CZ20022643A3 - Farmaceutický prostředek - Google Patents
Farmaceutický prostředek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20022643A3 CZ20022643A3 CZ20022643A CZ20022643A CZ20022643A3 CZ 20022643 A3 CZ20022643 A3 CZ 20022643A3 CZ 20022643 A CZ20022643 A CZ 20022643A CZ 20022643 A CZ20022643 A CZ 20022643A CZ 20022643 A3 CZ20022643 A3 CZ 20022643A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nef
- tat
- hiv
- protein
- vaccine
- Prior art date
Links
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 101710090322 Truncated surface protein Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 46
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108010084873 Human Immunodeficiency Virus nef Gene Products Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 83
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 69
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 claims description 64
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 50
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 46
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 44
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 claims description 19
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 claims description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 9
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims description 8
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 4
- -1 Nef Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 124
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 85
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 70
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 62
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 62
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 37
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 16
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 16
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 15
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 13
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 13
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 10
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 9
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 6
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 6
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 6
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 6
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 5
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 5
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 5
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 5
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 5
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000007623 carbamidomethylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 4
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 4
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 4
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 4
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- PYTISYCTLQTCTM-UHFFFAOYSA-N sodium;2-sulfanylethanesulfonic acid Chemical compound [Na].OS(=O)(=O)CCS PYTISYCTLQTCTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 2
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 2
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 2
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 2
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 2
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 102100037853 C-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100031658 C-X-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710082516 C-X-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 235000001815 DL-alpha-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011627 DL-alpha-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010039334 HIV Envelope Protein gp120 Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- XOGTZOOQQBDUSI-UHFFFAOYSA-M Mesna Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCS XOGTZOOQQBDUSI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 101900170934 Simian immunodeficiency virus Protein Nef Proteins 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000008350 antigen-specific antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004868 gas analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002126 nonhaemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N sivmac Chemical compound O=C([C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000007919 viral pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Farmaceutický prostředek
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nových použití proteinů HIV v lékařství a vakcin s obsahem těchto proteinů HIV. Vynález se zvláště týká použití proteinů HIV Tat a HIV gp120 v kombinaci. Vynález se dále týká použití proteinů HIV Nef a HIV gp120 v kombinaci.
Dosavadní stav techniky
HIV-1 je primární příčinou syndromu získané imunitní nedostatečnosti (AIDS), který se považuje za jeden z hlavních světových zdravotních problémů. Ačkoli se dosud prováděl ve velké míře výzkum s cílem poskytnout vakcinu, nebylo toto úsilí dosud úspěšné.
Glykoprotein obalu HIV gp120 je virový protein, který je používán pro zachycení na hostitelskou buňku. Toto zachycení je zprostředkováno vazbou dvou povrchových molekul pomocných Tbuněk a makrofágů známých jako CD4 a jednoho nebo dvou chemokinových receptorů CCR-4 nebo CXCR-5. Protein gp120 se nejprve exprimuje ve formě větší molekuly prekurzoru (gp160), která potom podléhá posttranslačnímu štěpení za získání proteinů gp120 a gp41. Protein gp120 se na povrchu virionu udržuje vazbou na molekulu gp41, která je vložena do membrány viru.
Protein gp120 je hlavním cílem neutralizačních protilátek, ale oblasti proteinů s největší imunogenicitou (smyčka V3) mají naneštěstí také nejvyšší variabilitu. Proto se předpokládá, že použití gp120 (nebo jeho prekurzoru gp 160) jako vakcinačního antigenů pro vyvolání neutralizačních protilátek bude mít pro vakcinu s širším ochranným působením pouze omezené použití. Protein gp120 také neobsahuje
- 2 epitopy, které jsou rozpoznávány cytotoxickými T-lymfocyty (CTL). Tyto efektorové buňky jsou schopny eliminovat buňky infikované virem, a proto představují druhý hlavní antivirový imunitní mechanismus. Na rozdíl od cílových oblastí neutralizujících protilátek se zdají některé epitopy CTL být relativně konzervované mezi různými kmeny HIV. Z tohoto důvodu jsou považovány proteiny gp120 a gp160 za použitelné antigenní složky ve vakcinách, které se zaměřují na vyvolání imunitních odpovědí zprostředkovaných buňkami (zvláště CTL).
Byly také popsány jiné než obalové proteiny HIV-1, mezi které patří například vnitřní strukturní proteiny jako jsou produkty genů gag a pol a jiné nestrukturní proteiny, jako například Rev, Nef, Vif a Tat (Green a další, New England J. Med., 324, 5, 308 a následující (1991) a Bryant a další (ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 a následující (1992).
Proteiny HIV Tat a Nef jsou proteiny rané fáze, tj. jsou exprimovány v rané fázi infekce a v nepřítomnosti strukturního proteinu.
