaseron ;
stupeň antivirového účinku ve srovnání s antiproliferativním účinkem konjugátu podle vynálezu se navíc může lišit, a může být tedy vyšší, nižší nebo stejný jako účinek lidského interferonu β standardního typu.in addition, the degree of antiviral effect compared to the antiproliferative effect of the conjugate of the invention may vary and may be higher, lower or equal to that of wild-type human interferon β.
Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidovou částí je molekula, která má jako vazebnou skupinu lysinA conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety is a molecule having a lysine as a linking group
Ve výhodném provedení má první nepolypeptidová část jako vazebnou skupinu lysin, a polypeptid interferonu β je tedy polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném a/nebo alespo jednom odstraněném zbytku lysinu. I když nepolypeptidová skupina může být kterákoli ze skupin, které se mohou vázat na lysinový zbytek, například na jeho ε-aminoskupinu, jako je molekula polymeru, lipofilní skupina, organické derivatizační činidlo nebo uhlohydrátová skupina, je výhodné, jestliže jakákoliIn a preferred embodiment, the first non-polypeptide moiety has a lysine binding moiety, and the interferon β polypeptide is therefore a polypeptide that contains an amino acid sequence different from the wild-type human interferon β sequence in at least one introduced and / or at least one lysine residue removed. Although the non-polypeptide moiety may be any of the groups that can bind to a lysine residue, for example its ε-amino group, such as a polymer molecule, a lipophilic group, an organic derivatizing agent, or a carbohydrate group, it is preferred that any
z polymerních molekul uvedených v části nazvané „konjugace k molekule polymeru“, je konkrétně rozvětvený nebo přímý PEG nebo polyalkylenoxid. Nejvýhodněji je polymemi molekulou PEG a aktivovanou molekulou použitou pro konjugaci je SS-PEG, NPCPEG, aldehyd-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC firmy Shearwater Polymers, lne., SC-PEG firmy Enzon, lne., tresylovaný mPEG popsaný v US 5,880,255, nebo oxykarbonyl-oxy-N-dikarboxyimid-PEG (US 5,122,614). Pro konjugaci k lysinovému zbytku má normálně nepolypeptidová část molekulovou hmotnost přibližně 5 nebo 10 kDa.of the polymer molecules referred to in the section entitled "conjugation to a polymer molecule" is specifically branched or straight PEG or polyalkylene oxide. Most preferably, the polymer is a PEG molecule and the activated molecule used for conjugation is SS-PEG, NPCPEG, aldehyde-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC from Shearwater Polymers, Inc., SC-PEG from Enzon, Inc., tresylated. mPEG disclosed in US 5,880,255, or oxycarbonyloxy-N-dicarboxyimide-PEG (US 5,122,614). For conjugation to a lysine residue, normally the non-polypeptide moiety has a molecular weight of about 5 or 10 kDa.
V jednom provedení se aminokyselinová sekvence polypeptidu interferonu β odlišuje od lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom odstraněném lysinovém zbytku, jako např. 1 až 5 odstraněných lysinových zbytcích, zvláště 1 až 4 nebo 1 až 3 odstraněných lysinových zbytcích. Lysinový zbytek nebo zbytky, které mají být odstraněny, s výhodou nahrazením, se volí ze skupiny K19, K33, K45, K52, K99, K105, K108, K115, K123, K134 a K136. Lysinový zbytek nebo zbytky mohou být nahrazeny zbytkem jakékoli jiné aminokyseliny, ale s výhodou jsou nahrazeny zbytkem argininu nebo glutaminu, aby vznikl alespoň jeden rozdíl ve struktuře. Polypeptidovou částí může být zvláště taková část, kde K19, K45, K52 a/nebo K123, s výhodou K19, K45 a/nebo K123 byly nahrazeny dalším z jakýchkoli jiných aminokyselinových zbytků, s výhodou argininu nebo glutaminu. Například polypeptidová část interferonu β konjugátu podle vynálezu obsahuje kombinaci aminokyselinových substitucí zvolených z následujícího seznamu:In one embodiment, the amino acid sequence of the interferon β polypeptide differs from wild-type human interferon β in at least one lysine residue removed, such as 1 to 5 lysine residues removed, particularly 1 to 4 or 1 to 3 lysine residues removed. The lysine residue or residues to be removed, preferably by replacement, is selected from the group of K19, K33, K45, K52, K99, K105, K108, K115, K123, K134 and K136. The lysine residue or residues may be replaced by any other amino acid residue, but are preferably replaced by an arginine or glutamine residue to produce at least one structure difference. In particular, the polypeptide moiety may be one in which K19, K45, K52 and / or K123, preferably K19, K45 and / or K123 have been replaced by another of any other amino acid residues, preferably arginine or glutamine. For example, the polypeptide portion of an interferon β conjugate of the invention comprises a combination of amino acid substitutions selected from the following list:
K19R+K45R+K123R;K19R + K45R + K123;
K19Q+K45R+K123R;K19Q + K45R + K123;
K19R+K45Q+K123R;K19R + K45Q + K123R;
K19R+K45R+K123Q;K19R + K45R + K123;
K19Q+K45Q+K123R;K19Q + K45Q + K123R;
K19R+K45Q+K123Q;K19R + K44Q + K123Q;
K19Q+K45R+K123Q;K19Q + K45R + K123;
K19Q+K45Q+K123Q;K19Q + K45Q + K123Q;
K45R+K123R;K45R + K123R;
K45Q+K123R;K45Q + K123R;
K45Q+K123Q;K45Q + K123Q;
K45R+K123Q;K45R + K123Q;
K19R+K123R;K19R + K123R;
K19Q+K123R;K19Q + K123R;
K19R+K123Q;K19R + K123Q;
K19Q+K123Q;K19Q + K123Q;
K19R+K45R;K19R + K45R;
K19Q+K45R;K19Q + K45R;
K19R+K45Q;neboK19R + K45Q;
K19Q+K45Q.K19Q + K45Q
Navíc nebo alternativně k substitucím aminokyselin uvedeným ve výše uvedeném seznamu může polypeptidová část obsahovat alespoň jednu substituci zvolenou ze skupiny K33R, K33Q, K52R, K52Q, K99R, K99Q, K105R, K105Q, K108R, K108Q, K115R, K115Q, K134R, K134Q, K136R a K136Q, například alespoň jednu z následujících substitucí:In addition to or alternatively to the amino acid substitutions listed above, the polypeptide moiety may comprise at least one substitution selected from K33R, K33Q, K52R, K52Q, K99R, K99Q, K105R, K105Q, K108R, K108Q, K115R, K115Q, K134R, K134Q, K136R and K136Q, for example at least one of the following substitutions:
K52R+K134R;K52R + K134R;
K99R+K136R;K99R + K136R;
K33R+K105R+K136R;K33R + K105R + K136R;
K52R+K108R+K134R;K52R + K108R + K134R;
K99R+K115R+K136R;K99R + K115R + K136R;
K19R+K33R+K45R+K123R;K19R + K32R + K45R + K123R;
K19R+K45R+K52R+K123R;K19R + K45R + K52R + K123R;
K19R+K33R+K45R+K52R+K123R; neboK19R + K32R + K45R + K52R + K123R; or
K19R+K45R+K52R+K99R+K123R.K19R + K45R + K52R + K99R + K123R
• » • ·• »•
V dalším provedení se odlišuje aminokyselinová sekvence polypeptídu interferonu β od sekvence ukázané v SEQ ID No. 2 tím, že byl zaveden lysinový zbytek substitucí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku zabírajícího polohu, která je v molekule rodičovského interferonu β obsazena aminokyselinovým zbytkem vystaveným na povrchu, s výhodou aminokyselinovým zbytkem, který má alespoň 25 %, jako je alespoň 50 % svého postranního řetězce vystaveného na povrchu. Nahrazovaný aminokyselinový zbytek se s výhodou volí ze skupiny N4, F8, L9, R11, S12, F15, Q16, Q18, L20,In another embodiment, the amino acid sequence of the interferon β polypeptide differs from the sequence shown in SEQ ID NO. 2 by introducing a lysine residue by substituting at least one amino acid residue occupying a position occupied by a surface exposed amino acid residue in the parent interferon β molecule, preferably an amino acid residue having at least 25%, such as at least 50% of its exposed side chain on the surface. The amino acid residue to be replaced is preferably selected from N4, F8, L9, R11, S12, F15, Q16, Q18, L20,
W22, Q23, G26, R27, L28, E29, Y30, L32, R35, M36, N37, D39, P41,W22, Q23, G26, R27, L28, E29, Y30, L32, R35, M36, N37, D39, P41,
E42, E43, L47, Q48, Q49, T58, Q64, N65, F67, A68, R71, Q72, D73,E42, E43, L47, Q48, Q49, T58, Q64, N65, F67, A68, R71, Q72, D73,
S75, S76, G78, N80, E81, I83, E85, N86, A89, N90, Y92, H93, H97,S75, S76, G78, N80, E81, I83, E85, N86, A89, N90, Y92, H93, H97,
T100, L102, E103, L106, E107, E109, D110, F111, R113, G114, L116, M117, L120, H121, R124, G127, R128, L130, H131, E137, Y138, H140, 1145, R147, V148, E149, R152, Y155, F156, N158, R159, G162, Y163, R165 a N166 SEQ ID No. 2.T100, L102, E103, L106, E107, E110, F111, R113, G114, L116, M117, L120, H121, R124, G127, R128, L130, H131, E137, Y138, H140, 1145, R147, V148 E149, R152, Y155, F156, N158, R159, G162, Y163, R165, and N166 SEQ ID NO. 2.
Výhodněji se aminokyselinová sekvence polypeptídu interferonu β liší od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 2 v tom, že lysinový zbytek byl zaveden substitucí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku zabírajícího polohu zvolenou ze skupiny N4, F8, L9, R11, S12, G26, R27, E29, R35, N37, D39, E42, L47, Q48, Q49, A68, R71, Q72, D73, S75, G78, N80, E85, N86, A89, Y92, H93, D110, F111, R113, L116, H121, R124, G127, R128, R147, V148, Y155, N158, R159, G162 a R165, ještě výhodněji zvolenou ze skupiny N4, R11, G26, R27, Q48, Q49, R71, D73, S75, N80, E85, A89, Y92, H93, F111, R113, L116, R124, G127, R128, Y155, N158 a G162, a nejvýhodněji zvolenou ze skupiny R11, Q49, R71, S75, N80, E85, A89, H93, F111, R113, L116 aY155, a nejvýhodněji Q49 a F111.More preferably, the amino acid sequence of the interferon β polypeptide differs from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2, wherein the lysine residue has been introduced by substituting at least one amino acid residue occupying a position selected from the group of N4, F8, L9, R11, S12, G26, R27, E29, R35, N37, D39, E42, L47, Q48, Q49, A68 , R71, Q72, D73, S75, G78, N80, E85, N86, A89, Y92, H93, D110, F111, R113, L116, H121, R124, G127, R128, R147, V148, Y155, N158, R159, G162 and R165, even more preferably selected from N4, R11, G26, R27, Q48, Q49, R71, D73, S75, N80, E85, A89, Y92, H93, F111, R113, L116, R124, G127, R128, Y155, N158 and G162, and most preferably selected from R11, Q49, R71, S75, N80, E85, A89, H93, F111, R113, L116, and Y155, and most preferably Q49 and F111.
Podle tohoto provedení obsahuje polypeptid interferonu β substituce na lysin v jedné nebo více výše uvedených polohách, • · ·· ·· * · · · • · ·According to this embodiment, the interferon β polypeptide comprises lysine substitutions at one or more of the above positions;
9 99 9
9 99 9
9999 zvláště v 1 až 15, jako je 1 až 8 nebo 1 až 5, a s výhodou alespoň ve dvou polohách, jako ve 2 až 8 nebo 2 až 5 polohách.9999 especially in 1 to 15, such as 1 to 8 or 1 to 5, and preferably at least two positions, such as in 2 to 8 or 2 to 5 positions.
V dalším provedení se aminokyselinová sekvence části polypeptidů interferonu β konjugátu odlišuje v alespoň jednom odstraněném a alespoň jednom zavedeném lysinovém zbytku, jako je v 1 až 5 nebo 2 až 5 odstraněných lysinových zbytcích a 1 až 5 nebo 2 až 5 zavedených lysinových zbytcích. Bude zřejmé, že se odstraňované a vkládané lysinové zbytky volí s výhodou ze zbytků popsaných v této části.In another embodiment, the amino acid sequence of a portion of the interferon β conjugate polypeptides differs in at least one deleted and at least one introduced lysine residue, such as 1 to 5 or 2 to 5 lysine residues removed, and 1 to 5 or 2 to 5 introduced lysine residues. It will be appreciated that the lysine residues to be removed and inserted are preferably selected from those described in this section.
Podle tohoto provedení vynálezu je celkový počet konjugovatelných lysinových zbytků s výhodou v rozmezí 1 až 10, jako je 2 až 8 nebo 3 až 7. Například polypeptidová část interferonu β konjugátu podle předkládaného provedení může obsahovat alespoň jednu z následujících substitucí: R11K, Q48K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K a Y155K; výhodněji R11K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K a Y155K, v kombinaci s alespoň jednou z následujících substitucí: K19R/Q, K33R/Q, K45R/Q, K52R/Q, K99R/Q, K105R/Q, K108R/Q, K115R/Q, K123R/Q, K134R/Q a K136R/Q, kde R/Q udává substituci na zbytek R/Q, s výhodou zbytek R. Polypeptid interferonu β výhodněji obsahuje alespoň jednu z následujících substitucí: R11K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K a Y155K, zvláště Q49K, F111K a/nebo N80K, v kombinaci s alespoň jednou substitucí zvolenou ze skupiny K19, K45, K52 a/nebo K123, s výhodou na zbytek R nebo Q. Polypeptid interferonu β zvláště obsahuje alespoň jednu ze substitucí Q49K, F111K a N80K v kombinaci s alespoň jednou ze substitucí uvedených výše pro odstranění lysinového zbytku. Polypeptid interferonu β může například obsahovat následující substituce:According to this embodiment of the invention, the total number of conjugatable lysine residues is preferably in the range of 1 to 10, such as 2 to 8 or 3 to 7. For example, the polypeptide portion of the interferon β conjugate of the present embodiment may contain at least one of the following substitutions: R11K, Q48K, Q49K , R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K and Y155K; more preferably R11K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K and Y155K, in combination with at least one of the following substitutions: K19R / Q, K33R / Q, K45R / Q, K52R / Q, K99R / Q, K105R / Q, K118R / Q, K115R / Q, K123R / Q, K134R / Q, and K136R / Q, wherein R / Q indicates a substitution for the R / Q residue, preferably the R residue. at least one of the following substitutions: R11K, Q49K, R71K, S75K, N80K, E85K, A89K, H93K, F111K, R113K, L116K and Y155K, especially Q49K, F111K and / or N80K, in combination with at least one substitution selected from K19, K45, K52 and / or K123, preferably to R or Q. The interferon β polypeptide particularly comprises at least one of the substitutions Q49K, F111K and N80K in combination with at least one of the substitutions listed above to remove the lysine residue. For example, an interferon β polypeptide may contain the following substitutions:
Y+Z+K19R+K45R+K123R;Y + Z + K19R + K45R + K123;
Y+Z+K19Q+K45R+K123R;Y + Z + K19Q + K45R + K123;
• · * ·· φ · ·· φ φ φ·· φ φ · · φ φ φφ φ φ · φ φ ΦΦΦ φ φ φφφφ φφφφ φ * φ ΦΦΦ ΦΦΦ· · · · · Φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ
ΦΦΦ ΦΦΦ· φφ φφφφ φφ φφφφΦΦΦ ΦΦΦ · φφ φφφφ φφ φφφφ
Υ+Ζ+Κ19R+K45Q+K123R;Υ + Ζ + Κ19Y + K45Q + K123R;
Y+Z+K19R+K45R+K123Q;Y + Z + K19R + K45R + K123;
Υ+Ζ+Κ19Q+K45Q+K123R;Υ + Ζ + Κ17Q + K45Q + K123R;
Y+Z+K19R+K45Q+K123Q;Y + Z + K19R + K45Q + K123Q;
Y+Z+K19Q+K45R+K123Q;Y + Z + K19Q + K45R + K123;
Y+Z+K19Q+K45Q+K123Q;Y + Z + K19Q + K45Q + K123Q;
Y+Z+K45R+K123R;Y + Z + K45R + K123;
Y+Z+K45Q+K123R;Y + Z + K45Q + K123;
Y+Z+K45Q+K123Q;Y + Z + K45Q + K123Q;
Y+Z+K45R+K123Q;Y + Z + K45R + K123;
Y+Z+K19R+K123R;Y + Z + K 19 R + K 123 R;
Y+Z+K19Q+K123R;Y + Z + K19Q + K123;
Y+Z+K19R+K123Q;Y + Z + K19R + K123Q;
Y+Z+K19Q+K123Q;Y + Z + K19Q + K123Q;
Y+Z+K19R+K45R;Y + Z + K 19 R + K 45 R;
Y+Z+K19Q+K45R;Y + Z + K19Q + K45R;
Y+Z+K19R+K45Q;neboY + Z + K 19 R + K 45 Q;
Υ+Ζ+Κ19Q+K45Q, kde Υ je zvoleno ze skupiny Q49K, F111K, N80K, Q49K+F111K, Q49K+N80K, F111K+N80K a Q49K+F111K+N80K a Z je nepřítomno nebo obsahuje alespoň jednu substituci zvolenou ze skupiny K33R, K33Q, K52R, K52Q, K99R, K99Q, K105R, K105Q, K108R, K108Q, K115R, K115Q, K134R, K134Q, K136R, a K136Q. Polypeptid interferonu β obsahuje s výhodou následující substituci Y+Z+K19R+K45Q+K123R, kde Y a Z mají výše uvedený význam.Υ + Ζ + Κ19Q + K45Q, wherein Υ is selected from Q49K, F111K, N80K, Q49K + F111K, Q49K + N80K, F111K + N80K and Q49K + F111K + N80K and Z is absent or contains at least one substitution selected from K33R K33Q, K52R, K52Q, K99R, K995, K105R, K105Q, K108R, K108Q, K115R, K115Q, K134R, K134Q, K136R, and K136Q. Preferably, the interferon β polypeptide comprises the following substitution Y + Z + K 19 R + K 45 Q + K 123 R, wherein Y and Z are as defined above.
Polypeptid interferonu β podle tohoto provedení vynálezu může zvláště obsahovat jednu z následujících substitucí:In particular, the interferon β polypeptide of this embodiment of the invention may comprise one of the following substitutions:
K19R+K45R+F111K+K123R;K19R + K45R + F111K;
K19R+K45R+Q49K+F111K+K123R;K19R + K45R + Q49K + F111K + K123R;
K19R+K45R+Q49K+K123R;K19R + K45R + Q49K + K123R;
K19R+K45R+F111K;K19R + K45R + F111K;
*· ·· ·· 44 • ·♦ · 4 44 4 • · · 4 4 4 • · · 4 4 4 ·· 4*44 44 4444* 44 44 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444 4444
K19R+K45R+Q49K+F111Κ; K19R+Q49K+K123R; K19R+Q49K+F111K+K123R; K45Q+F111K+K123Q; K45R+Q49K+K123R; nebo K45R+Q49K+F111K+K123R.K19R + K45R + Q49K + F111Κ; K19R + Q50K + K123R; K19R + Q49K + F111K + K123R; K45Q + F111K; K45R + Q50K + K123R; or K45R + Q49K + F111K + K123R.
Zvláště pro expresi v neglykosylujícím hostiteli jako je E. coli může polypeptid interferonu β obsahovat substituci N80K nebo C17S+N80K, popřípadě v kombinaci s jednou nebo více ze substitucí K19R/Q; K45R/Q; K52R/Q nebo K123R/Q. Substituce N80K je zvláště zajímavá, jestliže se polypeptid interferonu β exprimuje v neglykosylující hostitelské buňce, protože N80 tvoří část vlastního glykosylačního místa lidského interferonu β a konjugace v takovém místě může napodobit přirozenou glykosylaci.In particular, for expression in a non-glycosylating host such as E. coli, the interferon β polypeptide may comprise a N80K or C17S + N80K substitution, optionally in combination with one or more of the K19R / Q substitutions; K45R / Q; K52R / Q or K123R / Q. The substitution of N80K is particularly interesting when the interferon β polypeptide is expressed in a non-glycosylating host cell, since N80 forms part of the intrinsic glycosylation site of human interferon β, and conjugation at that site may mimic natural glycosylation.
Navíc je výhodné, pokud konjugát podle tohoto provedeni obsahuje alespoň dvě první nepolypeptidové skupiny, jako 2 až 8 skupin.In addition, it is preferred that the conjugate of this embodiment comprises at least two first non-polypeptide groups, such as 2 to 8 groups.
Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidové část se váže na zbytek cysteinuA conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety binds to a cysteine residue
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu první nepolypeptidovou část konjugovanou k alespoň jednomu cysteinovému zbytku polypeptidu interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v tom, že byl zaveden, s výhodou substitucí, alespoň jeden cysteinový zbytek do polohy, kterou v molekule rodičovského interferonu β zabírá aminokyselinový zbytek, který je vystavený na povrchu molekuly, s výhodou zbytek, který má na povrchu vystaveno alespoň 25 %, jako je alespoň 50 % svého postranního řetězce. Aminokyselinový zbytekIn yet another embodiment, the invention relates to a conjugate with interferon β activity comprising at least one first non-polypeptide moiety conjugated to at least one cysteine residue of an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type interferon β sequence in that it has been introduced, preferably by substitution, at least one cysteine residue at a position that in the parent interferon β molecule occupies an amino acid residue that is exposed on the surface of the molecule, preferably a residue having at least 25%, such as at least 50%, of its side chain. Amino acid residue
·· ·· © · © © • · « • · · · • · · • © · · · · se například volí ze skupiny F8, L9, R11, S12, F15, Q16, Q18, L20, W22, L28, L32, M36, P41, T58, Q64, N65, F67, I83, E85, N86, A89, N90, Y92, H93, H97, T100, L102, E103, L106, M117, L120, H121, R124, G127, R128, L 130, H131, H140, 1145, R147, V148, E149, R152, Y155 a F156 ze SEQ ID No. 2.For example selected from the group F8, L9, R11, S12, F15, Q16, Q18, L20, W22, L28, L32 , M36, P41, T58, Q64, N65, F67, I83, E85, N86, A89, N90, Y92, H93, H97, T100, L102, E103, L106, M117, L120, H121, R124, G127, R128, L 130, H131, H140, 1145, R147, V148, E149, R152, Y155, and F156 of SEQ ID NO. 2.
Navíc nebo alternativně se substituce s výhodou provádí v poloze, která je obsazena zbytkem threoninu nebo šeřinu. Tato poloha se například volí ze skupiny S2, S12, S13, T58, S74, S75, S76, T77, T82, T100, T112, S118, S119, S139, T144 a T161, výhodněji S2, S12, S13, S74, S75, S76, T77, T82, T100, T112, S118, S119, S139 a T144 (postranní řetězec vystavený na povrchu), ještě výhodněji S2, S12, S75, S76, T82, T100, S119 a S139 (na povrchu vystaveno alespoň 25 % postranního řetězce) a ještě výhodněji S12, S75, T82 a T100 (na povrchu vystaveno alespoň 50 % postranního řetězce).Additionally or alternatively, the substitution is preferably carried out at a position occupied by a threonine or serine residue. This position is, for example, selected from the group of S2, S12, S13, T58, S74, S75, S76, T77, T82, T100, T112, S118, S119, S139, T144 and T161, more preferably S2, S12, S13, S74, S75, S76, T77, T82, T100, T112, S118, S119, S139, and T144 (surface-exposed side chain), more preferably S2, S12, S75, S76, T82, T100, S119 and S139 (at least 25% of the side-exposed surface) and more preferably S12, S75, T82, and T100 (exposed to at least 50% of the side chain).
Z výše uvedených substitucí threoninu nebo šeřinu jsou výhodné substituce šeřinu. Podle ještě výhodnějších provedení se poloha volí ze skupiny S2, S12, S13, S74, S75, S76, S118, S119 a S139, výhodněji S2, S12, S13, S74, S75, S76, S118, S119 a S139, ještě výhodněji S2, S12, S75, S76, S119 a S139, a ještě výhodněji S12 a S75. V jednom provedení se do polypeptidu interferonu β vkládá pouze jeden cysteinový zbytek, aby se zabránilo vytvoření disulfidických můstků mezi dvěma nebo více zavedenými cysteinovými zbytky. V této souvislosti může být odstraněn C17 přítomný v lidském interferonu β standardního typu, s výhodou substitucí, zvláště substitucí za S nebo A. V dalším provedení se zavádějí dva nebo více cysteinových zbytků, jako 2 až 6 nebo 2 až 4 cysteinové zbytky. Polypeptidová část interferonu β konjugátu podle tohoto provedení vynálezu obsahuje s výhodou mutaci L47C, Q48C, Q49C, D110C, F111C nebo R113C, zvláště jednu z těchto mutací, popřípadě v kombinaci s mutací C17S. Polypeptid interferonu β může také obsahovat substituci C17S+N80C.Of the above threonine or serine substitutions, serine substitutions are preferred. According to even more preferred embodiments, the position is selected from the group of S2, S12, S13, S74, S75, S76, S118, S119 and S139, more preferably S2, S12, S13, S74, S75, S76, S118, S119 and S139, even more preferably S2, S12, S75, S76, S119 and S139, and more preferably S12 and S75. In one embodiment, only one cysteine residue is inserted into the interferon β polypeptide to prevent the formation of disulfide bridges between two or more introduced cysteine residues. In this context, C17 present in wild-type human interferon β may be removed, preferably by substitution, particularly by substitution with S or A. In another embodiment, two or more cysteine residues, such as 2 to 6 or 2 to 4 cysteine residues, are introduced. The polypeptide portion of the interferon β conjugate of this embodiment of the invention preferably comprises a L47C, Q48C, Q49C, D110C, F111C or R113C mutation, particularly one of these mutations, optionally in combination with a C17S mutation. The interferon β polypeptide may also contain a C17S + N80C substitution.
4 • ·· 99 ·9 994 • 99 99
4 4 9 99 9 94
9 9 · 4 4 4 99 9 4
9 » 9 9 9 9 9 9 9 • 4 444 444 ··· 4444 44 4444 44 44449 »9 9 9 9 9 9 9 • 4444 444 ··· 4444 44 4444 44 4444
I když první nepolypeptidová část podle tohoto provedení vynálezu může být jakákoli molekula, která má s použitím dané metody konjugace jako vazebnou skupinu cystein (jako je karbohydrátová skupina, lipofilní skupina nebo organické derivatizační činidlo), je výhodné, jestliže je nepolypeptidová část molekula polymeru. Molekula polymeru může být jakákoli z molekul uvedených v části nazvané „Konjugace k polymerní molekule“, ale s výhodou se volí ze skupiny přímého nebo rozvětveného polyethylenglykolu nebo polyalkylenoxidu. Nejvýhodněji je molekula polymeru VS-PEG. Konjugace mezi polypeptidem a polymerem může být dosažena jakýmkoli vhodným způsobem, například jak se popisuje v části nazvané „Konjugace k polymerní molekule“, například použitím jednostupňové metody nebo postupně, jak je v uvedené části popsáno. Jestliže polypeptid interferonu β obsahuje pouze jeden konjugovatelný cysteinový zbytek, je s výhodou konjugován k první nepolypeptidové části s molekulovou hmotností alespoň 20 kDa, buď přímo konjugované nebo nepřímo konjugované prostřednictvím polymeru s nízkou molekulovou hmotností (jak se popisuje ve WO 99/55377). Jestliže konjugát obsahuje dvě nebo více prvních nepolypeptidových částí, každá z těchto částí normálně má molekulovou hmotnost 5 nebo 10 kDa.While the first non-polypeptide moiety of this embodiment of the invention may be any molecule having a cysteine (such as a carbohydrate group, a lipophilic group or an organic derivatizing agent) using a given conjugation method, it is preferred that the non-polypeptide moiety is a polymer molecule. The polymer molecule may be any of the molecules listed in the section entitled "Conjugation to a polymer molecule", but is preferably selected from straight or branched polyethylene glycol or polyalkylene oxide. Most preferably, the polymer molecule is VS-PEG. Conjugation between the polypeptide and the polymer can be achieved by any suitable method, for example as described in the section entitled "Conjugation to a polymer molecule", for example using a one-step method or sequentially as described in that section. If the interferon β polypeptide contains only one conjugatable cysteine residue, it is preferably conjugated to a first non-polypeptide moiety of at least 20 kDa, either directly conjugated or indirectly conjugated via a low molecular weight polymer (as described in WO 99/55377). If the conjugate comprises two or more first non-polypeptide moieties, each moiety normally has a molecular weight of 5 or 10 kDa.
Konjugát podle vynálezu, kde se nepolypeptidová část váže na skupinu kyselinyA conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety binds to an acid moiety
V ještě dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje alespoň jednu první polypeptidovou část obsahující skupinu kyseliny jako vazebnou skupinu, přičemž tato část je konjugována k alespoň jednomu zbytku kyseliny asparagové, nebo zbytku kyseliny glutamové polypeptidů interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném a/neboIn yet another embodiment, the invention relates to a conjugate having interferon β activity comprising at least one first polypeptide moiety comprising an acid moiety as a linking moiety, the moiety being conjugated to at least one aspartic acid residue or glutamic acid residue of an interferon β polypeptide having an amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in at least one established and / or
· · · • · • 4 » 4 4 • 4· 4 · 4 4 • 4
44
44
4 4 4 alespoň jednom odstraněném zbytku kyseliny asparagové, popřípadě kyseliny glutamové. Příslušný zbytek aminokyseliny může být vložen v jakékoli poloze obsazené zbytkem aminokyseliny vystaveným na povrchu, s výhodou zbytkem aminokyseliny, který má vystavených více než 25 % svého postranního řetězce. S výhodou je alespoň jeden zbytek aminokyseliny zabírající polohu zvolenou ze skupiny zahrnující N4, L5, L6, F8, L9, Q10, R11, S12, S13, F15, Q16, Q18, K19, L20, W22, Q23, L24, N25, G26, R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49, I66, F67, A68, I69, F70, R71, S75, T82, I83, L87, A89, N90, V91, Y92, H93, Q94, I95, N96, H97, K108, F111, L116, L120, K123, R124, Y126, G127, R128, L130, H131, Y132, K134, A135, H140, T144, R147, Y155, F156, N158, R159, G162, Y163 a R165 substituován zbytkem kyseliny asparagové nebo zbytkem kyseliny glutamové.At least one aspartic acid or glutamic acid residue is removed. The respective amino acid residue may be inserted at any position occupied by an amino acid residue exposed on the surface, preferably an amino acid residue having more than 25% of its side chain exposed. Preferably at least one amino acid residue occupying a position selected from the group consisting of N4, L5, L6, F8, L9, Q10, R11, S12, S13, F15, Q16, Q18, K19, L20, W22, Q23, L24, N25, G26 , R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49, I66, F67, A68, I69, F70, R71, S75, T82, I83, L87, A89, N90, V91, Y92, H93, Q94, I95, N96, H97 , K108, F111, L116, L120, K123, R124, Y126, G127, R128, L130, H131, Y132, K134, A135, H140, T144, R147, Y155, F156, N158, R159, G162, Y163 and R165 aspartic acid or a glutamic acid residue.
S výhodou je tato poloha zvolena ze skupiny N4, L5, F8, L9, R11, S12, F15, Q16, Q18, K19, W22, Q23, G26, R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49, A68, R71, S75, T82, A89, N90, Y92, H93, N96, H97, K108, F111, L116, L120, K123, R124, G127, R128, L130, H131, K134, A135, H140, Y155, N158, R159, G162, Y163 a R165, jako je skupina N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49, R71, S75, T82, A89, Y92, H93, K108, F111, L116, K123, R124, G127, H131, K134, A 135, Y155 a R165, ještě výhodněji ze skupiny zahrnující N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, R27, Y30, Q46, Q48, Q49, S75, T82, A89, Y92, H93, K108, F111, L116, R124, G127, H131, K134, Y155 a R165, jako například skupina zahrnující L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, Q48, Q49, Y92, H93, R124, G127, H131 a Y155, ještě výhodněji skupina S12, Q16, K19, Q23, Q48, Q49, Y92, H93, R124, G127, H131 a Y155, jako je například skupina S12, Q16, K19, Q23, Q48, Y92, H93, R124, G127, H131 a Y155, zvláště skupina zahrnující S12, Q16, K19, Q23, Q48, H93 a H131, ještě výhodněji skupina S12, Q16, K19, Q48, H93 a H31, a nejvýhodněji skupina zahrnující Q16 a Q48.Preferably, this position is selected from N4, L5, F8, L9, R11, S12, F15, Q16, Q18, K19, W22, Q23, G26, R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49, A68, R71, S75, T82, A89, N90, Y92, H93, N96, H97, K108, F111, L116, L120, K123, R124, G127, R128, L130, H131, K134, A135, H140, Y155, N158, R159, G162, Y163 and R165, such as N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, R27, Y30, M36, Q46, Q48, Q49, R71, S75, T82, A89, Y92, H93, K108 , F111, L116, K123, R124, G127, H131, K134, A135, Y155 and R165, more preferably from the group consisting of N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, Q23, R27, Y30, Q46 , Q48, Q49, S75, T82, A89, Y92, H93, K108, F111, L116, R124, G127, H131, K134, Y155 and R165, such as the group comprising L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22 , Q23, Q48, Q49, Y92, H93, R124, G127, H131 and Y155, more preferably S12, Q16, K19, Q23, Q48, Q49, Y92, H93, R124, G127, H131, and Y155, such as S12, Q16, K19, Q23, Q48, Y92, H93, R124, G127, H131 and Y155, especially the group of summarizing S12, Q16, K19, Q23, Q48, H93 and H131, more preferably S12, Q16, K19, Q48, H93 and H31, and most preferably Q16 and Q48.
» • 9 · • 9 9 99 9 9
9 99 9
9 49 4
9 99 9
49944994
99 • 9« 998 • 9 «9
9 49 4
9 9 99 9 9
9 99 9
94999499
Pro získání dostatečného počtu nepolypeptidových skupin je dále výhodné, jestliže se vloží alespoň dva zbytky kyseliny asparagové nebo alespoň dva zbytky kyseliny glutamové, s výhodou ve dvou polohách zvolených z jakýchkoli výše uvedených seznamů. Je také výhodné, jestliže konjugát podle tohoto provedení obsahuje alespoň dvě první nepolypeptidové části.In order to obtain a sufficient number of non-polypeptide groups, it is further preferred that at least two aspartic acid residues or at least two glutamic acid residues are inserted, preferably at two positions selected from any of the above lists. It is also preferred that the conjugate of this embodiment comprises at least two first non-polypeptide moieties.
V případě odstraňování aminokyselinového zbytku se aminokyselinová sekvence polypeptidů interferonu β odlišuje od lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom odstraněném zbytku kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové, jako například v 1 až 5 odstraněných zbytcích, zvláště 1 až 4 nebo 1 až 3 odstraněných zbytcích kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové. Zbytek nebo zbytky, které se mají odstranit, s výhodou jejich náhradou, se volí ze skupiny zahrnující D34, D39, D54, D73, D110, E29, E42, E43, E53, E61, E81, E85, E103, E104, E107, E109, E137 a E149. Zbytek nebo zbytky kyseliny asparagové nebo kyseliny glutamové mohou být nahrazeny zbytkem jakékoli jiné aminokyseliny, ale s výhodou se nahrazují zbytkem argininu nebo glutaminu. První nepolypeptidová část může být jakákoli nepolypeptidová část obsahující skupinu s takovou vlastností, přičemž výhodné je, jestliže je nepolypeptidovou částí molekula polymeru nebo organický derivatizační prostředek obsahující skupinu kyseliny jako vazebnou skupinu, zvláště molekula polymeru jako je PEG, kde konjugát se připravuje například podle popisu uvedeného v Sakane a Pardridge, Pharmceutical Research, díl 14, No. 8, 1997, str. 1085 - 1091. Za normálních okolností má nepolypeptidová část pro konjugaci ke skupině kyseliny molekulovou hmotnost přibližně 5 nebo 10 kDa.In the case of removal of an amino acid residue, the amino acid sequence of interferon β polypeptides differs from wild-type human interferon β in at least one aspartic acid or glutamic acid residue removed, such as 1 to 5 residues removed, especially 1 to 4 or 1 to 3 aspartic acid residues removed. or glutamic acid. The residue or residues to be removed, preferably by replacement thereof, is selected from the group consisting of D34, D39, D54, D73, D110, E29, E42, E43, E53, E61, E81, E85, E103, E104, E107, E109 , E137 and E149. The residue (s) of aspartic acid or glutamic acid may be replaced by any other amino acid residue, but are preferably replaced by an arginine or glutamine residue. The first non-polypeptide moiety may be any non-polypeptide moiety containing a moiety having such a property, preferably the non-polypeptide moiety is a polymer molecule or an organic derivatizing agent containing an acid moiety as a linking group, especially a polymer molecule such as PEG, wherein the conjugate is prepared as described in Sakan and Pardridge, Pharmceutical Research, Vol. 8, 1997, pp. 1085-1091. Normally, the non-polypeptide moiety for conjugation to the acid moiety has a molecular weight of about 5 or 10 kDa.
Konjugát podle vynálezu obsahující druhou nepolypeptidovou částA conjugate of the invention comprising a second non-polypeptide moiety
Navíc k první nepolypeptidové části (jak bylo popsáno v předcházejících částech) může konjugát podle vynálezu obsahovat • ·In addition to the first non-polypeptide moiety (as described in the foregoing sections), the conjugate of the invention may comprise:
• 999 • 9 «9 9• 999 • 9 «9
99
9 • 99 • 9
9 9 9 druhou nepolypeptidovou část odlišného typu ve srovnání s první nepoiypeptidovou částí. S výhodou je v jakémkoli z výše popsaných konjugátů, kde první nepolypeptidovou částí je například molekula polymeru jako je PEG, druhá nepolypeptidová část cukerná část, zvláště cukerná část navázaná přes atom N. I když může být druhá nepolypeptidová část navázána na přirozené glykosylační místo lidského interferonu β, například glykosylační místo navázané přes atom dusíku definované jako N80, je za normálních okolností výhodné zavádět alespoň jedno další glykosylační místo v polypeptidu interferonu β. Takovým místem je například jakékoli místo popsané v bezprostředně následující části s názvem „Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidová část je cukerná část“. Navíc, jestliže se vloží alespoň jedno další glykosylační místo, může se navíc provést odstranění existujícího glykosylačního místa, jak bude popsáno dále.The second non-polypeptide portion of a different type compared to the first non-polypeptide portion. Preferably, in any of the above-described conjugates wherein the first non-polypeptide moiety is, for example, a polymer molecule such as PEG, the second non-polypeptide moiety is a sugar moiety, particularly a sugar moiety bonded through the N atom. β, for example a N-linked glycosylation site defined as N80, it is normally preferred to introduce at least one additional glycosylation site in the interferon β polypeptide. Such a site is, for example, any site described in the immediately following section entitled "Conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety is a sugar moiety". In addition, if at least one additional glycosylation site is inserted, the removal of an existing glycosylation site can be performed as described below.
Je zřejmé, že pro dosažení optimální distribuce navázané první a druhé nepolypeptidové části může být polypeptid interferonu β modifikován vzhledem k počtu a distribuci vazebných skupin pro první, stejně jako pro druhou nepoiypeptidovou část, aby byla získána například alespoň jedna odstraněná vazebná skupina pro první nepolypeptidovou část a alespoň jedna zavedená vazebná skupina pro druhou nepolypeptidovou část nebo naopak. Například polypeptid interferonu β obsahuje alespoň dvě (např. 2 až 5) odstraněné vazebné skupiny pro první nepolypeptidovou část a alespoň jednu (např. 1 až 5) vloženou vazebnou skupinu pro druhou nepolypeptidovou část nebo naopak. Zvláště zajímavý je konjugát, ve kterém je první nepolypeptidová část molekula polymeru jako je PEG obsahující jako vazebnou skupinu lysin, a druhá nepolypeptidová část je cukerná skupina navázaná přes atom dusíku.Obviously, to achieve optimal distribution of the bound first and second non-polypeptide moieties, the interferon β polypeptide may be modified with respect to the number and distribution of the binding moieties for the first as well as the second non-polypeptide moiety to obtain for example at least one removed binding moiety for the first non-polypeptide moiety. and at least one established linking group for the other non-polypeptide moiety or vice versa. For example, an interferon β polypeptide comprises at least two (eg, 2 to 5) deleted binding groups for the first non-polypeptide moiety and at least one (eg, 1 to 5) inserted binding group for the second non-polypeptide moiety, or vice versa. Of particular interest is a conjugate in which the first non-polypeptide moiety is a polymer molecule such as PEG containing lysine as a linking group, and the second non-polypeptide moiety is a sugar moiety attached through a nitrogen atom.
Konjugátem podle vynálezu může být konkrétněji konjugát s aktivitou interferonu β, který současně obsahuje alespoň jednu polymerní molekulu, s výhodou PEG, a alespoň jednu cukernou část φφ φφ φ » φ <More particularly, the conjugate of the invention may be a conjugate with interferon β activity, which at the same time comprises at least one polymer molecule, preferably PEG, and at least one sugar moiety φφ φφ φ »φ <
- 36 »φ φφφφ φφ φφφφ kovalentně navázanou na polypeptid interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v- 36 »φ φφφφ φφ φφφφ covalently bound to an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence in
a) alespoň jednom zavedeném a/nebo alespoň jednom odstraněném aminokyselinovém zbytku obsahujícím vazebnou skupinu pro molekulu polymeru; aa) at least one introduced and / or at least one deleted amino acid residue containing a linker for the polymer molecule; and
b) alespoň jednom zavedeném a/nebo alespoň jednom odstraněném místě glykosylace in vivo, zvláště místě N-glykosylace, za předpokladu, že jestliže je vazebnou skupinou pro molekulu polymeru zbytek cysteinu, a cukerná část je cukerná část navázaná přes atom dusíku, zbytek cysteinu není zaveden takovým způsobem, aby došlo ke zničení místa N-glykosylace. WO 99/03887 navrhuje, že cysteinový zbytek může být vložen do místa přirozené N-glykosylace interferonu β.(b) at least one introduced and / or at least one removed glycosylation site in vivo, particularly an N-glycosylation site, provided that if the polymer molecule binding group is a cysteine residue, and the sugar moiety is a sugar moiety bonded via a nitrogen atom, the cysteine residue is not introduced in such a way as to destroy the N-glycosylation site. WO 99/03887 suggests that a cysteine residue can be inserted into the natural N-glycosylation site of interferon β.
Ve zvláštním provedení obsahuje polypeptid interferonu β jeden z následujících souborů mutací:In a particular embodiment, the interferon β polypeptide comprises one of the following sets of mutations:
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R;K19R + K45R + Q49N + Q51T + F111N + R113T + K123R;
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T; neboK19R + K45R + Q51N + Q51T + F111N + R113T; or
K19R+K45R+Q49N+Q51T+ K123R.K19R + K45R + Q49N + Q51T + K123R
Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidová část je cukerná částThe conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety is a sugar moiety
Jestliže konjugát podle vynálezu obsahuje alespoň jednu cukernou část navázanou na glykosylační místo in vivo, zvláště místo N-glykosylace, jde buď o přírodní místo N-glykosylace lidského interferonu β standardního typu v poloze N80, tj. definované aminokyselinovými zbytky N80, E81, T82 a I83, nebo o nové glykosylační místo in vivo zavedené do polypeptidu interferonu β. Glykosylační místo in vivo může být O-glykosylační místo, ale s výhodou jde o N-glykosylační místo.When the conjugate of the invention comprises at least one sugar moiety linked to an in vivo glycosylation site, particularly an N-glycosylation site, it is either a natural N-glycosylation site of wild-type human interferon β at position N80, ie defined by amino acid residues N80, E81, T82 and I83, or a novel glycosylation site in vivo introduced into an interferon β polypeptide. The in vivo glycosylation site may be an O-glycosylation site, but is preferably an N-glycosylation site.
• · · ·· 4 4 44 4«• · · ·· 4 4 44
4 4 4 · · · 4 φ 4 4 4 • 4·· · · 4 4 >4·· 4444 4 ·· 444 44· • 44 4444 44 4444 44 44444 4 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 4444 4444 444 44 4444 44 4444 44 4444
Jedno provedení vynálezu se konkrétněji týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje polypeptid interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu v alespoň jednom zavedeném místě glykosylace, kde tento konjugát dále obsahuje alespoň jednu nePEGylovanou cukernou část navázanou na zavedené glykosylační místo.More particularly, one embodiment of the invention relates to a conjugate with interferon β activity comprising an interferon β polypeptide having an amino acid sequence different from the wild-type human interferon β sequence at least one introduced glycosylation site, the conjugate further comprising at least one non-PEGylated sugar moiety bound to the introduced glycosylation site.
V dalším provedení se vynález týká konjugátu s aktivitou interferonu β, který obsahuje polypeptid interferonu β, jehož aminokyselinová sekvence se odlišuje od sekvence lidského interferonu β standardního typu tím, že bylo zavedeno nebo odstraněno glykosylační místo, za předpokladu, že jestliže se odstraní pouze jedno glykosylační místo (a žádné glykosylační místo se tedy nevloží), polypeptid interferonu β neobsahuje jednu nebo více z následujících substitucí: N80C, E81C nebo T82C. Naposledy uvedená substituce se navrhuje ve WO 99/03887.In another embodiment, the invention relates to a conjugate with interferon β activity comprising an interferon β polypeptide whose amino acid sequence differs from the wild-type human interferon β sequence by introducing or removing a glycosylation site, provided that if only one glycosylation site is removed site (and therefore no glycosylation site is inserted), the interferon β polypeptide does not contain one or more of the following substitutions: N80C, E81C or T82C. The latter substitution is proposed in WO 99/03887.
Glykosylační místo in vivo se například vkládá do polohy rodičovské molekuly interferonu β obsazené aminokyselinovým zbytkem vystaveným na povrch molekuly, s výhodou s více než 25 % postranního řetězce vystavenými rozpouštědlu, zvláště s více než 50 % vystavenými rozpouštědlu (tyto polohy jsou identifikovány v části „Metody“, dále. N-glykosylační místo se vkládá takovým způsobem, že N-zbytek tohoto místa je umístěn v uvedené poloze. Analogicky se Oglykosylační místo vkládá tak, že v uvedené poloze je umístěn zbytek S nebo T, který vytváří toto místo. Navíc je pro zajištění účinné glykosylace výhodné, aby místo glykosylace in vivo, zvláště N-zbytek místa N-glykosylace nebo zbytek S nebo T místa O-glykosylace bylo umístěno v rámci prvních 141 aminokyselinových zbytků polypeptidu interferonu β, výhodněji v rámci prvních 116 aminokyselinových zbytků. Ještě výhodněji je místo glykosylace zavedeno do polohy, kde se pro vytvoření tohoto místa vyžaduje pouze jedna mutace (tj. kde je »* 44 44 44For example, an in vivo glycosylation site is inserted at the position of the parent interferon β molecule occupied by an amino acid residue exposed to the surface of the molecule, preferably with more than 25% solvent-exposed side chain, particularly more than 50% solvent-exposed positions (these positions are identified in The N-glycosylation site is inserted in such a way that the N-residue of this site is located in said position. By analogy, the O-glycosylation site is inserted such that the S or T residue that forms this site is located in said position. for efficient glycosylation, it is preferred that the in vivo glycosylation site, particularly the N-residue of the N-glycosylation site, or the S or T residue of the O-glycosylation site be located within the first 141 amino acid residues of the interferon β polypeptide, more preferably within the first 116 amino acid residues. more preferably, a glycosylation site is introduced o to a position where only one mutation is required to create this site (ie, where »* 44 44 44
4 4 4 4 4 « • 4 4 4 44 4 4 4 4
4 4 C « 4 « 4 4 4 4 4 •44 44 4444 44 4444 již v molekule přítomen jakýkoli další zbytek aminokyseliny nezbytný pro vytvoření funkčního glykosylačního místa.44 44 4444 44 4444 already present in the molecule any other amino acid residue necessary to create a functional glycosylation site.
Substituce, které vedou k zavedení dalšího N-glykosylačního místa v polohách vystavených na povrchu molekuly interferonu β a obsazených aminokyselinovými zbytky, které mají více než 25 % svého postranního řetězce vystaveného na povrchu, zahrnují následující substituce:Substitutions that result in the introduction of an additional N-glycosylation site at positions exposed to the surface of an interferon β molecule and occupied by amino acid residues having more than 25% of its surface exposed side chain include the following substitutions:
S2N+N4S/T, L6S/T, L5N+G7S/T, F8N+Q10S/T, L9N+R11S/T, R11N, R11N+S13T, S12N+N14S/T, F15N+C17S/T, Q16N+Q18S/T, Q18N+L20S/T, K19N+L21S/T, W22N+L24S/T, Q23N+H25S/T, G26N+L28S/T, R27N+E29S/T, L28S+Y30S/T, Y30N+L32S/T, L32N+D34S/T, K33N+R35S/T, R35N+N37S/T, M36N+F38S/T,S2N + N4S / T, L5N + G7S / T, F8N + Q10S / T, L9N + R11S / T, R11N, R11N + S13T, S12N + N14S / T, F15N + C17S / T, Q16N + Q18S / T, Q18N + L20S / T, W22N + L24S / T, K19N + L21S / T, G26N + L28S / T, G27N + L28S / T, R27N + E29S / T, L28S + Y30S / T, Y30N + L32S / T, L32N + D34S / T, M33N + F38S / T, K33N + R35S / T
D39S/T, D39N+P41S/T, E42N+I44S/T, Q43N+K45S/T, K45N+L47S/T, Q46N+Q48S/T, L47N+Q49T/S, Q48N+F50S/T, Q49N+Q51S/T, Q51N+E53S/T, K52N+D54S/T, L57N+I59S/T, Q64N+I66S/T, A68N+F70S/T, R71N+D73S/T, Q72N, Q72N+S74T, D73N,D39S / T, Q43N + L45S / T, E42N + I44S / T, Q43N + Q47S / T, Q46N + Q48S / T, Q48N + F50S / T, Q49N + Q51S / T T, Q51N + E53S / T, K52N + D54S / T, L57N + I59S / T, Q64N + I66S / T, A68N + F70S / T, R71N + D73S / T, Q72N, Q72N + S74T, D73N,
D73N+S75T, S75N+T77S, S75N, S76N+G78S/T, E81N+I83S/T, T82N+V84S/T, E85N+L87S/T, L88S/T, A89N+V91S/T, Y92S/T, Y92N+Q94S/T, H93N+I95S/T, L98S/T, H97N+K99S/T,D73N + S75T, S75N + G78S / T, E81N + I83S / T, E85N + L87S / T, L88S / T, A89N + V91S / T, Y92S / T, Y92N + Q94S / T, H93N + I95S / T, H97N + K99S / T, L98S / T,
E103N+K105S/T, E104N+L106S/T, T100N+L102S/T,E103N + K105S, T100N + L102S / T
K108N+D110S/T, E109N+F111S/T, D110N+T112S, K105N+E107S/T, E107N+E109S/T, R113N+K115S/T, G114N+L116S/T,K108N + D110S / T, E109N + F111S / T, D110N + T112S, K105N + E107S / T, E107N + E119S / T, G114N + L116S / T,
K115N+M117S/T, L116N, D110N, F111N+R113S/T, L116N+S118T, S119N+H212S/T, L120N+L122S/T, H121N+K123S/T,K115N + M117S / T, L116N, D110N, F111N + R113S / T, L116N + S118T, S119N + H212S / T, L120N + L122S / T, H121N + K123S / T,
K123N+Y125S/T, R124N+Y126S/T, G127N+I129S/T,K123N + Y125S / T, G127N + I129S / T, R124N + Y126S / T,
R128N+L130S/T, L130N+Y132S/T, H131N+L133S/T, K134N+KI36S/T, A135N+EI37S/T, K136N+YI38S/T, E137N, Y138N+HI40S/T, H140N+A142S/T, V148N+I150S/T, R152N+F154S/T, Y155N+I157S/T, L160S/T, R159N+T161S, R59N, G162N+L164S/T a Y163N+R165 S/T.R128N + L130S / T, L130N + Y132S / T, H131N + L133S / T, K134N + KI36S / T, K136N + KI36S / T, K136N + KI36S / T, K136N + KI36S / T V148N + I150S / T, R152N + F154S / T, Y155N + I157S / T, L160S / T, R159N + T161S, R59N, G162N + L164S / T and Y163N + R165 S / T.
Substituce, které vedou k zavedení dalšího N-glycosylačního místa v polohách vystavených na povrchu molekuly interferonu β, • 4 4 * 4 ····Substitutions that lead to the introduction of an additional N-glycosylation site at positions exposed to the surface of the interferon β molecule, • 4 4 * 4 ····
4 4 4 « 4 44 4 4
4444 444 4 44443 444 4 4
4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 5
444 44 494« 44 4444 které mají více než 50 % svého postranního řetězce vystaveného na povrchu, zahrnují:444 44 494 «44 4444 having more than 50% of their surface exposed side chain include:
L6S/T, L5N+G7S/T, F8N+Q10S/T, L9N+R11S/T, S12N+N14S/T, F15N+C17S/T, Q16N+Q18S/T, K19N+L21S/T, W22N+L24S/T, Q23N+H25S/T, G26N+L28S/T, R27N+E29S/T, Y30N+L32S/T, K33N+R35S/T, R35N+N37S/T, M36N+F38S/T, D39S/T,L6S / T, L9N + R11S / T, F15N + C17S / T, L16N + Q18S / T, L19N + L21S / T, W22N + L24S / T T, Q23N + H25S / T, G26N + L28S / T, R27N + E29S / T, Y30N + L32S / T, K33N + R35S / T, M35N + F38S / T, M36N + F38S / T,
D39N+P41S/T, E42N+I44S/T, Q46N+Q48S/T, Q48N+F50S/T, Q49N+Q51S/T, Q51N+E53S/T, K52N+D54S/T, L57N+I59S/T, R71N+D73S/T, D73N, D73N+S75T, S75N+T77S, S75N,D39N + P41S / T, Q42N + I44S / T, Q46N + Q48S / T, Q48N + Q50S / T, Q49N + Q51S / T, Q52N + D54S / T, L57N + I59S / T, R71N + D73S / T, D73N, D73N, S75N, S75N, S75N,
S76N+G78S/T, E81N+I83S/T, T82N+V84S/T, E85N+L87S/T, A89N+V91S/T, Y92S/T, Y92N+Q94S/T, H93N+I95S/T,S76N + G78S / T, E81N + I83S / T, E82N + V84S / T, E85N + L87S / T, A89N + V91S / T, Y92N + Q94S / T, H93N + I95S / T,
T100N+L102S/T, E103N+K105S/T, K108N+D110S/T, D110N+T112S, D110N, E104N+L106S/T, E107N+E109S/T, F11N+R113S/T, R113N+K115S/T, L116N, L116N+S118T, K123N+Y125S/T, R124N+Y126S/T, G127N+I129S/T, H131N+L133S/T,T100N + L102S / T, E103N + K105S / T, K108N + D110S / T, D110N + T112S, D110N, E104N + L106S / T, E107N + E109S / T, F11N + R113S / T L116N + S118T, K123N + Y125S / T, R124N + Y126S / T, G127N + I129S / T, H131N + L133S / T,
K134N+K136S/T, A135N+E137S/T, E137N,E137N, V148N+I150S/T a Y155N+I157S/T.K134N + K136S / T, A135N + E137S / T, E137N, E137N, V148N + I150S / T and Y155N + I157S / T.
Mezi substitucemi uvedenými ve výše uvedených seznamech jsou uvedeny takové substituce, ve kterých je N-zbytek zavedený mezi 141 N-koncové aminokyselinové zbytky, zvláště mezi 116 N-koncové aminokyselinové zbytky.Among the substitutions listed above, those substitutions are mentioned in which the N-residue is introduced between 141 N-terminal amino acid residues, especially between 116 N-terminal amino acid residues.
Substituce, které vedou k zavedení N-glykosylačního místa použitím pouze jedné substituce aminokyseliny, zahrnují: L6S/T, R11N, D39S/T, Q72N, D73N, S75N, L88S/T, Y92S/T, L98S/T, D110N, L116N, E137N, R159N a L160S/T. Mezi těmito substitucemi je výhodná substituce zvolená ze skupiny L6S/T, R11N, D39S/T, Q72N, D73N, S75N, L88S/T, Y92S/T, L98S/T, D110N a L116N, výhodněji ze skupiny L6S/T, D39S/T, D73N, S75N, L88S/T, D110N, L116N a E137N; a nejvýhodněji ze skupiny L6S/T, D39S/T, D73N, S75N, L88S/T, D110N a L116N.Substitutions that lead to the introduction of an N-glycosylation site using only one amino acid substitution include: L6S / T, R11N, D39S / T, Q72N, D73N, S75N, L88S / T, Y92S / T, L98S / T, D110N, L116N, E137N, R159N and L160S / T. Among these substitutions, a substitution selected from L6S / T, R11N, D39S / T, Q72N, D73N, S75N, L88S / T, Y92S / T, L98S / T, D110N and L116N, more preferably L6S / T, D39S /, is preferred. T, D73N, S75N, L88S / T, D110N, L116N and E137N; and most preferably from L6S / T, D39S / T, D73N, S75N, L88S / T, D110N and L116N.
V současnosti nejvýhodnější polypeptid interferonu β podle tohoto provedení obsahuje alespoň jednu z následujících substitucí:Currently, the most preferred interferon β polypeptide of this embodiment comprises at least one of the following substitutions:
S2N+N4T/S, L9N+R11T/S, R11N, S12N+N14T/S,S2N + N4T / S, L9N + R11T / S
F15N+C17S/T, Q16N+Q18T/S, K19N+L21T/S, Q23N+H25T/S, G26N+L28T/S, R27N+E29T/S, L28N+Y30T/S, D39T/S, K45N+L47T/S, Q46N+Q48T/S, Q48N+F50T/S, Q49N+Q51T/S, Q51N+E53T/S, R71N+D73T/S, Q72N, D73N, S75N, S76N+G78T/S, L88T/S, Y92T/S, N93N+I95T/S, L98T/S, E103N+K105T/S, E104N+L106T/S, E107N+E109T/S, K108N+D110T/S, D110N, F111N+R113T/S, nebo L116N, výhodněji alespoň jednu z následujících substitucí: S2N+N4T, L9N+R11T, 49N+Q51T nebo F111N+R113T nebo R71N+D73T, zvláště 49N+Q51T nebo F111N+R113T nebo R71N+D73T. Polypeptid interferonu β obsahuje například jeden z následujících souborů substituentů:F15N + C17S / T, K19N + L21T / S, K27N + L21T / S, G26N + L28T / S, R27N + E29T / S, L28N + Y30T / S, K45N + L47T / S S, Q46N + Q48T / S, Q49N + Q51T / S, Q71N + D73T / S, Q71N + D73T / S, Q72N, D73N, S75N, S76N + G78T / S, L92T / S, Y92T / S, N93N + I95T / S, E103N + K105T / S, E104N + L106T / S, E107N + E109T / S, K108N + D110T / S, D110N, F111N + R113T / S, or more preferably at least one among the following substitutions: S2N + N4T, L9N + R11T, 49N + Q51T or F111N + R113T or R71N + D73T, especially 49N + Q51T or F111N + R113T or R71N + D73T. For example, the interferon β polypeptide contains one of the following sets of substituents:
Q49N+Q61T+F111N+R113T;Q49N + Q61T + F111N;
Q49N+Q51T+R71N+D73T+ F111N+ R113T;Q49N + Q51T + R73N + D73T + F111N + R113T;
S2N+N4T+ F111N+R113T;S2N + N4T + F111N + R113T;
S2N+N4T+Q49N+Q51T;S2N + N4T + Q49N + Q51T;
S2N+N4T+Q49N+Q51T+F111N+R113T;S2N + N4T + Q51N + Q51T + F111N + R113T;
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T;S2N + N4T + L9N + R11T + Q49N + Q51T;
S2N+N4T+L9N+R11T+F111N+R113T;S2N + N4T + L9N + R11T;
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T;S2N + N4T + L9N + R11T + Q49N + Q51T + F111N + R113T;
L9N+R11T+Q49N+Q51T;L9N + R11T + Q49N + Q51T;
L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T; neboL9N + R11T + Q51N + Q51T + F111N + R113T; or
L9N+R11T+F111N+R113T.L9N + R11T + F111N + R113T
Je třeba rozumět, že pro zavedení funkčního glykosylačního místa in vivo je aminokyselinový zbytek mezi N-zbytkem a zbytkem S/T odlišný od prolinu. Za normálních okolností bude mezilehlým aminokyselinlovým zbytkem takový zbytek, který obsadí příslušnou polohu v aminokyselinové sekvenci ukázané v SEQ ID No. 2.It will be understood that to introduce a functional glycosylation site in vivo, the amino acid residue between the N-residue and the S / T residue is different from proline. Normally, the intermediate amino acid residue will be one that occupies the appropriate position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2.
• ·• ·
Například u polypeptidu obsahujícího substituce Q49N+Q51S je mezilehlou polohou poloha 50.For example, in a polypeptide containing Q49N + Q51S substitutions, the intermediate position is position 50.
Polypeptidová část interferonu β konjugátu podle vynálezu může obsahovat jedno glykosylační místo in vivo. Pro získání účinného stínění epitopů přítomných na povrchu rodičovského polypeptidu je však Často žádoucí, aby polypeptid obsahoval více než jedno glykosylační místo in vivo, zvláště 2 až 7 glykosylačních míst in vivo, jako například 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 glykosylačních míst in vivo. Polypeptid interferonu β tedy může obsahovat jedno další glykosylační místo, nebo může obsahovat dvě, tři, čtyři, pět, šest, sedm nebo více zavedených glykosylačních míst in vivo, s výhodou zavedených jednou nebo více substitucemi popsanými v některém z výše uvedených seznamů.The polypeptide portion of the interferon β conjugate of the invention may comprise a single glycosylation site in vivo. However, to obtain effective shielding of epitopes present on the surface of the parent polypeptide, it is often desirable for the polypeptide to contain more than one glycosylation site in vivo, particularly 2 to 7 in vivo glycosylation sites such as 2, 3, 4, 5, 6 or 7 glycosylation sites. in vivo. Thus, the interferon β polypeptide may comprise one additional glycosylation site, or may contain two, three, four, five, six, seven, or more in vivo glycosylation sites introduced, preferably introduced by one or more of the substitutions described in any of the above lists.
Jak je uvedeno výše, navíc k jednomu nebo více zavedeným glykosylačním místům mohou být z polypeptidu interferonu β odstraněna existující glykosylační místa. Například kterákoli z výše uvedených substitucí pro zavedení glykosylačního místa může být kombinována se substitucí pro odstranění přírodního N-glykosylačního místa lidského interferonu β standardního typu. Například polypeptid interferonu β může obsahovat substituci polohy N80, například jednu ze substitucí N80K/C/D/E, jestliže prvním nepolypeptidovým polypeptidem je molekula, která obsahuje jako vazebnou skupinu jeden ze zbytků K, C, D, E. Polypeptid interferonu β může například obsahovat alespoň jednu z následujících substitucí:As mentioned above, in addition to one or more established glycosylation sites, existing glycosylation sites may be removed from the interferon β polypeptide. For example, any of the above substitutions for the introduction of a glycosylation site may be combined with a substitution for removal of the wild-type wild type N-glycosylation site of human interferon β. For example, an interferon β polypeptide may comprise a N80 position substitution, for example one of N80K / C / D / E substitutions, if the first non-polypeptide polypeptide is a molecule that contains one of K, C, D, E as a linking group. contain at least one of the following substitutions:
S2N+N4T/S, L9N+R11T/S, R11N, S12N+N14T/S,S2N + N4T / S, L9N + R11T / S
F15N+C17S/T, Q16N+Q18T/S, K19N+L21T/S, Q23N+H25T/S, G26N+L28T/S, R27N+E29T/S, L28N+Y30T/S, D39T/S, K45N+L47T/S, Q46N+Q48T/S, Q48N+F50T/S, Q49N+Q51T/S, Q51N+E53T/S, R71N+D73T/S, Q72N, D73N, S75N, S76N+G78T/S, L88T/S, Y92T/S, N93N+I95T/S, L98T/S, E103N+K105T/S, E104N+L106T/S, E107N+E109T/S, K108N+D110T/S, D110N, F111N+R113T/S, nebo » ·F15N + C17S / T, K19N + L21T / S, K27N + L21T / S, G26N + L28T / S, R27N + E29T / S, L28N + Y30T / S, K45N + L47T / S S, Q46N + Q48T / S, Q49N + Q51T / S, Q71N + D73T / S, Q71N + D73T / S, Q72N, D73N, S75N, S76N + G78T / S, L92T / S, Y92T / S, N93N + I95T / S, E103N + K105T / S, E104N + L106T / S, E107N + E109T / S, K108N + D110T / S, D110N, F111N + R113T / S, or »·
L116N v kombinaci s N80K/C/D/E. Polypeptid interferonu β může výhodněji obsahovat substituci: Q49N+Q51T nebo F111N+R113T nebo R71N+D73T, zvláště Q49N+Q51T+F111N+R113T nebo Q49N+Q51T+R71N+D73T+ F111N+ R113T v kombinaci s N80K/C/D/E.L116N in combination with N80K / C / D / E. More preferably, the interferon β polypeptide may comprise the substitution: Q49N + Q51T or F111N + R113T or R71N + D73T, particularly Q49N + Q51T + F111N + R113T or Q49N + Q51T + R71N + D73T + F111N + R113T in combination with N80K / C / D / E / E.
Kterákoli z glykosylovaných variant popsaných v této části se zavedeným a/nebo odstraněným alespoň jedním glykosylačním místem, jako je varianta obsahující substituce Q48N+F50T/S, Q48N+F50T/S+F111N+R113T/S, Q49N+Q51T/S, F111N+R113T/S, nebo Q49N+Q51T/S+F111N+R113T/S, může být dále konjugována s polymerní molekulou jako je PEG, nebo s jakoukoli jinou nepolypeptidovou částí. Pro tento účel může být konjugace dosaženo použitím vazebných skupin, které jsou již přítomny v polypeptidu interferonu β, nebo mohou být zavedeny a/nebo odstraněny vazebné skupiny, zvláště tak, že pro konjugaci je k dispozici celkem 1 až 6, zvláště 3 až 4 nebo 1,2,3, 4, 5 nebo 6 vazebných skupin. V konjugátu podle vynálezu, kde polypeptid interferonu β obsahuje dvě glykosylační místa, se počet a molekulová hmotnost nepolypeptidové části s výhodou volí tak, aby celková molekulová hmotnost přidaná nepolypeptidovou částí byla v rozmezí 20 až 40 kDa, zvláště přibližně 20 kDa nebo 30 kDa.Any of the glycosylated variants described in this section with at least one glycosylation site introduced and / or removed, such as a variant containing substitutions Q48N + F50T / S, Q48N + F50T / S + F111N + R113T / S, Q49N + Q51T / S, F111N + R113T / S, or Q49N + Q51T / S + F111N + R113T / S, may further be conjugated to a polymer molecule such as PEG or any other non-polypeptide moiety. For this purpose, conjugation may be achieved using binding groups that are already present in the interferon β polypeptide, or binding groups may be introduced and / or removed, in particular such that a total of 1 to 6, in particular 3 to 4, are available for conjugation, or 1,2,3, 4, 5 or 6 linking groups. In a conjugate of the invention wherein the interferon β polypeptide comprises two glycosylation sites, the number and molecular weight of the non-polypeptide moiety is preferably selected such that the total molecular weight added by the non-polypeptide moiety is in the range of 20 to 40 kDa, particularly about 20 kDa or 30 kDa.
Gyikosylovaná varianta může být zvláště konjugována s nepolypeptidovou skupinou prostřednictvím lysinové vazebné skupiny, a jeden nebo více lysinových zbytků rodičovského polypeptidu může být odstraněno, například jakoukoli ze substitucí uvedených v části nazvané „Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidová část je molekula, která má jako vazebnou skupinu lysin“, zvláště substitucí K19R+K45R+K123R. Alternativně nebo navíc může býtlysinový zbytek zaveden například kteroukoli ze substitucí uvedených v popsané části, zvláště substitucí R71K. Konkrétním konjugátem podle vynálezu je tedy například konjugát, který obsahuje glykosylovaný polypeptid • 4 • · 44 4 ♦ · * · · 4 »4 4444 interferonu β obsahující mutace Q49N + Q51T + F111N + R113T + K19R + K45R + K123R nebo Q49N + Q51T + F111N + R113T + K19R + K45R + K123R + R71K, který je dále konjugovaný k PEG. Glykosylovaná peptidová část uvedeného konjugátu je s výhodou produkována v buňkách CHO a PEGylována po vyčištění použitím materiálů SS-PEG, NPC-PEG, aldehyd-PEG, mPEG-SPA, mPEGSCM, mPEG-BTC firmy Shearwater Polymers, lne., SC-PEG firmy Enzon, lne., tresylovaného mPEG popsaného v US 5,880,255 nebo materiálu oxykarbonyl-oxy-N-dikarboxyimid-PEG (US 5,122,614).In particular, the gycosylated variant may be conjugated to a non-polypeptide moiety through a lysine linking moiety, and one or more lysine residues of the parent polypeptide may be removed, for example, by any of the substitutions listed in the "Conjugate of the invention" lysine ', especially by substitution K19R + K45R + K123R. Alternatively or additionally, the lysine moiety may be introduced, for example, by any of the substitutions mentioned in the described section, particularly by substitution of R71K. Thus, a particular conjugate of the invention is, for example, a conjugate that contains a glycosylated polypeptide of 4444 interferon β containing mutations Q49N + Q51T + F111N + R113T + K19R + K45R + K123R or Q49N + Q51T + F111N + R113T + K19R + K45R + K123R + R71K, which is further conjugated to PEG. The glycosylated peptide portion of said conjugate is preferably produced in CHO cells and PEGylated after purification using SS-PEG, NPC-PEG, aldehyde-PEG, mPEG-SPA, mPEGSCM, mPEG-BTC from Shearwater Polymers, Inc., SC-PEG Enzone, Inc, of tresylated mPEG described in US 5,880,255 or oxycarbonyloxy-N-dicarboxyimide-PEG (US 5,122,614).
Alternativně k PEGylaci prostřednictvím lysinové skupiny může být glykosylovaný konjugát podle tohoto provedení PEGylován prostřednictvím skupiny cysteinu, jak je popsáno v části nazvané „Konjugát podle vynálezu, kde nepolypeptidová část je molekula, která má jako vazebnou skupinu cystein“ (pro tento účel může polypeptid interferonu β obsahovat například alespoň jednu z mutací N80C, R71C a C17S), prostřednictvím skupiny kyseliny jak bylo popsáno v části nazvané „Konjugace podle vynálezu, kde nepolypeptidová část se váže na skupinu kyseliny“, nebo prostřednictvím jakékoli jiné vhodné skupiny.Alternatively to PEGylation via a lysine moiety, the glycosylated conjugate of this embodiment may be PEGylated via a cysteine moiety as described in the section entitled "Conjugate of the invention wherein the non-polypeptide moiety is a molecule having a cysteine binding group" (for this purpose, the interferon β polypeptide contain, for example, at least one of the mutations N80C, R71C and C17S), through an acid group as described in the section entitled "Conjugation of the invention wherein the non-polypeptide moiety binds to an acid group" or through any other suitable group.
Další konjugáty podle vynálezuOther conjugates of the invention
Navíc ke zavedení a/nebo odstranění aminokyselinových zbytků obsahujících vazebnou skupinu pro zvolenou nepolypeptidovou část (jak je popsáno v kterékoli z výše uvedených částí nazvaných „Konjugát podle vynálezu...“) může polypeptidová část interferonu β konjugátu obsahovat další substituce. Výhodný příklad je substituce kteréhokoli ze zbytků M1, C17, N80 nebo V101, například jedna nebo více z následujících substitucí: C17S; N80K/C/D/E; V101Y/W/F/, H; delece M1; nebo M1K. Substituce M1K je zvláště zajímavá, jestliže je polypeptid interferonu β exprimován s navázanou značkovací sekvencíIn addition to introducing and / or removing amino acid residues containing a linking moiety for a selected non-polypeptide moiety (as described in any of the aforementioned sections entitled "Conjugate of the Invention ..."), the polypeptide portion of the interferon β conjugate may contain additional substitutions. A preferred example is the substitution of any of the moieties M1, C17, N80 or V101, for example one or more of the following substitutions: C17S; N80K / C / D / E; V101Y / W / F / H; deletion M1; or M1K. The M1K substitution is of particular interest when the interferon β polypeptide is expressed with a linked marker sequence
(tag), např. His-14tag, kde tato značkovací sekvence se odstraňuje DAP (diaminopeptidáza) po vyčištění a/nebo konjugaci.(tag), eg His-14tag, wherein the tagging sequence is removed by DAP (diaminopeptidase) after purification and / or conjugation.
Nepolypeptidová část konjugátu podle vynálezuThe non-polypeptide portion of the conjugate of the invention
Jak bylo uvedeno výše, nepolypeptidová část konjugátu podle vynálezu se s výhodou volí ze skupiny zahrnující polymemi molekulu, lipofilní sloučeninu, cukernou část (prostřednictvím glykosylace in vivo) a organické derivatizační činidlo. Všechny tyto látky mohou polypeptidové části konjugátu propůjčovat požadované vlastnosti, zvláště sníženou imunogenicitu a/nebo zvýšený funkční poločas in vivo a/nebo zvýšený poločas v séru. Polypeptidová část konjugátu může být konjugována s pouze jedním typem nepolypeptidové části, ale může být také konjugována s dvěma nebo více odlišnými typy nepolypeptidových částí, například k polymemi molekule a cukerné části, k lipofilní skupině a cukerné části, k organickému derivatizačnímu činidlu a cukerné části, k lipofilní skupině a polymemi molekule atd. Konjugace dvou nebo více různých nepolypeptidových částí může být prováděna současně nebo postupně. Volba nepolypeptidové části nebo částí například závisí na účinku, který je od konjugace požadován. Například bylo zjištěno, že cukerné části jsou zvláště vhodné pro snížení imunogenicity, zatímco polymemi molekuly jako je PEG mají zvláštní význam pro zvýšení funkčního poločasu in vivo a/nebo poločasu v séru. Použitím polymemi molekuly jako první nepolypeptidové části a cukerné skupiny jako druhé nepolypeptidové části může vést ke snížení imunogenicity a zvýšení funkčního poločasu in vivo nebo poločasu v séru.As noted above, the non-polypeptide portion of the conjugate of the invention is preferably selected from the group consisting of a polymer molecule, a lipophilic compound, a sugar moiety (via in vivo glycosylation) and an organic derivatizing agent. All of these may confer the desired properties to the polypeptide portions of the conjugate, in particular reduced immunogenicity and / or increased in vivo half-life and / or increased serum half-life. The polypeptide moiety of the conjugate may be conjugated to only one type of non-polypeptide moiety, but may also be conjugated to two or more different types of non-polypeptide moieties, e.g., polymers of the molecule and sugar moiety, lipophilic moiety and sugar moiety, organic derivatizing agent and sugar moiety, to a lipophilic moiety and a polymer molecule, etc. The conjugation of two or more different non-polypeptide moieties may be performed simultaneously or sequentially. For example, the selection of the non-polypeptide moiety or moieties depends on the effect desired from conjugation. For example, sugar moieties have been found to be particularly useful for reducing immunogenicity, while polymer molecules such as PEG are of particular importance for increasing the functional in vivo and / or serum half-lives. Using polymer molecules as the first non-polypeptide moiety and a sugar moiety as the second non-polypeptide moiety may result in reduced immunogenicity and increased functional half-life in vivo or serum half-life.
Metody přípravy konjugátu podle vynálezuMethods for preparing the conjugate of the invention
V následujících částech „Konjugace k lipofilní sloučenině“, „Konjugace k polymemi molekule“, „Konjugace k cukerné skupině“ a ·· ·· ·· ·· ···· · * » · • · · · · · • · · · · · ·· ···· ·· ···· „Konjugace k organickému derivatizačnímu činidlu“ se popisují specifické typy nepolypeptidových částí.In the following sections "Conjugation to a lipophilic compound", "Conjugation to a polymer molecule", "Conjugation to a sugar moiety" and "· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · "Conjugation to an organic derivatizing agent" describes specific types of non-polypeptide moieties.
Konjugace k lipofilní sloučeniněConjugation to lipophilic compound
Pro konjugaci k lipofilní sloučenině mohou jako vazebno skupiny fungovat následující polypeptidové skupiny: N-koncová nebo Ckoncová skupina polypeptidu, hydroxylové skupiny aminokyselinových zbytků Ser, Thr nebo Tyr, ε-aminoskupina Lys, skupina SH, Cys nebo karboxylová skupina Asp a Glu. Polypeptid a lipofilní sloučenina mohou být vzájemně konjugovány buď přímo, nebo použitím propojovací skupiny (linkeru). Lipofilní sloučenina může být přírodní sloučenina, jako je nasycená nebo nenasycená mastná kyselina, diketon mastné kyseliny, terpen, prostaglandin, vitamin, karotenoid nebo steroid, nebo syntetická sloučenina jako je karboxylová kyselina, alkohol, aminová a sulfonová kyselina s jedním nebo více alkylovými, arylovými, alkenylovými nebo jinými vícenásobně nenasycenými substituenty. Konjugace mezi polypeptidem a lipofilní sloučeninou, popřípadě prostřednictvím propojovací skupiny, může být prováděna způsoby známými v oboru, například jak se popisuje v Bodanszky v Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 a ve WO 96/12505.For conjugation to a lipophilic compound, the following polypeptide moieties may function as binding moieties: the N-terminal or C-terminal moiety of the polypeptide, the hydroxyl groups of the amino acid residues Ser, Thr or Tyr, the ε-amino group Lys, SH, Cys or carboxyl group Asp and Glu. The polypeptide and the lipophilic compound may be conjugated to each other either directly or by using a linker. The lipophilic compound may be a natural compound such as a saturated or unsaturated fatty acid, a fatty acid diketone, terpene, prostaglandin, vitamin, carotenoid or steroid, or a synthetic compound such as a carboxylic acid, alcohol, amine and sulfonic acid with one or more alkyl, aryl , alkenyl or other polyunsaturated substituents. Conjugation between the polypeptide and the lipophilic compound, optionally via a linker group, can be performed by methods known in the art, for example as described in Bodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 and in WO 96/12505.
Konjugace k polymerní molekuleConjugation to a polymer molecule
Polymerní molekula, která se váže na polypeptid, může být jakákoli vhodná molekula polymeru, jako je přírodní nebo syntetický homopolymer nebo heteropolymer, typicky s molekulovou hmotností v rozmezí od 300 do 100 000 Da, jako je 300 až 20 000 Da, výhodněji v rozmezí od 500 do 10 000 Da, ještě výhodněji v rozmezí od 500 do 5000 Da.The polymer molecule that binds to the polypeptide may be any suitable polymer molecule, such as a natural or synthetic homopolymer or heteropolymer, typically having a molecular weight in the range of 300 to 100,000 Da, such as 300 to 20,000 Da, more preferably in the range of 500 to 10,000 Da, even more preferably in the range of 500 to 5000 Da.
Příklady homopolymerů zahrnují polyol (tj. poly-OH sloučeninu), polyamin (řj. poly-NH2 sloučeninu) a polykarboxylovou kyselinu (tj.Examples of homopolymers include a polyol (i.e., a poly-OH compound), a polyamine (i.e., a poly-NH2 compound), and a polycarboxylic acid (i.e. a poly-OH2 compound).
poly-COOH sloučeninu). Heteropolymer znamená polymer, který obsahuje jednu nebo více rozdílných vazebných skupin, jako je například hydroxylová skupina a aminová skupina.poly-COOH compound). Heteropolymer means a polymer that contains one or more different linking groups, such as a hydroxyl group and an amino group.
Mezi příklady vhodných polymerních molekul patří polymerní molekuly zvolené ze skupiny polyalkylenoxid (PAO) včetně polyalkylenglykolu (PAG), jako je polyethylenglykol (PEG) a polypropylenglykol (PPG), rozvětvené PEG, polyvinylalkohol (PVA), polykarboxylát, poly(vinylpyrolidon), kopolymer polyethylen- anhydrid kyseliny maleinové, kopolymer polystyren-anhydrid kyseliny jablečné, dextran obsahující vazby karboxymethyl-dextran, nebo jakýkoli jiný biopolymer vhodný pro snížení imunogenicity a/nebo zvýšení funkčního poločasu in vivo a/nebo poločasu v séru. Další příklad polymerní molekuly je lidský albumin nebo jiné proteiny, které jsou přítomny ve větším množství v plasmě. Polymery odvozené od polyalkylenglykolu jsou obecně biologicky kompatibilní, netoxické, neantigenní, neimunogenní, mají různé vlastnosti z hlediska rozpustnosti ve vodě a jsou snadno vylučovány z živých organismů.Examples of suitable polymer molecules include polymer molecules selected from the group of polyalkylene oxide (PAO) including polyalkylene glycol (PAG) such as polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol (PPG), branched PEG, polyvinyl alcohol (PVA), polycarboxylate, poly (vinylpyrrolidone), polyethylene copolymer maleic anhydride, polystyrene-malic anhydride copolymer, dextran containing carboxymethyl-dextran bonds, or any other biopolymer suitable to reduce immunogenicity and / or increase the functional in vivo and / or serum half-life. Another example of a polymer molecule is human albumin or other proteins that are present in large quantities in plasma. Polymers derived from polyalkylene glycol are generally biocompatible, non-toxic, non-antigenic, non-immunogenic, have different water solubility properties, and are readily secreted from living organisms.
PEG je výhodná použitelná polymerní molekula, protože obsahuje pouze několik reaktivních skupin schopných zesítění, ve srovnání například s polysacharidy jako je dextran apod. Zajímavý je zvláště monofunkční PEG, například monomethoxypolyethylenglykol (mPEG), protože podléhá jednoduchým vazebným chemickým reakcím (pro konjugaci s vazebnými skupinami na polypeptidů je dostupná pouze jedna reaktivní skupina). Riziko zesítění je tedy odstraněno, získané polypeptidové konjugáty jsou homogennější a reakce polymerních molekul s polypeptidem může být snadněji řízena.PEG is a preferred useful polymer molecule because it contains only a few reactive groups capable of crosslinking compared to, for example, polysaccharides such as dextran and the like. Monofunctional PEG such as monomethoxypolyethylene glycol (mPEG) is particularly interesting because it undergoes simple chemical bonding reactions (for conjugation with linking groups) only one reactive group is available per polypeptide). Thus, the risk of crosslinking is eliminated, the obtained polypeptide conjugates are more homogeneous, and the reaction of the polymer molecules with the polypeptide can be more easily controlled.
Aby bylo možno uskutečnit kovalentní vazbu polymerní molekuly nebo molekul na polypeptid, hydroxylové koncové skupiny polymerní molekuly musí být přítomny v aktivované formě, tj. s reaktivními funkčními skupinami (jejichž příklady zahrnují primární aminové skupiny, hydrazid (HZ), thiol, sukcinát (SUC), sukcinimidylsukcinátIn order to effect covalent binding of the polymer molecule or molecules to the polypeptide, the hydroxyl end groups of the polymer molecule must be present in activated form, i.e. with reactive functional groups (examples include primary amino groups, hydrazide (HZ), thiol, succinate (SUC) , succinimidyl succinate
4· 4· ·· 44 • · 4 44 · 4 · ··
4 · • · 4 4 4 *4 · • · 4
4444 44 4444 (SS), sukcinimidylsukcinamid (SSA), sukcinimidylpropionát (SPA), sukcinimidylkarboxymethylát (SCM), benzotriazolkarbonát (BTC), Nhydroxysukcinimid (NHS), aldehyd, nitrofenylkarbonát (NPC), a tresylát (TŘES)). Vhodně aktivované polymerní molekuly jsou komerčně dostupné, například od firmy Shearwater Polymers, lne., Huntsville, AL, USA. Polymerní molekuly mohou být alternativně aktivovány běžnými metodami známými v oboru, například jak se popisuje ve WO 90/13540. Konkrétní příklady aktivovaných přímých nebo rozvětvených molekul polymerů pro použití podle předkládaného vynálezu se popisují v katalozích 1997 a 2000 firmy Shearwater Polymers, lne. (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylen Glycol and Derivatives), které se zahrnují odkazem. Specifické příklady aktivovaných polymerů PEG zahrnují následující lineární PEG: NHS-PEG (např. SPA-PEG, SSPAPEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG a SCM-PEG), a NOR-PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDIPEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG a MAL-PEG, a rozvětvené PEG jako PEG2-NHS a látky popisované v US 5,932,462 a US 5,643,575, které jsou oba zařazeny odkazem. Použitelné polymerní molekuly a/nebo chemické sloučeniny využitelné pro PEGylaci jsou dále popisovány v následujících publikacích, které se zařazují odkazem: US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 a EP 154 316.4444 44 4444 (SS), succinimidyl succinamide (SSA), succinimidyl propionate (SPA), succinimidyl carboxymethyl (SCM), benzotriazol carbonate (BTC), N-hydroxy succinimide (NHS), aldehyde, nitrophenyl carbonate (NPC), and tresylate (TES). Appropriate activated polymer molecules are commercially available, for example, from Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA. Alternatively, the polymer molecules may be activated by conventional methods known in the art, for example as described in WO 90/13540. Specific examples of activated linear or branched polymer molecules for use in the present invention are described in the catalogs 1997 and 2000 of Shearwater Polymers, Inc. (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and Pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives), which are incorporated by reference. Specific examples of activated PEG polymers include the following linear PEGs: NHS-PEG (e.g., SPA-PEG, SSPAPEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, and SCM-PEG), and NOR- PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDIPEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, and MAL-PEG, and branched PEG such as PEG2-NHS and substances disclosed in US 5,932,462 and US 5,643,575, both of which are incorporated by reference. Useful polymer molecules and / or chemical compounds useful for PEGylation are further described in the following publications which are incorporated by reference: US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5,122,614, US No. 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95 / WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95 / 06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510,356, EP 400,472, EP 183,503 and EP 154,316.
• · · · · · ·· ···· · · ····• · · · · · ···· · · ····
Konjugace polypeptidu a aktivovaných molekul polymeru se provádí jakýmkoli vhodným způsobem, například jak se popisuje v následujících odkazech (které také popisují vhodné metody pro aktivaci polymerních molekul): Harris a Zalípsky, ed.,The conjugation of the polypeptide to the activated polymer molecules is accomplished by any suitable method, for example as described in the following references (which also describe suitable methods for activating polymer molecules): Harris and Zalipsky, ed.,
Poly(ethylenglycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; R. F. Taylor, (1991), „Protein immobilisation. Fundamental and applications“, Marcel Dekker, N. Y.; S. S. Wong (1992), „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking“, CRC Press, Boča Raton; G. T. Hermanson a další, (1993), „Immobilized Affinity Ligand Techniques“, Academie Press, NY). Odborníkům v oboru bude zřejmé, že použitá metoda aktivace a/nebo konjugační reakce bude záviset na vazebné skupině nebo vazebných skupinách polypeptidu interferonu β stejně jako na funkčních skupinách polymeru (například zda se jedná o aminovou, hydroxylovou, karboxylovou, aldehydovou nebo sulfhydrylovou skupinu). PEGylace může být zaměřena na konjugaci ke všem dostupným vazebným skupinám na polypeptidu (tj. takovým vazebným skupinám, které jsou vystaveny na povrchu polypeptidu), nebo může být zaměřena na specifické vazebné skupiny, například N-koncovou aminoskupinu (US 5,985,265). Navíc se může konjugace provádět jednostupňově nebo vícestupňovým způsobem (například jak se popisuje ve WO 99/55377).Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington. R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilization. Fundamental and Applications ”, Marcel Dekker, N.Y .; S. S. Wong (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al. (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, NY). It will be appreciated by those skilled in the art that the method of activation and / or conjugation reaction employed will depend on the binding group (s) of the interferon β polypeptide as well as on the functional groups of the polymer (for example, whether it is an amino, hydroxyl, carboxyl, aldehyde or sulfhydryl group). PEGylation may be directed to conjugation to all available binding groups on the polypeptide (ie, such binding groups that are exposed on the surface of the polypeptide), or may be directed to specific binding groups, for example, the N-terminal amino group (US 5,985,265). In addition, the conjugation may be carried out in a one-step or multi-step manner (e.g. as described in WO 99/55377).
Je třeba rozumět, že PEGylace je navržena tak, aby se získala optimální molekula z hlediska počtu navázaných molekul PEG, velikosti a formy (například rozvětvená nebo přímá) těchto molekul, a z hlediska míst, na která jsou v polypeptidu tyto molekuly navázány. Například molekulová hmotnost použitelného polymeru může být zvolena na základě požadovaného účinku. Jestliže je například primárním účelem konjugace získání konjugátu s vysokou molekulovou hmotností (například pro snížení vylučování ledvinami), je obvykle žádoucí konjugovat pro dosažení požadované molekulové hmotnosti co nejméně molekul polymeru s vysokou molekulovou hmotností. Jestliže se má získat vysoká míra stínění epitopu, lze toho dosáhnout • ♦· 44 44 ··· 4 4 44 4 • · 4 4 4It is to be understood that PEGylation is designed to obtain an optimal molecule in terms of the number of PEG molecules bound, the size and form (e.g., branched or straight) of these molecules, and the sites to which these molecules are bound in the polypeptide. For example, the molecular weight of the useful polymer can be selected based on the desired effect. For example, if the primary purpose of conjugation is to obtain a high molecular weight conjugate (e.g., to reduce renal excretion), it is usually desirable to conjugate as few high molecular weight polymer molecules as possible to achieve the desired molecular weight. If high epitope shielding is to be obtained, this can be achieved • ♦ · 44 44 ··· 4 4 44 4 • · 4 4 4
44 • 4 4 4• 4 4 4
4 44 4
4 44 4
4444 • 4 4 4 ·· · 44 4444 použitím dostatečně velkého počtu molekul nízkomolekulárního polymeru (například s molekulovou hmotností přibližně 5000 Da) pro účinné stínění všech nebo většiny epitopů polypeptidu. Může být například použito 2 až 8, jako je 3 až 6 těchto polymerů.4444 using a sufficiently large number of low molecular weight polymer molecules (for example, having a molecular weight of about 5000 Da) to effectively shield all or most epitopes of the polypeptide. For example, 2 to 8 such as 3 to 6 of these polymers may be used.
V souvislosti s konjugací na pouze jedinou vazebnou skupinu na proteinu (jak se popisuje v US 5,985,265) může být výhodné, aby měla polymerní molekula, která může být přímá nebo rozvětvená, vysokou molekulovou hmotnost, například přibližně 20 kDa.In the context of conjugation to only a single binding moiety on a protein (as described in US 5,985,265), it may be preferred that the polymer molecule, which can be straight or branched, have a high molecular weight, for example about 20 kDa.
Za normálních okolností se konjugace polymeru provádí za podmínek vedoucích k reakči všech dostupných vazebných skupin pro polymer s molekulami polymeru. Molární poměr aktivovaných molekul polymeru k polypeptidu je typicky 1000 - 1, zvláště 200 - 1 s výhodou 100 - 1, jako je například 10-1 nebo 5-1, aby se dosáhlo optimální reakce. Mohou být však také použity ekvimolární poměry.Normally, the conjugation of the polymer is performed under conditions resulting in the reaction of all available polymer binding groups with the polymer molecules. The molar ratio of activated polymer molecules to polypeptide is typically 1000-1, particularly 200-1, preferably 100-1, such as 10-1 or 5-1, in order to achieve an optimal reaction. However, equimolar ratios may also be used.
Podle vynálezu se také předpokládá, že polymerní molekuly se mohou na polypeptid vázat prostřednictvím propojovací skupiny. Vhodné propojovací skupiny jsou odborníkům v oboru dobře známy. Výhodným příkladem je kyanurchlorid (Abuchowski a další (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578 - 3581; US 4,179,337; Shafer a další (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. ed., 24, 375 - 378).According to the invention, it is also contemplated that polymer molecules may bind to the polypeptide via a linker group. Suitable linking groups are well known to those skilled in the art. A preferred example is cyanuric chloride (Abuchowski et al. (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al. (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).
Po konjugaci se zbytkové molekuly aktivovaného polymeru blokují metodami známými v oboru, například přidáním primárního aminu k reakční směsi, a získané inaktivované molekuly polymeru se vhodným způsobem odstraňují.After conjugation, residual activated polymer molecules are blocked by methods known in the art, for example by adding a primary amine to the reaction mixture, and the inactivated polymer molecules obtained are appropriately removed.
Pro modifikaci nebo zvýšení počtu nebo profilu uhlohydrátových substituentů může být použita kovalentní vazba in vitro uhlohydrátové skupiny na aminokyselinové zbytky interferonu β. V závislosti na způsobu použité reakce mohou být karbohydrát nebo karbohydráty navázány na a) arginin a histidin (Lundblad a Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press lne. Boča Raton, Fl), b) volné karboxylové skupiny (například zbytku C-koncové aminokyseliny, ·♦ 44 • 4 4 4 4 4 • 4 4 4In vitro covalent bonding of the carbohydrate moiety to the amino acid residues of interferon β can be used to modify or increase the number or profile of carbohydrate substituents. Depending on the reaction method used, the carbohydrate or carbohydrates may be attached to a) arginine and histidine (Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boča Raton, Fl), b) free carboxyl groups (e.g. C-terminal residue) amino acids, ♦ 44 • 4 4 4 4 4 • 4 4 4
4 4 4 *··· 44 44444 4 4 * ··· 44 4445
44 • · 4 4• 4 4
4 44 4
4f4f
4 44 4
4444 asparaginu nebo glutaminu), c) volné sulfhydrylové skupiny jako jsou skupiny cysteinu, d) volné hydroxylové skupiny jako jsou skupiny šeřinu, threoninu, tyrosinu nebo hydroxyprolinu), e) aromatické zbytky jako jsou zbytky fenylalaninu nebo tryptofanu) nebo f) amidové skupiny glutaminu. Tyto zbytky aminokyselin jsou uvedeny jako příklady vazebných skupin karbohydrátové části, které mohou být zavedeny do a/nebo odstraněny z polypeptidu interferonu β. Vhodné metody vazby in vitro se popisují ve WO 87/05330 a v Aplin a další, CRC Crit. Rev. Biochem., str. 259 - 306, 1981. Vazba karbohydrátových skupin nebo PEG na zbytky Gin navázané na proteiny a peptidy in vitro může být také prováděna použitím transglutamináz (TGázy), například jak se popisuje v Sáto a další, 1996 Biochemistry 35, 13072 - 13080 nebo v EP 725145.(C) free sulfhydryl groups such as cysteine groups, d) free hydroxyl groups such as lilac, threonine, tyrosine or hydroxyproline groups, e) aromatic residues such as phenylalanine or tryptophan residues) or f) glutamine amide groups . These amino acid residues are exemplified by carbohydrate moiety linking groups that can be introduced into and / or removed from the interferon β polypeptide. Suitable in vitro binding methods are described in WO 87/05330 and Aplin et al., CRC Crit. Roar. Biochem., Pp. 259-306, 1981. Binding of carbohydrate groups or PEG to Gin residues bound to proteins and peptides in vitro can also be accomplished using transglutaminases (TGases), for example, as described in Sato et al., 1996 Biochemistry 35, 13072 13080 or EP 725145.
Vazba na cukernou částLink to the sugar part
Pro dosažení glykosylace polypeptidu interferonu β, který byl modifikován zavedením jednoho nebo více glykosylačních míst (viz část „Konjugáty podle vynálezu, kde nepeptidová část je cukerná část“) in vivo musí být nukleotidová sekvence kódující polypeptidovou část konjugátu zavedena do glykosylujícího eukaryotického expresního hostitele. Expresní hostitelská buňka může být zvolena z houbových (vláknité houby nebo kvasinky), hmyzích, savčích živočišných buněk, transgenních rostlinných buněk nebo buněk transgenních zvířat. Dále může být glykosylace dosaženo v těle člověka při použití nukleotidové sekvence kódující polypeptidovou část konjugátu podle vynálezu nebo polypeptid podle vynálezu při genové terapii. V jednom provedení je hostitelskou buňkou savčí buňka, jako je buňka CHO, BHK nebo HEK, například HEK293, nebo hmyzí buňka jako je buňka SF9, nebo kvasinková buňka, například Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris nebo jakýkoli další vhodný glykosylující hostitel, například jak se popisuje dále. Cukerné části navázané na polypeptid interferonu βIn order to achieve glycosylation of an interferon β polypeptide that has been modified by introducing one or more glycosylation sites (see section "Conjugates of the invention where the non-peptide moiety is a sugar moiety") in vivo, the nucleotide sequence encoding the polypeptide moiety of the conjugate must be introduced into a glycosylating eukaryotic expression host. The expression host cell may be selected from fungal (filamentous fungi or yeast), insect, mammalian animal cells, transgenic plant cells or cells of transgenic animals. Further, glycosylation can be achieved in the human body using a nucleotide sequence encoding a polypeptide portion of a conjugate of the invention or a polypeptide of the invention in gene therapy. In one embodiment, the host cell is a mammalian cell, such as a CHO, BHK or HEK cell, for example HEK293, or an insect cell such as SF9, or a yeast cell, for example Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris or any other suitable glycosylating host, for example further. Sugar moieties bound to an interferon β polypeptide
glykosylací in vivo se dále modifikují použitím glykosyltransferáz, například použitím technologie glycoAdvance™ dodávané na trh firmou Neose, Horsham, PA, USA. Tak je možné například zvýšit sialyaci glykosylovaného polypeptidu interferonu β po expresi a glykosylací in vivo buňkami CHO.in vivo glycosylation is further modified using glycosyltransferases, for example, using the glycoAdvance ™ technology marketed by Neose, Horsham, PA, USA. For example, it is possible to increase sialylation of a glycosylated interferon β polypeptide after expression and glycosylation in vivo by CHO cells.
Vazba na organické derivatizační činidloBinding to organic derivatizing agent
Kovalentní modifikace polypeptidu interferonu β může být prováděna reakcí vazebné skupiny nebo vazebných skupin polypeptidu s organickým derivatizačním činidlem. Vhodná derivatizační činidla a metody jsou v oboru dobře známé. Například cysteinylové zbytky nejběžněji reagují s α-haíoacetáty (a odpovídajícími aminy), jako je kyselina chloroctová nebo chloracetamid, za poskytnutí karboxymethyíových nebo karboxyamidomethylových derivátů. Cysteinylové zbytky se také derivatizují reakcí s bromtrifluoracetonem, kyselinou a-brom^-(4-imidozoyl)propionovou, chloracetylfosfátem, N-alkylmaleimidy, 3-nitro-2-pyridyldisulfidem, methyl-2-pyridyldisulfidem, p-chlormerkuri-benzoátem, 2-chlormerkuri-4-nitrofenolem, nebo chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazolem. Histidylové zbytky se derivatizují reakcí s diethyl-pyrokarbonátem při pH 5,5 až 7,0, protože toto činidlo je relativně specifické pro histidylový postranní řetězec. Použitelný je také para-bromfenacylbromid; reakce se s výhodou provádí v 0,1 M kakodylátu sodném při pH 6,0. Lysinylové a aminokoncové zbytky se ponechají reagovat s anhydridy kyseliny jantarové enbo jiných karboxylových kyselin. Derivatizace těmito činidly má vliv na změnu náboje lysinylových zbytků. Jiná vhodná činidla pro derivatizaci zbytků obsahujících α-aminoskupiny zahrnují imidoestery, jako je methylpikolinimidát; pyridoxaifosfát; pyridoxal; chlorborohydrid; kyselina trinitrobenzensulfonová; O-methylisourea; 2,4-pentandion; a transaminázou katalyzovaná reakce s glyoxylátem. Arginylové zbytkyThe covalent modification of the interferon β polypeptide can be accomplished by reacting the binding group (s) of the polypeptide with an organic derivatizing agent. Suitable derivatizing agents and methods are well known in the art. For example, cysteinyl residues most commonly react with α-haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to provide carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. Cysteinyl residues are also derivatized by reaction with bromotrifluoroacetone, α-bromo-4- (4-imidozoyl) propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkyl maleimides, 3-nitro-2-pyridyldisulfide, methyl 2-pyridyldisulfide, p-chlorometurobenzoate, 2- chlormerkuri-4-nitrophenol, or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole. Histidyl residues are derivatized by reaction with diethyl pyrocarbonate at pH 5.5 to 7.0, since this agent is relatively specific for the histidyl side chain. Para-bromophenacyl bromide is also useful; the reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0. The lysinyl and amino-terminal residues are reacted with succinic anhydrides or other carboxylic acids. Derivatization with these agents has an effect on the change in charge of lysinyl residues. Other suitable agents for derivatizing α-amino-containing moieties include imidoesters such as methyl picolinimidate; pyridoxaiphosphate; pyridoxal; chlorborohydride; trinitrobenzenesulfonic acid; O-methylisourea; 2,4-pentanedione; and a transaminase catalyzed reaction with glyoxylate. Arginyl residues
se modifikují reakcí s jedním nebo několika běžnými činidly, z nichž je možno uvést fenylglyoxal, 2,3-butandion, 1,2-cyklohexandion a ninhydrin. Derivatizace argininových zbytků vyžaduje, aby byla reakce prováděna za alkalických podmínek z důvodů vysoké hodnoty pKa guanidinové funkční skupiny. Navíc mohou tato činidla reagovat se skupinami lysinu stejně jako s guanidinovou skupinou argininu. Karboxylové postranní skupiny (aspartyl nebo glutamyl nebo zbytek Ckoncové aminokyseliny) se selektivně modifikují reakcí s karbodiimidy (R-N=C=N-R’), kde R a R’ jsou odlišné alkylové skupiny, jako je 1-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-4-ethyl)karbodiimid nebo 1 -ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)karbodiimid. Aspartylové a glutamylové zbytky se dále převádějí na asparaginylové a glutaminylové zbytky reakcí s amoniovými ionty.are modified by reaction with one or more conventional reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione, and ninhydrin. Derivatization of arginine residues requires that the reaction be carried out under alkaline conditions because of the high pKa of the guanidine functional group. In addition, these agents can react with the lysine groups as well as the guanidine group of arginine. Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl or a terminal amino acid residue) are selectively modified by reaction with carbodiimides (RN = C = N-R '), where R and R' are different alkyl groups such as 1-cyclohexyl-3- (2- morpholinyl-4-ethyl) carbodiimide or 1-ethyl-3- (4-azonia-4,4-dimethylpentyl) carbodiimide. Aspartyl and glutamyl residues are further converted to asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with ammonium ions.
Blokování funkčního místaBlocking of a functional point
Uvádí se, že nadměrná konjugace polymerů může vést k úbytku aktivity polypeptidů interferonu β, ke kterému se polymer konjuguje. Tento problém je možno odstranit například odstraněním vazebných skupin umístěných na funkčním místě nebo blokováním funkčního místa před konjugací. Tyto naposledy uvedené strategie tvoří další provedení vynálezu (první strategie bude uvedena dále, například jde o odstranění lysinových zbytků, které mohou být umístěny v blízkosti funkčního místa. Konkrétněji se podle druhé strategie konjugace mezi polypeptidem interferonu β a nepolypeptidovou částí provádí za podmínek, kdy je funkční místo polypeptidů blokováno pomocnou molekulou schopnou vázat se na funkční místo polypeptidů. Pomocná molekula je s výhodou molekula, která specificky rozpoznává funkční místo polypeptidů, jako je receptor, zvláště receptor interferonu typu I. Alternativně může být pomocnou molekulou protilátka, zvláště monoklonální protilátka rozpoznávající polypeptid interferonu β.It is reported that excessive conjugation of polymers may lead to a decrease in the activity of the interferon β polypeptides to which the polymer is conjugated. This problem can be overcome, for example, by removing linking groups located at the functional site or by blocking the functional site before conjugation. These latter strategies form a further embodiment of the invention (the first strategy will be discussed below, for example by removing lysine residues that may be located near the functional site. More specifically, the second strategy conjugates between the interferon β polypeptide and the non-polypeptide moiety under conditions where The helper molecule is preferably a molecule that specifically recognizes a functional site of a polypeptide, such as a receptor, especially a type I interferon receptor. Alternatively, the helper molecule may be an antibody, particularly a monoclonal antibody recognizing the polypeptide. interferon β.
Pomocnou molekulou může být zvláště neutralizační monoklonální protilátka.In particular, the helper molecule may be a neutralizing monoclonal antibody.
Polypeptid se ponechá interagovat s pomocnou molekulou před uskutečněním konjugace. To zajistí odstínění nebo ochranu funkčního místa polypeptidu a tedy jeho nedostupnost pro derivatizaci nepolypeptidovou skupinou, jako je polymer. Po eluci z pomocné molekuly může být konjugát mezi nepolypeptidovou částí a polypeptidem izolován s alespoň částečně ochráněným funkčním místem.The polypeptide is allowed to interact with the helper molecule prior to conjugation. This ensures screening or protection of the functional site of the polypeptide and thus its inaccessibility for derivatization with a non-polypeptide moiety such as a polymer. After elution from the helper molecule, the conjugate between the non-polypeptide moiety and the polypeptide can be isolated with at least partially protected functional site.
Následná konjugace polypeptidu s blokovaným funkčním místem k polymeru, lipofilní sloučenině, organickému derivatizačnímu činidlu nebo kterékoli jiné sloučenině, se provádí normálním způsobem, například jak se popisuje v částech výše nazvaných „Konjugace k...“.Subsequent conjugation of the blocked functional site polypeptide to a polymer, lipophilic compound, organic derivatizing agent, or any other compound is performed in a normal manner, for example as described in the sections entitled "Conjugation to ..." above.
Bez ohledu na povahu pomocné molekuly používané pro stínění funkčního místa polypeptidu před konjugací je žádoucí, aby byla pomocná molekula zbavena vazebných skupin, nebo aby obsahovala pouze malé množství vazebných skupin pro zvolenou nepolypeptidovou část v části nebo částech molekuly, kde bude konjugace k těmto skupinám omezovat desorpci konjugovaného polypeptidu od pomocné molekuly. Takto může být dosaženo selektivní konjugace k vazebným skupinám přítomným v nestíněných částech polypeptidu, a je možné znovu použít pomocné molekuly pro opakované cykly konjugace. Například jestliže je nepolypeptidovou částí molekula polymeru jako je PEG, která má jako vazebnou skupinu epsilon-aminoskupinu lysinu nebo zbytek N-koncové aminokyseliny, je vhodné, aby byla pomocná molekula v podstatě prostá konjugovatelných epsilon-aminoskupin, s výhodou zcela prostá epsilon-aminoskupin. Podle výhodného provedení je pomocnou molekulou protein nebo peptid schopný vázat se na funkční místo polypeptidu, přičemž tento protein nebo peptid je prostý jakýchkoliRegardless of the nature of the helper molecule used to shield the functional site of the polypeptide prior to conjugation, it is desirable that the helper molecule be devoid of binding groups or contain only a small amount of binding groups for the selected non-polypeptide moiety in the moiety or moieties. desorption of the conjugated polypeptide from the helper molecule. In this way, selective conjugation to binding groups present in unshielded portions of the polypeptide can be achieved, and helper molecules for repeated conjugation cycles can be reused. For example, if the non-polypeptide moiety is a polymer molecule such as PEG having an epsilon-amino group lysine or an N-terminal amino acid residue as a linking group, it is preferred that the helper molecule be substantially free of conjugatable epsilon-amino groups, preferably completely free of epsilon-amino groups. According to a preferred embodiment, the helper molecule is a protein or peptide capable of binding to a functional site of the polypeptide, wherein the protein or peptide is free of any
99
9 99 9
99999999
99 • 9 9 9 • 9 999 • 9 9 • 9 9
9 9 • 99 •9 9999 konjugovatelných vazebných skupin pro zvolenou nepolypeptidovou část.9,999,999,999 conjugatable linking groups for the selected non-polypeptide moiety.
V dalším provedení vynálezu je pomocná molekula nejprve kovalentně navázaná na pevnou fázi, jako jsou materiály náplně kolony, například Sephadex nebo agarózové kuličky, nebo na povrch, například reakční nádoby. Potom se polypeptid nanese na materiál kolony nesoucí pomocnou molekulu a způsoby známými v oboru se provede konjugace, například jak se popisuje ve výše uvedených částech nazvaných „Konjugace k...“. Tento postup umožňuje oddělení konjugátu polypeptidů od pomocné molekuly elucí. Polypeptidový konjugát se eluuje běžnými způsoby za fyzikálně-chemických podmínek, které nevedou k podstatné degradaci polypeptidového konjugátu. Kapalná fáze obsahující polypeptidový konjugát se oddělí od pevná fáze, na kterou zůstává pomocná molekula kovalentně navázaná. Separace může být dosaženo jinými způsoby, například pomocná molekula může být derivatizována druhou molekulou (např. biotin), která může být rozpoznána specifickou vazebnou látkou (např. streptavidinem). Specifická vazebná látka může být navázána na pevnou fázi, čímž umožní separaci konjugátu polypeptidů od komplexu pomocná molekula - druhá molekula, průchodem přes druhou kolonu s navázanou pomocnou látkou na pevné fázi, která zachytí po následné eluci komplex pomocná molekula - druhá molekula, ale nikoli polypeptidový konjugát. Polypeptidový konjugát může být z pomocné molekuly uvolněn jakýmkoli vhodným způsobem. Odstranění ochranných skupin je možno dosáhnout poskytnutím podmínek, za kterých pomocná molekula disociuje od funkčního místa interferonu β, na které je navázána. Například komplex mezi protilátkou, ke které je konjugován polymer, a antiidiotypickou protilátkou může být disociován úpravou pH do kyselé nebo alkalické oblasti pH.In another embodiment of the invention, the helper molecule is first covalently bound to a solid phase such as column packing materials, for example Sephadex or agarose beads, or to a surface, for example a reaction vessel. Thereafter, the polypeptide is loaded onto the column support material and conjugation is carried out by methods known in the art, for example as described in the above sections entitled "Conjugation to ...". This procedure allows separation of the polypeptide conjugate from the helper molecule by elution. The polypeptide conjugate is eluted by conventional methods under physicochemical conditions that do not result in substantial degradation of the polypeptide conjugate. The liquid phase containing the polypeptide conjugate is separated from the solid phase to which the helper molecule remains covalently bound. Separation may be achieved by other means, for example, the helper molecule may be derivatized with a second molecule (eg biotin), which may be recognized by a specific binding agent (eg streptavidin). The specific binding agent can be bound to the solid phase, thereby allowing separation of the polypeptide conjugate from the helper molecule-second molecule complex, by passing through a second solid phase adjuvant column which retains the helper molecule-second molecule complex but not the polypeptide conjugate. The polypeptide conjugate may be released from the helper molecule by any suitable means. Deprotection can be achieved by providing conditions under which the helper molecule dissociates from the functional site of interferon β to which it is bound. For example, the complex between the antibody to which the polymer is conjugated and the anti-idiotypic antibody can be dissociated by adjusting the pH to an acidic or alkaline pH range.
·· 44 44 44 • · · 4 4 4 4 4 4 4 • · · · · 4 4 • 444 · · 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4·· 44 44 44 • · 4 4 4 4 4 4 4 · · · · 4 4 · 444 · · 4 4 4 · 4 4 4 4 4 4
4444 44 4*44 44 44444444 44 4 44 44 4444
Konjugace označeného polypeptidů interferonu βConjugation of labeled interferon β polypeptides
V alternativním provedení se polypeptid interferonu β exprimuje jako fúzní protein se značkou (tágem), tj. aminokyselinovou sekvencí nebo peptidovým řetězcem připraveným z typicky 1 až 30, jako 1 až 20 nebo 1 až 15 nebo 1 až 10 aminokyselinových zbytků. Kromě umožnění rychlého a snadného čištění je tato značka vhodným nástrojem pro dosažení konjugace mezi označeným polypeptidem a nepolypeptidovou částí. Značka může být konkrétně použita pro dosažení konjugace v mikrotitračních destičkách nebo na jiných nosičích, jako jsou paramagnetické kuličky, na kterých se má značený polypeptid prostřednictvím značky imobilizovat. Konjugace ke značenému polypeptidů, například v mikrotitračních destičkách, má tu výhodu, že značený polypeptid může být v mikrotitračních destičkách imobilizován přímo z kultivační půdy (v podstatě bez jakéhokoli čištění) a může být vystaven konjugaci. Tím je možno snížit celkový počet kroků procesu (od exprese ke konjugaci). Navíc může značka fungovat jako mezerníková molekula (spacer) zajišťující zlepšenou dostupnost konjugovaného imobilizovaného peptidu.In an alternative embodiment, the interferon β polypeptide is expressed as a fusion protein with a tag, i.e., an amino acid sequence or a peptide chain prepared from typically 1 to 30, such as 1 to 20 or 1 to 15 or 1 to 10 amino acid residues. In addition to allowing rapid and easy purification, this label is a suitable tool for achieving conjugation between the labeled polypeptide and the non-polypeptide moiety. In particular, the label can be used to achieve conjugation in microtiter plates or other carriers, such as paramagnetic beads, on which the labeled polypeptide is to be immobilized by the label. Conjugation to labeled polypeptides, for example in microtiter plates, has the advantage that the labeled polypeptide can be immobilized directly from the culture medium (essentially without any purification) in the microtiter plates and subjected to conjugation. This can reduce the overall number of process steps (from expression to conjugation). In addition, the label may function as a spacer molecule providing improved availability of the conjugated immobilized peptide.
Konjugace použitím značeného polypeptidů se může použít pro konjugaci k jakýmkoli zde popisovaným nepolypeptidovým částem, například k polymerní molekule jako je PEG.Conjugation using a labeled polypeptide can be used for conjugation to any non-polypeptide moieties described herein, for example, to a polymer molecule such as PEG.
Identita konkrétní použité značky není kritická, pokud je značka schopna společné exprese s polypeptidem a je schopná imobilizace na vhodném povrchu nebo nosném materiálu. Komerčně dostupná je celá řada vhodných značek, například firmy Unizyme Laboratories, Dánsko. Značkou může být například jakákoli z následujících sekvencí:The identity of the particular label used is not critical if the label is capable of co-expression with the polypeptide and is capable of immobilizing on a suitable surface or support material. A number of suitable brands are commercially available, such as Unizyme Laboratories, Denmark. For example, the tag can be any of the following sequences:
His-His-His-His-His-HisHis-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-GIn-His-His » ·© • · · · • · · ·· *©·· ♦ · ·· • 9 9 9Met-Lys-His-His-Ala-His-His-GIn-His-His »© · · © 9 9 9 9 9 9
9 · • · ©9 · • · ©
9 9 99 99
Met-Lys-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn (vektory použitelné pro získání těchto značek jsou dostupné od firmy Unizyme Laboratories, Dánsko), nebo jakákoli z následujících sekvencí:Met-Lys-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn-His-GIn (vectors useful for obtaining these labels are available from Unizyme Laboratories, Denmark), or any of the following sequences:
EQKLI SEEDL (C-koncová značka popsaná v Mol. Cell. Biol. 5: 3610 - 16, 1985)EQKLI SEEDL (C-terminal tag described in Mol. Cell. Biol. 5: 3610-16, 1985)
DYKDDDDK (C- nebo N-koncová značka)DYKDDDDK (C- or N-terminal mark)
YPYDVPDYA.YPYDVPDYA.
Protilátky proti výše uvedeným značkám jsou komerčně dostupné, například u firem ADI, Aves Lab a Research Diagnostics.Antibodies against the above labels are commercially available, for example, from ADI, Aves Lab and Research Diagnostics.
Běžný způsob používání značeného polypeptidu pro PEGylaci se popisuje v části „Materiály a metody“, dále.A conventional method of using a labeled polypeptide for PEGylation is described in the "Materials and Methods" section below.
Následné odštěpení značky od polypeptidu se může provést použitím běžně dostupných enzymů.Subsequent cleavage of the label from the polypeptide may be accomplished using commercially available enzymes.
Polypeptidy podle vynálezuPolypeptides of the invention
V dalších provedeních se vynález obecně týká popisovaných nových polypeptidu interferonu β, které mají ve srovnání s lidským interferonem β standardního typu alespoň jednu zavedenou a/nebo alespoň jednu odstraněnou vazebnou skupinu pro nepolypeptidovou část. Nové polypeptidy jsou důležité meziprodukty pro přípravu konjugátu podle vynálezu. Navíc mohou mít zajímavé vlastnosti samotné polypeptidy.In other embodiments, the invention generally relates to novel novel interferon β polypeptides having at least one introduced and / or at least one non-polypeptide moiety removed as compared to wild-type human interferon β. The novel polypeptides are important intermediates for preparing the conjugate of the invention. In addition, the polypeptides themselves may have interesting properties.
Mezi příklady těchto polypeptidu patří látky, které obsahují aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence lidského interferonu β standardního typu v tom, že alespoň jeden aminokyselinový zbytek zvolený ze skupiny N4, F8, L9, Q10, R11, S13, L24, N25, G26, L28, E29, N37, F38, Q48, Q49, Q64, N65, I66, F67, A68, I69, F70, R71, Q72, D73, S74, S75, S76, T77, G78, W79, N80, E81, T82, I83, V84, • · · * · ♦ · * · · · 9 Φ φ 9 9 • 9 9 9 9 9 9Examples of such polypeptides include substances that contain an amino acid sequence different from the wild-type human interferon β sequence in that at least one amino acid residue selected from N4, F8, L9, Q10, R11, S13, L24, N25, G26, L28, E29, N37, F38, Q48, Q49, Q64, N65, I66, F67, A68, I69, F70, R71, Q72, D73, S74, S75, S76, T77, G78, W79, N80, E81, T82, I83, V84, 9 · 9 9 9 9 9 9 9
L87, L88, Α89, Ν90, V91, Υ92, Η93, Q94, D110, F111, T112, R113, R128, Η140, Τ144, 1145, R147, V148, L151, R152, F154, Υ155, Ν158 a N166 je nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem zvoleným ze skupiny K, R, D, E, C a N. Výše uvedené aminokyselinové zbytky jsou umístěny v polohách, které jsou vystaveny na povrchu molekuly lidského interferonu β, jak je ukázáno vyřešenou 3D strukturou lidského interferonu β. Náhradou jednoho nebo více z těchto zbytků některou z vazebných skupin K, R, D, E, C a N pro nepolypeptidovou část, se do lidského interferonu β zavede nebo zavedou zvláště polymerní vazebná skupina nebo aminokyselinový zbytek přístupný modifikaci uhlohydrátovou skupinou. Získaná molekula modifikovaného lidského interferonu β je vhodnou výchozí sloučeninou pro přípravu konjugátu interferonu β se zlepšenými vlastnostmi ve srovnání s nemodifikovanou molekulou lidského interferonu β.L87, L88, Α89, Ν90, V91, Υ92, Η93, Q94, D110, F111, T112, R113, R128, Η140, 44144, 1145, R147, V148, L151, R152, F154, Υ155, Ν158 and N166 are replaced by different an amino acid residue selected from K, R, D, E, C, and N. The above amino acid residues are located at positions that are exposed to the surface of a human interferon β molecule, as shown by the resolved 3D structure of human interferon β. By replacing one or more of these residues with one of the non-polypeptide moieties K, R, D, E, C, and N, in particular, a polymeric linkage group or an amino acid residue accessible by carbohydrate modification is introduced or introduced into human interferon β. The obtained modified human interferon β molecule is a suitable starting compound for the preparation of an interferon β conjugate with improved properties compared to the unmodified human interferon β molecule.
V dalším provedení se vynález táká polypeptidu interferonu β, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence lidského interferonu β standardního typu tím, že alespoň jeden aminokyselinový zbytek zvolený ze skupiny N4, F8, L9, Q10, R11, S12, S13, L24, N25, G26, L28, E29, N37, F38, D39, Q48, Q49, Q64, N65, I66, F67, A68, I69, F70, R71, Q72, D73, S74, S75, S76, T77, G78, W79, N80, E81, T82, I83, V84, E85, L87, L88, A89, N90, V91, Y92, H93, Q94, D110, F111, T112, R113, R128, H140, T144, 1145, R147, V148, L151, R152, F154, Y155, N158, G162 a N166 je nahrazen zbytkem lysinu, za předpokladu, že polypeptid je odlišný od polypeptidu lidského interferonu β standardního typu s následujícími substitucemi: D54N+E85K+V91I+V101M a odlišný od polypeptidu, který je hybridní molekulou mezi interferonem β a interferonem a, který má v důsledku vytvoření hybridu lysin v poloze 39. První z polypeptidů zahrnutých do disclaimeru se popisuje v Stewart a další, DNA díl 6, no. 2, 1987, str. 19 - 128, přičemž bylo zjištěno, že je neaktivní, druhý se popisuje v US 4,769,233, přičemž tento polypeptid • 44 44 «« Di ii ··«* t * · 4 4 4 4 • « · · · i i i · i Λ i ·«· · « « 4 * · 4 «·· ··· «4·· H 4··· ·« ··»· byl zkonstruován za účelem zlepšení biologické aktivity interferonu β. žádný z polypeptidů zahrnutých do disclaímeru nebyl připraven nebo popsán ve funkci vhodného meziproduktu pro přípravu konjugátů interferonu β se sníženou imunogenicitou a/nebo prodlouženým funkčním poločasem in vivo a/nebo poločasem v séru.In another embodiment, the invention relates to an interferon β polypeptide comprising an amino acid sequence different from the wild-type human interferon β sequence by at least one amino acid residue selected from the group of N4, F8, L9, Q10, R11, S12, S13, L24, N25, G26, L28, E29, N37, F38, D39, Q48, Q49, Q64, N65, I66, F67, A68, I69, F70, R71, Q72, D73, S74, S75, S76, T77, G78, W79, N80, E81, T82, I83, V84, E85, L87, L88, A89, N90, V91, Y92, H93, Q94, D110, F111, T112, R113, R128, H140, T144, 1145, R147, V148, L151, R152, F154, Y155, N158, G162 and N166 are replaced by a lysine residue, provided that the polypeptide is different from the wild-type human interferon β polypeptide with the following substitutions: D54N + E85K + V91I + V101M and different from the polypeptide that is a hybrid molecule between interferon β and interferon α, which has a lysine at position 39 as a result of the formation of the hybrid. The first of the polypeptides involved in the disclaimer is described in Stewart et al. 6, no. 2, 1987, pp. 19-128, which has been found to be inactive, the latter being described in US 4,769,233, wherein the polypeptide is described in U.S. Pat. No. 4,769,233. Iii has been designed to improve the biological activity of interferon β. Iii 4 H * H β byl byl byl byl byl byl byl byl byl byl byl byl byl byl byl byl none of the polypeptides involved in the disclaimer has been prepared or described as a suitable intermediate for the preparation of interferon β conjugates with reduced immunogenicity and / or prolonged functional in vivo and / or serum half-life.
Ještě další příklad zahrnuje polypeptid interferonu β obsahující aminokyselinovou sekvenci, která se od SEQ ID No. 2 liší v jedné nebo více substitucích zvolených ze skupiny N4K, F1SK, Q16K, R27K, R35K, D39K, Q49K, E85K, A89K, E103K, E109K, R124K, E137K a R159K, za předpokladu, že jestliže substituce je R27K, polypeptid je odlišný od polypeptídu s aminokyselinovou sekvenci lidského interferonu β standardního typu s následnujícími substitucemi: R27K+E43K. Tento polypeptid jako část disclaímeru se popisuje v Stewart a další, DNA díl 6, no. 2, 1987, str. 119 - 128, a bylo zjištěno, že má nízkou aktivitu. Tento polypeptid byl připraven během studie vztahu mezi funkcí a strukturou, a nebylo uváděno, že by byl možným meziproduktem pro přípravu zlepšených molekul konjugátu interferonu β. Polypeptid interferonu β obsahuje například aminokyselinovou sekvenci, která se liší od SEQ ID No. 2 tím, že obsahuje substituci R27K v kombinaci s alespoň jednou další substitucí, která je odlišná od E43K, nebo substituci R35K v kombinaci s alespoň jednou další substitucí, za předpokladu, že polypeptid má aminokyselinovou sekvenci odlišnou od aminokyselinové sekvence lidského interferonu β standardního typu modifikovaného následujícími substitucemi: G7E+S12N+C17Y+R35K. Polypeptid, který je součástí disclaímeru, se popisuje v Stewart a další, DNA díl 6, no. 2, 1987, str. 119 - 128, a má zachovanou antiproliferativní aktivitu na Daudiho buňkách co se týče jejich antivirové aktivity, ale sníženou celkovou aktivitu ve srovnání s lidským interferonem β standardního typu. Tento polypeptid, který je součástí disclaímeru, nebyl připraven za účelem snížení imunogenicity a/nebo zvýšení funkčního poločasu in vivo • ·· ·» ·· ·· ·· *· · · · · · · ···· • ··· ··· · ř» · · » · · · · · 9 • · · » · Λ · · ··· ···· *9 ·«·· ·· »··· a/nebo poločasu v séru, ale byl připraven při studii vztahu mezi strukturou a funkcí interferonu β.Yet another example includes an interferon β polypeptide comprising an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO. 2 differs in one or more substitutions selected from N4K, F1SK, Q16K, R27K, R35K, D39K, Q49K, E85K, A89K, E103K, E109K, R124K, E137K and R159K, provided that when the substitution is R27K, the polypeptide is different from a polypeptide with the amino acid sequence of wild-type human interferon β with the following substitutions: R27K + E43K. This polypeptide as part of the disclaimer is described in Stewart et al., DNA Volume 6, no. 2, 1987, pp. 119-128, and was found to have low activity. This polypeptide was prepared during the study of the relationship between function and structure, and was not reported to be a possible intermediate for the preparation of improved interferon β conjugate molecules. For example, the interferon β polypeptide comprises an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO. 2 by comprising a substitution of R27K in combination with at least one additional substitution that is different from E43K, or a substitution of R35K in combination with at least one additional substitution, provided that the polypeptide has an amino acid sequence different from the amino acid sequence of the wild-type modified with the following substitutions: G7E + S12N + C17Y + R35K. The polypeptide that is part of the disclaimer is described in Stewart et al., DNA Volume 6, no. 2, 1987, pp. 119-128, and retained antiproliferative activity on Daudi cells in terms of their antiviral activity, but reduced overall activity compared to wild-type human interferon β. This polypeptide, which is part of the disclaimer, has not been prepared to reduce immunogenicity and / or increase the functional half-life in vivo. 9 and / or serum half-life, but has been discontinued. prepared in the study of the relationship between structure and function of interferon β.
Polypeptid podle vynálezu může navíc k výše uvedeným substitucím dále obsahovat substituci C17S a/nebo deieci M1 nebo substituci M1K. Polypeptid podle vynálezu může dále obsahovat aminokyselinovou sekvenci, která se dále odlišuje od SEQ ID No. 2 odstraněním, s výhodou substitucí, alespoň jednoho lysinového zbytku zvoleného ze skupiny K19, K33, K45, K52, K99, K105, K108, K115, K123, K134 a K136. Lysinový zbytek nebo zbytky mohou být nahrazeny jakýmkoli jiným zbytkem aminokyseliny, ale s výhodou jsou nahrazeny argininem nebo glutaminem. Polypeptidem podle vynálezu může být zvláště takový polypeptid, kde K45, K52 a/nebo K123 byl nebo byly nahrazeny jiným aminokyselinovým zbytkem, ale s výhodou zbytkem argininu nebo glutaminu. Polypeptid může být také exprimován se značkou (tágem), například jak se popisuje v části nazvané „Konjugace značeného polypeptidu interferonu β“.The polypeptide of the invention may further comprise a C17S substitution and / or a M1 or a M1K substitution in addition to the above substitutions. The polypeptide of the invention may further comprise an amino acid sequence that differs further from SEQ ID NO. 2 by removing, preferably by substitution, at least one lysine residue selected from the group of K19, K33, K45, K52, K99, K105, K108, K115, K123, K134 and K136. The lysine residue or residues may be replaced by any other amino acid residue, but are preferably replaced by arginine or glutamine. In particular, the polypeptide of the invention may be a polypeptide wherein K45, K52 and / or K123 have been or have been replaced by another amino acid residue, but preferably an arginine or glutamine residue. The polypeptide may also be expressed with a tag, for example, as described in the section entitled "Conjugation of a labeled interferon β polypeptide".
Ještě další příklad polypeptidu interferonu β podle vynálezu zahrnuje polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se liší od sekvence lidského interferonu β standardního typu v tom, že alespoň jeden lysinový zbytek zvolený ze skupiny K19, K33, K45, K52, K99, K105, K108, K115, K124, K134 a K136 byl nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, za předpokladu, že polypeptid interferonu β je odlišný od hybridu mezi interferonem β a interferonem a, který jako důsledek vytvoření hybridu má fenylalanin v poloze 45. S výhodou je nahrazen alespoň jeden ze zbytků K19, K45, K52 a/nebo K123. Jestliže má být podle tohoto provedení vynálezu odstraněn lysinový zbytek, je výhodné, aby byl nahrazen zbytkem jakékoli další aminokyseliny, s výhodou argininu nebo glutaminu. Polypeptid podle vynálezu za normálních podmínek obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se odlišuje v 1 až 15 aminokyselinách od aminokyselinové sekvence ukázané v SEQ ID No. 2 a diskutované • · · ·· · · ·· · · • φ φ φ · · · · · ♦ · · • · · · · · · ··· ······ ·· ···· výše. Příklady polypeptidů podle vynálezu se volí ze skupiny zahrnující polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci, která se liší od SEQ ID No. 2 alespoň jednou z následujících substitucí:Yet another example of an interferon β polypeptide of the invention includes a polypeptide that comprises an amino acid sequence that differs from the wild-type human interferon β sequence in that at least one lysine residue selected from K19, K33, K45, K52, K99, K105, K108 , K115, K124, K134 and K136 have been replaced by another amino acid residue, provided that the interferon β polypeptide is different from the hybrid between interferon β and interferon α, which has phenylalanine at position 45 as a result of the hybrid formation. Preferably at least one of residues K19, K45, K52 and / or K123. If, according to this embodiment of the invention, the lysine residue is to be removed, it is preferred that it be replaced by any other amino acid residue, preferably arginine or glutamine. The polypeptide of the invention normally comprises an amino acid sequence that differs from 1 to 15 amino acids from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2 and discussed in the above. Examples of polypeptides of the invention are selected from the group consisting of polypeptides comprising an amino acid sequence that differs from SEQ ID NO. 2 with at least one of the following substitutions:
R27K+R159K;R27K + R159K;
R27K+K45R+R159K;R27K + K45R + R159K;
R27K+Q49K+E85K+A89K;R27K + Q49K + E85K + A89K;
R27K+K45R+Q49K+E85K+A89K;R27K + K45R + Q49K + E85K + A89K
R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K;R27K + D39K + Q49K + E85K + A89K;
R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K;R27K + D39K + K45R + Q49K + E85K + A89K;
N4K+R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K;N4K + R27K + D39K + Q49K + E85K + A89K;
N4K+R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K;N4K + R27K + D39K + K45R + Q49K + E85K + A89K;
R27K+K123R+R159K;R27K + K125R + R159K;
R27K+K45R+K123R+R159K;R27K + K45R + K123R + R159K;
R27K+Q49K+E85K+A89K+K123R;R27K + Q49K + A85K + A89K + K123R;
R27K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R;R27K + K45R + Q49K + E85K + A89K + K123R;
R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K+K123R;R27K + D39K + E49K + E85K + A89K + K123R;
R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R;R27K + D39K + K45R + Q49K + E85K + A89K + K123R;
N4K+R27K+D39K+Q49K+E85K+A89K+K123R; aN4K + R27K + D39K + Q49K + A85K + A89K + K123R; and
N4K+R27K+D39K+K45R+Q49K+E85K+A89K+K123R.N4K + R27K + D39K + K45R + Q49K + E85K + A89K + K123R.
Je zřejmé, že kterýkoli z popisovaných polypeptidů podle vynálezu může být použit pro přípravu konjugátu podle vynálezu, tj. může být kovalentně navázán na kteroukoli z popisovaných nepolypeptidových částí. Jestliže je polypeptid podle vynálezu exprimován v glykosylujícím organismu, může být polypeptid poskytnut v glykosylované formě.It will be appreciated that any of the disclosed polypeptides of the invention may be used to prepare the conjugate of the invention, i.e., it may be covalently linked to any of the described non-polypeptide moieties. When the polypeptide of the invention is expressed in a glycosylating organism, the polypeptide may be provided in a glycosylated form.
Způsoby přípravy polypeptidu interferonu β pro použití v rámci předkládaného vynálezuMethods of preparing an interferon β polypeptide for use in the present invention
Polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo polypeptidová část konjugátu podle vynálezu, popřípadě v glykosylované formě, může být vyrobena jakoukoli vhodnou metodou známou v oboru. MeziThe polypeptide of the present invention or the polypeptide portion of the conjugate of the invention, optionally in glycosylated form, can be produced by any suitable method known in the art. Between
tyto metody patří konstrukce nukleotidové sekvence kódující polypeptid a exprimující sekvenci ve vhodně transformovaném nebo transfekovaném hostiteli. Polypeptidy podle vynálezu však mohou být produkovány, i když s menší účinností, chemickou syntézou nebo kombinací chemické syntézy nebo kombinací chemické syntézy a rekombinantní technologie DNA.such methods include constructing a nucleotide sequence encoding a polypeptide and expressing the sequence in a suitably transformed or transfected host. However, the polypeptides of the invention may be produced, albeit with less potency, by chemical synthesis or by a combination of chemical synthesis or a combination of chemical synthesis and recombinant DNA technology.
Nukleotidová sekvence podle vynálezu kódující polypeptid interferonu β může být zkonstruována izolací nebo syntézou nukleotidové sekvence kódující rodičovský interferon β, například s aminokyselinovou sekvencí ukázanou v SEQ ID No. 2, a potom změnou nukleotidové sekvence pro uskutečnění zavedení (tj. inzerce nebo substituce) nebo delece (tj. odstranění nebo substituce) příslušného zbytku nebo zbytků aminokyselin.A nucleotide sequence of the invention encoding an interferon β polypeptide can be constructed by isolating or synthesizing a nucleotide sequence encoding a parent interferon β, for example, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2, and then altering the nucleotide sequence to effect the introduction (ie, insertion or substitution) or deletion (ie, removal or substitution) of the corresponding amino acid residue (s).
Nukleotidová sekvence se vhodně modifikuje místně specifickou mutagenezí známými způsoby, viz např. Mark a další, „Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene“, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, str. 5662 - 66 (1984); a US 4,588,585.The nucleotide sequence is suitably modified by site-specific mutagenesis by known methods, see, e.g., Mark et al., "Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 5662-66 (1984); and US 4,588,585.
Nukleotidová sekvence se alternativně připravuje chemickou syntézou, například použitím syntezátoru oligonukleotidů, přičemž oligonukleotidy jsou navrženy na základě aminokyselinové sekvence požadovaného polypeptidu, a s výhodou s volbou takových kodonů, které jsou výhodné v hostitelské buňce, ve které bude rekombinantní polypeptid produkován. Může být například syntetizováno několik malých oligonukleotidů kódujících části požadovaného polypeptidu, které mohou být sestaveny metodou PCR, spojením (ligací) jednotlivých Částí nebo metodou ligation chain reaction (LCR). Jednotlivé oligonukleotidy typicky obsahují 5’ nebo 3’ překrývající se části pro komplementární sestavení.Alternatively, the nucleotide sequence is prepared by chemical synthesis, for example using an oligonucleotide synthesizer, wherein the oligonucleotides are designed based on the amino acid sequence of the polypeptide of interest, and preferably with the choice of codons that are preferred in the host cell in which the recombinant polypeptide will be produced. For example, several small oligonucleotides encoding portions of the desired polypeptide can be synthesized, which can be assembled by PCR, ligation of the individual portions, or ligation chain reaction (LCR). Individual oligonucleotides typically contain 5 'or 3' overlapping portions for complementary assembly.
Jakmile je nukleotidová sekvence kódující polypeptid interferonu β sestavena (syntézou, místně specifickou mutagenezí nebo jiným způsobem), nukleotidová sekvence kódující polypeptid interferonu βOnce the nucleotide sequence encoding the interferon β polypeptide is assembled (by synthesis, site-specific mutagenesis, or otherwise), the nucleotide sequence encoding the interferon β polypeptide
se vloží do rekombinantního vektoru a operativně se naváže na kontrolní sekvence nutné pro expresi interferonu β v požadované transformované hostitelské buňce.is inserted into a recombinant vector and operably linked to control sequences necessary for expression of interferon β in the desired transformed host cell.
Melo by být zřejmé, že ne všechny vektory a sekvence řídící expresi nefungují stejně dobře co se týče exprese nukleotidové sekvence kódující popisovanou variantu polypeptidu. Stejně tak platí, že se stejným expresním systémem nefungují stejně dobře všichni hostitelé. Odborník v oboru však může zvolit bez nadměrného experimentování vhodnou variantu mezi těmito vektory, sekvencemi řídícími expresi a hostiteli. Například při volbě vektoru se musí vzít v úvahu hostitel, protože vektor se v něm musí replikovat nebo musí být schopný integrovat se do chromosomu. Měly by se také vzít v úvahu počet kopií vektoru, schopnost řídit tento počet kopií a expresi jakýchkoli dalších proteinů kódovaných vektorem, jako jsou antibiotické markéry. Při volbě sekvence řídící expresi by měla být také zvážena řada faktorů. Patří sem například relativní síla sekvence, možnost jejího řízení a její kompatibilita s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid, zvláště co se týče potenciálních sekundárních struktur. U hostitelů by se měla brát v úvahu jejich kompatibilita se zvoleným vektorem, toxicita produktu kódovaného nukleotidovou sekvencí, jejich vlastnosti z hlediska sekrece, jejich schopnost správně prostorově uspořádat polypeptid, jejich požadavky na fermentaci nebo kultivaci a snadnost čištění produktů kódovaných nukleotidovou sekvencí.It will be appreciated that not all vectors and expression control sequences function equally well in terms of expression of the nucleotide sequence encoding the disclosed polypeptide variant. Likewise, not all hosts work equally well with the same expression system. However, one of ordinary skill in the art can select, without undue experimentation, an appropriate variant between these vectors, expression control sequences, and hosts. For example, the choice of vector must take into account the host because the vector must replicate therein or be able to integrate into the chromosome. The number of copies of the vector, the ability to control that copy number, and the expression of any other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, should also be considered. A number of factors should also be considered when selecting an expression control sequence. These include, for example, the relative strength of the sequence, the ability to direct it, and its compatibility with the nucleotide sequence encoding the polypeptide, particularly with respect to potential secondary structures. For hosts, consideration should be given to their compatibility with the selected vector, the toxicity of the product encoded by the nucleotide sequence, their secretion properties, their ability to properly arrange the polypeptide, their fermentation or culture requirements, and the ease of purification of the products encoded by the nucleotide sequence.
Rekombinantní vektor může být vektor s autonomní replikací, tj. vektor existující ve formě extrachromosomální jednotky, jehož replikace nezávisí na replikaci chromosomu, například plasmid. Alternativně je vektorem takový vektor, který se při zavedení do hostitelské buňky integruje do genomu hostitelské buňky a replikuje spolu s chromosomem nebo chromosomy, do kterých byl integrován.The recombinant vector may be an autonomous replication vector, i.e. a vector existing in the form of an extrachromosomal unit whose replication does not depend on chromosome replication, for example a plasmid. Alternatively, the vector is one that, when introduced into a host cell, integrates into the genome of the host cell and replicates together with the chromosome or chromosomes into which it has been integrated.
Vektorem je s výhodou expresní vektor, ve kterém je nukleotidová sekvence kódující polypeptid podle vynálezu operativně navázána na další části nutné pro transkripci nukleotidové sekvence. Vektor je typicky odvozen od plasmidové nebo virové DNA. Komerčně dostupná nebo popsaná v literatuře je celá řada vhodných expresních vektorů pro expresi v uváděných hostitelských buňkách. Mezi použitelné expresní vektory pro eukaryotické hostitelské buňky patří například vektory obsahující sekvence řídící expresi z viru SV40, bovinního papillomaviru, adenoviru a cytomegaloviru. Konkrétní vektory jsou například pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a pCI-neo (Stratagene, La Jola, CA, USA). Mezi použitelné expresní vektory pro bakteriální hostitele patří známé bakteriální plasmidy, jako jsou plasmidy E. coli, včetně pBR322, pET3a a pET12a (oba od Novagen lne., Wl, USA), plasmidy vhodné pro širší rozmezí hostitelů, jako je RP4, fágové DNA, četné deriváty fágu lambda, např. NM989, a jiné DNA fágy, jako je M13 a vláknité fágy s jednořetězcovou DNA. Mezi expresní vektory pro kvasinkové buňky patří plasmid 2μ a jeho deriváty, vektor POT1 (US 4,931,373), vektor pJS037 (Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202 - 207, 1996) a vektory pPICZ A, B nebo C (Invitrogen). Použitelné vektory pro hmyzí buňky zahrnují pVL941, pBG311 (Cate a další, „Isolation of the Bovin a Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene In Animal Cells“, Cell, 45, str. 685 - 98 (1986), pBluebac 4.5 a pMeibac (oba dostupné od firmy Invitrogen).Preferably, the vector is an expression vector in which the nucleotide sequence encoding the polypeptide of the invention is operably linked to other portions necessary for transcription of the nucleotide sequence. The vector is typically derived from plasmid or viral DNA. Commercially available or described in the literature are a variety of suitable expression vectors for expression in said host cells. Useful expression vectors for eukaryotic host cells include, for example, vectors comprising expression control sequences from SV40 virus, bovine papillomavirus, adenovirus, and cytomegalovirus. Specific vectors are, for example, pCDNA3.1 (+) \ Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and pCI-neo (Stratagene, La Jola, CA, USA). Useful expression vectors for bacterial hosts include known bacterial plasmids such as E. coli plasmids, including pBR322, pET3a and pET12a (both from Novagen Inc., W1, USA), plasmids suitable for a broader range of hosts such as RP4, phage DNA , numerous lambda phage derivatives, eg, NM989, and other DNA phages such as M13 and filamentous single-stranded DNA phages. Yeast cell expression vectors include the 2μ plasmid and its derivatives, the POT1 vector (US 4,931,373), the pJS037 vector (Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996), and the pPICZ A, B, or C vectors ( Invitrogen). Useful vectors for insect cells include pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovin and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986), pBluebac 4.5 and pMeibac (both available from Invitrogen).
Další vektory použitelné v rámci předkládaného vynálezu zahrnují vektory, které umožňují amplifikaci nukleotidové sekvence kódující variantu polypeptidu počtem kopií. Tyto amplifikovatelné vektory jsou v oboru dobře známé. Patří sem například vektory, které mohou být amplifikovány DHFR amplifikaci (viz např. Kaufman, US patent No. 4,470,461, Kaufman a Sharp, „Construction of a Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized For Efficient Expression“, Mol. Cell. Biol., 2, str. 1304 - 19 (1982)) a ·*·· ···· · • · · · · · · glutaminsyntetázovou („GS“) amplifikací (viz např. US 5,122,464 a EP 338,841).Other vectors useful in the present invention include vectors that allow amplification of the nucleotide sequence encoding the polypeptide variant by the number of copies. These amplifiable vectors are well known in the art. For example, vectors that can be amplified by DHFR amplification (see, e.g., Kaufman, US Patent No. 4,470,461, Kaufman and Sharp, "Construction of a Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene: Analysis of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) and glutamine synthetase ("GS") amplification (see, eg, US 5,122,464 and EP 338,841).
Rekombinantní vektor může dále obsahovat sekvenci DNA umožňující replikaci vektoru v dotyčné hostitelské buňce. Příkladem takové sekvence, jestliže hostitelskou buňkou je savčí buňka, je počátek replikace SV40. Jestliže je hostitelskou buňkou kvasinková buňka, vhodné sekvence umožňující replikaci vektoru jsou replikační geny REP 1-3 a počátek replikace plasmidu 2μ.The recombinant vector may further comprise a DNA sequence allowing the vector to replicate in the host cell in question. An example of such a sequence, when the host cell is a mammalian cell, is the SV40 origin of replication. If the host cell is a yeast cell, suitable vector replication sequences are the REP 1-3 replication genes and the 2μ plasmid origin of replication.
Vektor může také obsahovat markér umožňující selekci, například gen, jehož produkt doplňuje určitý defekt v hostitelské buňce, jako je například gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR) nebo gen TPI Schizosaccharomyces pombe (popsaný v P. R. Russell, Gene 40, 1985, str. 125 - 130), nebo gen propůjčující buňce rezistenci na léčivo, například ampicilin, kanamycin, tetracyklin, chloramfenikol, neomycin, hygromycin nebo methotrexát. Pro vláknité houby patří mezi markéry umožňující selekci amdS, pyrG, arcB, niaD, sC.The vector may also contain a selectable marker, for example a gene whose product complements a particular defect in the host cell, such as a gene encoding dihydrofolate reductase (DHFR) or the Schizosaccharomyces pombe TPI gene (described in PR Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130). ), or a gene conferring drug resistance on a cell, for example ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, neomycin, hygromycin or methotrexate. For filamentous fungi, they are among the markers allowing selection of amdS, pyrG, arcB, niaD, sC.
Termín „řídící sekvence“ je zde definován ve smyslu zahrnutí veškerých složek, které jsou nezbytné nebo výhodné pro expresi polypeptidu podle vynálezu. Každá řídící sekvence může být vzhledem k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid vlastní nebo cizí. Mezi tyto řídící sekvence patří bez omezení úvodní sekvence, polyadenylační sekvence, propeptidová sekvence, promotor, zesilující sekvence nebo proti směru translace aktivující sekvence, signální peptidová sekvence a terminátor transkripce. Jako minimum zahrnují řídící sekvence promotor.The term "control sequence" is defined herein to include all components that are necessary or advantageous for the expression of a polypeptide of the invention. Each control sequence may be intrinsic or foreign to the nucleotide sequence encoding the polypeptide. Such control sequences include, but are not limited to, a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, an enhancer sequence or an upstream translation activating sequence, a signal peptide sequence, and a transcription terminator. As a minimum, the control sequences include a promoter.
V rámci předkládaného vynálezu může být použita široká řada sekvencí řídících expresi. Tyto použitelné sekvence řídící expresi zahrnují sekvence řídící expresi asociované se strukturními geny výše uvedených expresních vektorů stejně jako jakákoli sekvence, o které je známo, že řídí expresi genů prokaryotických nebo eukaryotických buněk nebo jejich virů, a jejich různé kombinace.A wide variety of expression control sequences can be used within the scope of the present invention. These useful expression control sequences include expression control sequences associated with the structural genes of the above expression vectors as well as any sequence known to direct the expression of prokaryotic or eukaryotic cell genes or viruses, and various combinations thereof.
• φ ♦ φ φ φ φφφφ φ φφφ · φ φφφφ «φφφ φ φ φφφ φφφ φφφφ φφ φφφφ φφ φφφφ• φ ♦ φ φ φ φ φ φ φ · · «« «« φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ
Příklady vhodných řídících sekvencí pro řízení transkripce v savčích buňkách zahrnují časné a pozdní promotory SV40 a adenoviru, například hlavní pozdní promotor adenoviru 2, promotor genu MT-1 (metalothioneinový gen), promotor časného genu (immediate-early) cytomegaloviru (CMV), promotor lidského elongačního faktoru 1a (EF-1a), promotor minimálního heat shock proteinu 70 Drosophila, promotor viru Rousova sarkomu (RSV), promotor lidského ubiquitinu C (UbC), terminátor lidského růstového hormonu, polyadenylační signály oblasti Elb viru SV40 nebo adenoviru a Kozáková konvenční sekvence (Kozák, M., J. Mol. Biol., 20. srpna 1987; 196(4): 947 - 50).Examples of suitable control sequences for controlling transcription in mammalian cells include the early and late promoters of SV40 and adenovirus, for example the adenovirus 2 major late promoter, the MT-1 gene (metallothionein gene), the cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter, the promoter human elongation factor 1a (EF-1a), Drosophila 70 heat shock protein promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter, human ubiquitin C promoter (UbC), human growth hormone terminator, SV40 or adenovirus Elb polyadenylation signals, and Kozak's conventional sequence (Kozak, M., J. Mol. Biol., August 20, 1987; 196 (4): 947-50).
Pro zvýšení exprese u savčích buněk může být v 5’nepřekládané oblasti nukleotidové sekvence kódující sledovaný polypeptid vložen syntetický intron. Příkladem syntetického intronu je syntetický intron plasmidu pCI-Neo (dostupný u firmy Promega Corporation, Wl, USA).To increase expression in mammalian cells, a synthetic intron may be inserted in the 5 ' untranslated region of the nucleotide sequence encoding the polypeptide of interest. An example of a synthetic intron is the synthetic intron of the plasmid pCI-Neo (available from Promega Corporation, WI, USA).
Příklady vhodných řídících sekvencí pro řízení transkripce u hmyzích buněk zahrnují polyhedrinový promotor, promotor P10, promotor základního proteinu polyhedrózového viru Autographa californica, promotor časného (immediate early) genu 1 bakuloviru a promotor časného (delayed-early) genu bakuloviru 39K, a polyadenylační sekvence SV40.Examples of suitable transcriptional control sequences for insect cells include the polyhedrin promoter, the P10 promoter, the Autographa californica polyhedrosis virus core protein promoter, the baculovirus immediate early gene 1 promoter, and the baculovirus 39K early-delayed early promoter, and the SV40 polyadenylation sequence. .
Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití v kvasinkových hostitelských buňkách zahrnují promotory systému α-mating kvasinek, promotoru kvasničné triózafosfátisomerázy (TPI), promotory z kvasinkových glykolytických genů nebo genů pro alkoholdehydrogenázu, promotor ADH2-4c a inducibilní promotor GAL.Examples of suitable control sequences for use in yeast host cells include the yeast α-mating system promoter, the yeast triose phosphate isomerase (TPI) promoter, the yeast glycolytic or alcohol dehydrogenase gene promoter, the ADH2-4c promoter, and the inducible GAL promoter.
Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití u vláknitých hub jako hostitelských buněk zahrnují promotor a terminátor ADH3, promotor odvozený od genů kódujících amylázatriózafosfátisomerázu TAKA nebo alkalickou proteázu Aspergillus oryzae, a-amylázu A. nigerExamples of suitable control sequences for use in filamentous fungi as host cells include the ADH3 promoter and terminator, the promoter derived from the genes encoding the amylase-triazine phosphate isomerase TAKA or the alkaline protease Aspergillus oryzae, α-amylase A. niger
• 4 • · nebo glukoamylázu A. nidulans, acetamidázu A. nidulans, aspartátproteinázu nebo lipásu Rhizomucor miehei, terminátor TPI1 a terminátor ADH3.Or A. nidulans glucoamylase, A. nidulans acetamidase, Rhizomucor miehei aspartate or lipase, TPI1 terminator, and ADH3 terminator.
Příklady vhodných řídících sekvencí pro použití v bakteriálních hostitelských buňkách zahrnují promotory systému tac, systému trp, systému TAC nebo TRC a hlavní promotorové oblasti fágu lambda.Examples of suitable control sequences for use in bacterial host cells include promoters of the tac system, trp system, TAC system or TRC, and the lambda phage main promoter regions.
Nukleotidová sekvence podle vynálezu kódující polypeptid interferonu β, ať už připravená místně specifickou mutagenezí, syntézou nebo jinými metodami, může nebo nemusí také obsahovat nukleotidovou sekvenci, která kóduje signální peptid. Signální peptid je přítomen, jestliže polypeptid se má sekrenovat z buněk, ve kterých je exprimován. Takový signálový peptid, pokud je přítomen, by měl být peptid rozpoznávaný buňkami zvolenými pro expresi polypeptidů. Signální peptid může být homologní (například může být normálně asociovaný s lidským interferonem β) nebo heterologní (tj. pocházející z jiného zdroje než lidský interferon β) vzhledem k peptidu, nebo může být homologní nebo heterologní vzhledem k hostitelské buňce, tj. signální peptid normálně exprimovaný hostitelskou buňkou nebo signální peptid, který se z hostitelské buňky normálně neexprimuje. Signální peptid by tedy měl být prokaryotický, např. odvozený z bakterie jako je E. coli, nebo eukaryotický, např. odvozený ze savčí, hmyzí nebo kvasinkové buňky.The nucleotide sequence of the invention encoding an interferon β polypeptide, whether prepared by site-specific mutagenesis, synthesis, or other methods, may or may not also contain a nucleotide sequence that encodes a signal peptide. The signal peptide is present when the polypeptide is to be secreted from the cells in which it is expressed. Such a signal peptide, if present, should be the peptide recognized by the cells selected for expression of the polypeptides. The signal peptide may be homologous (for example, it may be normally associated with human interferon β) or heterologous (ie, derived from a source other than human interferon β) with respect to the peptide, or may be homologous or heterologous to the host cell, ie. expressed by the host cell or a signal peptide that is not normally expressed from the host cell. Thus, the signal peptide should be prokaryotic, e.g., derived from a bacterium such as E. coli, or eukaryotic, e.g., derived from a mammalian, insect, or yeast cell.
Přítomnost nebo nepřítomnost signálního peptidu závisí například na expresní hostitelské buňce používané pro produkci polypeptidů, exprimovaném proteinu (zda jde o intracelulární nebo extracelulární protein), a zda je to vhodné pro dosažení sekrece. Pro použití ve vláknitých houbách může být signální peptid vhodně odvozený od genu kódujícího amylázu nebo glukoamylázu Aspergillus sp. genu kódujícího lipázu nebo proteázu Rhizomucor miehei nebo lipázu Humicola lanuginosa. Signální peptid je s výhodou odvozený od genu kódujícího amylázu TAKA A. oryzae, neutrální α-amylázu A.The presence or absence of a signal peptide depends, for example, on the expression host cell used to produce the polypeptide, the expressed protein (whether it is an intracellular or extracellular protein), and whether it is appropriate to achieve secretion. For use in filamentous fungi, the signal peptide may suitably be derived from the gene encoding the amylase or glucoamylase of Aspergillus sp. a gene encoding a lipase or protease of Rhizomucor miehei or a lipase of Humicola lanuginosa. The signal peptide is preferably derived from the gene encoding the amylase of TAKA A. oryzae, neutral α-amylase A.
• · · · · · · ··· * · ···· ·· · · ·· niger, amylázu stabilní v kyselém prostředí A. niger nebo glukoamylázu A. niger. Pro použití v hmyzích buňkách může být signální peptid vhodně odvozený od hmyzího genu (srovnej WO 90/05783), jako je prekurzor adipokinetického hormonu lepidoptery Manduca sexta (srovnej US 5,023,328), melittin včely medonosné (Invitrogen), ecdysteroid UDPglukosyltransferáza (egt) (Murphy a další, Protein Expression and Purification 4, 349 - 357 (1993) nebo lidská pankreatická lipáza (hpl) (Methods in Enzymology 284, str. 262 272, 1997).Niger, acid-stable amylase of A. niger or glucoamylase of A. niger. For use in insect cells, the signal peptide may suitably be derived from an insect gene (cf. WO 90/05783), such as the adipokinetic hormone precursor of lepidopters Manduca sexta (cf. US 5,023,328), honeybee melittin (Invitrogen), UDPglucosyltransferase (egt) ecdysteroid (egt) et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993) or human pancreatic lipase (hpl) (Methods in Enzymology 284, 262 262, 1997).
Výhodný signální peptid pro použití v savčích buňkách je signální peptid lidského interferonu β, jak je zřejmé z následujících příkladů, nebo signální peptid lehkého řetězce myšího Ig kappa (Coloma, M. (1992) J. Imm. Methods 152: 89 - 104). Pro použití v kvasinkových buňkách bylo zjištěno, že vhodné signální peptidy jsou signální peptid α-faktoru S. cerevisiae (srovnej US 4,870,008), signální peptid myší amylázy slin (srovnej O. Hagenbuchle a další, Nátuře 289, 1981, str. 643 - 646), modifikovaný signální peptid karboxypeptidázy (srovnej L. A. Valíš a další, Cell 48, 1987, str. 887 - 897), kvasinkový signální peptid BAR1 (srovnej WO 87/02670) a signální peptid kvasinkové aspartátové proteázy 3 (YAP3) (srovnej M. Egel-Mitani a další, Yeast 6, 1990, str. 127 - 137).A preferred signal peptide for use in mammalian cells is the human interferon β signal peptide as shown in the following examples, or the murine Ig kappa light chain signal peptide (Coloma, M. (1992) J. Imm. Methods 152: 89-104). For use in yeast cells, suitable signal peptides have been found to be S. cerevisiae α-factor signal peptide (cf. US 4,870,008), mouse saliva amylase signal peptide (cf. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646). ), a modified carboxypeptidase signal peptide (cf. LA Valis et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897), a yeast signal peptide BAR1 (cf. WO 87/02670) and a yeast aspartic protease 3 (YAP3) signal peptide (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137).
Pro produkci polypeptidu interferonu β může být použit jakýkoli vhodný hostitel včetně bakterií, hub (včetně kvasinek), rostlinných, hmyzích, savčích nebo dalších vhodných živočišných buněk nebo buněčných linií, stejně jako transgenních zvířat nebo rostlin. Příklady bakteriálních hostitelských buněk zahrnují grampozitivní bakterie, jako jsou kmeny Bacillus, například B. brevis nebo B. subtilis, Pseudomonas nebo Streptomyces, nebo gramnegativní bakterie, jako jsou kmeny E. coli. Zavedení vektoru do bakteriální buňky se může provádět například transformací protoplastů (viz např. Chang a Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111 - 115), s použitím • 4 ··Any suitable host, including bacteria, fungi (including yeast), plant, insect, mammalian or other suitable animal cells or cell lines, as well as transgenic animals or plants, can be used to produce the interferon β polypeptide. Examples of bacterial host cells include Gram positive bacteria such as Bacillus strains, for example B. brevis or B. subtilis, Pseudomonas or Streptomyces, or Gram-negative bacteria such as E. coli strains. Introduction of the vector into a bacterial cell can be accomplished, for example, by transformation of protoplasts (see, e.g., Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), using 4
• 4 4 4 4 ···· · 4 · · 4· kompetentních buněk (viz např. Young a Spizizin, 1961, Journal of Bacteríology 81: 823 - 829, nebo Dubnau a Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209 - 221), elektroporací (viz např. Shigekawa a Dower, 1988, Biotechniques 6: 742 - 751), nebo konjugací (viz např. Koehler a Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771 - 5278).Competent cells (see, eg, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56). : 209-221), by electroporation (see, eg, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), or by conjugation (see, eg, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771 - 5278).
Příklady vhodných hostitelských buněk založených na vláknitých houbách zahrnují kmeny Aspergillus, např. A. oryzae, A. niger, nebo A. nidulans, Fusarium nebo Trichoderma. Buňky hub mohou být transformovány procesem zahrnujícím vytvoření protoplastu, transformací protoplastu a regenerací buněčné stěny způsobem, který je sám o sobě známý. Vhodné postupy pro transformaci do hostitelských buněk Aspergillus se popisují v EP 238 023 a US 5,679,543. Vhodné způsoby transformace druhů Fusarium se popisují v Malardier a další, 1989, Gene 78: 147 - 156 a WO 96/00787. Kvasinky mohou být transformovány postupy popsanými v Becker a Guarente, v Abelson, J. N. a Simon, Μ. I, ed., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, díl 194, str. 182 - 187, Academie Press, lne., New York; Ito a další, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; a Hinnen a další, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.Examples of suitable filamentous fungal-based host cells include strains of Aspergillus, e.g., A. oryzae, A. niger, or A. nidulans, Fusarium or Trichoderma. Fungal cells can be transformed by a process comprising protoplast formation, protoplast transformation, and cell wall regeneration in a manner known per se. Suitable procedures for transformation into Aspergillus host cells are described in EP 238,023 and US 5,679,543. Suitable methods for transforming Fusarium species are described in Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 and WO 96/00787. Yeast can be transformed according to the procedures described in Becker and Guarente, in Abelson, J. N. and Simon, Μ. I, ed., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
Mezi vhodné kvasinkové hostitelské buňky patří kmeny Saccharomyces, např. S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, jako je P. pastoris nebo P. methanolica, Hansenula, jako je H. Polymorpha nebo Yarrowia. Způsoby transformace hostitelských buněk heterologní DNA a produkce heterologních polypeptidů těmito buňkami se popisují v publikacích Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA, USA (v protokolu výrobku Yeastmaker™ Yeast Tranformation System Kit), a v Reeves a další, FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193 - 198, Manivasakam a Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, díl 21, No. 18, str. 4414 - 69 • ·· ·* ·« ·· *· * · · · · · « 4 t · · 9 • · · · ··· t • · ··# 9 9 9Suitable yeast host cells include strains of Saccharomyces such as S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia such as P. pastoris or P. methanolica, Hansenula such as H. Polymorpha or Yarrowia. Methods for transforming heterologous DNA host cells and producing heterologous polypeptides by these cells are described in Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, in the Yeastmaker ™ Yeast Transformation System Kit protocol, and in Reeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198, Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 18, pp. 4414 - 69 • 4 t 9 t 9 9 t 9 9 9
999 9999 99 9999 99 9999999 9999 99 9999 99 9999
4415 a Ganeva a další, FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159 164.4415 and Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159 164.
Mezi případy vhodných hmyzích buněk patří buněčná linie Lepidoptora, jako je Spodoptera frugiperda (Sf9 nebo Sf21) nebo buňky Trichoplusioa ni (High Five) (US 5,077,214). Transformace hmyzích buněk a produkce heterologních polypeptidů těmito buňkami mohou být provedeny metodami popsanými firmou Invitrogen.Suitable insect cells include a Lepidoptora cell line such as Spodoptera frugiperda (Sf9 or Sf21) or Trichoplusioa ni (High Five) cells (US 5,077,214). Transformation of insect cells and production of heterologous polypeptides by these cells can be accomplished by the methods described by Invitrogen.
Mezi příklady vhodných savčích buněk patří buněčné linie vaječníků čínských křečků (CHO) (například CHO-K1; ATCC CCL-61), buněčné linie kočkodanů zelených (COS) (např. COS 1 (ATCC CRL1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); myší buňky (např. NS/O), buněčné linie ledvin mláďat křečků (BHK) (např. ATCC CRL-1632 nebo ATCC CCL-10), a lidské buňky (např. HEK 293 (ATCC CRL-1573)), stejně jako rostlinné buňky ve tkáňové kultuře. Další vhodné buněčné linie jsou v oboru známé a jsou dostupné z veřejných sbírek, jako je American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Savčí buňky jako jsou buňky CHO mohou být také modifikovány tak, aby exprimovaly sialyltransferázu, např. 1,6-sialyltransferázu, například jak se popisuje v US 5,047,335, pro poskytnutí zlepšení glykosylace polypeptidů interferonu β.Examples of suitable mammalian cells include Chinese Hamster Ovary (CHO) cell lines (e.g., CHO-K1; ATCC CCL-61), Green Vervet (COS) cell lines (eg, COS 1 (ATCC CRL1650), COS 7 (ATCC CRL-1651) )); mouse cells (eg NS / O), baby hamster kidney (BHK) cell lines (eg ATCC CRL-1632 or ATCC CCL-10), and human cells (eg HEK 293 (ATCC CRL-1573)), as well as plant cells in tissue culture. Other suitable cell lines are known in the art and are available from public collections such as the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Mammalian cells such as CHO cells can also be modified to express a sialyltransferase, eg, 1,6-sialyltransferase, for example, as described in US 5,047,335, to provide improved glycosylation of interferon β polypeptides.
Jako způsoby pro zavádění exogenní DNA do savčích hostitelských buněk lze použít transfekci s podporou fosforečnanu vápenatého, elektroporaci, transfekci pomocí DEAE-dextranu, transfekci pomocí liposomů, virových vektorů, a transfekční metody popisované v Life Technologies Ltd., Paisley, UK, s použitím materiálu Lipofectamin 2000, a u firmy Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA s použitím materiálu FuGENE 6. Tyto metody jsou v oboru dobře známé a popisují se například v Ausbel a další (ed.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA. Kultivace savčích buněk se provádějí zavedenými způsoby, například jak se popisuje v Animal Cell Biotechnology,Calcium phosphate-assisted transfection, electroporation, DEAE-dextran transfection, liposome transfection, viral vectors, and transfection methods described in Life Technologies Ltd., Paisley, UK, can be used as methods for introducing exogenous DNA into mammalian host cells. Lipofectamine 2000, and from Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA using FuGENE 6. These methods are well known in the art and are described, for example, in Ausbel et al., 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. , New York, USA. Culturing of mammalian cells is carried out by established methods, for example as described in Animal Cell Biotechnology,
• · · 4 4 4 4• · · 4 4 4 4
4 · ·· * · · · * · 44444 4444
Methods and Protocols, ed. Nigel Jenkins, 1999, Human Press lne., Totowa, New Jersey, USA a Harrison M. A. a Rae I. F., General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997). Při způsobech výroby podle předkládaného vynálezu se buňky kultivují v živném médiu vhodném pro produkci polypeptidů použitím v oboru známých metod. Buňka může být například kultivována v baňkách na třepačce, fermentací v malém nebo velkém měřítku (včetně kontinuální, vsádkové, doplňované vsádkové fermentace nebo fermentace na pevné fázi), v laboratorních nebo průmyslových fermentorech a ve vhodném médiu a za podmínek umožňujících expresi a/nebo izolaci polypeptidů. Kultivace probíhá ve vhodném živném médiu obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku a anorganické soli, použitím v oboru známých postupů. Vhodná média jsou dostupná od komerčních dodavatelů nebo mohou být připravena podle známých předpisů (například uvedených v katalozích American Type Culture Collection). Jestliže se polypeptid sekrenuje do živného média, může být izolován přímo z média. Jestliže se polypeptid nesekrenuje, může být izolován z buněčných lyzátů.Methods and Protocols, eds. Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA and Harrison M.A. and Rae I.F., General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997). In the production methods of the present invention, cells are cultured in a nutrient medium suitable for producing polypeptides using methods known in the art. For example, the cell may be cultured in shake flasks, small or large scale fermentation (including continuous, batch, fed batch or solid phase fermentation), laboratory or industrial fermenters, and in a suitable medium and under conditions allowing expression and / or isolation. of polypeptides. The cultivation takes place in a suitable nutrient medium containing carbon and nitrogen sources and inorganic salts, using methods known in the art. Suitable media are available from commercial suppliers or may be prepared according to known regulations (for example, listed in the American Type Culture Collection catalogs). If the polypeptide is secreted into the nutrient medium, it can be isolated directly from the medium. If the polypeptide is not secreted, it can be isolated from cell lysates.
Výsledný polypeptid může být izolován metodami známými v oboru. Polypeptid může být například izolován z živného média použitím běžných postupů včetně bez omezení centrifugace, filtrace, extrakce, rozprašovacího sušení, odpařování nebo srážení.The resulting polypeptide can be isolated by methods known in the art. For example, the polypeptide may be isolated from the nutrient medium using conventional procedures including, but not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation, or precipitation.
Polypeptidy mohou být čištěny řadou způsobů známých v oboru, včetně bez omezení chromatografie (například iontoměničové, afinitní, hydrofobní, chromatofokusací a chromatografií typu size exclusion), elektroforetickými metodami (například preparativní isoelektrickou fokusací), diferenciální rozpustností (například srážením síranem amonným), SDS PAGE, nebo extrakcí (viz např. Protein Purification, J.-C. Janson a Lars Ryden, ed., VCH Publishers, New York, 1989). Specifické metody čištění polypeptidů s aktivitou interferonu β se popisují v US 4,289,689, US 4,359,389, US 4,172,071, US 4,551,271, US 5,244,655, US US 4,257,938 a US 4,541,952. Specifický způsob • · čištění je založen na imunoafinitní purifikaci (viz např. Okamura a další, „Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography and N-Terminal Amino Acid Sequence“, Biochem., 19, str. 3831 - 35 (1980)). Dále může být čištění založeno na použití IFNAR 1 a/nebo IFNAR 2, zvláště IFNAR 2.Polypeptides can be purified by a variety of methods known in the art, including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromatofocusing and size exclusion chromatography), electrophoretic methods (e.g., preparative isoelectric focusing), differential solubility (e.g., ammonium sulfate precipitation), SDS PAGE , or by extraction (see, e.g., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, ed., VCH Publishers, New York, 1989). Specific methods for purifying polypeptides with interferon-beta activity are described in US 4,289,689, US 4,359,389, US 4,172,071, US 4,551,271, US 5,244,655, US 4,257,938 and US 4,541,952. A specific method of purification is based on immunoaffinity purification (see, e.g., Okamura et al., "Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography and N-Terminal Amino Acid Sequence", Biochem., 19, 3831-35 (1980)). Further, the purification may be based on the use of IFNAR 1 and / or IFNAR 2, in particular IFNAR 2.
Biologická aktivita polypeptidů interferonu β může být zjišťována jakýmkoli v oboru známým způsobem. Mezi tyto testy patří neutralizace antivirové aktivity protilátkami, indukce proteinkinázy, zjišťování aktivity oligoadenylát-2,5-A-syntetázy nebo fosfodiesterázy, jak se popisuje v EP 41313 B1. Do těchto testů také patří testy imunomodulace (viz např. US 4,753,795), testy inhibice růstu a měření vazby na buňky exprimující receptory interferonu. Specifické testy pro zjišťování biologické aktivity polypeptidů nebo konjugátů podle vynálezu se popisují v části Materiály a metody uvedené dále.The biological activity of interferon β polypeptides can be determined by any method known in the art. These assays include neutralizing antiviral activity by antibodies, inducing protein kinase, detecting oligoadenylate-2,5-A synthetase activity or phosphodiesterase as described in EP 41313 B1. These assays also include immunomodulation assays (see, eg, US 4,753,795), growth inhibition assays, and measurement of binding to cells expressing interferon receptors. Specific assays for determining the biological activity of the polypeptides or conjugates of the invention are described in the Materials and Methods section below.
Kultivace buněk podle vynálezuCulturing the cells of the invention
Další provedení vynálezu se týká kultivace buněk, která zahrnuje následující složky: a) hostitelská buňka transformovaná nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid s aktivitou interferonu β, a b) kultivační médium obsahující uvedený polypeptid vytvořený expresí nukleotidové sekvence v koncentraci alespoň 800 000 lU/ml média, s výhodou v koncentraci v rozmezí 800 000 až 3 500 000 lU/ml média. I když může být polypeptid s aktivitou interferonu α interferon β standardního typu, například lidský interferon β nebo jeho varianta (například interferon β 1a nebo 1b), polypeptid je s výhodou polypeptid interferon β popsaný v předkládaném vynálezu.Another embodiment of the invention relates to cell culture comprising the following components: a) a host cell transformed with a nucleotide sequence encoding a polypeptide having interferon β activity, and b) a culture medium comprising said polypeptide produced by expressing the nucleotide sequence at a concentration of at least 800,000 IU / ml medium, preferably at a concentration ranging from 800,000 to 3,500,000 IU / ml medium. Although the polypeptide having interferon α activity may be a wild-type interferon, such as human interferon β or a variant thereof (e.g., interferon β 1a or 1b), the polypeptide is preferably an interferon β polypeptide described in the present invention.
V ještě dalším provedení se vynález týká způsobů výroby polypeptidu interferonu β, kde tento způsob zahrnuje:In yet another embodiment, the invention relates to methods for producing an interferon β polypeptide, the method comprising:
(a) kultivaci buňky exprimující variantu polypeptidu interferonu β v kultivačním médiu, takže koncentrace varianty polypeptidu(a) culturing the cell expressing the variant interferon β polypeptide in a culture medium such that the concentration of the variant polypeptide
interferonu β v médiu je alespoň 800 000 lU/ml média, zvláště v rozmezí mezi 800 000 a 3 500 000 lU/ml média; a (b) polypeptid interferonu β se izoluje.interferon β in the medium is at least 800,000 IU / ml medium, especially in the range between 800,000 and 3,500,000 IU / ml medium; and (b) isolating the interferon β polypeptide.
Další způsoby podle vynálezuOther methods of the invention
V ještě dalším provedení se vynález týká způsobu snížení imunogenicity a/nebo zvýšení funkčního poločasu in vivo a/nebo poločasu v séru polypeptidu interferonu β, kde tento způsob zahrnuje zavedení aminokyselinového zbytku tvořícího vazebnou skupinu pro první nepolypeptidovou část do polohy vystavené na povrchu proteinu, která takovou skupinu neobsahuje, a/nebo odstranění zbytku aminokyseliny tvořícího vazebnou skupinu pro první nepolypeptidovou část a vystavení získaného modifikovaného peptidu konjugaci s první nepolypeptidovou částí.In yet another embodiment, the invention relates to a method of decreasing immunogenicity and / or increasing the functional half-life in vivo and / or serum half-life of an interferon β polypeptide, the method comprising introducing the amino acid residue forming the binding group for the first non-polypeptide moiety into a position exposed on the protein surface and / or removing the amino acid residue forming the linking group for the first non-polypeptide moiety and exposing the obtained modified peptide to conjugation with the first non-polypeptide moiety.
Aminokyselinový zbytek, který se má vložit a/nebo odstranit, se s výhodou definuje v předkládaném vynálezu. Nepolypeptidové část se obvykle volí ze skupiny zahrnující polymerní molekulu, cukernou část, lipofilní skupinu a organické derivatizační činidlo.The amino acid residue to be inserted and / or removed is preferably defined in the present invention. The non-polypeptide moiety is typically selected from the group consisting of a polymer molecule, a sugar moiety, a lipophilic moiety, and an organic derivatizing agent.
V ještě dalším provedení se vynález týká způsobu výroby konjugátu podle vynálezu, kde polypeptid interferonu β se ponechá reagovat s nepolypeptidovou částí, ke které má být konjugován, za podmínek vedoucích k dosažení konjugace, a konjugát se izoluje.In yet another embodiment, the invention relates to a method of making a conjugate of the invention, wherein the interferon β polypeptide is reacted with the non-polypeptide moiety to be conjugated under conditions resulting in conjugation, and the conjugate is isolated.
Farmaceuticky prostředek a použití konjugátu podle vynálezuPharmaceutical composition and use of the conjugate of the invention
Polypeptid interferonu β nebo konjugát podle vynálezu se podává v přibližně podobné dávce jako se používá při léčení lidským interferonem β, jako je Avonex, Rebif a Betaseron, nebo ve vyšších dávkách. Přesná podávaná dávka závisí na okolnostech. Normálně by dávka měla být schopná zabránit snížení vážnosti nebo šíření stavu, • «· 99 ·· 99 99 *•9 9 · « ♦ · 9 9··The interferon β polypeptide or conjugate of the invention is administered at approximately similar doses to those used in the treatment of human interferon β such as Avonex, Rebif and Betaseron, or at higher doses. The exact dose administered depends on the circumstances. Normally, the dose should be able to prevent a decrease in severity or spread of the condition.
9 9 * 9 9 9 ••9 9 · 9 «9 99·« «· »·99 nebo léčeného onemocnění. Odborníkům v oboru bude zřejmé, že účinné množství polypeptidu, konjugátu nebo prostředku podle vynálezu závisí mj. na onemocnění, dávce, schématu podávání, zda se polypeptid nebo konjugát nebo prostředek podávají samostatně nebo spolu s dalšími léčivy, poločasu prostředků v séru a obecném zdravodním stavu pacienta.9 9 * 9 9 9 •• 9 9 · 9 «9 99 ·« «·» · 99 or the disease being treated. It will be appreciated by those skilled in the art that an effective amount of a polypeptide, conjugate or composition of the invention depends, inter alia, on the disease, dose, administration schedule, whether the polypeptide or conjugate or composition is administered alone or together with other drugs, serum half-life and general health. patient.
Polypeptid nebo konjugát podle vynálezu mohou být použity „jako takové“ a/nebo ve formě svých solí. Mezi vhodné soli patří bez omezení soli s alkalickými kovy nebo kovy alkalických zemin, jako je sodík, draslík, lithium, vápník a hořčík, stejně jako například soli zinku. Tyto soli nebo komplexy mohou být přítomny jako krystalické a/nebo amorfní struktury.The polypeptide or conjugate of the invention may be used "as such" and / or in the form of its salts. Suitable salts include, but are not limited to, alkali metal or alkaline earth metal salts such as sodium, potassium, lithium, calcium, and magnesium, as well as, for example, zinc salts. These salts or complexes may be present as crystalline and / or amorphous structures.
Polypeptid nebo konjugát podle vynálezu se s výhodou podává v prostředku obsahujícím farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku. „Farmaceuticky přijatelný“ znamená nosič nebo pomocnou látku, která nezpůsobuje nežádoucí účinky u pacientů, kterým se podává. Takové farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky jsou v oboru dobře známé.The polypeptide or conjugate of the invention is preferably administered in a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. "Pharmaceutically acceptable" means a carrier or excipient that does not cause adverse effects in patients to which it is administered. Such pharmaceutically acceptable carriers and excipients are well known in the art.
Polypeptid nebo konjugát podle vynálezu může být formulován do farmaceutických prostředků známými způsoby. Vhodné formulace se popisují v US 5,183,746, publikaci Remingtoďs Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, 18th ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer a L. Hovgaard, ed., Taylor & Francis [2000]; a Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., A. Kibbe, ed., Pharmaceutical Press [2000]).The polypeptide or conjugate of the invention may be formulated into pharmaceutical compositions by known methods. Suitable formulations are described in US 5,183,746, Remington's Pharmaceutical Sciences, EW Martin, 18 th ed., AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3 rd ed., A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).
Farmaceutický prostředek obsahující polypeptid nebo konjugát podle vynálezu může být formulován v řadě forem, včetně kapaliny, gelu, lyofilizovaného prostředku, disperze pro podávání do plic nebo v jakékoli jiné vhodné formě, například ve formě slisované pevné látky.The pharmaceutical composition comprising the polypeptide or conjugate of the invention may be formulated in a variety of forms, including liquid, gel, lyophilized composition, dispersion for pulmonary administration, or any other suitable form, such as a compressed solid.
- 74 9 ·· ·· 99 99 «9 • · «999 99«ft • * ♦ 9 9 9 9 ••9 9 999 9 9 • 9 9 9 9 9 9 ••99 99 9999 |» 9999- 74 9 ·· ·· 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Výhodná forma bude záviset na konkrétním léčeném onemocnění a bude zřejmá odborníkům v oboru.The preferred form will depend on the particular disease being treated and will be apparent to those skilled in the art.
Farmaceutický prostředek obsahující polypeptid nebo konjugát podle vynálezu může být podáván orálně, intravenózně, intracerebrálně, intramuskulárně, intraperitoneálně, intradermálně, subkutánně, intranazálně, intrapulmonárně, inhalačně nebo jakýmkoli jiným přijatelným způsobem, například technologií PowderJect nebo ProLease. Výhodný způsob podávání bude záviset na konkrétním léčeném stavu a bude zřejmý odborníkům v oboru.The pharmaceutical composition comprising the polypeptide or conjugate of the invention may be administered orally, intravenously, intracerebrally, intramuscularly, intraperitoneally, intradermally, subcutaneously, intranasally, intrapulmonarily, by inhalation or by any other acceptable means, for example PowderJect or ProLease technology. The preferred mode of administration will depend on the particular condition being treated and will be apparent to those skilled in the art.
Parenterální prostředkyParenteral preparations
Příkladem farmaceutického prostředku je roztok navržený pro parenterální podávání. Ačkoli v mnoha případech se poskytují formulace farmaceutického roztoku v kapalné formě vhodné pro okamžité použití, tyto parenterální formulace mohou být také poskytovány ve zmrazené nebo lyofilizované formě. Prostředky ve zmrazené formě musí být před použitím rozmraženy. Prostředky v lyofilizované formě se často používají pro zvýšení stability účinné sloučeniny obsažené v prostředku v širším rozmezí podmínek skladování, protože odborníkům v oboru je zřejmé, že lyofilizované preparáty jsou obecně stabilnější než jejich kapalné protějšky. Tyto lyofilizované preparáty se před použitím rekonstituují přidáním jednoho nebo více vhodných farmaceuticky přijatelných řediv, jako je sterilní voda pro injekce nebo sterilní fyziologický roztok.An example of a pharmaceutical composition is a solution designed for parenteral administration. Although in many cases pharmaceutical solution formulations are provided in a ready-to-use liquid form, these parenteral formulations may also be provided in frozen or lyophilized form. Products in frozen form must be thawed before use. Compositions in lyophilized form are often used to enhance the stability of the active compound contained in the composition over a wide range of storage conditions, as those skilled in the art will recognize that lyophilized preparations are generally more stable than their liquid counterparts. These lyophilized preparations are reconstituted prior to use by the addition of one or more suitable pharmaceutically acceptable diluents such as sterile water for injection or sterile saline.
V případě parenterálních prostředků se tyto prostředky připravují pro skladování ve formě lyofilizovaných formulací nebo vodných roztoků vhodným mícháním polypeptidu s požadovaným stupněm čistoty s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, pomocnými látkami nebo stabilizátory typicky používanými v oboru (kde všechny tyto látky se souhrnně označují jako „pomocné látky“), například pufry, stabilizátory, ochrannými látkami, látkami upravujícímiFor parenteral compositions, these compositions are prepared for storage in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions by appropriately mixing the polypeptide of the desired degree of purity with one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers typically used in the art (all of which are collectively referred to as " excipients "), such as buffers, stabilizers, preservatives, conditioning agents
4444
4« 4 ·»4 «3 ·»
4 4 ·4 4 ·
4 4 ·4 4 ·
444 >44444> 44
44444444
4444
4 4 44 4 4
4 «4 «
4 44 4
4444 osmotický tlak roztoku, neiontovými detergenty, antioxidanty a/nebo jinými aditivy různých typů.4444 solution osmotic pressure, nonionic detergents, antioxidants and / or other additives of various types.
Pufrační látky napomáhají udržet pH v rozmezí, které se podobá fyziologickým podmínkám. Jsou typicky přítomny v rozmezí koncentrací od přibližně 2 mM do přibližně 50 mM. Mezi vhodné pufrační látky pro použití v rámci předkládaného vynálezu patří organické i anorganické kyseliny a jejich soli, jako jsou citrátové pufry (tj. směs dihydrogencitranu sodného a hydrogencitranu sodného, směs kyselina citronová-citran trojsodný, směs kyselina citronovádihydrogencitran sodný atd.), sukcinátové pufry (například směs kyselina jantarová-monosodná sůl sukcinátu, kyselina jantarováhydroxid sodný, kyselina jantarová-dvojsodná sůl sukcinátu atd.), tartrátové pufry (například kyselina vinná-monosodná sůl kyseliny vinné, kyselina vinná-draselná sůl kyseliny vinné, kyselina vinnáhydroxid sodný atd.), fumarátové pufry (například kyselina fumarovámonosodná sůl kyseliny fumarové, kyselina fumarová-dvojsodná sůl kyseliny fumarové, monosodná sůl kyseliny fumarové-dvojsodná sůl kyseliny fumarové atd.), glukonátové pufry (například směs kyselina glukonová-monosodná sůl kyseliny glukonové, kyselina glukonováhydroxid sodný, kyselina glukonová-draselná sůl kyseliny glukonové atd.), oxalátový pufr (například kyselina šťavelová-šťavelan sodný, kyselina šťavelová-hydroxid sodný, kyselina šťavelová-šťavelan draselný atd.), laktátové pufry (například kyselina mléčná-laktát sodný, kyselina mléčná-hydroxid sodný, kyselina mléčná-laktát draselný atd.) a acetátové pufry (například kyselina octová-octan sodný, kyselina octová-hydroxid sodný atd.). Další možnosti jsou fosfátové pufry, histidinové pufry a soli trimethylaminu, jako je Tris.Buffering agents help to maintain the pH within a range that is similar to physiological conditions. They are typically present in a concentration range of from about 2 mM to about 50 mM. Suitable buffering agents for use in the present invention include organic and inorganic acids and salts thereof, such as citrate buffers (i.e., a mixture of sodium dihydrogen citrate and sodium hydrogen citrate, citric acid trisodium citrate, sodium citrate dihydrogen citrate, etc.), succinate buffers. (e.g. succinic acid monosodium salt, succinic acid sodium hydroxide, succinic acid disodium salt, etc.), tartrate buffers (e.g., tartaric-monosodium tartaric acid, tartaric-potassium tartaric acid, sodium tartaric acid, etc.) , fumarate buffers (e.g. fumaric acid monosodium fumaric acid, fumaric acid-disodium fumaric acid, monosodium fumaric acid-disodium fumaric acid, etc.), gluconate buffers (for example, gluconic acid-monosodium gluconic acid mixture, sodium gluconate, gluconic acid-potassium salt of gluconic acid, etc.), oxalate buffer (e.g. oxalic-sodium oxalate, oxalic-sodium hydroxide, oxalic-potassium oxalate, etc.), lactate buffers (e.g., lactic acid-sodium lactate, acid) lactic-sodium hydroxide, lactic acid-potassium lactate, etc.) and acetate buffers (e.g., acetic acid-sodium acetate, acetic acid-sodium hydroxide, etc.). Other options are phosphate buffers, histidine buffers, and trimethylamine salts such as Tris.
Ochranné látky se přidávají pro zpomalení růstu mikrobů, a typicky se přidávají v množstvích přibližně 0,2 % až 1 % (hmotn./obj.). Mezi vhodné ochranné látky pro použití v rámci předkládaného vynálezu patří fenol, benzylalkohol, metakresol, methylparaben, propylparaben, oktadecyldimethyibenzylamonium76 • 44 ·♦ 4« 44 44The preservatives are added to retard microbial growth, and are typically added in amounts of about 0.2% to 1% (w / v). Suitable preservatives for use in the present invention include phenol, benzyl alcohol, metacresol, methylparaben, propylparaben, octadecyldimethyibenzylammonium76 • 44 · ♦ 4 «44 44
4 4 4444 4 4 4 44 4444 4 4 4 4
444 444 4 • 4444 4444 4 ·· 444 444444 444 4 • 4444 4444 4 ·· 444 444
444 4444 >4 4444 44 4444444 4444> 4,444 44,444
-chlorid, benzalkoniumhalidy (např. benzalkoniumchlorid, -bromid nebo -jodid), hexamethoniumchlorid, alkylparabeny jako je methyl- nebo propylparaben, katechol, resorcinol, cyklohexanol a 3-pentanol.-chloride, benzalkonium halides (e.g. benzalkonium chloride, -bromide or -iodide), hexamethonium chloride, alkyl parabens such as methyl or propyl paraben, catechol, resorcinol, cyclohexanol and 3-pentanol.
Látky pro úpravu osmotického tlaku do isotonického stavu se přidávají pro zajištění isotonicity kapalných prostředků a obsahují cukerné polyhydroxyalkoholy, s výhodou trihydroxy nebo vyšší cukerné alkoholy, jako je glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol a mannitol. Polyhydroxyalkoholy mohou být přítomny v množství mezi 0,1 % a 25 % hmotnostními, typicky 1 % až 5 %, přičemž se berou v úvahu relativní množství jiných složek.The isotonicity adjusting agents are added to provide isotonicity of the liquid compositions and contain sugar polyhydroxy alcohols, preferably trihydroxy or higher sugar alcohols such as glycerol, erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol and mannitol. The polyhydroxy alcohols may be present in an amount between 0.1% and 25% by weight, typically 1% to 5%, taking into account the relative amounts of the other components.
Stabilizátory označují širokou skupinu pomocných látek, jejichž působení spočívá ve vytvoření potřebného objemu prostředku až po solubilizaci terapeutického prostředku nebo napomáhání nebo zabránění denaturaci nebo adhezi ke stěně nádoby. Typické stabilizátory budou cukerné polyhydroxyalkoholy (uvedené výše); aminokyseliny jako je arginin, lysin, glycin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, omithin, L-leucin, 2-fenylalanin, kyselina glutamová, threonin, atd., organické cukry nebo cukerné alkoholy jako je laktóza, trehalóza, stachyóza, mannitol, sorbitol, xylitol, ribitol, myoinisitol, galaktitol, glycerol apod., včetně cyklitoiů jako je inositol; polyethylenglykol; polymery aminokyselin; redukční činidla s obsahem síry jako je močovina, glutathion, kyselina thioktová, thioglykolát sodný, thioglycerol, cc-monothioglycerol a thiosulfát sodný; nízkomolekulární polypeptidy (tj. obsahující <10 zbytků aminokyselin); proteiny jako je lidský sérový albumin, bovinní sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery jako je polyvinylpyrrolidon; monosacharidy jako je xylóza, mannóza, fruktóza a glukóza; disacharidy jako je laktóza, maltóza a sacharóza; trisacharidy jako je rafinóza, a polysacharidy jako je dextran. Stabilizátory jsou typicky přítomny v množství 0,1 až 10 000 dílů hmotnostních, vztaženo na hmotnost účinného proteinu.Stabilizers refer to a wide variety of excipients whose action consists in providing the required volume of the composition only after solubilizing the therapeutic composition or assisting or preventing denaturation or adhesion to the container wall. Typical stabilizers will be sugar polyhydroxy alcohols (mentioned above); amino acids such as arginine, lysine, glycine, glutamine, asparagine, histidine, alanine, omithine, L-leucine, 2-phenylalanine, glutamic acid, threonine, etc., organic sugars or sugar alcohols such as lactose, trehalose, stachyose, mannitol, sorbitol, xylitol, ribitol, myoinisitol, galactitol, glycerol and the like, including cyclitols such as inositol; polyethylene glycol; amino acid polymers; sulfur-containing reducing agents such as urea, glutathione, thioctic acid, sodium thioglycolate, thioglycerol, α-monothioglycerol, and sodium thiosulfate; low molecular weight polypeptides (ie containing <10 amino acid residues); proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; monosaccharides such as xylose, mannose, fructose and glucose; disaccharides such as lactose, maltose and sucrose; trisaccharides such as raffinose, and polysaccharides such as dextran. The stabilizers are typically present in an amount of 0.1 to 10,000 parts by weight based on the weight of the active protein.
• · · · · « · <·· ·« ···· ·· ····• · · · <<«· · · · ·
Neiontové povrchově aktivní látky nebo detergenty (známé také jako „smáčedla“) mohou být přítomny, aby pomohly solubilizovat terapeutický prostředek a chránit terapeutický polypeptid proti agregaci způsobené mícháním, což také napomáhá vystavení prostředku působení střižných povrchových sil, aniž by došlo k denaturaci polypeptídu. Mezi vhodné neiontové povrchově aktivní látky patří polysorbáty (20, 80 atd.), polyoxamery (184, 188 atd.), polyoly Pluronic®, polyoxyethylensorbitanmonoethery (Tween®-20, Tween®-80, atd.).Nonionic surfactants or detergents (also known as "wetting agents") may be present to help solubilize the therapeutic agent and protect the therapeutic polypeptide from aggregation caused by agitation, which also aids exposure of the agent to shear surface forces without denaturing the polypeptide. Suitable nonionic surfactants include polysorbates (20, 80, etc.), polyoxamers (184, 188, etc.), Pluronic® polyols, polyoxyethylene sorbitan monoethers (Tween®-20, Tween®-80, etc.).
Mezi další pomocné látky jiných typů patří objemotvorné látky jako jsou plniva (například škrob), chelatační látky (například EDTA), antioxidanty (např. kyselina askorbová, methionin, vitamin E) a pomocná rozpouštědla. Účinná složka může být také zachycena v mikropouzdrech, která se například připravují technologií koacervace nebo mezipovrchovou polymerací, například v mikropouzdrech z hydroxymethylcelulózy, želatiny nebo poly-(methylmethakrylátu), v koloidních systémech pro dodávání léčiv (například liposomech, albuminových mikrokuličkách, mikroemulzích, nanočásticích a nanokapslích) nebo ve formě mikroemulzí. Tyto způsoby se popisují v publikaci Remington’s Pharmaceutical Sciences, výše.Other excipients of other types include bulking agents such as fillers (e.g. starch), chelating agents (e.g. EDTA), antioxidants (e.g. ascorbic acid, methionine, vitamin E) and co-solvents. The active ingredient may also be entrapped in microcapsules, for example prepared by coacervation technology or by interfacial polymerization, e.g. in hydroxymethylcellulose, gelatin or poly (methyl methacrylate) microcapsules, in colloidal drug delivery systems (e.g. liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles) nanocapsules) or in the form of microemulsions. These methods are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Parenterální prostředky pro použití k podávání in vivo musí být sterilní. Tento požadavek se snadno splní například filtrací přes sterilní filtrační membrány.Parenteral compositions for use in vivo must be sterile. This requirement is readily accomplished, for example, by filtration through sterile filtration membranes.
Prostředky s prodlouženým uvolňovánímSustained-release preparations
Mezi příklady prostředků s prodlouženým uvolňováním patří semipermeabilní matrice pevných hydrofobních polymerů obsahujících polypeptid nebo konjugát, kde tyto matrice mají vhodnou formu jako je film nebo mikrokapsle. Příklady matric s prodlouženým uvolňováním zahrnují polyestery, hydrogely (například poly(2-hydroxyethyl-methakrylát) nebo poly(vinylalkohol)), polylaktidy, kopolymery kyselinyExamples of sustained release compositions include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing a polypeptide or conjugate, which matrices are in a suitable form such as a film or microcapsule. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (e.g. poly (2-hydroxyethyl methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactides, acid copolymers
L-glutamové a ethyl-L-glutamát, nedegradovatelný ethylenvinylacetát, degradovatelné kopolymery kyseliny mléčné a kyseliny glykolové, jako je technologie ProLease® technology nebo Lupron Depot® (injikovatelné mikrokuličky složené z kopolymerů kyseliny mléčné a kyseliny glykolové a acetátu leuprolidu), a kyselina poly-D-(-)-3-hydroxymáselná. Zatímco polymery jako je ethylenvinylacetát a kyselina mléčná - kyselina glykolová, umožňují uvolňování molekul dlouhodobě, jako například až do nebo více než 100 dnů, některé hydrogely uvolňují proteiny po kratší časová období. Jestliže zapouzdřené polypeptidy zůstávají v těle po delší dobu, mohou se denaturovat nebo agregovat důsledkem vystavení vlhkosti při 37 °C, což vede k úbytku biologické aktivity a možným změnám v imunogenicitě. Pro stabilizaci mohou být v závislosti na použitém mechanismu použity vhodné strategie. Například jestliže se zjistí, že mechanismem agregace je intermolekulární vazba S-S vytvořená záměnou thiodisulfidů, stabilizace může být dosažena modifikací sulfhydrylových zbytků, lyofilizací z kyselých roztoků, řízením obsahu vlhkosti, použitím vhodných aditiv a vyvinutím prostředků založených na specifických matricích.L-glutamic and ethyl L-glutamate, non-degradable ethylene vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as ProLease® technology or Lupron Depot® (injectable microspheres composed of copolymers of lactic acid and glycolic acid and leuprolide acetate), and poly acid -D - (-) - 3-hydroxybutyric. While polymers such as ethylene vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid allow the release of molecules in the long term, such as up to or more than 100 days, some hydrogels release proteins for shorter periods of time. If encapsulated polypeptides remain in the body for an extended period of time, they may denature or aggregate as a result of exposure to moisture at 37 ° C, resulting in a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Appropriate strategies may be used for stabilization, depending on the mechanism used. For example, if it is found that the aggregation mechanism is an S-S intermolecular bond formed by a replacement of thiodisulfides, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilizing from acidic solutions, controlling moisture content, using appropriate additives, and developing formulations based on specific matrices.
Dodávání do plicDelivery to the lungs
Formulace konjugátu vhodné pro použití s nebulizérem, buď tryskovým nebo ultrazvukovým, budou typicky obsahovat konjugát rozpuštěný ve vodě v koncentraci například přibližně 0,01 až 25 mg konjugátu na ml roztoku, s výhodou přibližně 0,1 až 10 mg/ml. Formulace může také obsahovat pufr a jednoduchý cukr (například pro stabilizaci proteinu a regulaci osmotického tlaku) a/nebo lidský sérový albumin v rozmezí koncentrací od 0,1 do 10 mg/ml. Příklady použitelných pufrů jsou octan sodný, citrát a glycin. Pufr bude mít s výhodou složení a molaritu vhodné pro nastavení jeho pH do rozmezí 3 až 9. Pro tento účel jsou obecně vhodné molární • · · · · · ' Μ φ • · · · φ φ φ • · · · Φφφφ φ * * · · · · Φ • · · · * · φ Φ · · · · Φ · φ koncentrace pufrů od 1 mM do 50 mM. Příklady cukrů, které mohou být použity, jsou laktóza, maltóza, mannitol, sorbitol, trehalóza a xylóza, obvykle v množstvích od 1 % do 10 % hmotnostních prostředku.Conjugate formulations suitable for use with a nebulizer, either jet or ultrasonic, will typically contain the conjugate dissolved in water at a concentration of, for example, about 0.01 to 25 mg of conjugate per ml of solution, preferably about 0.1 to 10 mg / ml. The formulation may also contain a buffer and a simple sugar (for example, for protein stabilization and regulation of osmotic pressure) and / or human serum albumin in a concentration range of 0.1 to 10 mg / ml. Examples of useful buffers are sodium acetate, citrate and glycine. The buffer will preferably have a composition and molarity suitable for adjusting its pH to a range of 3 to 9. Molar moieties are generally suitable for this purpose. Buffer concentrations from 1 mM to 50 mM. Examples of sugars that can be used are lactose, maltose, mannitol, sorbitol, trehalose and xylose, usually in amounts of from 1% to 10% by weight of the composition.
Prostředek pro nebulizér může také obsahovat povrchově aktivní látku pro snížení nebo zamezení povrchově indukované agregace proteinu způsobené atomizací roztoku při vytváření aerosolu. Mohou být použity běžné povrchově aktivní látky, jako jsou polyoxyethylenové estery mastných kyselin a alkoholy, a polyoxyethylensorbitanové estery mastných kyselin. Jejich množství budou obecně mezi 0,001 % a 4 % hmotnostními, vztaženo na farmaceutický prostředek. Zvláště výhodná povrchově aktivní látka pro účely tohoto vynálezu je polyoxyethylensorbitanmonooleát.The nebulizer composition may also contain a surfactant to reduce or prevent surface-induced protein aggregation caused by atomizing the solution to form an aerosol. Conventional surfactants such as polyoxyethylene fatty acid esters and alcohols and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters can be used. The amounts will generally be between 0.001% and 4% by weight of the pharmaceutical composition. A particularly preferred surfactant for the purposes of this invention is polyoxyethylene sorbitan monooleate.
Specifické prostředky a způsoby tvorby vhodných disperzí kapalných částic podle vynálezu se popisují ve WO 9420069, US 5915378, US 5960792, US 5957124, US 5934272, US 5915378, US 5855564, US 5826570 a US 5522385, které jsou tímto zařazeny odkazem.Specific compositions and methods for making suitable liquid particle dispersions of the invention are described in WO 9420069, US 5915378, US 5960792, US 5957124, US 5934272, US 5915378, US 5855564, US 5826570 and US 5522385, which are hereby incorporated by reference.
Jako tři konkrétní příklady komerčně dostupných nebulizérů vhodných pro použití v rámci předkládaného vynálezu jsou zařízení Ultravent nebulizer firmy Mallinckrodt, lne., St. Louis, Mo., Acorn II nebulizer firmy Marquest Medical Products, Englewood, Colorado, a AERx pulmonary drug delivery systém dodávaný firmou Aradigm Corporation, Hayward, California.As three specific examples of commercially available nebulizers suitable for use in the present invention are Ultravent nebulizer devices from Mallinckrodt, Inc. Louis, Mo., Acorn II nebulizer from Marquest Medical Products, Englewood, Colorado, and the AERx pulmonary drug delivery system supplied by Aradigm Corporation, Hayward, California.
Prostředky s obsahem konjugátů pro použití v inhalátorech s odměřovanou dávkou budou obecně obsahovat jemnozrnný prášek. Tento prášek se může vyrábět lyofilizací a potom mletím kapalného prostředku s obsahem konjugátu a může obsahovat stabilizátor jako je lidský sérový albumin (HSA). Typicky se přidává více než 0,5 % (hmotn./hmotn.) HSA. Navíc je podle potřeby možno přidat k prostředku jeden nebo více cukrů nebo cukerných alkoholů. MeziConjugate formulations for use in metered dose inhalers will generally contain a fine-grained powder. This powder may be made by lyophilization and then milling of a liquid conjugate-containing composition and may contain a stabilizer such as human serum albumin (HSA). Typically, greater than 0.5% (w / w) HSA is added. In addition, one or more sugars or sugar alcohols may be added to the composition as desired. Between
4» 4« • 4 4 44 4 »4 4
4 44 4
4 44 4
444«444 «
44- 44 • «4 4 • 4 444-44 • «4 4 • 4 4
4«4 «
4444 příklady lze uvést laktózu, maltózu, mannitol, sorbitol, sorbitózu, trehalózu, xylitol a xylózu. Množství přidané k prostředku se může pohybovat od přibližně 0,01 do 200 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od přibližně 1 do 50 % přítomného konjugátu. Tyto prostředky se potom lyofilizují a melou na požadovanou velikost částic.4444 examples include lactose, maltose, mannitol, sorbitol, sorbitose, trehalose, xylitol and xylose. The amount added to the composition may range from about 0.01 to 200% (w / w), preferably from about 1 to 50% of the conjugate present. These compositions are then lyophilized and ground to the desired particle size.
Částice o správné velikosti se potom suspendují v hnacím prostředku za pomoci povrchově aktivní látky. Hnacím prostředkem může být jakýkoli vhodný materiál používaný k tomuto účelu, jako je zcela chlorofluorovaný uhlovodík a částečně chlorofluorovaný uhlovodík, fluorovaný uhlovodík nebo uhlovodík, včetně trichlorfíuormethanu, dichlordifluormethanu, dichlortetrafluorethanolu a 1,1,1,2-tetrafluorethanu, nebo jejich kombinace. Mezi vhodné povrchově aktivní látky patří sorbitantrioleát a sojový lecitin. Jako povrchově aktivní látka může být také použita kyselina olejová. Tato směs se potom vloží do dodávacího zařízení. Příkladem komerčně dostupného inhalátoru s odměřovanou dávkou vhodného pro použití v rámci předkládaného vynálezu je zařízení Ventolin metered dose inhaler, dodávaný firmou Glaxo lne., Research Triangle Park, N. C.The particles of the correct size are then suspended in the propellant with the aid of a surfactant. The propellant may be any suitable material used for this purpose, such as a fully chlorofluorocarbon and a partially chlorofluorocarbon, a fluorocarbon or a hydrocarbon, including trichlorofluoromethane, dichlorodifluoromethane, dichlorotetrafluoroethanol and 1,1,1,2-tetrafluoroethane, or a combination thereof. Suitable surfactants include sorbitan trioleate and soya lecithin. Oleic acid may also be used as a surfactant. This mixture is then loaded into the delivery device. An example of a commercially available metered dose inhaler suitable for use in the present invention is a Ventolin metered dose inhaler, supplied by Glaxo Inc, Research Triangle Park, N. C.
Prostředky s obsahem konjugátu pro inhalátory prášku budou obsahovat jemnozrnný suchý prášek obsahující konjugát a mohou také obsahovat objemotvorný prostředek, jako je laktóza, sorbitol, sacharóza nebo mannitol, v množstvích umožňujících disperzi prášku ze zařízení, např. 50 % až 90 % hmotnostních z prostředku. Částice prášku budou mít aerodynamické vlastnosti v plicích odpovídající částicím s hustotou přibližně 1 g/cm3 se středním průměrem nižším než 10 pm, s výhodou mezi 0,5 a 5 pm, nejvýhodněji mezi 1,5 aConjugate-containing compositions for powder inhalers will contain a fine-grained dry powder containing the conjugate and may also contain a bulking agent such as lactose, sorbitol, sucrose or mannitol in amounts allowing dispersion of the powder from the device, e.g. 50% to 90% by weight of the composition. The powder particles will have aerodynamic properties in the lungs corresponding to particles having a density of about 1 g / cm 3 with a mean diameter less than 10 µm, preferably between 0.5 and 5 µm, most preferably between 1.5 and 5 µm.
3,5 pm.3,5 pm.
Příklad inhalátoru prášku vhodného pro použití podle vynálezu je zařízení Spinhaler powder inhaler, vyráběný firmou Fisons Corp., Bedford, Mass.An example of a powder inhaler suitable for use in the present invention is the Spinhaler powder inhaler manufactured by Fisons Corp., Bedford, Mass.
·· • φ φ* «φ • φ φ φφ · • Φ · 9 φ • · · Φ· · Φ · · · · · ·
ΦφφφΦφφφ
Φ Φ Φ Φ ·Φ Φ Φ ·
ΦΦ ΦΦΦΦ ·· φφφφΦΦ ΦΦΦΦ ·· φφφφ
Prášky pro tato zařízení se mohou vyrábět a/nebo dodávat způsoby popsanými v US 5997848, US 5993783, US 5985248, US 5976574, US 5922354, US 5785049 a US 55654007.Powders for these devices can be manufactured and / or delivered by the methods described in US 5997848, US 5993783, US 5985248, US 5976574, US 5922354, US 5785049 and US 55654007.
Farmaceutický prostředek obsahující konjugát podle vynálezu může být podáván širokou řadou mechanických zařízení navržených pro dodávání terapeutických výrobků do plic, včetně bez omezení nebulizérů, inhalátorů s odměřovanou dávkou a inhalátorů prášku, které jsou všechny odborníkům v oboru známé.The pharmaceutical composition comprising the conjugate of the invention can be administered by a wide variety of mechanical devices designed to deliver therapeutic products to the lung, including, but not limited to, nebulizers, metered dose inhalers, and powder inhalers, all known to those skilled in the art.
Jako několik konkrétních příkladů komerčně dostupných zařízení vhodných pro provádění tohoto vynálezu je možno uvést Ultravent nebulizer, vyráběný firmou Mallinckrodt, lne., St. Louis, Missouri; Acorn II nebulizer, vyráběný firmou Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin metered dose inhaler, vyráběný firmou Glaxo lne., Research Triangle Park, North Carolina; Spinhaler powder inhaler, vyráběný firmou Fisons Corp, Bedford, Massachusetts; zařízení typu „standing cloud“ device firmy Inhale Therapeutic Systems, lne., San Carlos, California; AIR inhaler, vyráběný firmou Alkermes, Cambridge, Massachusetts; a zařízení AERx pulmonary drug delivery systém, dodávané firmou Aradigm Corporation, Hayward, California.A few specific examples of commercially available devices suitable for practicing the present invention include Ultravent Nebulizer, manufactured by Mallinckrodt, Inc. St. Louis, Missouri; Acorn II nebulizer, manufactured by Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin metered dose inhaler manufactured by Glaxo Inc, Research Triangle Park, North Carolina; Spinhaler powder inhaler, manufactured by Fisons Corp, Bedford, Massachusetts; standing cloud device from Inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, California; AIR inhaler, manufactured by Alkermes, Cambridge, Massachusetts; and the AERx pulmonary drug delivery system supplied by Aradigm Corporation, Hayward, California.
Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být dodáván spolu s dalšími terapeutickými prostředky. Tyto prostředky mohou být zahrnuty jako součást stejného farmaceutického prostředku, nebo mohou být podávány odděleně od polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu, buď současně nebo podle jakéhokoli jiného přijatelného léčebného schématu. Navíc se může polypeptid, konjugát nebo farmaceutický prostředek podle vynálezu používat jako doplněk dalších způsobů léčení.The pharmaceutical composition of the invention may be delivered with other therapeutic agents. These compositions may be included as part of the same pharmaceutical composition, or may be administered separately from the polypeptide or conjugate of the invention, either simultaneously or according to any other acceptable treatment regimen. In addition, the polypeptide, conjugate or pharmaceutical composition of the invention may be used as a supplement to other methods of treatment.
Předkládaný vynález tedy poskytuje prostředky a způsoby pro léčení většiny typů virových infekcí, rakovinných onemocnění nebo tumorů (například karcinom mléčné žlázy, rakovina jiných než malýchThus, the present invention provides compositions and methods for treating most types of viral infections, cancer, or tumors (e.g., breast cancer, non-small cell cancer
- 82 ·« ·· • · · • · ·· • 99 ·· ···· ·· ···· buněk plic) nebo tumorové angiogeneze, Crohnovy nemoci, ulcerativní kolitidy, syndromu Guillain-Barré, gliomu, idiopatické plicní fibrózy, abnormálního růstu buněk nebo pro imunomodulaci u jakéhokoli vhodného živočicha, s výhodou savce, zvláště člověka. Polypeptid, konjugát nebo prostředek podle vynálezu může být zvláště použit pro léčení roztroušené sklerózy (multiple sclerosis, MS), jako je jakýkoli z obecně uznávaných čtyř typů MS (benigní recidivující MS (RRMS), primární progresivní MS (PPMS) a sekundární progresivní MS (SPMS), a pro léčení monosymptomatické MS), hepatitidy nebo herpetické infekce (kde se léčba popřípadě kombinuje s léčením IL-10).- 82 • Lung cells) or tumor angiogenesis, Crohn's disease, ulcerative colitis, Guillain-Barré syndrome, glioma, idiopathic pulmonary fibrosis , abnormal cell growth, or immunomodulation in any suitable animal, preferably a mammal, particularly a human. In particular, the polypeptide, conjugate or composition of the invention may be used to treat multiple sclerosis (MS), such as any of the generally accepted four types of MS (benign relapsing MS (RRMS), primary progressive MS (PPMS) and secondary progressive MS ( SPMS), and for the treatment of monosymptomatic MS), hepatitis or herpes infection (where treatment is optionally combined with IL-10 treatment).
V dalším provedení se vynález týká způsobu léčení savce s cirkulujícími protilátkami proti interferonu β 1a, jako je Avonex™ nebo Rebif®, nebo 1b, jako je Betaseron®, kde tento způsob zahrnuje podávání sloučeniny, která má biologickou aktivitu interferonu β, a která má sníženou reaktivitu nebo která nereaguje s uvedenými protilátkami. Sloučenina se podává v účinném množství. Sloučeninou je s výhodou konjugát popisovaný v této přihlášce a savcem je s výhodou člověk. Léčení savci mohou trpět jakýmkoli z onemocnění uvedených výše, které lze úspěšní léčit interferonem β. Toto provedení vynálezu je zvláště zajímavé pro léčení roztroušené sklerózy (kteréhokoli z výše uvedených typů), nebo rakoviny. Vynález se dále týká způsobů výroby farmaceutického prostředku pro použití při léčení savců s obíhajícími protilátkami proti interferonu β 1a, jako je Avonex™ nebo Rebif®, nebo 1b, jako je Betaseron®, kde je sloučenina s biologickou aktivitou interferonu β, která nereaguje s těmito protilátkami, formulována do injikovatelné nebo jinak vhodné formulace. Termín „cirkulující protilátky“ má označovat protilátky, zvláště neutralizační protilátky, vytvořené savcem jako odpověď na léčení jakýmkoli z komerčně dostupných preparátu interferonu β (Rebif, Betaseron, Avonex).In another embodiment, the invention relates to a method of treating a mammal with circulating antibodies against interferon β 1a such as Avonex ™ or Rebif ®, or 1b such as Betaseron ®, which method comprises administering a compound having the biological activity of interferon β and having reduced reactivity or that does not react with said antibodies. The compound is administered in an effective amount. Preferably, the compound is the conjugate described in this application, and the mammal is preferably a human. Treated mammals may suffer from any of the diseases listed above that can be successfully treated with interferon β. This embodiment of the invention is of particular interest for the treatment of multiple sclerosis (any of the above types) or cancer. The invention further relates to methods of making a pharmaceutical composition for use in treating mammals with circulating antibodies against interferon β 1a, such as Avonex ™ or Rebif ®, or 1b such as Betaseron ®, wherein the compound has biological activity of interferon β that does not react with these. antibodies formulated into an injectable or otherwise suitable formulation. The term "circulating antibodies" is intended to refer to antibodies, particularly neutralizing antibodies, produced by a mammal in response to treatment with any of the commercially available interferon β preparations (Rebif, Betaseron, Avonex).
• · · · · · ·• · · · · · · ·
V dalším provedení se vynález týká způsobu léčení pacienta v případě potřeby farmaceutickým prostředkem, který má alespoň některé z terapeuticky prospěšných vlastností interferonu β, kde tento způsob zahrnuje podávání prostředku obsahujícího sloučeninu s alespoň částečnou terapeuticky prospěšnou aktivitou interferonu β, kde toto léčení má snížené nebo nepřítomné nepříznivé psychologické efekty ve srovnání s léčením interferonem β, přičemž uvedená sloučenina je konjugát polypeptidů s aktivitou interferonu β a nepolypeptidové části, zvláště konjugát podle předkládaného vynálezu, který se nevyskytuje v přírodě.In another embodiment, the invention relates to a method of treating a patient in need thereof with a pharmaceutical composition having at least some of the therapeutically beneficial properties of interferon β, the method comprising administering a composition comprising a compound having at least partial therapeutically beneficial interferon β activity. adverse psychological effects as compared to treatment with interferon β, wherein said compound is a conjugate of polypeptides with interferon β activity and a non-polypeptide moiety, especially a conjugate of the present invention that does not occur in nature.
V ještě dalším provedení se vynález týká farmaceutického prostředku pro léčení pacienta v případě potřeby sloučeninou s alespoň částí terapeuticky prospěšných vlastností interferonu β, kde uvedený prostředek obsahuje sloučeninu, která je konjugátem interferonu β a nepolypeptidové části, která se nevyskytuje v přírodě, kde toto léčení vyvolává méně nepříznivých psychologických účinků, než léčení interferonem β. Tento konjugát je s výhodou konjugát podle vynálezu.In yet another embodiment, the invention relates to a pharmaceutical composition for treating a patient in need thereof with a compound having at least a portion of the therapeutically beneficial properties of interferon β, said composition comprising a compound that is a conjugate of interferon β and a nonpeptide moiety that does not occur in nature. less adverse psychological effects than treatment with interferon β. This conjugate is preferably a conjugate of the invention.
V rámci vynálezu se také uvažuje použití nukleotidové sekvence kódující polypeptid podle vynálezu v aplikacích genové terapie. Může být zajímavé zvláště použití nukleotidové sekvence kódující polypeptidy popsané v části „Glykosylované peptidy podle vynálezu, modifikované tak, aby obsahovaly další glykosylační místa“. Glykosylace polypeptidů se takto dosahuje v průběhu genové terapie, tj. po expresi nukleotidové sekvence v lidském těle.Also contemplated by the invention is the use of a nucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention in gene therapy applications. Of particular interest may be the use of the nucleotide sequence encoding the polypeptides described in the "Glycosylated peptides of the invention, modified to contain additional glycosylation sites" section. Glycosylation of polypeptides is thus achieved during gene therapy, ie after expression of the nucleotide sequence in the human body.
Mezi uvažovaná použití genové terapie patří léčení onemocnění, u kterých se očekává, že polypeptid poskytne účinnou terapii v důsledku své antivirové aktivity, například virových onemocnění včetně hepatitidy, jako je hepatitida C, a zvláště HPV, nebo jiných infekčních onemocnění, která odpovídají na interferon β, nebo infekční činitele citlivé na interferon β. Konjugát nebo polypeptid podleGene therapy uses contemplated include treating diseases in which the polypeptide is expected to provide effective therapy due to its antiviral activity, for example, viral diseases including hepatitis such as hepatitis C, and in particular HPV, or other infectious diseases that respond to interferon β or interferon β-sensitive infectious agents. The conjugate or polypeptide of
• · • · vynálezu může být dále použit při léčení chronické zánětlivé demyelinizující polyradikuloneuropatie a těžkých nekrotizujících poškození kůže. Je uvažována také virová terapie v souvislosti s léčením jakéhokoli typu roztroušené sklerózy. Vynález podobně zahrnuje použití při genové terapii pro imunomodulaci, stejně jako při léčení takových onemocnění, u kterých se očekává, že interferon β poskytne účinné léčení v důsledku své antiproliferativní aktivity, například tumorů a rakovin, nebo jiných stavů charakterizovaných nežádoucí proliferací buněk, jako je restenóza. Další popis takové genové terapie se poskytuje ve WO 95/25170.The invention can further be used in the treatment of chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy and severe necrotizing skin lesions. Viral therapy in connection with the treatment of any type of multiple sclerosis is also contemplated. The invention likewise encompasses use in gene therapy for immunomodulation, as well as in the treatment of diseases in which interferon β is expected to provide effective treatment due to its antiproliferative activity, for example tumors and cancers, or other conditions characterized by unwanted cell proliferation such as restenosis . Further description of such gene therapy is provided in WO 95/25170.
Místní dodávání interferonu β použitím metody genové terapie může poskytnout léčebný prostředek do cílové oblasti, čímž je možno se vyhnout potenciálním problémům s toxicitou spojeným s nespecifickým podáváním.Local delivery of interferon β using a gene therapy method can provide a therapeutic agent to the target region, thereby avoiding potential toxicity problems associated with non-specific administration.
Jsou uvažovány metody genové terapie jak in vitro, tak in vivo. Je známo několik metod pro přenos potenciálně terapeutických genů do definovaných buněčných populací. Další odkazy je možno nalézt např. v Mulligan, „The Basic Science of Gene Therapy“, Science, 260, str. 926 - 31 (1993). Mezi tyto metody patří:Both in vitro and in vivo gene therapy methods are contemplated. Several methods for transferring potentially therapeutic genes to defined cell populations are known. Further references can be found, for example, in Mulligan, "The Basic Science of Gene Therapy," Science, 260, pp. 926-31 (1993). These methods include:
přímý přenos genů, například jak se popisuje ve Wolff a další, „Direct Gene transfer Into Mouše Muscle in vivo“, Science 247, str. 1465 - 68 (1990);direct gene transfer, for example, as described in Wolff et al., "Direct Gene Transfer Into Muscle Muscle In Vivo", Science 247, pp. 1465-68 (1990);
přenos DNA pomocí liposomů, jak se popisuje v Caplen a další, „Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium of Patients with Cystic Fibrosis“, Nátuře Med., 3, str. 39 - 46 (1995); Crystal, „The Gene as a Drug“, Nátuře Med., 1, str. 15 - 17 (1995); Gao a Huang, „A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Celíš“, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, str. 280 - 85 (1991);liposome DNA transfer as described in Caplen et al., "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to Nasal Epithelium of Patients with Cystic Fibrosis", Nature Med., 3, pp. 39-46 (1995); Crystal, "The Gene as a Drug", Nature Med., 1, pp. 15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic Liposome Reagent For Effective Transfection Of Mammalian Cell," Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, pp. 280-85 (1991);
přenos DNA prostřednictvím retrovirů, např. jak se popisuje v Kay a další, „In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained • ·· ·· · · · · ·· • · · · · ·· · · ·· « • · · · · · · ·transfer of DNA by retroviruses, e.g., as described in Kay et al., "In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained" · · · · · · · ·
Partial Correction in Factor IX-Deficient Dogs“, Science, 262, str. 117 19 (1993); Anderson, „Human Gene Theřapy“, Science, 256, str. 808 13 (1992);Partial Correction in Factor IX-Deficient Dogs, Science, 262, p. 117 19 (1993); Anderson, "Human Gene Theory", Science, 256, p. 808 13 (1992);
přenos DNA s využitím DNA virů, kde mezi DNA viry patří adenoviry (s výhodou vektory založené na Ad-2 nebo Ad-5), herpetické viry (s výhodou vektory založené na viru herpes simplex) a parvoviry (s výhodou vektory založené na „defektním“ nebo neautonomním parvoviru, výhodněji vektory založené na viru asociovaném s adenovirem, nejvýhodněji vektory založené na AAV-2), viz např. Ali a další, „The Use of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy“, Gene Therapy, 1, str. 367 - 84 (1994); US 4,797,368, a US 5,139,941.DNA transfer using DNA viruses, wherein DNA viruses include adenoviruses (preferably vectors based on Ad-2 or Ad-5), herpes viruses (preferably vectors based on herpes simplex virus) and parvoviruses (preferably vectors based on "defective" Or non-autonomous parvovirus, more preferably vectors based on adenovirus associated virus, most preferably AAV-2 based vectors, see, e.g., Ali et al., "Use of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, p. 367-84 (1994); US 4,797,368, and US 5,139,941.
Vynález bude dále popsán na následujících příkladech. Příklady by však v žádném případě neměly být chápány jako omezující obecný rozsah předkládané přihlášky a nároků.The invention will be further described by the following examples. However, the examples should in no way be construed as limiting the general scope of the present application and claims.
Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Obr. 1 ilustruje antivirový účinek konjugátu podle vynálezu.Giant. 1 illustrates the antiviral effect of the conjugate of the invention.
Obr. 2 ukazuje výtěžek výroby interferonu β získaného podle příkladu 8.Giant. 2 shows the yield of the production of interferon β obtained according to Example 8.
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Materiály a metodyMaterials and methods
MateriályMaterials
Buňky HeLa (dostupné z American Type Culture Collection (ATCC) ISRE-Luc (Stratagene, La Jolla USA) pCDNA 3.1/hygro (Invitrogen, Carlsbad USA)HeLa cells (available from the American Type Culture Collection (ATCC)) ISRE-Luc (Stratagene, La Jolla, USA) pCDNA 3.1 / hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)
Bazický vektor pGL3 (Promega) • ·Basic vector pGL3 (Promega) • ·
Lidská genomická DNA (CloneTech, USA)Human Genomic DNA (CloneTech, USA)
Médium DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM), 10% fetálního bovinního séra (dostupné u firmy Life Technologies A/S, Copenhagen, Dánsko)DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% fetal bovine serum (available from Life Technologies A / S, Copenhagen, Denmark)
TestyTests
Popis testu na interferonDescription of the interferon test
Již dříve bylo publikováno, že interferon β interaguje s a aktivuje receptory interferonu typu I na buňkách HeLa. Jako důsledek se aktivuje transkripce na promotorech obsahujících prvek Interferon Stimulated Response Element (ISRE). Je tedy možné provést screening na agonisty interferonových receptorů použitím luciferázového reporterového genu navázaného na ISRE (ISRE-luc) umístěného v buňkách HeLa.It has been previously reported that interferon β interacts with and activates type I interferon receptors on HeLa cells. As a result, transcription is activated on promoters containing the Interferon Stimulated Response Element (ISRE). Thus, it is possible to screen for interferon receptor agonists using an ISRE-linked luciferase reporter gene (ISRE-luc) located in HeLa cells.
Primární testPrimary test
Buňky HeLa se kotransfekují ISRE-Luc a pCDNA 3.1/hygro a ohniska (buněčné klony) se vytvoří selekcí v médiu DMEM obsahujícím Hygromycin B. Buněčné klony se prozkoumávají na luciferázovou aktivitu v přítomnosti nebo nepřítomnosti interferonu β. Klony vykazující nejvyšší poměr stimulované k nestimulované luciferázové aktivitě se používají v dalších testech.HeLa cells are co-transfected with ISRE-Luc and pCDNA 3.1 / hygro and foci (cell clones) are generated by selection in DMEM medium containing Hygromycin B. Cell clones are screened for luciferase activity in the presence or absence of interferon β. Clones showing the highest ratio of stimulated to unstimulated luciferase activity are used in other assays.
Pro screening muteinů se zaočkuje 15 000 buněk/jamku do 96jamkových kultivačních destiček a inkubuje se přes noc v médiu DMEM. Další den se k buňkám v různých koncentracích přidávají muteiny a známé standardy. Destičky se inkubují 6 hod při 37 °C ve vzduchu s 5 % CO2. Potom se do každé jamky přidá substrát LucLite (Packard Bioscience, Groningen, Nizozemí). Destičky se uzavřou a měří se luminiscence na přístroji TopCount luminometer (Packard)For mutein screening, 15,000 cells / well are seeded in 96-well culture plates and incubated overnight in DMEM medium. The next day, muteins and known standards are added to the cells at various concentrations. Plates are incubated for 6 hours at 37 ° C in air with 5% CO 2 . LucLite substrate (Packard Bioscience, Groningen, The Netherlands) is then added to each well. Plates are sealed and luminescence measured on a TopCount luminometer (Packard)
• · · ft ·· «· • · · · ···· v modu SPC (single photon counting). Každá jednotlivá destička obsahuje jamky inkubované s interferonem β jako stimulovanou kontrolu a další jamky obsahující normální médium jako nestimulovanou kontrolu. Poměr mezi stimulovanou a nestimulovanou luciferázovou aktivitou slouží jako vnitřní standard jak pro aktivitu muteinu, tak i pro sledování rozdílů mezi jednotlivými experimenty.• ft. In single photon counting (SPC) mode. Each individual plate contains wells incubated with interferon β as stimulated control and other wells containing normal medium as unstimulated control. The ratio between stimulated and unstimulated luciferase activity serves as an internal standard for both mutein activity and for monitoring differences between experiments.
Sekundární testSecondary test
V současnosti je známo 18 nealelických genů interferonu α a 1 gen interferonu β. Aktivity těchto proteinů se překrývají a je tedy kritické zajistit, aby si muteiny zachovaly selektivitu a specificitu interferonu β.Currently, 18 non-allelic genes of interferon α and 1 gene of interferon β are known. The activities of these proteins overlap and it is therefore critical to ensure that the muteins retain the selectivity and specificity of interferon β.
Gen β-RI je aktivován interferonem β, ale nikoli jinými interferony. Transkripce genu β-RI tedy slouží jako druhý markér aktivace interferonem β a používá se pro zjištění, že si muteiny zachovávají aktivitu interferonu β. Metodou PCR byl izolován z lidské genomické DNA promotorový fragment β-RI o délce 300 bp, u kterého bylo zjištěno, že řídí transkripci citlivou na interferon (Rani, M. R. a další (1996), JBC 271, 22878 - 22884), a tento fragment byl vložen do bazického vektoru pGL3 (Promega). Získaný gen β-RI : luciferáza se použije v podobných testech jako výše popsaný primární test. Bylo ukázáno, že v buňkách astrocytomu má výsledný gen β-RI : luciferáza 250 krát vyšší citlivost na interferon β, než na interferon α (Rani a další, výše).The β-RI gene is activated by interferon β, but not by other interferons. Thus, transcription of the β-RI gene serves as a second marker of interferon β activation and is used to determine that muteins retain interferon β activity. The 300 bp β-RI promoter fragment, which was found to direct interferon-sensitive transcription (Rani, MR et al. (1996), JBC 271, 22878 - 22884), was isolated from the human genomic DNA. was inserted into the pGL3 basic vector (Promega). The β-RI: luciferase gene obtained is used in similar tests to the primary assay described above. In astrocytoma cells, the resulting β-RI: luciferase gene has been shown to be 250 times more sensitive to interferon β than to interferon α (Rani et al., Supra).
Test ELISAELISA
Koncentrace IFN-β se kvantifikuje použitím komerčního sendvičového imunologického testu (PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ, USA). Tento kit je založen na metodě ELISA • 9 9 · · · · 9* «9 ··· 9 9 · 9 · 9 99 9IFN-β concentration is quantified using a commercial sandwich immunoassay (PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ, USA). This kit is ELISA-based. 9 9 · 9 · 9 · 9 · 9 99 9
999 999 · s monoklonálními myšími protilátkami proti IFN-β pro vychytávání a detekci IFN-β v testovaných vzorcích. Detekční protilátka je konjugována k biotinu.999 999 · with monoclonal murine anti-IFN-β antibodies for uptake and detection of IFN-β in test samples. The detection antibody is conjugated to biotin.
Testované vzorky a standardy rekombinantního lidského IFN-β se přidávají v množství 0,1 ml v koncentracích 10 až 0,25 ng/ml do mikrotitračních destiček, které jsou předem potaženy vychytávací protilátkou. Destičky se inkubují při laboratorní teplotě 1 hodinu. Vzorky a standardy se zředí v ředicím pufru obsaženém v kitu. Destičky se promyjí v pufru, který je součástí kitu a inkubují s biotinylovanou detekční protilátkou v množství 0,1 ml 1 hod při laboratorní teplotě. Po dalším promytí se přidá 0,1 ml konjugátu streptavidin-křenová peroxidáza a provede se inkubace 1 hod při laboratorní teplotě.Test samples and recombinant human IFN-β standards are added in an amount of 0.1 ml at concentrations of 10 to 0.25 ng / ml to microtiter plates pre-coated with the capture antibody. Plates are incubated at room temperature for 1 hour. The samples and standards are diluted in the dilution buffer contained in the kit. Plates are washed in buffer included in the kit and incubated with biotinylated detection antibody for 0.1 ml for 1 hour at room temperature. After further washing, 0.1 ml of streptavidin-horseradish peroxidase conjugate is added and incubated for 1 hour at room temperature.
Reakce se zviditelní přidáním 0,1 ml tetramethylbenzidinu (TMB) jako chromogenního substrátu. Destičky se inkubují 15 min v temnu při laboratorní teplotě a reakce se ukončí přidáním zastavovacího roztoku. Absorbance se odečítá při 450 nm na čtecím zařízení ELISA.The reaction is visualized by adding 0.1 ml of tetramethylbenzidine (TMB) as a chromogenic substrate. Plates are incubated for 15 min in the dark at room temperature and the reaction is terminated by addition of stop solution. Absorbance is read at 450 nm on an ELISA reader.
Test vazby na receptorReceptor Binding Assay
Schopnost polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu vázat se na receptor může být zjištěna testem popsaným ve WO 95/25170, nazvaným „Analysis of IFN-β (Phe-ιοί) For Receptor Binding“ (který je založen na buňkách Daudi nebo A549). Rozpustné domény IFNAR1 a IFNAR2 mohou být získány v podstatě tak, jak se popisuje v Arduini a další, Protein Science, 1999, díl 8, 1867 - 1877, nebo jak se popisuje v dále uvedeném příkladu 9.The ability of a polypeptide or conjugate of the invention to bind to a receptor can be determined by the assay described in WO 95/25170, entitled "Analysis of IFN-β (Phe-οοί) For Receptor Binding" (which is based on Daudi or A549 cells). Soluble domains of IFNAR1 and IFNAR2 can be obtained essentially as described in Arduini et al., Protein Science, 1999, Vol. 8, 1867-1877, or as described in Example 9 below.
Schopnost vazby na receptor se alternativně zjišťuje pomocí zesíťujícího činidla jako je disukcinimidylsuberát (DSS), dostupný od firmy Pierce, Rockford, IL, USA, následujícím způsobem:Alternatively, receptor binding capacity is determined using a cross-linking agent such as disuccinimidylsuberate (DSS), available from Pierce, Rockford, IL, USA, as follows:
• «9 · 9 · · 99 99 ··· · 9 99 · 9 99 9 • · 9 · · · · « · 9 9 · 9 *9 9 99 99 99 99 99 99 99 9 9 9 9
999 ·· ·«·· ·* 9·99 polypeptid nebo konjugát se inkubují s rozpustným receptorem IFNAR-2 v přítomnosti nebo nepřítomnosti DSS podle doporučení výrobce. Vzorky se oddělí SDS-PAGE a provede se westernový přenos použitím protilátek proti interferonu β nebo proti IFNAR2. Přítomnost funkční interakce polypeptidu interferonu β/konjugátu s receptorem je zřejmá zvětšením velikosti molekuly receptoru a interferonu β v přítomnosti DSS.The polypeptide or conjugate is incubated with the soluble IFNAR-2 receptor in the presence or absence of DSS according to the manufacturer's recommendations. Samples were separated by SDS-PAGE and Western blotted using antibodies against interferon β or against IFNAR2. The presence of a functional interaction of the interferon β / conjugate polypeptide with the receptor is evident by increasing the size of the receptor molecule and interferon β in the presence of DSS.
Vazebnou schopnost na receptor 1 interferonu je možno také zjistit zesíťujícím testem použitím polypeptidu nebo konjugátu podle vynálezu a obou podjednotek receptoru (IFNAR-1 a IFNAR-2). V této souvislosti bylo publikováno, že IFNAR-1 se váže pouze poté, co dojde k vytvoření komplexu interferon β : IFNAR-2 (Mogensen a další, Journal of Interferon and Cytokin Research, 19: 1069 - 1098, 1999).Binding ability to interferon receptor 1 can also be determined by a cross-linking assay using the polypeptide or conjugate of the invention and both receptor subunits (IFNAR-1 and IFNAR-2). In this context, it has been reported that IFNAR-1 binds only when the interferon β: IFNAR-2 complex is formed (Mogensen et al., Journal of Interferon and Cytokin Research, 19: 1069-1098, 1999).
Testy konjugátů interferonu β na imunogenicitu in vitroTests of interferon β conjugates for in vitro immunogenicity
Snížená imunogenicita konjugátu nebo polypeptidu podle vynálezu se zjišťuje metodou ELISA, při které se měří imunologická reaktivita konjugátu nebo polypeptidu, vzhledem k referenční molekule nebo prostředku. Referenční molekulou nebo prostředkem je normálně preparát rekombinantního lidského interferonu β jako Avonex, Rebif nebo Betaseron, nebo jiný prostředek obsahující rekombinantní lidský interferon β vyrobený způsobem, kterým se tyto produkty obvykle vyrábějí. Metoda ELISA je založena na protilátkách pacientů léčených jedním z těchto rekombinantních prostředků s interferonem β. Imunogenicita se považuje za sníženou, jestliže polypeptid podle vynálezu má statisticky významně nižší odpověď při testu než referenční molekula nebo prostředek.The reduced immunogenicity of the conjugate or polypeptide of the invention is determined by an ELISA method that measures the immunological reactivity of the conjugate or polypeptide with respect to a reference molecule or composition. The reference molecule or composition is normally a recombinant human interferon β preparation such as Avonex, Rebif or Betaseron, or another composition comprising recombinant human interferon β produced by the method by which these products are usually produced. The ELISA method is based on the antibodies of patients treated with one of these recombinant agents with interferon β. Immunogenicity is considered to be reduced when the polypeptide of the invention has a statistically significantly lower assay response than the reference molecule or composition.
Imunogenicitu je dále možno zjistit použitím sér pacientů léčených interferonem β (tj. jakýmkoli komerčním produktem obsahujícím interferon β) analogickým způsobem jako je způsob ·· ·· ► · · 1 popsaný v Ross a další, J. Clin. Invest. 95, 1974 - 78, 1995. Snížená imunogenicita v biologickém testu antivirové neutralizace vede ke snížené inhibicí konjugátu podle vynálezu sérem pacienta ve srovnání s referenční molekulou lFN-β standardního typu. Navíc se očekává, že se bude konjugát zjištěný při biochemickém testu vazby IFN jako méně imunogenní vázat na IgG pacienta v menší míře, než referenční molekuly IFN-β.Immunogenicity can further be determined using the sera of patients treated with interferon β (ie, any commercial interferon β-containing product) in an analogous manner to that described by Ross et al., J. Clin. Invest. 95, 1974-78, 1995. The reduced immunogenicity in the biological antiviral neutralization assay results in reduced inhibition of the conjugate of the invention by the patient's serum as compared to the wild-type IFN-β reference molecule. In addition, it is expected that the conjugate found to be less immunogenic to the patient's IgG to a lesser extent than the IFN-β reference molecules in the IFN biochemical assay.
Pro neutralizační test se molekuly referenční sloučeniny a konjugátu přidávají v koncentraci, která poskytne přibližně 80% ochranu před virem v testu antivirové neutralizace. Proteiny IFN-β se smísí se séry pacientů v různých ředěních (počínaje ředěním 1 : 20).For the neutralization assay, reference compound and conjugate molecules are added at a concentration that provides approximately 80% virus protection in the antiviral neutralization assay. IFN-β proteins are mixed with patient sera at various dilutions (starting at 1:20).
Antivirová aktivitaAntiviral activity
Test na antivirovou aktivitu se provádí na buňkách A549 (CCL 185, American tissue culture collection) a viru encefalomyokarditidy (EMC) (VR-125B, American tissue culture collection). Buňky se zaočkují do 96-jamkových destiček pro tkáňovou kultivaci v koncentraci 10 000 buněk/jemku a inkubují se při 37 °C v atmosféře vzduchu s 5 % CO2. Polypeptid nebo konjugát podle vynálezu se přidává v koncentracích od 100 do 0,0001 lU/ml v celkem 100 pl média DMEM obsahujícího fetální telecí sérum a antibiotika.The assay for antiviral activity is performed on A549 cells (CCL 185, American tissue culture collection) and encephalomyocarditis virus (EMC) (VR-125B, American tissue culture collection). Cells are seeded into 96-well tissue culture plates at a concentration of 10,000 cells / well and incubated at 37 ° C in an atmosphere of air with 5% CO 2. The polypeptide or conjugate of the invention is added at concentrations of 100 to 0.0001 IU / ml in a total of 100 µl of DMEM medium containing fetal calf serum and antibiotics.
Po 24 hod se médium odstraní a do každé jamky se přidá 0,1 ml čerstvého média obsahujícího virus EMC. Virus EMC se přidává v koncentraci, která způsobí během 24 hod smrt 100 % buněk v buněčných kulturách bez IFN-β.After 24 hours, the medium is removed and 0.1 ml of fresh medium containing EMC virus is added to each well. EMC virus is added at a concentration that causes 100% cell death in IFN-β cell cultures within 24 hours.
Po dalších 24 hod se měří antivirový účinek polypeptidů nebo konjugátu testem WST-1. Do 0,1 ml kultury se přidá 0,01 ml WST-1 (WST-1 cell proliferation agent, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Německo), a inkubuje se 0,5 až 2 hod při 30 °C v atmosféře vzduchu s 5 % C02. Štěpení tetrazoliové soli WST-1 mitochondriálnímiAfter an additional 24 hours, the antiviral effect of the polypeptides or conjugate is measured by the WST-1 assay. 0.01 ml of WST-1 (WST-1 cell proliferation agent, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) is added to 0.1 ml of culture and incubated for 0.5 to 2 hours at 30 ° C in an air atmosphere of 5 ° C. % CO2. Cleavage of tetrazolium salt WST-1 by mitochondrial
• 9 94• 9 94
4 4 44 4 4
4 44 4
4 9 · 4*494 9 · 4 * 49
9494
9 9 9 • 4 49 9 9 4
4 94 9
9994 dehydrogenázami v živých buňkách vede k vytváření formazanu, jehož množství se zjišťuje měřením absorbance při 450 nm.9994 dehydrogenases in living cells result in the formation of formazan, the amount of which is determined by measuring absorbance at 450 nm.
Test neutralizace aktivity prvku odpovědi stimulovaného interferonem (Interferon Stimulated Response Element, ISRE)Interferon Stimulated Response Element (ISRE) Activity Neutralization Assay
Neutralizační efekt interferonu β v sérech obsahujících protilátky proti interferonu β se analyzuje použitím testu aktivity ISRE-luciferázy.The neutralizing effect of interferon β in sera containing antibodies against interferon β is analyzed using an ISRE-luciferase activity assay.
Při tomto testu se používají séra od pacientů léčených interferonem nebo séra od imunizovaných zvířat. Séra se přidávají buď v pevných koncentracích (1 : 20 až 1 : 500 (séra pacientů) nebo 20 až 600 ng/ml (séra zvířat)) nebo v pětinásobných sériových ředěních sér počínaje ředěním 1/20 (séra pacientů) nebo 600 ng/ml (séra zvířat). Interferon β se přidává buď v pětinásobných ředěních počínaje 25 000 lU/ml nebo v pevných koncentracích (0,1 až 10 ÍU/ml) v celkovém objemu 80 pl média DMEM + 10 % FCS. Séra se inkubují 1 hod při 37 °C s IFN-β.Sera from patients treated with interferon or sera from immunized animals are used in this assay. Sera are added either at fixed concentrations (1:20 to 1: 500 (patient sera) or 20 to 600 ng / ml (animal sera)) or in 5-fold serial dilutions of sera starting at 1/20 dilution (patient sera) or 600 ng / ml. ml (animal sera). Interferon β is added either at 5-fold dilutions starting at 25,000 IU / ml or at fixed concentrations (0.1 to 10 IU / ml) in a total volume of 80 µl DMEM + 10% FCS. Sera are incubated for 1 hour at 37 ° C with IFN-β.
Vzorky se potom převedou do 96-jamkových kultivačních destiček pro tkáňovou kultivaci obsahujících buňky HeLa transfekované ISRE-Luc a kultivované 24 hod předem (15 000 buněk/jamku) v médiu DMEM. Kultury se inkubují 6 hod při 37 °C v atmosféře vzduchu s 5 % CO2. Potom se do každé jamky přidá substrát LucLite (Packard Bioscience, Groningen, Nizozemí). Destičky se uzavřou a na přístroji TopCount luminometer (Packard) se měří luminiscence v modu SPC (single photon counting).The samples are then transferred to 96-well tissue culture plates containing ISRE-Luc transfected HeLa cells and cultured 24 hours in advance (15,000 cells / well) in DMEM medium. The cultures are incubated for 6 hours at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . LucLite substrate (Packard Bioscience, Groningen, The Netherlands) is then added to each well. Plates are sealed and luminescence is measured on a TopCount luminometer (Packard) in single photon counting (SPC) mode.
Jestliže se vzorky interferonu β titrují v přítomnosti pevného množství séra, neutralizační efekt byl definován jako násobek inhibice (Fl) kvantifikovaný jako EC50 (se sérem)/EC50 (bez séra). Snížení neutralizace protilátky variant proteinů interferonu β se definuje jakoWhen interferon β samples are titrated in the presence of a fixed amount of serum, the neutralizing effect was defined as the fold inhibition (F1) quantified as EC50 (with serum) / EC50 (without serum). The reduction in antibody neutralization of variant interferon β protein variants is defined as
Fl varianty (1 ) x 100 %Fl variants (1) x 100%
Fl standardního typu • · ·· ·· • 4 4 4 • · · • · · • · 4 • t · · 9 ·Fl of standard type • 4 4 4 • 4 • 4 • t • 9
Měření biologického poločasu konjugátu PEG-Interferon βMeasurement of half-life of PEG-Interferon β conjugate
Měření biologického poločasu se může provádět řadou způsobů popsaných v literatuře. Jedna metoda se popisuje v Munafo a další (European Journal of Neurology 1998, díl 5, No. 2, str. 187 - 193), kde se používala pro detekci hladin interferonu β v séru po subkutánním a intramuskulárním podání interferonu β metoda ELISA.Measurement of half-life can be performed in a number of ways described in the literature. One method is described in Munafo et al. (European Journal of Neurology 1998, Vol. 5, No. 2, pp. 187-193) where ELISA was used to detect serum levels of interferon β after subcutaneous and intramuscular administration of interferon β.
Rychlé snížení koncentrací interferonu β v séru po i.v. podání se ukázalo jako důležité pro vyhodnocování biologických odpovědí na léčení interferonem β. Předpokládá se však, že konjugáty podle předkládaného vynálezu budou mít prodloužené poločasy v séru také po i.v. podání, což umožňuje měření například metodou ELISA nebo metodou primárního screeningu.Rapid decrease in serum concentrations of interferon β after i.v. administration has been shown to be important in evaluating biological responses to interferon-β therapy. However, it is contemplated that the conjugates of the present invention will have prolonged serum half-lives also after i.v. administration, which allows measurement by, for example, ELISA or primary screening.
Byly také studovány různé farmakodynamické markéry (například neupterin a beta2 mikroglobulin v séru) (Clin. Drug Invest. (1999) 18 (1): 27 - 34). Tyto markéry mohou být také použity pro vyhodnocení prodlouženého biologického účinku. Tyto experimenty se také mohou provádět na vhodných druzích zvířat, například na krysách.Various pharmacodynamic markers have also been studied (e.g., serum necterin and beta2 microglobulin) (Clin. Drug Invest. (1999) 18 (1): 27-34). These markers can also be used to evaluate the prolonged biological effect. These experiments can also be performed on suitable animal species, for example rats.
Testy pro hodnocení biologických účinků interferonu β jako jsou antivirové, antiproliferativní a imunomodulační účinky (jak se popisuje například v Annals of Neurology 1995, díl 37, No. 1, str. 7-15) mohou být použity spolu s testy primárního a sekundárního screeningu popsanými výše pro vyhodnocení biologického účinku konjugátu ve srovnání s interferonem β standardního typu.Assays to evaluate the biological effects of interferon β such as antiviral, antiproliferative, and immunomodulatory effects (as described, for example, in Annals of Neurology 1995, Volume 37, No. 1, pp. 7-15) can be used in conjunction with the primary and secondary screening tests described above to evaluate the biological effect of the conjugate compared to wild-type interferon β.
Pro zjištění účinnosti konjugátu nebo polypeptidu podle vynálezu může být konečně také použit experimentální zvířecí model běžně používaný při modelové experimentální autoimunitní encefalomyelitidě (EAE). Imunizace myelinem nebo proteiny odvozenými od myelinu vyvolá onemocnění napodobující většinu zánětlivých a neurologických ·· 4 4 44 «4 ·4Finally, an experimental animal model commonly used in the model autoimmune encephalomyelitis (EAE) model can also be used to determine the efficacy of the conjugate or polypeptide of the invention. Immunization with myelin or myelin-derived proteins causes a disease mimicking most inflammatory and neurological · 4 4 44 «4 · 4
44 4444 444444 4444 4444
4 4 4 444 44 4 4 445 4
4 4 4 4 4 4 ··· ·· «444 44 4444 příznaků roztroušené sklerózy u lidí. Model EAE byl používán u myší, krys, králíků a kosmanů (Cannelia a další, PNAS, 95, 10100 - 5, 1998, Zaprianova a další, Morfologiia, 112, 25 - 8, 1997, Hassouna a další, J. Urology, 130, 806 - 10, 1983, Genain & Hauser J. Mol. Med. 75, 187 - 97, 1997). Pro zjištění účinnosti konjugátu interferonu β se také mohou použít další modely zahrnující model Theilerova viru myší encefalomyelitidy (TMEV) (Murray a další. J. Neurosci. 18, 7306 - 14, 1998).4 4 4 4 4 4 ··· ·· «444 44 4444 symptoms of multiple sclerosis in humans. The EAE model has been used in mice, rats, rabbits and marmosets (Cannelia et al., PNAS, 95, 10100-5, 1998; Zaprianova et al., Morfologiia, 112, 25-8, 1997, Hassoun et al., J. Urology, 130 806-10 (1983), Genain & Hauser J. Mol. Med., 75, 187-97, 1997). Other models including the model of the murine encephalomyelitis (TMEV) Theiler virus (Murray et al., J. Neurosci. 18, 7306-14, 1998) may also be used to determine the efficacy of interferon β conjugate.
PEGyiace značeného polypeptidu s aktivitou interferonu β v mikrotitračních destičkáchPEGylation of a labeled polypeptide with interferon β activity in microtiter plates
Tato metoda zahrnuje:This method includes:
expresi polypeptidu interferonu β opatřeného vhodnou značkou, například jakoukoli ze značek uvedených jako příklady v obecném popisu výše;expressing an interferon β polypeptide bearing a suitable label, for example, any of the labels exemplified in the general description above;
převedení kultivační půdy do jedné nebo více jamek v mikrotitrační destičce schopné imobilizovat označený polypeptid; jestliže je značkou His-His-His-His-His-His (Casey a další, J. Immunol. Meth., 179, 105 (1995)), je možno použít komerčně dostupné mikrotitrační destičky Ni-NTA HisSorb firmy QiaGen;transferring the culture broth to one or more wells in a microtiter plate capable of immobilizing the labeled polypeptide; if the label is His-His-His-His-His-His (Casey et al., J. Immunol. Meth., 179, 105 (1995)), commercially available Ni-NTA HisSorb microtiter plates from QiaGen can be used;
po umožnění imobilizace označeného polypeptidu na mikrotitrační destičku promytí buněk pufrem vhodným pro vazbu a následnou PEGylaci;after allowing the immobilized labeled polypeptide to the microtiter plate, washing the cells with a buffer suitable for binding and subsequent PEGylation;
inkubaci jamek se zvoleným aktivovaným PEG.incubating the wells with the selected activated PEG.
Jako příklad je možno použít materiál M-SPA-5000 firmy Shearwater Polymers. Molární poměr aktivovaného PEG k polypeptidu se musí optimalizovat, ale typicky je větší než 10:1, lépe více než 100:1;As an example, M-SPA-5000 from Shearwater Polymers can be used. The molar ratio of activated PEG to polypeptide must be optimized, but is typically greater than 10: 1, preferably greater than 100: 1;
• 44 44 4* 44 4444 44 4 * 44 44
4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 5
444 444 4444 444 4
4444 44*4 44444 44 * 4
4 444 4444,444,444
444 4444 44 ·444 44 4444 po vhodné době reakce při laboratorní teplotě, typicky 1 hod, se reakce zastaví odstraněním roztoku aktivovaného PEG. Konjugovaný protein se z destičky eluuje inkubací s vhodným pufrem. Vhodné eluční pufry mohou obsahovat imidazol, nadbytek NTA nebo jinou chelatační sloučeninu;444 4444 44 · 444 44 4444 After a suitable reaction time at room temperature, typically 1 hour, the reaction is stopped by removing the PEG activated solution. The conjugated protein is eluted from the plate by incubation with an appropriate buffer. Suitable elution buffers may include imidazole, excess NTA, or other chelating compound;
konjugovaný protein se testuje na biologickou aktivitu a imunogenicitu vhodnou metodou;the conjugated protein is assayed for biological activity and immunogenicity by a suitable method;
značka (tag) může být popřípadě odštěpena použitím v oboru známé metody, například diaminopeptidáza a Gin v poloze -1 budou převedeny na pyroglutamyl pomocí GCT (glutamylcyklotransferáza) a nakonec odštěpeny PGAP (pyroglutamylaminopeptidáza) za získání nativního proteinu. Tento proces zahrnuje několik kroků afinitní chromatografie s využitím kovových chelátů. Alternativně může být značený polypeptid konjugován.the tag may optionally be cleaved using a method known in the art, for example, the diaminopeptidase and the Gin at the -1 position will be converted to pyroglutamyl by GCT (glutamylcyclotransferase) and finally cleaved by PGAP (pyroglutamylaminopeptidase) to yield the native protein. This process involves several steps of affinity chromatography using metal chelates. Alternatively, the labeled polypeptide may be conjugated.
PEGylace polypeptidu interferonu β navázaného na receptorPEGylation of a receptor bound interferon β polypeptide
Pro optimalizaci PEGylace na polypeptidu interferonu β takovým způsobem, aby se vyloučila PEGylace lysinů účastnících se rozpoznávání receptoru, byla vyvinuta následující metoda:To optimize PEGylation on an interferon β polypeptide in such a way as to avoid PEGylation of lysines involved in receptor recognition, the following method has been developed:
Získají se rozpustné domény IFNAR1 a IFNAR2 v podstatě tak, jak se popisuje v Arduini a další, Protein Science (1999), díl 8: 1867 1877, nebo jak se popisuje v příkladu 9.Soluble IFNAR1 and IFNAR2 domains are obtained essentially as described in Arduini et al., Protein Science (1999), Vol. 8: 1867, 1877, or as described in Example 9.
V pufru PBS při pH 7 až 9 se vytvoří ternární komplex sestávající z polypeptidu interferonu β, rozpustné domény IFNAR1 a rozpustné domény IFNAR2 ve stechiometrickém poměru 1:1:1. Koncentrace polypeptidu interferonu β je přibližně 20 ug/ml nebo 1 μΜ a receptory jsou přítomny v ekvimolární koncentraci.A ternary complex consisting of an interferon β polypeptide, a soluble IFNAR1 domain and a soluble IFNAR2 domain in a stoichiometric ratio of 1: 1: 1 is formed in PBS buffer at pH 7-9. The concentration of the interferon β polypeptide is approximately 20 µg / ml or 1 μΜ and the receptors are present at equimolar concentration.
Přidá se materiál M-SPA-5000 firmy Shearwater Polymers, lne. ve třech různých koncentracích odpovídajících 5, 20 nebo 100 násobnému molárnímu nadbytku vzhledem k polypeptidu interferonu β.Add M-SPA-5000 from Shearwater Polymers, Inc. at three different concentrations corresponding to a 5, 20 or 100 fold molar excess relative to the interferon β polypeptide.
- 95 • · * ♦ * · ♦ · · ♦ · · ♦ · · » • · · ♦ · · · · « • 9 9 9 9 9 9- 95 · * · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 99 9999 99 9999999 99,999 99,999
Doba reakce je 30 min při laboratorní teplotě. Po 30 min reakce se upraví pH reakční směsi na pH 2,0 a reakční směs se nanese na kolonu Vydac C18 a eluuje gradientem acetonitrilu v podstatě tak, jak se popisuje v Utsumi a další, J. Biochem., díl 101, 1199 až 1208 (1987). Alternativně a elegantněji je možno použít gradientu isopropanolu.The reaction time is 30 min at room temperature. After 30 minutes of reaction, the pH of the reaction mixture is adjusted to pH 2.0 and the reaction mixture is loaded onto a Vydac C18 column and eluted with a gradient of acetonitrile essentially as described in Utsumi et al., J. Biochem. Vol. 101, 1199-1208. (1987). An isopropanol gradient may be used alternatively and more elegantly.
Získané frakce se analyzují použitím testu primárního screeningu popsaného výše a aktivní PEGylovaný polypeptid interferonu β získaný tímto způsobem se uchovává při -80 °C v PBS, pH 7 s obsahem 1 mg/ml HSA.The fractions obtained are analyzed using the primary screening assay described above and the active PEGylated interferon β polypeptide obtained in this way is stored at -80 ° C in PBS, pH 7 containing 1 mg / ml HSA.
Alternativně se pro vytvoření rozpustné domény IFNAR1 použije pouze složka receptoru za vytvoření binárního komplexu. IFNAR2 může být dále imobilizován na vhodné pryskyřici (například materiál Sepharose 6B aktivovaný epoxidovými skupinami) podle doporučení výrobce před vytvořením binárního komplexu. Po PEGylaci se eluuje PEGylovaný interferon β pufrem s 0,1 M glycinem pH 2 a měří se aktivita metodou popsanou výše po nastavení pH na neutrální hodnotu.Alternatively, only the receptor component is used to generate the soluble IFNAR1 domain to form a binary complex. IFNAR2 can be further immobilized on a suitable resin (for example, epoxy-activated Sepharose 6B material) according to the manufacturer's recommendations before forming a binary complex. After PEGylation, PEGylated interferon β buffer is eluted with 0.1 M glycine pH 2 and activity is measured by the method described above after adjusting the pH to neutral.
Přístupná oblast povrchu (Accessible Surface Area, ASA)Accessible Surface Area (ASA)
Pro výpočet přístupné oblasti povrchu jednotlivých atomů ve struktuře se použije počítačový program Access (B. Lee a F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379400 (1971)) verze 2 (Copyright (c) 1983 Yale University). Při této metodě se typicky využívá sonda o velikosti 1,4A (1 A = 0,1 nm) a přístupná oblast povrchu (ASA) se definuje jako plocha vytvořená středem této sondy. Před výpočtem se ze souboru souřadnic odstraní všechny molekuly vody a všechny atomy vodíku, stejně jako další atomy, které přímo nesouvisí s proteinem. Pro výpočet ASA jsou dostupné alternativní programy, například program Whatlf G. Vriend, J. Mol. Graph. (1990) 8, 52 - 56, dostupný v elektronické formě na adrese WWWThe computer program Access (B. Lee and F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379400 (1971)) version 2 (Copyright (c) 1983 Yale University) is used to calculate the accessible surface area of each atom in the structure. This method typically uses a probe of 1.4A (1A = 0.1 nm) and the accessible surface area (ASA) is defined as the area formed by the center of the probe. Before calculation, all water molecules and all hydrogen atoms as well as other atoms not directly related to the protein are removed from the coordinate file. Alternative programs are available to calculate ASA, such as Whatlf G. Vriend, J. Mol. Graph. (1990) 8, 52-56, available in electronic form on the World Wide Web
http://swift.emblheidelberg.de/servers2/ (R. Rodriguez a další, CABIOS (1998) 14, 523 - 528), přičemž pro výpočet přístupné oblasti povrchu se používá nastavení Accessibility.http://swift.emblheidelberg.de/servers2/ (R. Rodriguez et al., CABIOS (1998) 14, 523-528) using Accessibility settings to calculate the accessible surface area.
Částečná (frakční) ASA postranního řetězcePartial (fractional) ASA side chain
Částečná ASA atomů postranního řetězce se vypočte vydělením součtu hodnot ASA atomů v postranním řetězci hodnotou reprezentující ASA atomů postranního řetězce tohoto typu zbytku v rozšířeném tripeptidu ALA-x-ALA (viz Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220, 507 - 530). Pro tento příklad se atom CA považuje za část postranního řetězce pro zbytky glycinu, ale ne pro zbývající zbytky. Následující tabulka uvádí 100 % standardní hodnoty ASA pro postranní řetězec (1Á2 = 0,01 nm2).The partial side chain ASA atoms are calculated by dividing the sum of the side chain ASA values by the value representing the side chain ASA atoms of this type of residue in the extended tripeptide ALA-x-ALA (see Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220). 507-530). For this example, the CA atom is considered to be part of the side chain for glycine residues, but not for the remaining residues. The following table shows 100% of the default ASA value for the side chain (1A 2 = 0.01 nm 2 ).
- 97 44 4 • 4 9· • 4 4 4 • · 44 «4 4 • 44- 97 44 4 • 4 9 · • 4 4 4 • • 44 «4 4 • 44
4« 44444 «4444
4 44 4
44444444
Tyr 176,61 A2 Val 114,14 A2 Tyr 176.61 A 2 Val 114.14 A 2
Zjištění aminokyselinových zbytků vystavených na povrchuDetection of surface exposed amino acid residues
Trojrozměrná krystalická struktura lidského interferonu β v rozlišení 2,2 A (Karpusas a další. Proč. Nat. Acad. Sci. USA (1997) 94: 11813-11818) je dostupná v Protein Data Bank (PDB) (Bernstein, J. Mol. Biol. (1977) 112, str. 535) a elektronickou cestou dostupná v The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB na adrese http://www.pdb.org/ pod přístupovým kódem 1AU1. Tato krystalová struktura obsahuje dvě nezávislé molekuly lidského interferonu beta, přičemž v tomto příkladu se používá molekula A.The three-dimensional crystalline structure of human interferon β at 2.2 A resolution (Karpusas et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1997) 94: 11813-11818) is available from the Protein Data Bank (PDB) (Bernstein, J. Mol. (1977) 112, p. 535) and electronically available from The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB at http://www.pdb.org/ under access code 1AU1. This crystal structure contains two independent molecules of human interferon beta, molecule A being used in this example.
Vystavení (expozice) na povrchuSurface exposure
S použitím programu Whatlf popsaného výše bylo zjištěno, že následující zbytky mají nulovou povrchovou dostupnost pro atomy svých vedlejších řetězců (pro Gly je použita dostupnost atomu CA): G7, N14, C17, L21, I44, A55, A56, T58, I59, M62, L63, L98, L122, Y125, 1129, L133, A142, W143, V146, 1150, N153, 1157, L160, T161 a L164.Using the Whatlf program described above, the following residues have been found to have zero surface availability for their side chain atoms (CA availability for Gly): G7, N14, C17, L21, I44, A55, A56, T58, I59, M62 , L63, L98, L122, Y125, 1129, L133, A142, W143, V146, 1150, N153, 1157, L160, T161, and L164.
Částečné vystavení na povrchuPartial surface exposure
Pro další analýzu bylo nutné znovu modelovat vedlejší řetězce zbytků R71, R113, K115, L116, M117 v důsledku sterických kolizí. Remodelování bylo prováděno programem Modeler 98, MSI INC. Provedením výpočtů frakční ASA použitím počítačového programu Access na remodelované molekule interferonu β (zahrnující pouze zbytky aminokyselin a vylučující cukernou část navázanou přes atom dusíku) bylo zjištěno, že následující zbytky mají vystavených naFor further analysis, it was necessary to re-model the side chains of residues R71, R113, K115, L116, M117 due to steric collisions. Remodeling was performed with Modeler 98, MSI INC. By performing fractional ASA calculations using the computer program Access on a remodeled interferon β molecule (including only amino acid residues and a secreted sugar moiety bound through a nitrogen atom), the following residues have been exposed to
·· • · • φ · * · • · ♦ φ φφφφ·· · · φ · ♦ · φ φ φφφφ
Φ· ·· • φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφφφ povrchu více než 25 % svých postranních řetězců: S2, N4, L5, F8, L9, R111, S12, F15, Q16, Q18, K19, W22, Q23, G26, R27, L28, E29, Y30, L32, K33, R35, M36, N37, D39, E42, K45, Q46, L47, Q48, Q49, Q51, K52, Q64, A68, R71, Q72, D73, S75, S76, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, N96, H97, K99, T100, E103, E104, K105, E107,More than 25% of their side chains: S2, N4, L5, F8, L9, R111, S12, F15, Q16, Q18, K19, W22, Q23 , G26, R27, L28, E29, Y30, L32, K33, R35, M36, N37, D39, E42, K45, Q46, L47, Q48, Q49, Q51, K52, Q64, A68, R71, Q72, D73, S75 , S76, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, N96, H97, K99, T100, E103, E104, K105, E107,
postranních řetězců vystavených na povrchu: N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, G26, R27, E29, Y30, K33, R35, N37, D39, E42, Q46, Q48, Q49, Q51, K52, R71, D73, S75, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, K99, T100, E103, E104, E107, K108, D110, F111, L116, K123, R124, G127, H131, K134, E137, V148, Y155, R165 a N166.side-chains exposed on the surface: N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, G26, R27, E29, Y30, K33, R35, N37, D39, E42, Q46, Q48, Q49, Q51, K52, R71, D73, S75, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, K99, T100, E103, E104, E107, K108, D110, F111, L116, K123, R124, G127, K134, E137, V148, Y155, R165 and N166.
Příklad 1Example 1
Návrh expresní katezy pro expresi interferonu β v savčích a hmyzích buňkáchDesign of expression catalysis for expression of interferon β in mammalian and insect cells
Sekvence DNA, GenBank přístupové číslo M28622 (ukázaná v SEQ ID No. 1), která obsahuje úplnou cDNA kódující lidský interferon β se svým nativním signálním peptidem, byla modifikována pro umožnění vysoké exprese v savčích buňkách. Nejprve byl modifikován startovací kodon ATG podle Kozákovy standardní sekvence (Kozák, M. J. Mol. Biol., 20. srpna 1987; 196 (4): 947 - 50), takovým způsobem, že se dosáhne výborné shody se standardní sekvencí proti směru translace vzhledem ke startovacímu kodonu ATG. Za druhé byly modifikovány kodony nativního lidského interferonu β vytvořením sklonu k využití kodonů směrem ke kodonům často používaným v lidských genech s vysokou expresí. Potom byly nahrazeny některé nukleotidy v sekvenci jinými pro zavedení • »» ♦·The DNA sequence, GenBank Accession No. M28622 (shown in SEQ ID No. 1), which contains the complete cDNA encoding human interferon β with its native signal peptide, has been modified to allow high expression in mammalian cells. First, the ATG start codon was modified according to the Kozak standard sequence (Kozak, MJ Mol. Biol., August 20, 1987; 196 (4): 947-50), in such a way that excellent agreement with the standard sequence upstream of the translation was achieved. ATG start codon. Secondly, the codons of native human interferon β have been modified by creating a tendency to use codons towards codons frequently used in high-expression human genes. Then, some nucleotides in the sequence have been replaced by others to introduce »» ♦ ·
4 4 4 4 4 4 ·· * 4 4 rozpoznávacích míst pro restrikční endonukleázy DNA (to umožňuje pozdější snadnou modifikaci sekvence DNA). Primery byly navrženy tak, aby mohl být syntetizován gen:4 4 4 4 4 4 ·· * 4 4 DNA restriction endonuclease recognition sites (this allows easy DNA sequence modification later). The primers were designed so that the gene could be synthesized:
CBProFprl:CBProFprl:
5’GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCGCCACCATGACCAACAA GTGCCTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGT-3’, SEQ ID 3,5’GGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCGCCACCATGACCAACAA GTGCCTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGT-3 ', SEQ ID 3,
CBProFpr2:CBProFpr2:
5’ACAACCTGCTCGGCTTCCTGCAGAGGAGTTCGAACTTCCAGTGC CAGAAGCTCCTGTGGCAGCTGAACGG-3’, SEQ ID 4,5’ACAACCTGCTCGGCTTCCTGCAGAGGAGTTCGAACTTCCAGTGC CAGAAGCTCCTGTGGCAGCTGAACGG-3 ', SEQ ID 4,
CBProFprS:CBProFprS:
5’GAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCAAGCAGCTGCAGCAGTTCC AGAAGGAGGACGCCGCTCTGACCATC-3’, SEQ ID 5,5’GAACTTCGACATCCCCGAGGAAATCAAGCAGCTGCAGCAGTTCC AGAAGGAGGACGCCGCTCTGACCATC-3 ', SEQ ID 5,
CBProFpr4:CBProFpr4:
5’TTCCGCCAGGACTCCAGCTCCACCGGTTGGAACGAGACCATCGT GGAGAACCTGCTGGCCAACGTGTACC-3’, SEQ ID 6,5’TTCCGCCAGGACTCCAGCTCCACCGGTTGGAACGAGACCATCGT GGAGAACCTGCTGGCCAACGTGTACC-3 ', SEQ ID 6,
CBProFpr5:CBProFpr5:
5’AGGAGAAGCTGGAGAAGGAGGACTTCACCCGCGGCAAGCTGATG AGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTACTA-3’, SEQ ID 7,5’AGGAGAAGCTGGAGAAGGAGGACTTCACCCGCGGCAAGCTGATG AGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTACTA-3 ', SEQ ID 7,
CBProFpr6:CBProFpr6:
5’GGAGTACAGCCACTGCGCCTGGACCATCGTACGCGTGGAGATCC TGCGCAACTTCTACTTCATCAACCGC-3’, SEQ ID 8,5’GGAGTACAGCCACTGCGCCTGGACCATCGTACGCGTGGAGATCC TGCGCAACTTCTACTTCATCAACCGC-3 ', SEQ ID 8,
CBProFpr9:CBProFpr9:
5’CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCC GGTCAGGCGGTTGATGAAGTAGAAGT-3’, SEQ ID 9,5’CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCC GGTCAGGCGGTTGATGAAGTAGAAGT-3 ', SEQ ID 9,
CBProFprl 0:CBProFprl 0:
5’AGGCGCAGTGGCTGTACTCCTTGGCCTTCAGGTAGTGCAGGATG CGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAG-3’, SEQ ID 10,5’AGGCGCAGTGGCTGTACTCCTTGGCCTTCAGGTAGTGCAGGATG CGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAG-3 ', SEQ ID 10,
100 • ·* *· ©· *» · · 9 9 9 9100 • 9 9 9 9
9 9 » · • · * · » © • 9 9 9 99 9 9
999 ©··« ©© 9999999 © ·· «© 9999
99 © « 998 © «9
9 99 9
9 99 9
9 99 9
9 99999 9999
CBProFprl 7:CBProFprl 7:
5’CTCCTTCTCCAGCTTCTCCTCCAGCACGGTCTTCAGGTGGTTGAT CTGGTGGTACACGTTGGCCAGCAGG-3’, SEQ ID 11,5’CTCCTTCTCCAGCTTCTCCTCCAGCACGGTCTTCAGGTGGTTGAT CTGGTGGTACACGTTGGCCAGCAGG-3 ', SEQ ID 11,
CBProFprl 2:CBProFprl 2:
5’GAGCTGGAGTCCTGGCGGAAGATGGCGAAGATGTTCTGCAGCAT CTCGTAGATGGTCAGAGCGGCGTCCT-3’, SEQ ID 12,5’GAGCTGGAGTCCTGGCGGAAGATGGCGAAGATGTTCTGCAGCAT CTCGTAGATGGTCAGAGCGGCGTCCT-3 ', SEQ ID 12,
CBProFprl 3:CBProFprl 3:
5'CCTCGGGGATGTCGAAGTTCATCCTGTCCTTCAGGCAGTACTCCA GGCGCCCGTTCAGCTGCCACAGGAG-3', SEQ ID 13,5'CCTCGGGGATGTCGAAGTTCATCCTGTCCTTCAGGCAGTACTCCA GGCGCCCGTTCAGCTGCCACAGGAG-3 ', SEQ ID 13,
CBProFprt4:CBProFprt4:
5’CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCGATAGGGCCGTGGTGC TGAAGCACAGGAGCAGGGCGATCTGG-3’, SEQ ID 14,5’CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCGATAGGGCCGTGGTGC TGAAGCACAGGAGCAGGGCGATCTGG-3 ', SEQ ID 14,
Tyto primery byly sestaveny do syntetického genu jednostupňovou PCR použitím kitu Platinum P/x-polymerase kit (Life Technologies) a standardních parametrů cyklování pro třístupňovou PCR. Sestavený gen byl amplifikován PCR za stejných podmínek.These primers were assembled into a synthetic gene by a one-step PCR using a Platinum P / x-polymerase kit (Life Technologies) and standard cycling parameters for a three-step PCR. The assembled gene was amplified by PCR under the same conditions.
cDNA kódující N-koncovou prodlouženou formu lidského interferonu β byla syntetizována za stejných podmínek PCR jak bylo popsáno výše, ale s primery CBProFprl a -14 nahrazenými následujícími primery:The cDNA encoding the N-terminal extended form of human interferon β was synthesized under the same PCR conditions as described above, but with primers CBProFpr1 and -14 replaced by the following primers:
CBProFpr7CBProFpr7
5’CTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGTGCTTCAGCACCACGGCCCT ATCGATGAAGCACCAGCACCAGCATC-3’, SEQ ID 15,5’CTGCTCCAGATCGCCCTGCTCCTGTGCTTCAGCACCACGGCCCT ATCGATGAAGCACCAGCACCAGCATC-3 ', SEQ ID 15,
CBProFpr8CBProFpr8
5’CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGA GACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAAC-3’, SEQ ID 16,5’CACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGA GACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAAC-3 ', SEQ ID 16,
CBProFprl 5CBProFprl 5
5’CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCTGTTGGTGTTGATGTTG GTGCTGATGCTGGTGCTGGTGCTTC-3’, SEQ ID 17,5’CAGGAAGCCGAGCAGGTTGTAGCTCATCTGTTGGTGTTGATGTTG GTGCTGATGCTGGTGCTGGTGCTTC-3 ', SEQ ID 17,
101101
CBProFpr16CBProFpr16
5’AGCAGGGCGATCTGGAGCAGGCACTTGTTGGTCATGGTGGCGAA GCTTAAGTTTAAACGCTAGCCAGCTT-3’, SEQ ID 18, aby se dosáhlo zavedení purifikační značky do molekuly interferonu β.5’AGCAGGGCGATCTGGAGCAGGCACTTGTTGGTCATGGTGGCGAA GCTTAAGTTTAAACGCTAGCCAGCTT-3 ', SEQ ID 18, to achieve the introduction of a purification tag into the interferon β molecule.
Syntetizované geny byly klonovány do pcDNA3.1/Hygro (invitrogen) mezi štěpící místo HindWl na 5’ konci a místo Sa/nHI na 3’ konci, za získání pCBProFI a pCBProF2.The synthesized genes were cloned into pcDNA3.1 / Hygro (invitrogen) between the HindWl cleavage site at the 5 'end and the Sa / nHI site at the 3' end, to obtain pCBProFI and pCBProF2.
Syntetický intron z pCI-Neo (Promega) byl amplifikován za standardních podmínek PCR jak bylo popsáno výše a s použitím následujících primerů:The synthetic intron from pCI-Neo (Promega) was amplified under standard PCR conditions as described above and using the following primers:
CBProFpr37CBProFpr37
5’-CCGTCAGATCCTAGGCTAGCTTATTGCGGTAGTTTATCAC-3’,5’-CCGTCAGATCCTAGGCTAGCTTATTGCGGTAGTTTATCAC-3 ’,
SEQ ID 19,SEQ ID 19,
CBProFpr38CBProFpr38
5’-GAGCTCGGTACCAAGCTTTTAAGAGCTGTAAT-3’, SEQ ID 20, za získání fragmentu PCR o velikosti 332 bp, který byl štěpen Nhe\ a H/ndlll a vložen do 5’UTR plasmidů pCBProFI a pCBProF2 za získání pCBProF4 a pCBProF5.5'-GAGCTCGGTACCAAGCTTTTAAGAGCTGTAAT-3 ', SEQ ID 20, to obtain a 332 bp PCR fragment that was digested with Nhe \ and H / ndlll and inserted into 5´UTR of the pCBProFI and pCBProF2 plasmids to obtain pCBProF4 and pCBProF5.
Kodony jednotlivých aminokyselin byly měněny amplifikací příslušných oblastí kódující oblasti pomocí PCR takovým způsobem, aby mohly být změny zavedené PCR do sekvence vkládány do expresních plasmidů klasickými technikami klonování. Například primery:The codons of the individual amino acids were altered by amplifying the appropriate regions of the coding region by PCR in such a way that changes introduced by the PCR into the sequence could be inserted into the expression plasmids by conventional cloning techniques. For example, primers:
primer Lys45arg-5 (Nar\/Kas\):primer Lys45arg-5 (Nar / Kas):
5’GCTGAACGGGCGCCTGGAGTACTGCCTGAAGGACAGGATGAACT TCGACATCCCCGAGGAAATCCGCCAGCTGCAGC-3’, SEQ ID 21, primer Lys45mut-3’ (Bsi\N\):5’GCTGAACGGGCGCCTGGAGTACTGCCTGAAGGACAGGATGAACT TCGACATCCCCGAGGAAATCCGCCAGCTGCAGC-3 ', SEQ ID 21, primer Lys45mut-3' (Bsi \ N \):
** ♦ · ··** ♦ · ··
102 • *102 • *
4» ··4 »··
5'TCTCCACGCGTACGATGGTCCAGGCGCAGTGGCTG-3’, SEQ ID 22, byly použity pro zavedení substituce K45R do fragmentu PCR zahrnujícího oblast od polohy 1055 do 1243 v plasmidu pCBProFI. Jak fragment PCR, tak i plasmid pCBProFI, byly štěpeny Narí a Bs/WI, přičemž obě tato místa štěpení jsou jedinečná. Fragment PCR a kostra vektoru plasmidu pCBProFI se čistí a spojují za získání substituce kodonu AAG pro LysA5 kodonem CGC pro ARG v plasmidu pCBProFI.The 5'TCTCCACGCGTACGATGGTCCAGGCGCAGTGGCTG-3 ', SEQ ID 22, was used to introduce a K45R substitution into a PCR fragment comprising a region from position 1055 to 1243 in plasmid pCBProFI. Both the PCR fragment and the pCBProFI plasmid were digested with Nali and Bs / WI, both of which were unique. The PCR fragment and the pCBProFI plasmid vector backbone are purified and ligated to obtain a codon substitution of the AAG codon for LysA5 by the CGC codon for ARG in the plasmid pCBProFI.
Pro zavedení substitucí aminokyselin byla použita metoda SOE (sequence overhang extension) PCR. Při metodě SOE-PCR byly nejprve amplifikovány v individuálních primárních PCR jak N-koncová část, tak C-koncová část molekuly INFB.The sequence overhang extension (SOE) PCR method was used to introduce amino acid substitutions. In the SOE-PCR method, both the N-terminal part and the C-terminal part of the INFB molecule were first amplified in individual primary PCRs.
Pro tyto primární PCR byly centrální komplementární primery syntetizovány tak, že kodon (kodony) pro substituovanou aminokyselinu (aminokyseliny) se mění na požadovaný kodon nebo kodony. Koncové primery byly standardní primery definující N- a Ckonec molekuly INF-β. Koncové primery dále poskytly štěpící místo pro restrikční enzym umožňující následné klonování produktu PCR s úplnou délkou. Centrální (nekódující) primer a N-koncový (kódující) primer byly tedy použity pro amplifikaci N-koncové části kódující oblasti INF-β v jedné z primárních PCR a stejně tomu bylo pro Ckoncovou část. Amplifikované N- a C-koncové části se uspořádají do úplného produktu při sekundární PCR a klonují se do modifikované verze pCDNA3.1/Hygro, jak bylo popsáno výše. Pro zavedení mutací pro substituce F11N a R113T byly tedy například použity následující primery;For these primary PCRs, the central complementary primers were synthesized such that the codon (s) for the substituted amino acid (s) changed to the desired codon (s). The terminal primers were standard primers defining the N- and C-terminus of the INF-β molecule. The end primers further provided a restriction enzyme cleavage site allowing subsequent cloning of the full-length PCR product. Thus, the central (non-coding) primer and the N-terminal (coding) primer were used to amplify the N-terminal portion of the coding region of INF-β in one of the primary PCRs, as was the case for the C-terminal portion. The amplified N- and C-terminal portions are assembled into the complete product by secondary PCR and cloned into the modified version of pCDNA3.1 / Hygro as described above. Thus, for example, the following primers were used to introduce mutations for the F11N and R113T substitutions;
CBProFprimer9 (kódující):CBProFprimer9 (coding):
CACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGCACCACACTGGACTAGTGGATCCTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGG
TCAGGCGGTTGATGAAGTAGAAGT (SEQ ID NO 23) • · • · · · • ·TCAGGCGGTTGATGAAGTAGAAGT (SEQ ID NO 23)
- 103- 103
CBProFprimer231 (nekódující):CBProFprimer231 (non-coding):
CATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC (SEQ ID NO 24), CBProFprimer230 (kódující):CATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC (SEQ ID NO 24), CBProFprimer230 (encoding):
GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATG (SEQ ID NO 25), CBProFprimer42 (nekódující):GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATG (SEQ ID NO 25), CBProFprimer42 (non-coding):
CACACTGGACTAGTAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGC (SEQ ID NO 26).CACACTGGACTAGTAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGC (SEQ ID NO 26).
Navíc v případech, kdy byla nebo byly zaváděné mutace dostatečně blízko jedinečnému restrikčnímu místu pro štěpení endonukleázou v expresním plasmidu, byly zkonstruovány varianty genů použitím postupu konstrukce zahrnujícího jediný krok PCR a následné klonování. Například substituce K19R byla zavedena použitím primeru PCR:In addition, in cases where the introduced mutations were or were sufficiently close to the unique restriction site for endonuclease cleavage in the expression plasmid, gene variants were constructed using a construction procedure involving a single PCR step and subsequent cloning. For example, the K19R substitution was introduced using a PCR primer:
CBProFpr58:CBProFpr58:
GAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGCGCCTCCTGTGGCAGCTGAAGAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGCGCCTCCTGTGGCAGCTGAA
CG (SEQ ID NO 27), aCG (SEQ ID NO. 27), a
CBProFprimer9:CBProFprimer9:
Produkt PCR byl potom klonován použitím štěpících míst Bsi\N\ a SsřBI.The PCR product was then cloned using the Bsi \ N \ and SsBBI cleavage sites.
Příklad 2Example 2
Exprese lidského interferonu β v systému bakulovirus/hmyzí buňkaExpression of human interferon β in the baculovirus / insect cell system
Pro expresi syntetického genu kódujícího lidský interferon β zahrnutý v plasmidu pCBProFI (popsaného v příkladu 1) v systému bakulovirus/hmyzí buňka byl gen vyříznut Nhe\ a Xho\ a vložen do přenosového vektoru pBlueBac 4.5, který je obsažen v kitu MaxBac 2.0 Transfection kit, získaném u firmy Invitrogen (San Diego, USA). Všechny metody pro vytváření rekombinantního bakuloviru a expresi • ·To express the synthetic gene encoding human interferon β included in the pCBProFI plasmid (described in Example 1) in a baculovirus / insect cell system, the gene was excised with Nhe \ and Xho \ and inserted into the pBlueBac 4.5 transfer vector contained in the MaxBac 2.0 Transfection kit. obtained from Invitrogen (San Diego, USA). All methods for recombinant baculovirus production and expression
- 104 ··· ···· · • · · · · · ·· ···· ·· ···· v hmyzích buňkách jsou popsány v příručce „MaxBac 2.0 Transfection and Expression Manual“, přiložené v kitu.- 104 in insect cells are described in the “MaxBac 2.0 Transfection and Expression Manual” included in the kit.
Ve stručnosti, spolu s iinearizovanou DNA AcMNPV (Bac-N-Blue DNA) byl do buněk SF9 transfekován systém pBlueBac 4.5-interferon β CBProFI. Tři dny po transfekci byl transfekční supernatant oddělen a bylo připraveno testování na plaky s vhodnými ředěními viru. Jednotlivé modré plaky byly viditelné po sedmi dnech a šest jednotlivých plaků bylo odděleno pro namnožení v šestijamkové destičce. Po dvou dnech byly z každé jamky sklizeny 2 ml virového supernatantu (zásobní supernatant P-1). Ze zásobních supernatantů P-1 bylo odebráno 0,75 ml a byla izolována virová genomická DNA. Virové genomické DNA byly analyzovány reakcemi PCR s primery v obou směrech, aby bylo možno provést selekci rekombinantních bakulovirů mezi šesti zásobními supernatanty P-1. Malý alikvot ze zásobního supernatantu P-1 byl testován specifickou ELISA na lidský interferon β (dostupná od PBL Biomedical Laboratories) pro zajištění, že v supernatantu je přítomen lidský interferon β.Briefly, pBlueBac 4.5-interferon-β CBProFI system was transfected into SF9 cells along with linearized AcMNPV DNA (Bac-N-Blue DNA). Three days after transfection, the transfection supernatant was collected and plaque testing with appropriate virus dilutions was prepared. Individual blue plaques were visible after seven days and six individual plaques were separated for multiplication in a six-well plate. After 2 days, 2 ml of virus supernatant (stock supernatant P-1) was harvested from each well. 0.75 ml was collected from the stock supernatants of P-1 and viral genomic DNA was isolated. Viral genomic DNAs were analyzed by PCR reactions with primers in both directions to select recombinant baculoviruses between the six stock supernatants of P-1. A small aliquot of the stock supernatant P-1 was tested by human ELISA for human interferon β (available from PBL Biomedical Laboratories) to ensure that human interferon β was present in the supernatant.
Pro další propagaci vybraného rekombinantního bakuloviru bylo zaočkováno 6 x 106 buněk SF9 do kultivační baňky T-80 a infikováno 100 pl zásobního supernatantu P-1. Po pěti dnech byl sklizen supernatant (zásobní supernatant P-2) a 2 ml tohoto supernatantu P-2 byly použity pro infekci 100 ml suspenzní kultury (1 x 106 buněk SF9/ml) v 500 ml Erlenmeyerově baňce (Corning). Po pěti dnech byl sklizen supernatant (zásobní supernatant P-3) a testováním plaků byl zjištěn titr viru.To further propagate the selected recombinant baculovirus, 6 x 10 6 SF9 cells were seeded into a T-80 flask and infected with 100 µl of the stock supernatant P-1. After five days the supernatant (stock supernatant P-2) was harvested and 2 ml of this supernatant P-2 were used to infect 100 ml suspension culture (1 x 10 6 SF9 cells / ml) in a 500 ml Erlenmeyer flask (Corning). After five days, the supernatant (stock supernatant P-3) was harvested and plaque assay was performed to determine virus titer.
Pro produkci lidského interferonu β pro vyčištění bylo sklizeno 1 x 109 buněk SF9 ze záložní suspenzní kultury. V 50 ml zkumavce se šroubovacím víčkem byly buňky SF9 infikovány rekombinantním bakulovirem ze zásobního supernatantu P-3 (MOI = 2) po dobu 15 min. Potom byly buňky odstředěny a jednou promyty bezsérovým médiem (Sf-900 II SFM, Gibco BRL) převedeny do 2800 ml • 9To produce human interferon β for purification, 1 x 10 9 SF9 cells were harvested from a back-up suspension culture. In a 50 ml screw cap tube, SF9 cells were infected with recombinant baculovirus from the stock supernatant P-3 (MOI = 2) for 15 min. The cells were then centrifuged and washed once with serum-free medium (Sf-900 II SFM, Gibco BRL) transferred to 2800 ml.
105 Fernbachovy baňky se třemi zarážkami (Bellco) obsahující 1 I bezsérového média. Tři dny po infekci byl supernatant z média sklizen a rekombinantní lidský interferon β byl čištěn.105 three-stop Fernbach flasks (Bellco) containing 1 L of serum-free medium. Three days after infection, the supernatant from the medium was harvested and recombinant human interferon β was purified.
Čištění molekul interferonu βPurification of interferon β molecules
Fermentační půda se zakoncentruje a/nebo se po zředění na vhodnou iontovou sílu nastaví pH na přibližně 4,5. Vhodná iontová síla je tak nízká iontová síla, že se interferon β váže na kationtovou iontoměničovou kolonu Mono S (Pharmacia) ekvilibrovanou v 4 mM kyselině octové pH 4,5 (pufr A). Po nanesení se kolona promyje třemi objemy pufru A a interferon β se eluuje lineárním gradientem od pufru A k pufru A s obsahem 1M NaCl. Alternativně je možno vyčištění dosáhnout metodou popsanou pro interferon α (Analytical Biochemistry 247, 434 - 440 (1997), použitím kolony TSK-gel SP-5PW (Toso Haas)).The fermentation broth is concentrated and / or the pH is adjusted to about 4.5 after dilution to a suitable ionic strength. A suitable ionic strength is so low an ionic strength that interferon β binds to a Mono S cation exchange column (Pharmacia) equilibrated in 4 mM acetic acid pH 4.5 (buffer A). After loading, the column is washed with three volumes of Buffer A and interferon β is eluted with a linear gradient from Buffer A to Buffer A containing 1M NaCl. Alternatively, purification can be achieved by the method described for interferon α (Analytical Biochemistry 247, 434-440 (1997), using a TSK-gel SP-5PW column (Toso Haas)).
Interferon β označený histidinovou značkou může být vyčištěn alternativně použitím metody IMAC (afinitní chromatografie s imobilizovaným kovem) dobře známými metodami, například jak se popisuje v UniZyme Laboratories, Denmark.The histidine tag labeled interferon β can be purified alternatively using IMAC (immobilized metal affinity chromatography) by well known methods, for example as described in UniZyme Laboratories, Denmark.
Další metoda čištění využívá monoklonální nebo polyklonální protilátky. Fermentační půda obsahující interferon β se upraví na pH 7 a obsah 0,5M NaCl a nanese se na kolonu s imobilizovanou monoklonální protilátkou proti rekombinantnímu lidskému interferonu β. Kolona se před použitím ekvilibruje například pufrem 10 mM Tris, 0,5M NaCl, pH 7 (pufr B). Po nanesení se kolona promyje třemi objemy kolony pufru B a eluuje se vhodným pufrem při nízkém pH (například pH 2 až 3).Another method of purification utilizes monoclonal or polyclonal antibodies. The fermentation broth containing interferon β is adjusted to pH 7 and 0.5 M NaCl and applied to a column with immobilized monoclonal antibody against recombinant human interferon β. The column is equilibrated, for example, with 10 mM Tris buffer, 0.5 M NaCl, pH 7 (buffer B) prior to use. After loading, the column is washed with three column volumes of buffer B and eluted with a suitable buffer at low pH (e.g. pH 2-3).
Alternativně se na interferon β naváže značka, například peptid c-Myc (EQKLI SEEDL), vytvoří se monoklonální protilátky proti peptidu c-Myc a interferon β se čistí podobným způsobem jak bylo uvedeno • · • ·Alternatively, a label, such as c-Myc peptide (EQKLI SEEDL), is bound to interferon β, monoclonal antibodies to the c-Myc peptide are generated, and interferon β is purified in a similar manner as described above.
- 106 ♦ · 4 výše. Imobilizace protilátky na kolonu se dosáhne například použitím materiálu CNBr-Sepharose (Pharmacia) podle doporučení výrobce.- 106 ♦ · 4 above. Immobilization of the antibody to the column is achieved, for example, using CNBr-Sepharose (Pharmacia) according to the manufacturer's recommendations.
Jestliže je nutné získat potřebný stupeň čistoty pro další experimenty, může se použít kombinace kationtové iontoměničové chromatografie, IMAC a/nebo chromatografie na protilátce.If it is necessary to obtain the necessary degree of purity for further experiments, a combination of cation exchange chromatography, IMAC, and / or antibody chromatography may be used.
Čistota, identita, kvantitativní obsah a aktivita eluovaných frakcí z popisovaných kolon může být měřena kombinací metod známých odborníkům v oboru. Ty mohou zahrnovat jednu nebo více z následujících testovacích metod a postupů, nebo jiné vhodné metody známé odborníkům v oboru: primární a sekundární testy popisované výše, metody ELISA, SDS-PAGE, westernový přenos, IEF, HPLC, sekvenování aminokyselin, hmognostní spektrometrie a analýza aminokyselin.The purity, identity, quantitative content and activity of the eluted fractions from the described columns can be measured by a combination of methods known to those skilled in the art. These may include one or more of the following test methods and procedures, or other suitable methods known to those skilled in the art: primary and secondary assays described above, ELISA, SDS-PAGE, western blotting, IEF, HPLC, amino acid sequencing, mass spectrometry and analysis amino acids.
Po vyčištění se může provést konjugace polypeptidů interferonu β k molekule polymeru jako je M-SPA-5000 firmy Shearwater Polymers, podle instrukcí výrobce. Před konjugací se s výhodou blokuje rozpoznávací místo receptoru vyčištěného modifikovaného polypeptidů interferonu β, jak se popisuje v části Materiály a metody.After purification, the interferon β polypeptides may be conjugated to a polymer molecule such as M-SPA-5000 from Shearwater Polymers, according to the manufacturer's instructions. Preferably, prior to conjugation, the recognition site of the purified modified interferon β polypeptide is blocked as described in Materials and Methods.
Příklad 3Example 3
Exprese lidského interferonu β v buňkách HEK293Expression of human interferon β in HEK293 cells
Pro expresi syntetického genu kódujícího lidský interferon β jako součást plasmidu pCBProFI (popsaného v příkladu 1), v buňkách HEK293 (ATCC katalogové číslo CRL-1573) byl gen amplifikován metodou PCR s dvěma primery:To express the synthetic gene encoding human interferon β as part of the plasmid pCBProFI (described in Example 1) in HEK293 cells (ATCC Catalog No. CRL-1573), the gene was amplified by two-primer PCR:
PBR 7 (5OGCGGATCCATATGACCAACAAGTGCCTG-3’) (SEQ ID NO 28) aPBR 7 (5OGCGGATCCATATGACCAACAAGTGCCTG-3 ') (SEQ ID NO 28) and
PBR 2 (5OGCGGATCCTTATCAGTTGCGCAG-3’) (SEQ ID NOPBR 2 (5OGCGGATCCTTATCAGTTGCGCAG-3 ') (SEQ ID NO
29) • · • ·29)
107 a klonován do štěpícího místa fíamHI plasmidu pcDNA3.1 (-) (Invitrogen, USA) ve správné orientaci za poskytnutí plasmidu pPR9.107 and cloned into the cleavage site of the plasmid pcDNA3.1 (-) (Invitrogen, USA) in the correct orientation to give plasmid pPR9.
Pro transfekci buněčné linie HEK293 byla zaočkována kultivační baňka T-25 do 50% konfluence v médiu DMEM (Life Technologies, USA) s obsahem 10% FBS a inkubována přes noc. Použitím činidla FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche, USA) byl pPR9 transfekován do buněk: do 95 μΙ bezsérového média DMEM bylo přidáno 5 μΙ činidla FuGENE 6 a 1,7 μΙ (2 μg) pPR9 a směs byla inkubována při teplotě laboratoře 20 min. Transfekční komplex byl potom přidán po kapkách k buňkám a kultivační baňka byla vrácena do inkubátoru. Další den byly buňky trypsinizovány a zaočkovány do kultivační baňky T-80 do média DMEM obsahujícího 10% FBS a 500 pg Geneticinu (Life Technologies) na ml.To transfect the HEK293 cell line, a T-25 culture flask was seeded into 50% confluency in DMEM medium (Life Technologies, USA) containing 10% FBS and incubated overnight. Using FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche, USA), pPR9 was transfected into cells: 5 µΙ of FuGENE 6 reagent and 1.7 µΙ (2 µg) of pPR9 were added to 95 μΙ serum-free DMEM and incubated at room temperature for 20 min. The transfection complex was then added dropwise to the cells and the culture flask was returned to the incubator. The next day, cells were trypsinized and seeded into a T-80 flask in DMEM medium containing 10% FBS and 500 µg Geneticin (Life Technologies) per ml.
Když bylo dosaženo konfluence, použitím ELISA specifické pro lidský interferon β bylo potvrzeno, že produkt primární transfekce exprimuje požadovaný protein a buňky byly subklonovány metodou omezeného ředění. Tímto způsobem byl identifikován HEK293 exprimující lidský interferon β.When confluence was achieved, using an human interferon β specific ELISA, it was confirmed that the primary transfection product expresses the desired protein and the cells were subcloned by a limited dilution method. In this way, HEK293 expressing human interferon β was identified.
Příklad 4Example 4
Dosažení vysoké exprese interferonu β v buňkách CHOAchieving high expression of interferon β in CHO cells
Buněčná linie CHO K1 [p22]-E4 (ATCC # CCL-61) stabilně exprimující lidský interferon β byla pasážována 1 : 10 z konfluentní kultury a pomnožena ve formě adherentních buněk v baňkách T-25 v médiu s obsahem séra (MEMcc s ribonukleotidy a deoxyribonukleotidy (Gibco/BRL Cat # 32571), 10% FCS (Gibco/BRL Cat # 10091), penicilinu a streptomycinu (Gibco/BRL Cat # 15140-114) až do dosažení konfluence. Média byla potom zaměněna za bezsérová média (RenCyte CHO; MediCult Cat. # 22600140) na 24 hod před přidáním 5 mM butyrátu sodného (Merck Cat # 8,17500) při výměněThe CHO K1 [p22] -E4 cell line (ATCC # CCL-61) stably expressing human interferon β was passaged 1: 10 from confluent culture and expanded as adherent cells in T-25 flasks in serum-containing medium (MEMcc with ribonucleotides and deoxyribonucleotides (Gibco / BRL Cat # 32571), 10% FCS (Gibco / BRL Cat # 10091), penicillin and streptomycin (Gibco / BRL Cat # 15140-114) until confluence was achieved, and the media was then changed to serum-free media (RenCyte CHO) MediCult Cat. # 22600140) for 24 hours before adding 5 mM sodium butyrate (Merck Cat # 8,17500) in exchange
• 4• 4
108 «108 «
4444 média. Buňky byly potom ponechány exprimovat interferon β 48 hod před sklizením média. Koncentrace interferonu β v kulturách ve dvojím opakování byla zjištěna jako 854 797 lU/ml (s dolním a horním intervalem spolehlivosti 95 % v rozmezí 711 134 lU/ml a 1 032 012 IU/ml)).4444 media. The cells were then allowed to express interferon β 48 hours prior to harvesting the medium. Interferon β concentrations in duplicate cultures were found to be 854,797 IU / ml (with 95% lower and upper confidence intervals between 711,134 IU / ml and 1,032,012 IU / ml).
V odděleném souboru experimentů byla buněčná linie CHO K1 [p22]-E4 stabilně exprimující lidský interferon β pasážována 1 : 10 z konfluentní kultury a pomnožena ve formě adherentních buněk v médiu s obsahem séra (MEMa s ribonukleotidy a deoxyribonukleotidy (Gibco/BRL Cat # 32571), 10% FCS (Gibco/BRL Cat # 10091), penicilinu a streptomycinu (Gibco/BRL Cat # 15140-114) až do dosažení konfluence v 10 vrstevném zařízení pro pěstování buněk (NUNC # 165250).In a separate set of experiments, the CHO K1 [p22] -E4 cell line stably expressing human interferon β was passaged 1: 10 from confluent culture and expanded as adherent cells in serum containing medium (MEMa with ribonucleotides and deoxyribonucleotides (Gibco / BRL Cat # 32571) ), 10% FCS (Gibco / BRL Cat # 10091), penicillin and streptomycin (Gibco / BRL Cat # 15140-114) until confluency was reached in a 10-layer cell culture apparatus (NUNC # 165250).
Média byla potom zaměněna za bezsérová média; DMEM/F12 (Gibco/BRL # 11039-021) s přídavkem 1 : 100 ITS-A (Gibco/BRL # 51300-044) a 1 : 500 EX-CYTE VLE (Serological Proteins lne. # 81129-1) a 1 : 100 penicilinu a streptomycinu (Gibco/BRL Cat # 15140114) 48 hod před výměnou média s dalším přidáním 5 mM butyrátu (Merck Cat # 8.17500). Buňky byly potom ponechány exprimovat interferon β 48 hod před sklizením média. Bylo zjištěno, že koncentrace interferonu β je 824 791 IU/ml (s dolním, popřípadě horním intervalem spolehlivosti 95% v rozmezí 610 956 IU/ml a 1 099 722 IU/ml)).The media was then changed to serum-free media; DMEM / F12 (Gibco / BRL # 11039-021) with 1: 100 addition of ITS-A (Gibco / BRL # 51300-044) and 1: 500 EX-CYTE VLE (Serological Proteins Inc. # 81129-1) and 1: 100 penicillin and streptomycin (Gibco / BRL Cat # 15140114) 48 hours prior to medium change with additional addition of 5 mM butyrate (Merck Cat # 8.17500). The cells were then allowed to express interferon β 48 hours prior to harvesting the medium. The concentration of interferon β was found to be 824,791 IU / ml (with a lower or upper 95% confidence interval between 610,956 IU / ml and 1,099,722 IU / ml).
Předpokládá se, že stejným způsobem jak bylo popsáno výše je možno produkovat se stejně vysokými výtěžky polypeptidy interferonu β podle vynálezu.It is believed that in the same manner as described above, the interferon β polypeptides of the invention can be produced with the same high yields.
44
- 109 • · 4 · 4 • · · 4 4 · • · 4 · · • * · · 44 4444- 109 • 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 44 4444
Příklad 5Example 5
Konstrukce a exprese varianty interferonu β s jedním zavedeným glykosylačním místemConstruction and expression of variant interferon β with a single glycosylation site
Pro zavedení dalšího glykosylačního místa navázaného přes atom dusíku v poloze 11 v hlNF-β byl syntetický gen (h/nf-β) kódující hlNF-β (popsaný v příkladu 1) změněn místně specifickou PCR mutagenezí. S použitím systému BIO-X-ACT (Biolin, UK) a plasmidu PF050 [M'nf-^)/pcDNA3.1(-)Hygro/lntron (derivát pcDNA3.1(-)Hygro (Invitrogen, USA), ve kterém je vložen chimérní intron získaný z pCIneo (Promega, USA) mezi štěpící místa SamHI a Nhe\ v MCS vektoru] jako templátu byly provedeny dvě reakce PCR s dvěma překrývajícími se soubory primerů [CB41 (5’TTTAAACTGGATCCAGCCACCATGACCAACAAG-3’) (SEQ ID NO 30)/CB55(5’CGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAGGGA-GCTCATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC-3’) (SEQ ID NO 31) aTo introduce another glycosylation site linked via the nitrogen atom at position 11 in h1NF-β, the synthetic gene (h / nf-β) encoding h1NF-β (described in Example 1) was altered by site-specific PCR mutagenesis. Using the BIO-X-ACT system (Biolin, UK) and plasmid PF050 [M'nf - ^) / pcDNA3.1 (-) Hygro / Intro (derivative of pcDNA3.1 (-) Hygro (Invitrogen, USA) in which a chimeric intron obtained from pCIneo (Promega, USA) is inserted between the SamHI and Nhe \ cleavage sites in the MCS vector] as two template PCR reactions with two overlapping primer sets [CB41 (5'TTTAAACTGGATCCAGCCACCATGACCAACAAG-3 ') (SEQ ID NO) 30) / CB55 (5'CGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAGGGA-GCTCATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC-3 ') and (SEQ ID NO 31) and
CB42 (SEQ ID 2Q)/CB86 (5’GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCT-GATGAGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTACTATGGCCG-3’) (SEQ ID No 32) za získání dvou fragmentů o délce 446 a 184 párů bází. Tyto dva fragmenty byly sestaveny při třetí PCR s okolními primery CB41 a CB42. Získaný gen byl vložen do savčího expresního vektoru pcDNA3.1(-)Hygro/lntron sekvenováním DNA bylo potvrzeno, ze obsahuje správné změny bází vedoucí k substitucím F111N a R113T v hlNF-β (plasmid označený PF085).CB42 (SEQ ID 2Q) / CB86 (5'GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCT-GATGAGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTACTATGGCCG-3 ') (SEQ ID No 32) to obtain two fragments of 446 and 184 base pairs in length. These two fragments were assembled in a third PCR with flanking primers CB41 and CB42. The obtained gene was inserted into the mammalian expression vector pcDNA3.1 (-) Hygro / Intertron by DNA sequencing was confirmed to contain the correct base changes leading to F111N and R113T substitutions in hlNF-β (plasmid designated PF085).
Pro testování aktivity varianty [F111N+R1 ISTjhlNF-β byl plasmid PF085 transfekován do buněčné linie CHO K1 (ATCC # CCL61) použitím prostředku Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA), jako transfekčního činidla. O 24 hod později bylo kultivační médium sklizeno a testováno na aktivitu a koncentraci INF-β:To test the activity of variant [F111N + R1 ISTjhlNF-β, plasmid PF085 was transfected into CHO K1 cell line (ATCC # CCL61) using Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) as a transfection reagent. 24 hours later, the culture medium was harvested and tested for activity and concentration of INF-β:
110 ♦ ·110 ♦ ·
·♦·· ·· 44 * · 4 4 • · 4· ♦ ·· ·· 44 * · 4 4 • 4
4» •44 • * 44444 »• 44 • 4444
Aktivita: 56046 lU/ml [primární test]Activity: 56046 lU / ml [primary test]
ELISA: 80 ng/mlELISA: 80 ng / ml
Specifická aktivita: 7 x 108 lU/mgSpecific activity: 7 x 10 8 IU / mg
Je vidět, že varianta [F111N+R113T]hlNF-p má velmi vysokou specifickou aktivitu, která je přibližně dvojnásobná, než specifická aktivita hlNF-β standardního typu.It can be seen that the variant [F111N + R113T] hlNF-β has a very high specific activity, which is approximately twice that of the wild-type hlNF-β.
Příklad 6Example 6
Konstrukce a exprese interferonu β s dalším zavedeným glykosylačním místem [Q49N+Q51T]Construction and expression of interferon β with another glycosylation site introduced [Q49N + Q51T]
Analogicky s postupem uvedeným v příkladu 5 bylo v poloze 49 zavedeno další glykosyiační místo navázané přes atom dusíku pomocí substitucí Q49N a Q51T, Použitím PF043 (hinf^/pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)) jako templátu byly provedeny dvě reakce PCR s dvěma překrývajícími se soubory primerů [PBR7 (SEQ ID NO 28IPBR78 (5’GGCGTCCTCCTTGGTGAAGTTC-TGCAGCTG-3’) (SEQ ID NO 33) aAnalogous to the procedure of Example 5, additional glycosylation site linked through the nitrogen atom was introduced at position 49 by substitutions Q49N and Q51T. Using PF043 (hinf ^ / pcDNA3.1 (Invitrogen, USA)) as template, two PCR reactions were performed with two overlapping primer sets [PBR7 (SEQ ID NO 28IPBR78 (5'GGCGTCCTCCTTGGTGAAGTTC-TGCAGCTG-3 ')) (SEQ ID NO 33), and
PBR8 (5’ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT3') (SEQ ID NO 34)/PBR77 (5’-CAGCTGCAGAACTTCACCAAGG-AGGACGCC-3’) (SEQ ID NO 35), jejichž výsledkem byly dvaa fragmenty o délce 228, popřípadě 369 párů bází. Tyto dva fragmenty byly uspořádány při třetí PCR s okolními primery PBR7 a PBR8. Získaný gen byl vložen do savčího expresního vektoru pcDNA3.1(-)Hygro/lntron a sekvenováním DNA bylo potvrzeno, že obsahuje správné změny bází vedoucí k [Q49N, QSITjhlNF-β (plasmid označený PF104).PBR8 (5´ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT3 ') (SEQ ID NO 34) / PBR77 (5´-CAGCTGCAGAACTTCACCAAGG-AGGACGCC-3 ´), resulting in two 228 or 369 base pair fragments, respectively. The two fragments were assembled in a third PCR with flanking primers PBR7 and PBR8. The obtained gene was inserted into the mammalian expression vector pcDNA3.1 (-) Hygro / Intron, and DNA sequencing confirmed that it contained the correct base changes resulting in [Q49N, QSIT] hlNF-β (plasmid designated PF104).
Pro testování aktivity varianty [Q49N+Q51T]hlNF-^ byl plasmid PF104 transfekován do buněčné linie CHO K1 použitím materiálu Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) jako transfekčníhoTo test the activity of the [Q49N + Q51T] hlNF-β variant, plasmid PF104 was transfected into the CHO K1 cell line using Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) as a transfection cell.
111 » 44111 »44
4 44 4
44
4 • 444 • 44
4444 činidla. O 24 hod později bylo kultivační médium sklizeno a testováno na aktivitu/koncentraci INF-β:4444 reagents. 24 hours later, the culture medium was harvested and tested for activity / concentration of INF-β:
Aktivita: 17639 lU/ml [primární test]Activity: 17639 lU / ml [primary test]
ELISA: 10 ng/mlELISA: 10 ng / ml
Specifická aktivita: 1,7 x 109 lU/mgSpecific activity: 1.7 x 10 9 IU / mg
Jak bylo pozorováno v tomto případě, varianta [Q49N+Q51T]hlNF-^ má vysokou specifickou aktivitu. To může být způsobeno špatným rozpoznáváním jedné z monoklonálních protilátek používaných při metodě ELISA.As observed in this case, the variant [Q49N + Q51T] hlNF-? Has a high specific activity. This may be due to poor recognition of one of the monoclonal antibodies used in the ELISA method.
Příklad 7Example 7
Konstrukce a exprese interferonu β se dvěma zavedenými glykosylačními místyConstruction and expression of interferon β with two introduced glycosylation sites
Do lidského interferonu β byla zavedena dvě další glykosylační místa popsaná v příkladech 5 a 6 pomocí substitucí Q49N, Q51T, F111N, a R113T.Two additional glycosylation sites described in Examples 5 and 6 were introduced into human interferon β by substitutions Q49N, Q51T, F111N, and R113T.
Použitím PF085 (popsaného v příkladu 5) jako templátu, byly provedeny dvě reakce PCR se dvěma překrývajícími se soubory primerů [PBR89 (5’CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) (SEQ ID NO 3Q)IPBR78 (SEQ ID NO 33) a PBR8 (SEQ ID NO 34))/P6R77 (SEQ ID NO 35)] vedoucí k získání dvou fragmentů o délce 228, popřípadě 369 párů bází.Using PF085 (described in Example 5) as template, two PCR reactions were performed with two overlapping primer sets [PBR89 (5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG) (SEQ ID NO 3Q) IPBR78 (SEQ ID NO 33) and PBR8 (SEQ ID NO 34) L / P6R77 (SEQ ID NO 35)] resulting in two 228 and 369 base pair fragments, respectively.
Tyto dva fragmenty byly uspořádány při třetí PCR s okolními primery PBR89 a PBR8. Výsledný gen byl vložen do savčího expresního vektoru pcDNA3.1(-)Hygro/lntron a sekvenováním bylo potvrzeno, že byly získány právně změny bází vedoucí k [Q49N, Q51T, F111N, R11 STjhíNF-β (plasmid označený PF123).The two fragments were assembled in a third PCR with flanking primers PBR89 and PBR8. The resulting gene was inserted into the mammalian expression vector pcDNA3.1 (-) Hygro / Intron, and sequencing confirmed that the base changes resulting in [Q49N, Q51T, F111N, R11 STjhNF-β (plasmid designated PF123) were obtained.
• · * ·• · * ·
- 112 ·♦ ·· • ♦ « • 9 ····- 112 ♦ ♦ • • • 9 9 ·
Plasmid PF123 byl transfekován do buněk CHO K1 použitím materiálu Fugene 6 (Roche) jako transfekčního činidla. O 24 hod později bylo kultivační médium sklizeno a testováno na aktivitu/koncentraci INF-β:Plasmid PF123 was transfected into CHO K1 cells using Fugene 6 (Roche) as a transfection reagent. 24 hours later, the culture medium was harvested and tested for activity / concentration of INF-β:
Aktivita: 29401 lU/ml [primární test]Activity: 29401 lU / ml [primary test]
ELISA: 14 ng/mlELISA: 14 ng / ml
Specifická aktivita: 2,1x109IU/mlSpecific activity: 2.1x10 9 IU / ml
Jak bylo pozorováno, rovněž varianta [Q49N+Q51T+F111N+As observed, also variant [Q49N + Q51T + F111N +
R113T]hlNF^ má vysokou specifickou aktivitu.R113T] hlNF3 has a high specific activity.
Bylo zjištěno, že tato varianta má vysokou vazebnou aktivitu na receptor při testu vazby na receptor popsaném v části Materiály a metody, který je založen na použití zesíťujícího činidla DSS.This variant has been found to have high receptor binding activity in the receptor binding assay described in Materials and Methods, which is based on the use of the DSS crosslinker.
Příklad 8Example 8
Produkce β-glykosylační varianty ÍQ49N+Q51T+F111N+R113T] interferonu β v lahvích Roller BottlesProduction of β-glycosylation variant IQ49N + Q51T + F111N + R113T] interferon β in Roller Bottles
Subklon CHOK1 (5/G-10) produkující glykosylační variantu [Q49N+Q51T+F111N+R113T] byl zaočkován do dvou lahví Roller Bottles, každá s expandovaným povrchem 1700 cm2 (Corning, USA), ve 200 ml média DMEM/F-12 (LifeTechnologies; Cat. # 31330), doplněném 10% FBS a penicilinem/streptomycinem (P/S). Po dvou dnech bylo médium vyměněno. Po dalších dvou dnech bylo ve dvou lahvích dosaženo téměř 100% konfluence a médium bylo zaměněno za 300 ml bezsérového média UltraCHO (BioWhittaker; Cat. # 12-724) doplněného materiálem 1/500 EX-CYTE (Serologicals Proteins; Cat. # 81129N) a P/S. Růst buněk v tomto médiu podporuje vysokou abuněčnou hmotu, vyšší, než je možno dosáhnout v médiu obsahujícím sérum. Po dvou dnech bylo médium obnoveno. Po dalších dvou dnech bylo toto médium zaměněno za produkční médium DMEM/F-12 (Life Technologies; Cat. # 21041) doplněné 1/100 ITSACHOK1 (5 / G-10) subclone producing the glycosylation variant [Q49N + Q51T + F111N + R113T] was inoculated into two Roller Bottles, each with an expanded surface of 1700 cm 2 (Corning, USA), in 200 ml DMEM / F- 12 (LifeTechnologies; Cat. # 31330), supplemented with 10% FBS and penicillin / streptomycin (P / S). After two days the medium was changed. After another two days, nearly 100% confluency was achieved in two bottles and the medium was changed to 300 ml of UltraCHO serum-free medium (BioWhittaker; Cat. # 12-724) supplemented with 1/500 EX-CYTE (Serologicals Proteins; Cat. # 81129N) and P / S. Cell growth in this medium promotes a high cell mass, higher than that achieved in serum-containing medium. After two days, the medium was recovered. After another two days, this medium was changed to DMEM / F-12 production medium (Life Technologies; Cat. # 21041) supplemented with 1/100 ITSA
- 113- 113
• 4 ·· ♦ ♦ 4 • · · •44 4• 4 ·· ♦ ♦ 4 • · · · 44 4
4 ·4 ·
4444 (Life Technologies; Cat. # 51300-044) [ITSA znamená Insulin (1,0 g/i) - Transferrin (0,55 g/l) - Selenium (0,67 mg/l) supplement for Adherent cultures], 1/500 EC-CYTE a P/S. Na obr. 2 je ukázán průběh produkce, kde z každé otáčivé lahve bylo každý den sklizeno 300 ml média. Sklizená média ze dvou lahví byla před odebíráním vzorku pro stanovení aktivity interferonu β spojena.4444 (Life Technologies; Cat. # 51300-044) [ITSA means Insulin (1.0 g / l) - Transferrin (0.55 g / l) - Selenium (0.67 mg / l) supplement for Adherent cultures], 1/500 EC-CYTE and P / S. FIG. 2 shows the production flow where 300 ml of medium was harvested from each rotating bottle each day. Harvested media from two flasks were pooled prior to sampling for interferon β activity.
Jak je vidět v obr. 2, produkční kultivace byla ukončena po 26 dnech. Po klidovém období (lag) 5 dnů dramaticky stoupla aktivita způsobená variantou [49N+Q51T+F111N+R113T] interferonu β a po zbylé období produkce byla sklizena aktivita interferonu β za den v průměru 2,4 milionu lU/mf x 600 ml = 1,440 χ 109 IU. Celkem bylo vyprodukováno 3,2 x 101° IU, což odpovídá 160 mg proteinu (s hypotetickou specifickou aktivitou 2 χ 108 lU/mg).As shown in Fig. 2, production culture was terminated after 26 days. After a resting period (lag) of 5 days, activity caused by [49N + Q51T + F111N + R113T] interferon β increased dramatically, and for the remaining production period, interferon β activity was harvested on average 2.4 million lU / mf x 600 ml = 1.440 χ 10 9 IU. A total of 3.2 x 10 1 IU was produced corresponding to 160 mg of protein (with a hypothetical specific activity of 2 χ 10 8 IU / mg).
Příklad 9Example 9
Produkce, čištění a PEGylace varianty K19R+K45R+K123R interferonu βProduction, purification and PEGylation of interferon β variant K19R + K45R + K123R
Tři baňky T-175 obsahující 100 ml bezsérového média obsahující variantu interferonu β K19R+K45R+K123R, byly zaočkovány buňkami COS-7 v médiu DMEM (Life technologies; Cat. # 21969-035) doplněném 10% FBS a glutaminem a penicilinem/streptomycinem. V den transfekce (při přibližně 100% konfluenci) bylo mésium nahrazeno 30 ml čerstvého média 4 až 5 hod před transfekcí. Pro přípravu transfekce byl alikvot 1890 μΙ média DMEM bez doplňků přidán do 14 ml polypropylenové zkumavky (Corning). Přímo k médiu bylo přidáno 210 μΙ materiálu Fugene 6 (Roche) a směs byla inkubována 5 min při laboratorní teplotě. Mezitím byl přidán do 14 ml polypropylenové zkumavky alikvot 168 pg plasmidové DNA ([K19R, K45R, K123R]INF^/pcDNA3.1 (-)Hygro; PF # 161). Po 5 min inkubace byla přidána směs obsahující Fugene 6 přímo ·· ·· • · ·Three T-175 flasks containing 100 ml of serum-free medium containing the interferon β variant K19R + K45R + K123R were seeded with COS-7 cells in DMEM (Life technologies; Cat. # 21969-035) supplemented with 10% FBS and glutamine and penicillin / streptomycin . On the day of transfection (at approximately 100% confluency), the medium was replaced with 30 ml of fresh medium 4-5 hours prior to transfection. For transfection preparation, an aliquot of 1890 μΙ DMEM without supplements was added to a 14 ml polypropylene tube (Corning). 210 μΙ of Fugene 6 (Roche) was added directly to the medium and incubated for 5 min at room temperature. Meanwhile, an aliquot of 168 µg plasmid DNA ([K19R, K45R, K123R] INF1 / pcDNA3.1 (-) Hygro; PF # 161) was added to a 14 ml polypropylene tube. After 5 min incubation, the mixture containing Fugene 6 was added directly.
114 k roztoku DNA a směs byla inkubována 15 min při laboratorní teplotě. Po inkubaci bylo po kapkách přidáno ke každému ze tří kultivačních médií 700 μΙ.114 to DNA solution and incubated for 15 min at room temperature. After incubation, 700 μΙ was added dropwise to each of the three culture media.
Další den bylo transfekční médium nahrazeno 35 ml bezsérového produkčního média. Bezsérové médium je založeno na médiu DMEM (Life Technologies; Cat. # 31053-028) doplněném glutaminem, pyruvátem sodným, peniciiinem/streptomycinem, 1% ITSA (Life Technologies; Cat. # 51300-044), a 0,2% Ex-Cyte (Serologicals Proteins; Cat. # 81-129). Před přidáním produkčního média byly vrstvy buněk dvakrát promyty médiem DMEM bez aditiv.The next day, the transfection medium was replaced with 35 ml of serum-free production medium. The serum-free medium is based on DMEM (Life Technologies; Cat. # 31053-028) supplemented with glutamine, sodium pyruvate, penicillin / streptomycin, 1% ITSA (Life Technologies; Cat. # 51300-044), and 0.2% Ex- Cyte (Serologicals Proteins; Cat. # 81-129). Before addition of production medium, the cell layers were washed twice with DMEM without additives.
Tři dny po transfekci bylo 100 ml bezsérového média sklizeno pro čištění a PEGylaci varianty interferonu β.Three days after transfection, 100 ml of serum-free medium was harvested for purification and PEGylation of the interferon β variant.
pH bylo nastaveno na 6,8 a vodivost byla nastavena na <10 mS/cm vodou Miili Q. Potom byla půda vsádkově adsorbována na ml kationtové iontoměničové pryskyřice SP 550 (TosoHaas) předekvilibrované s pufrem A (20 mM fosfát, 100 mM NaCl, pH 7). Po hod převracení byla pryskyřice ponechána usadit a byla převedena na kolonu. Pryskyřice byla promyta pěti objemy kolony pufru A a eluována 2 ml pufru B (20 mM fosfát, 800 mM NaCl, pH 7). Eluát byl zakoncentrován na 500 μΙ na zařízení VivaSpin (mezní hodnota oddělování 10 kDa) po přidání 5 % ethyleneglykolu. Koncentrát byl upraven na 50 mM fosfát, 0,3M NaCl, 20 % ethyleneglykol, pH 8 v konečném objemu 2 ml a dále zakoncentrován na 0,5 ml.The pH was adjusted to 6.8 and the conductivity was set to < 10 mS / cm with Miili Q. Then the soil was batch adsorbed onto ml of cation exchange resin SP 550 (TosoHaas) pre-equilibrated with buffer A (20 mM phosphate, 100 mM NaCl, pH 7). After an inversion hour, the resin was allowed to settle and transferred to a column. The resin was washed with five column volumes of buffer A and eluted with 2 ml of buffer B (20 mM phosphate, 800 mM NaCl, pH 7). The eluate was concentrated to 500 μΙ on a VivaSpin (10 kDa cutoff limit) after addition of 5% ethyleneeglycol. The concentrate was adjusted to 50 mM phosphate, 0.3M NaCl, 20% ethyleneeglycol, pH 8 in a final volume of 2 ml and further concentrated to 0.5 ml.
Konečný koncentrát byl PEGylován následujícím způsobem: ke 100 μΙ konečného koncentrátu bylo přidáno 25 μΙ aktivovaného mPEGSPA (5000 kDa, Shearwater, Alabama) čerstvě připraveného ve fosfátovém pufru pH 8, pro dosažení konečných koncentrací aktivovaného PEG 0, 5, 10, 25 nebo 50 mg/ml. Reakce byla ponechána probíhat 30 min při laboratorní teplotě a potom byla ukončena přidáním 50mM glycinového pufru. Vzorky byly ihned zmrazený při -80 °C a biologická aktivita byla měřena jak bylo popsáno ·· ·· ♦ · 9 9The final concentrate was PEGylated as follows: 25 μΙ of activated mPEGSPA (5000 kDa, Shearwater, Alabama) freshly prepared in phosphate buffer pH 8 was added to 100 μΙ of the final concentrate to achieve final concentrations of activated PEG 0, 5, 10, 25 or 50 mg / ml. The reaction was allowed to proceed for 30 min at room temperature and then quenched by the addition of 50 mM glycine buffer. Samples were immediately frozen at -80 ° C and biological activity was measured as described ·· ·· ♦ · 9 9
115 • * · · · ·* ·· « 9 9 9 •9 9115 9 9 9 9
9 99 9
9 9 · · * ♦ φ9 9 · · * ♦ φ
9999 výše (primární test). Byly provedeny westernové přenosy každého vzorku s cílem zjistit množství nezreagované aktivity interferonu β přítomné v PEGylovaném vzorku.9999 above (primary test). Western blots of each sample were performed to determine the amount of unreacted interferon β activity present in the PEGylated sample.
Výsledky ukazují, že při 25 mg aktivovaného PEG/ml byla nePEGylovaná varianta interferonu β nepřítomná podle vyhodnocení westernovým přenosem, a tato varianta si zachovala 50 % biologické aktivity ve srovnání s kontrolním vzorkem (zpracovaným stejným způsobem, ale s 0 mg/ml aktivovaného PEG).The results show that at 25 mg of activated PEG / ml, the non-PEGylated variant of interferon β was absent by Western blotting, and this variant retained 50% biological activity compared to the control (treated in the same way but with 0 mg / ml activated PEG) .
Přiklad 10Example 10
Exprese a purifikace rozpustného 1FNAR2 cDNA kódující extracelulární doménu IFNAR-1 a IFNAR-2 (označené IFNARlec a lFNAR2ec) byly amplifikovány z cDNA buněk HeLa použitím PCR s primery odpovídajícími prvním 10 aminokyselinovým zbytkům a posledním 10 aminokyselinovým zbytkům extracelulární domény IFNAR-2 (jejíž nukleotidová sekvence je zřejmá z článku Novick a další, Cell, díl 77, str. 391 - 400, 1994) a prvním 10 aminokyselinovým zbytkům a posledním 10 aminokyselinovým zbytkům extracelulární domény IFNAR-1 (jejíž nukleotidová sekvence je zřejmá z Uze a další, Cell díl 60, 225 - 234, 1990). Tytp cDNA byly subsklonovány do vektoru pBlueBac 4.5/V5His-TOPO (Invitrogen) a rekombinantní bakulovirus byl získán homologní rekombinací, purifikací plaků a pomnožením v buňkách Sf9. Buňky Sf9 byly infikovány rekombinantním bakulovirem a exprese z výsledných buněk bylo dosaženo v podstatě tak, jak se popisuje v příkladu 2.Expression and purification of soluble 1FNAR2 cDNA encoding the extracellular domain of IFNAR-1 and IFNAR-2 (designated IFNARlec and 1FNAR2ec) were amplified from HeLa cDNA using PCR with primers corresponding to the first 10 amino acid residues and the last 10 amino acid residues of the extracellular domain IFNAR-2 ( the sequence is evident from Novick et al., Cell, Vol. 77, pp. 391-400, 1994) and the first 10 amino acid residues and the last 10 amino acid residues of the extracellular domain of IFNAR-1 (whose nucleotide sequence is evident from Uze et al. 60, 225-234, 1990). Tytp cDNAs were subcloned into the pBlueBac 4.5 / V5His-TOPO vector (Invitrogen) and recombinant baculovirus was obtained by homologous recombination, plaque purification and enrichment in Sf9 cells. Sf9 cells were infected with recombinant baculovirus and expression from the resulting cells was achieved essentially as described in Example 2.
Protein IFNARlec a IFNAR2ec byl pozorován v kultivačních supernatantech 2 až 3 dny po infekci buněk Sf9 rekombinantním bakulovirem. Aktivita rozpustných receptorů byla sledována antagonistickým testem na interferon. Ve stručnosti, buňky HeLaIFNARlec and IFNAR2ec were observed in culture supernatants 2-3 days after infection of Sf9 cells with recombinant baculovirus. Soluble receptor activity was monitored by interferon antagonist assay. Briefly, HeLa cells
116 • · *4 « »· · • · · • · to • · to *· ··♦· • to ·· to «· • to to • •to • toto ·· ···· obsahující prvek ISRE (jak bylo popsáno v části primární test, výše), se stimulují maximální dávkou lidského interferonu β standardního typu v přítomnosti různých koncentrací supernatantu IFNARec. Antagonistický efekt supernatantu je přímo úměrný množství přítomného rozpustného receptoru.116 • 4 to 4 to to this to to this to contain this ISRE element (as as described in the primary assay, above), are stimulated with the maximum dose of wild-type human interferon β in the presence of various concentrations of IFNARec supernatant. The antagonist effect of the supernatant is directly proportional to the amount of soluble receptor present.
IFNAR2ec byl vyčištěn ze zfiltrovaných kultivačních supernatantů použitím výměny iontů a afinitní chromatografie. pH kultivačních supernatantů pozitivních na IFNAR2ec bylo nastaveno naIFNAR2ec was purified from filtered culture supernatants using ion exchange and affinity chromatography. The pH of IFNAR2ec positive culture supernatants was adjusted to
7,5 a supernatanty byly naneseny na aniontovou iontoměničovou kolonu a navázaný rekombinantní protein byl eluován použitím 500mM NaCI. Částečně čistý IFNAR2ec byl potom zředěn a pH bylo nastaveno na 8,0, před dalším čištěním, použitím vazby na afinitní pryskyřici TALON™ Metal Affinity Resin a elucí imidazolem. Konečný preparát byl zamrazen v alikvotech. IFNARlec může být čištěn jak bylo popsáno pro IFNAR2ec s tím rozdílem, že se v kroku výměny iontů používá kationtová iontoměničová chromatografie při pH 6,0.7.5 and supernatants were loaded onto an anion exchange column and bound recombinant protein was eluted using 500 mM NaCl. The partially pure IFNAR2ec was then diluted and the pH was adjusted to 8.0, prior to further purification, using binding to the TALON ™ Metal Affinity Resin and eluting with imidazole. The final preparation was frozen in aliquots. IFNARlec can be purified as described for IFNAR2ec, except that cation exchange chromatography at pH 6.0 is used in the ion exchange step.
Příklad 11Example 11
Použití rozpustného IFNAR2 pro čištění a PEGylaci interferonu β a jeho variantUse of soluble IFNAR2 for purification and PEGylation of interferon β and variants thereof
Čištěný IFNAR2 získaný podle popisu uvedeného v příkladu 9 se imobilizuje bud’ prostřednictvím aminových nebo karboxylových skupin použitím například CNBr-aktivovaného materiálu Sepharose 4B nebo EAH Sepharose 4B podle instrukcí výrobce (Amersham Pharmacia Biotech, Affinity Chromatography, Principles and Methods, 18-102229, vydání AB). Kriticky důležité je, že metoda vazby umožní imobilizaci funkčního IFNAR2, což se testuje optimalizací podmínek vazby (pH vazebný pufr, poměr IFNAR2 k aktivované matrici atd.). Další kritický parametr je blokování nadbytečných aktivních skupin. Potom se provede testování vazebné kapacity přidáním interferonu β a měřením jeho rozkladu.Purified IFNAR2 obtained as described in Example 9 is immobilized either through amino or carboxyl groups using, for example, CNBr-activated Sepharose 4B or EAH Sepharose 4B according to the manufacturer's instructions (Amersham Pharmacia Biotech, Affinity Chromatography, Principles and Methods, 18-102229, edition AB). Critically important is that the binding method allows immobilization of functional IFNAR2, which is tested by optimizing binding conditions (pH binding buffer, ratio of IFNAR2 to activated matrix, etc.). Another critical parameter is blocking excess active groups. The binding capacity is then tested by adding interferon β and measuring its degradation.
99
117 999 9999 • 9 9 • 99117 999 9999 • 9 9 • 99
9 9 ····9 9 ····
Optimálně imobilizovaný IFNAR2 se používá přo čištění interferonu β následujícím způsobem. 5 ml kolona s 1 mg IFNAR2 imobilizovaným na 1 ml gelu se ekvilibruje pufrem A (20 mM fosfát, 300 mM NaCl, pH 7). Potom se na kolonu nanesou 2 mg vzorku interferonu β v pufru A a provede se následné promytí pěti objemy kolony pufru A. Eluce se dosáhne načerpáním dvou objemů kolony pufru B na kolonu. Jímají se frakce o objemu 1 ml, které se testují na biologickou aktivitu. Optimální podmínky eluce závisí na způsobu imobilizace, ale příklady podmínek eluce jsou například pH 1,5-3 (např. 0,1 M glycin pH 2,3 v 0,5 M NaCl), pH 11,5 - 12, 3,5 M MgCb, 6M močovina apod.Optimally immobilized IFNAR2 is used to purify interferon β as follows. A 5 ml column with 1 mg IFNAR2 immobilized on 1 ml gel was equilibrated with buffer A (20 mM phosphate, 300 mM NaCl, pH 7). A 2 mg sample of interferon β in buffer A is then applied to the column, followed by a five column column A wash. Elution is achieved by pumping two column volumes of buffer B per column. Fractions of 1 ml are collected and tested for biological activity. Optimal elution conditions depend on the method of immobilization, but examples of elution conditions are, for example, pH 1.5-3 (e.g., 0.1 M glycine pH 2.3 in 0.5 M NaCl), pH 11.5 - 12, 3.5 M MgCl 2, 6M urea and the like
Příklad 12Example 12
Použití imobilizovaného IFNAR2 pro PEGylaci interferonu β (variant)Use of immobilized IFNAR2 for PEGylation of interferon β (variant)
Navíc k použití popsanému v příkladu 10 může být IFNAR2 použit pro optimální PEGylaci, při které se zabrání PEGylaci části interferonu β nebo jeho variant, která se účastní interakce s receptorem.In addition to the use described in Example 10, IFNAR2 can be used for optimal PEGylation, which avoids PEGylation of the portion of interferon β or variants that participates in receptor interaction.
ml kolona s 1 mg IFNAR2 imobilizovaného na 1 ml gelu se ekvilibruje pufrem A (20 mM fosfát, 300 mM NaCl, pH 7). Potom se na kolonu nanesou 2 mg vzorku interferonu β v pufru A a provede se promytí 5 objemy kolony pufru. Roztok aktivovaného mPEG-SPA (1 až 50 mg/ml v pufru A) se čerpá na kolonu a ponechá se reagovat 15 min až 12 hod v závislosti na teplotě. Jedno výhodné rozmezí kombinace doby zdržení a teploty je 15 až 60 min, 10 až 20 °C; další je 30 min až 5 hod, 2 až 8 °C. Po uvedené době se dosáhne eluce čerpáním dvou objemů kolony pufru B na kolonu. Jímají se frakce 1 ml, které se oddělí a testují na biologickou aktivitu použitím testu primárního screeningu. Optimální podmínky eluce závisí na způsobu imobilizace, ale jako příklady podmínek eluce je možno uvést pH 1,5-3 (např.A 1 ml column of 1 mg IFNAR2 immobilized on 1 ml of gel was equilibrated with buffer A (20 mM phosphate, 300 mM NaCl, pH 7). A 2 mg sample of interferon β in buffer A is then applied to the column and washed with 5 column volumes of buffer. The activated mPEG-SPA solution (1-50 mg / ml in Buffer A) is pumped onto the column and allowed to react for 15 min to 12 h depending on temperature. One preferred range of combination of residence time and temperature is 15 to 60 min, 10 to 20 ° C; the next is 30 min to 5 h, 2 to 8 ° C. After this time, elution is achieved by pumping two column volumes of buffer B per column. Fractions of 1 ml were collected and collected and tested for biological activity using a primary screening assay. Optimum elution conditions depend on the method of immobilization, but examples of elution conditions include a pH of 1.5-3 (e.g.
- 118- 118
9999
9 9 • 99 9 • 9
9 99 9
99
999 9999 • · ·999 9999 • · ·
9 • 99 • 9 9999 *9 99 • 99 • 9999 * 9 9
9 • 9 • 9 99999 • 9 • 9 9999
0,1Μ glycin ρΗ 2,3 ν 0,5 Μ NaCI), ρΗ 11,5 - 12, 3,5 Μ MgCI2, 6Μ močovina apod.0,1Μ glycine ρΗ 2,3 ν 0,5 Μ NaCl), ρΗ 11,5 - 12, 3,5 Μ MgCl 2 , 6 Μ urea, etc.
Přiklad 13Example 13
Antivirová aktivita PEGylované variantyAntiviral activity of PEGylated variant
Antivirová aktivita PEGylovaného varianty proteinu IFN-β, K19R+K45R+K123R, byla zjišťována antivirovým biologickým testem. Proteiny standardního typu a varianty byly přidávány k buňkám A549 v koncentracích od 10 do 0,0001 lU/ml v trojnásobných opakováních.The antiviral activity of the PEGylated IFN-β protein variant, K19R + K45R + K123R, was determined by an antiviral bioassay. The wild-type proteins and variants were added to A549 cells at concentrations from 10 to 0.0001 IU / ml in triplicate.
PEGylovaná varianta IFN-β prokázala úplnou inhibici smrti buněk indukované virem EMC při koncentraci 3 lU/ml, kde EC50 je 0,13 lU/ml (obr. 1). Srovnávací vzorek standardního typu vykazuje inhibici viru s hodnotou EC50 1,4 lU/ml.The PEGylated IFN-β variant demonstrated complete inhibition of cell death induced by EMC virus at a concentration of 3 IU / ml, with an EC 50 of 0.13 IU / ml (Fig. 1). The wild-type comparative sample shows virus inhibition with an EC50 of 1.4 IU / ml.
Tyto výsledky ukazují, že PEGylace modifikovaného polypeptidu interferonu β poskytla konjugát s úplnou antivirovou aktivitou.These results indicate that PEGylation of the modified interferon β polypeptide gave a conjugate with complete antiviral activity.
Příklad 14Example 14
Neutralizace glykosylované varianty protilátkamiNeutralization of glycosylated variant by antibodies
Neutralizace IFN-β standardního typu a glykosylované varianty proteinu IFN-β Q49N+Q51T+F111N+R113T protilátkami byla testována použitím neutralizačního testu ISRE. Interferon β standardního typu a varianty proteinů (v pěti postupných ředěních počínaje 12 500 lU/ml) byly inkubovány s polyklonální králičí protilátkou proti interferonu β (PBL Biomedical Laboratories) v koncentracích 0,40 a 200 ng/ml.Neutralization of wild-type IFN-β and glycosylated IFN-β protein variants by Q49N + Q51T + F111N + R113T by antibodies was tested using the ISRE neutralization assay. Wild-type interferon β and protein variants (at five sequential dilutions starting at 12,500 IU / ml) were incubated with polyclonal rabbit anti-interferon β antibody (PBL Biomedical Laboratories) at concentrations of 0.40 and 200 ng / ml.
V přítomnosti 200 ng/ml polykíonálního králičího antiséra byla aktivita proteinu interferonu β standardního typu snížena 11,8 krát, zatímco aktivita glykosylované varianty interferonu β byla snížena 3,0 krát. Stupeň rozpoznání protilátky varianty interferonu β byl snížen o 75 %, ve srovnání s interferonem β standardního typu, viz tabulka 1In the presence of 200 ng / ml polyclonal rabbit antiserum, the activity of the wild-type interferon β protein was reduced 11.8-fold, while the activity of the glycosylated variant of interferon β was reduced 3.0-fold. The degree of antibody recognition of the interferon β variant was reduced by 75% compared to wild-type interferon β, see Table 1
44
119 • ·*· 4119 • · * · 4
4 • 4 44 • 4 4
4 • « 44 • «4
44
44444444
4 4 44 4 4
4 44 4
4 44 4
4>4>
4444 níže. Tyto výsledky ukazují, že rozpoznávání glykosylované mutanty interferonu β polyklonálními protilátkami ze zvířat imunizovaných lidským interferonem β standardního typu je značně sníženo. Modifikacemi provedenými ve variantě molekuly byla tedy odstraněna/odstíněna velká část imunogenních epitopů, které se vyskytují v lidském interferonu β standardního typu.4444 below. These results indicate that recognition of glycosylated mutant interferon β by polyclonal antibodies from animals immunized with wild-type human interferon β is greatly reduced. Thus, by modifying the variant of the molecule, much of the immunogenic epitopes that occur in wild-type human interferon β have been removed / shielded.
Tabulka 1 (wt = standardní typ)Table 1 (wt = standard type)
Příklad 15Example 15
Konstrukce a exprese molekul interferonu β s modifikovaným NkoncemConstruction and expression of N-modified interferon β molecules
Varianty interferonu β s modifikovaným N-koncem byly zkonstruovány podle popisu uvedeného v předcházejících příkladech.N-terminally modified interferon β variants were constructed as described in the previous examples.
Pro konstrukci expresního plasmidu pro variantu interferonu β, INFB S(-1)A+M1Q byly použity následující primery:The following primers were used to construct an expression plasmid for the interferon β, INFB S (-1) A + M1Q variant:
CBProFprl 10: AAC TGG ATC CAG CCA CCA TGA CCA ACA AGT GCC TGC TCC AGA TCG CCC TGC TCC TGT GCT TCA GCA CCA CGG CCC TAG CCC AGA GCT AC (SEQ ID NO 37) a CBProFpr42 (SEQ ID NO 26).CBProFpr11 10: AAC TGG ATC CAG CCA CCA TGA CCA ACA AGT GCC TGC TCC AGA TCG CCC TGC TCC TGT GCT TCA GCA CCA CGG CCC TAG CCC AGA GCT AC (SEQ ID NO 37) and CBProFpr42 (SEQ ID NO 26).
• * • ·• * • ·
- 120 φφ · • φ • · φ φ • · · · · ♦ φφ φφ φ φ φ • φ φφ φφ • φ φ φφ φφφφ- 120 φ · φ · · · · · φ φ φ φ φ φ φ φ φ
Pro konstrukci expresního plasmidu varianty interferonu β, ΙΝΡβ S(-1)AQ (označuje substituci zbytku S umístěného v poloze (-1) za A a Q) byly použity následující primery:The following primers were used to construct an expression plasmid of the interferon β, ΙΝΡβ S (-1) AQ variant (indicating the substitution of the S residue located at (-1) after A and Q):
CBProFpr109·. AAC TGG ATC CAG CCA CCA TG A CCA ACA AGT GCC TGC TCC AGA TCG CCC TGC TCC TGT GCT TCA GCA CCA CGG CCC TAG CCC AGA TGA GCT AC (SEQ ID NO 38) a CBProFpr42 (SEQ ID NO 26).CBProFpr109 ·. AAC TGG ATC CAG CCA CCA TG A CCA ACA AGT GCC TGC TCC AGA TCG CCC TGC TCC TGT GCT TCA GCA CCA CGG CCC TAG CCC AGA TGA GCT AC (SEQ ID NO 38) and CBProFpr42 (SEQ ID NO 26).
Pro testování aktivity těchto variant v příslušných plasmidech byly plasmidy pF154 a pF163 transfekovány do buněk CHO K1 použitím materiálu Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) jako transfekčního činidla. Supernatanty byly sklizeny 24 hod po transfekci a testovány testem primární aktivity a metodou ELISA, jak je popsáno v části Materiály a metody. Byly získány následující výsledky:To test the activity of these variants in the respective plasmids, plasmids pF154 and pF163 were transfected into CHO K1 cells using Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) as a transfection reagent. Supernatants were harvested 24 hours after transfection and assayed by primary activity assay and ELISA as described in Materials and Methods. The following results were obtained:
INFB S-1A + M1Q (pF154) Aktivita:INFB S-1A + M1Q (pF155)
ELISA:ELISA:
Specifická aktivita:Specific activity:
INFB S-1AQ (pF163): Aktivita:INFB S-1AQ (pF163):
ELISA:ELISA:
Specifická aktivita:Specific activity:
Tyto molekuly mají standardního typu.These molecules are of the wild type.
106 410 lU/ml 333 ng/ml 3,2 x 108 lU/mg106,410 IU / ml 333 ng / ml 3.2 x 10 8 IU / mg
634 lU/ml 193 ng/ml 4,7 x 108 lU/mg stejnou aktivitu jako lidský interferon β634 IU / ml 193 ng / ml 4.7 x 10 8 IU / mg the same activity as human interferon β
Příklad 16Example 16
Příprava PEGylovanych variant IFN-β μΐ 0,3 mg/ml roztoku rekombinantního lidského polypeptidu IFN-β obsahujícího mutace Q49N+Q51T+K19R+K45R+K123R v 50mM Na-acetátu, 35% ethylenglykolu pH 5,5 bylo smíseno s 10 μΙ 0,5M Nafosfátu, pH 8,0 a 20 μΙ roztoku 50mM Na-fosfát, 0,1M NaCl, 30%Preparation of PEGylated IFN-β μ variant variants 0.3 mg / ml recombinant human IFN-β polypeptide solution containing Q49N + Q51T + K19R + K45R + K123R mutations in 50 mM Na-acetate, 35% ethylene glycol pH 5.5 was mixed with 10 μΙ 0 , 5M Naphosphate, pH 8.0 and 20 μΙ of 50mM Na-phosphate solution, 0.1M NaCl, 30%
99 • 9 • 998 • 9 • 9
121 •121 •
9 9 9 • 99 9 • 9
9 « 99 «9
9999 ethylenglykol pH 8,0 obsahujícího 0,02 mg/ml SPA-mPEG (N-sukcin-imidylpropionátmethoxypolyethylenglykol). Tyto poměry odpovídají 10 násobnému molárnímu přebytku SPA-mPEG vzhledem k IFN-β.9999 ethylene glycol pH 8.0 containing 0.02 mg / ml SPA-mPEG (N-succinimidylpropionate methoxypolyethylene glycol). These ratios correspond to a 10-fold molar excess of SPA-mPEG relative to IFN-β.
Po 1/2 hod za mírného otáčení při laboratorní teplotě byla reakce ukončena přidáním 5 μΙ 20mM glycinu pH 8,0. V této fázi obsahovala reakční směs jak nemodifikovanou, tak i PEGylovanou formu rekombinantního lidského IFN-β.After 1/2 hour with gentle rotation at room temperature, the reaction was terminated by the addition of 5 μΙ 20 mM glycine pH 8.0. At this stage, the reaction mixture contained both an unmodified and a PEGylated form of recombinant human IFN-β.
Testování in vitro s použitím primárního screeningového testu ukázalo, že PEGylovaný materiál si zachoval 40 % aktivity ve srovnání s nemodifikovaným rekombinantním lidským IFN-β.In vitro testing using a primary screening assay showed that PEGylated material retained 40% activity compared to unmodified recombinant human IFN-β.
V dalším experimentu bylo smícháno 50 μΙ 0,14 mg/ml roztoku rekombinantního lidského polypeptidu IFN-β obsahujícího mutace Q49N+Q51T v 50 mM Na-acetátu, 35% ethylenglykolu pH 5,5 s 10 μΙ 0,5M Na-fosfátu, pH 8,0 a 20 μΙ směsi 50mM Na-fosfát, 0,1M NaCl, 30% ethylenglykol, pH 8,0 obsahující 0,03 mg/ml SPA-mPEG. Tak byl získán 10 násobný molární přebytek SPA-mPEG vzhledem k IFN-β.In another experiment, a 50 μΙ 0.14 mg / ml solution of recombinant human IFN-β polypeptide containing the Q49N + Q51T mutations in 50 mM Na-acetate, 35% ethylene glycol pH 5.5 was mixed with 10 μΙ 0.5M Na-phosphate, pH 8.0 and 20 μΙ of a mixture of 50 mM Na-phosphate, 0.1 M NaCl, 30% ethylene glycol, pH 8.0 containing 0.03 mg / ml SPA-mPEG. This gave a 10-fold molar excess of SPA-mPEG relative to IFN-β.
Po 1/2 hod za mírného otáčení při teplotě laboratoře byla reakce ukončena přidáním 5 μΙ 20mM glycinu, pH 8,0. V této fázi obsahovala reakční směs jak nemodifikovanou, tak i PEGylovanou formu rekombinantního lidského IFN-β.After 1/2 hour with gentle rotation at room temperature, the reaction was terminated by the addition of 5 μΙ 20 mM glycine, pH 8.0. At this stage, the reaction mixture contained both an unmodified and a PEGylated form of recombinant human IFN-β.
Testování in vitro s použitím testu primárního screeningu, že PEGylovaný materiál si zachoval ve srovnání s nemodifikovaným rekombinantním lidským IFN-β 20% aktivitu.In vitro testing using a primary screening assay that PEGylated material retained 20% activity compared to unmodified recombinant human IFN-β.
Claims (60)
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA199901197 | 1999-08-27 | ||
US16078299P | 1999-10-21 | 1999-10-21 | |
DKPA199901691 | 1999-11-26 | ||
DKPA200000194 | 2000-02-07 | ||
DKPA200000363 | 2000-03-07 | ||
DKPA200000642 | 2000-04-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2002521A3 true CZ2002521A3 (en) | 2002-05-15 |
Family
ID=27545189
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2002521A CZ2002521A3 (en) | 1999-08-27 | 2000-08-25 | Novel molecules resembling beta interferon |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1328295A2 (en) |
JP (1) | JP2003527090A (en) |
KR (1) | KR20020034181A (en) |
CN (1) | CN1501815A (en) |
AU (1) | AU6687000A (en) |
BR (1) | BR0013638A (en) |
CA (1) | CA2380760A1 (en) |
CZ (1) | CZ2002521A3 (en) |
HU (1) | HUP0302674A2 (en) |
IL (1) | IL147581A0 (en) |
MX (1) | MXPA02001969A (en) |
NO (1) | NO20020929L (en) |
SK (1) | SK2942002A3 (en) |
WO (1) | WO2001015736A2 (en) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
LT2599503T (en) * | 1998-10-16 | 2017-06-26 | Biogen Ma Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof |
CN100480266C (en) | 1998-10-16 | 2009-04-22 | 拜奥根Idec马萨诸塞公司 | Interferon-beta fusion proteins and uses |
US7431921B2 (en) | 2000-04-14 | 2008-10-07 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules |
US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
EP1334128A2 (en) * | 2000-11-02 | 2003-08-13 | Maxygen Aps | New multimeric interferon beta polypeptides |
MXPA03007619A (en) * | 2001-02-27 | 2003-12-04 | Maxygen Aps | New interferon beta-like molecules. |
AU2002254174A1 (en) * | 2001-03-13 | 2002-09-24 | Vical Incorporated | Interferon-beta polynucleotide therapy for autoimmune and inflammatory diseases |
KR100511749B1 (en) * | 2001-11-06 | 2005-09-02 | 선바이오(주) | Modified interferon-beta, and chemically modified conjugates thereof |
EP3669887A1 (en) | 2002-01-18 | 2020-06-24 | Biogen MA Inc. | Polyalkylene polymer compounds and uses thereof |
AU2003254641A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-19 | Maxygen Aps | Interferon beta-like molecules for treatment of cancer |
EA008866B1 (en) | 2002-12-26 | 2007-08-31 | Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. | POLYMER CONJUGATES OF INTERFERON-β, PHARMACEUTICAL PRODUCTS BASED THEREON AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
PT1666496E (en) | 2003-08-25 | 2014-06-24 | Toray Industries | Interferon-beta composite |
EP1674113A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol) |
WO2008020968A2 (en) * | 2006-08-08 | 2008-02-21 | Novartis Ag | Recombinant interferon-beta with enhanced biological activity |
US7625555B2 (en) | 2007-06-18 | 2009-12-01 | Novagen Holding Corporation | Recombinant human interferon-like proteins |
CL2008002399A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-01-02 | Pharmaessentia Corp | Substantially pure conjugate having a polymeric portion, a protein portion (interferon alpha 2b) and an aliphatic binder of 1 to 10 carbon atoms, useful in the treatment of hepatitis b or c. |
CN104043112B (en) * | 2014-07-01 | 2016-03-30 | 哈药集团生物工程有限公司 | A kind of ointment pharmaceutical composition containing recombinanthumaninterferonα-2b (pseudomonas) |
SI3215193T1 (en) | 2014-11-06 | 2024-02-29 | Pharmaessentia Corporation | Dosage regimen for pegylated interferon |
WO2017194783A1 (en) * | 2016-05-13 | 2017-11-16 | Orionis Biosciences Nv | Targeted mutant interferon-beta and uses thereof |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5206344A (en) * | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
DE3676670D1 (en) * | 1985-06-26 | 1991-02-07 | Cetus Corp | SOLUBILIZATION OF PROTEINS FOR PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS BY POLYMER CONJUGATION. |
US4917888A (en) * | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
IL113280A (en) * | 1994-04-12 | 2004-12-15 | Res Dev Foundation | Composition for treating auto-immune diseases using type one interferons |
US5738846A (en) * | 1994-11-10 | 1998-04-14 | Enzon, Inc. | Interferon polymer conjugates and process for preparing the same |
EP1017794A1 (en) * | 1997-02-06 | 2000-07-12 | Novo Nordisk A/S | Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups |
BR9812267B1 (en) * | 1997-07-14 | 2013-11-26 | Recombinant Growth Hormone. | |
LT2599503T (en) * | 1998-10-16 | 2017-06-26 | Biogen Ma Inc. | Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof |
-
2000
- 2000-08-25 MX MXPA02001969A patent/MXPA02001969A/en not_active Application Discontinuation
- 2000-08-25 WO PCT/DK2000/000471 patent/WO2001015736A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-08-25 EP EP00954404A patent/EP1328295A2/en not_active Withdrawn
- 2000-08-25 IL IL14758100A patent/IL147581A0/en unknown
- 2000-08-25 BR BR0013638-7A patent/BR0013638A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-08-25 HU HU0302674A patent/HUP0302674A2/en unknown
- 2000-08-25 CZ CZ2002521A patent/CZ2002521A3/en unknown
- 2000-08-25 CA CA002380760A patent/CA2380760A1/en not_active Abandoned
- 2000-08-25 SK SK294-2002A patent/SK2942002A3/en unknown
- 2000-08-25 JP JP2001520147A patent/JP2003527090A/en active Pending
- 2000-08-25 AU AU66870/00A patent/AU6687000A/en not_active Abandoned
- 2000-08-25 CN CNA008121966A patent/CN1501815A/en active Pending
- 2000-08-25 KR KR1020027002608A patent/KR20020034181A/en not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-02-26 NO NO20020929A patent/NO20020929L/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HUP0302674A2 (en) | 2003-11-28 |
KR20020034181A (en) | 2002-05-08 |
CA2380760A1 (en) | 2001-03-08 |
AU6687000A (en) | 2001-03-26 |
WO2001015736A2 (en) | 2001-03-08 |
NO20020929L (en) | 2002-04-25 |
JP2003527090A (en) | 2003-09-16 |
IL147581A0 (en) | 2002-08-14 |
CN1501815A (en) | 2004-06-02 |
BR0013638A (en) | 2002-05-14 |
SK2942002A3 (en) | 2002-08-06 |
MXPA02001969A (en) | 2003-07-21 |
WO2001015736A3 (en) | 2003-05-22 |
EP1328295A2 (en) | 2003-07-23 |
NO20020929D0 (en) | 2002-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7238344B2 (en) | Interferon-β variants and conjugates | |
EP1366075B1 (en) | New interferon beta-like molecules | |
US7144574B2 (en) | Interferon β variants and conjugates | |
US7232562B2 (en) | E38N interferon gamma polypeptide variants | |
US20090030183A1 (en) | Interferon Beta-Like Molecules | |
CZ2002521A3 (en) | Novel molecules resembling beta interferon | |
US20030186386A1 (en) | Interleukin 10 | |
US7390638B2 (en) | S99T C-11 Truncated polynucleotides encoding interferon gamma polypeptide variants | |
US7230081B1 (en) | Interferon gamma conjugates | |
US20020169290A1 (en) | New multimeric interferon beta polypeptides | |
US7524931B2 (en) | Full-length interferon gamma polypeptide variants | |
WO2002036628A2 (en) | New multimeric interferon beta polypeptides | |
ZA200200337B (en) | New interferon beta-like molecules. | |
AU2002235727A1 (en) | New interferon beta-like molecules | |
ZA200303964B (en) | New interferon beta-like molecules. | |
AU1270101A (en) | Interferon gamma conjugates |