V prezentaci na konferenci (C. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12th Cent Gardes meeting, Marnes-La-Coquette, 26. 10. 1999) byly popsány experimenty s makaky rhesus, kteří byli imunizováni samotným toxoidem Tat, nebo kombinovanou vakcinou s obalovým glykoproteinem gp160 (jedna dávka rekombinantního viru vakcinie a jedna dávka rekombinantního proteinu). Pozorované výsledky však ukázaly, že přítomnost obalového glykoproteinu neměla žádnou výhodu ve srovnání s experimenty prováděnými se samotným Tat.
Autoři vynálezu však zjistili, že imunogen obsahující Tat a/nebo Nef (zvláště fúzní protein Nef-Tat) působí synergicky s gp120 při ochraně opic rhesus před testovacím podáním patogenu, chimérního lidského/opičího viru imunodeficitu (SHIV). V současnosti je infekce • · ·
- 3 • · · · ···· ··· · · ·
SHIV makaků rhesus považována za nejrelevantnější zvířecí model lidského AIDS. Autoři vynálezu proto používali tento předklinický model pro vyhodnocení ochranné účinnosti vakcin obsahujících antigen gp120 a antigen obsahující Nef a Tat bud’ samostatně nebo v kombinaci. Analýza dvou markérů virové infekce a patogenicity, tedy procenta CD4-pozitivních buněk v periferní krvi a koncentrace volných genomů RNA SHIV v plasmě opic ukázala, že tyto dva antigeny působily synergickým způsobem. Imunizace buď samotným gp120 nebo NefTat + samotný SIV Nef nevedla k žádnému rozdílu ve srovnání s imunizací samotným adjuvans. Naopak podání kombinace antigenů gp120 a NefTat + SIV Nef vedla ke značnému zvýšení těchto dvou výše uvedených parametrů u všech zvířat z příslušné experimentální skupiny.
Podstata vynálezu
Podle předkládaného vynálezu se tedy poskytuje nové použití proteinu HIV Tat a/nebo Nef spolu s proteinem HIV gp120 při výrobě vakcíny pro preventivní nebo léčebnou imunizaci lidí proti HIV.
Jak bylo popsáno výše, protein NefTat, protein Nef SIV a protein gp120 poskytují společně zesílenou odpověď ve srovnání s případem, kdy se používá buď NefTat + SIV Nef, nebo gp120 samostatně. Tato zesílená odpověď nebo synergický účinek mohou být sledovány na poklesu množství viru (viral load) jako výsledek vakcinace těmito kombinovanými proteiny. Alternativně nebo navíc se zesílená odpověď sama projevuje udržením hladin CD4+ na vyšších úrovních proti hladinám v nepřítomnosti vakcinace HIV NefTat, SIV Nef a HIV gp120. Synergický účinek je připisován kombinaci gp120 a Tat, nebo gp120 a Nef, nebo gp120 a jak Nef, tak i Tat.
Synergický účinek pozorovaný na vzájemné interakci gp120 a Tat a/nebo Nef může být dále zvýšen přidáním jiných proteinů HIV.
- 4 - .· :·:::· ···· ··· · · · · ·
Tyto další proteiny mohou také působit synergicky s jednotlivými složkami vakciny s obsahem gp120, Tat a/nebo Nef, přičemž nemusí být nutná přítomnost úplné úvodní kombinace antigenů. Dalšími proteiny mohou být regulační proteiny HIV, jako je Rev, Vif, Vpu a Vpr. Mohou jimi být také strukturní proteiny odvozené od genů HIV gag nebo pol.
Gen HIV gag kóduje prekurzorový protein p55, který se může spontánně uspořádat do nezralých částic podobných viru (virus-like particles, VLP). Tento prekurzor je potom proteolyticky štěpen na hlavní strukturní proteiny p24 (kapsida) a p18 (matrice) a na několik menších proteinů. Jak prekurzorový protein p55, tak jeho hlavní deriváty p24 a p18, mohou být považovány za vhodné vakcinační antigeny, které mohou dále zesílit synergický účinek pozorovaný mezi gp120 a Tat a/nebo Nef. Prekurzor p55 a kapsidový protein p24 mohou být použity jako částice VLP nebo jako monomerní proteiny.
Protein HIV Tat ve vakcině podle předkládaného vynálezu může být popřípadě navázán na protein HIV Nef, například jako fúzní protein. Protein HIV Tat, protein HIV Nef a/nebo fúzní protein NefTat může obsahovat v předkládaném vynálezu C-koncové histidinové zakončení, které s výhodou obsahuje mezi 5 až 10 histidinovými zbytky. Přítomnost histidinového zakončení (neboli „His“) napomáhá při čištění.
Ve výhodném provedení se proteiny exprimují s histidinovým zakončením obsahujícím mezi 5 až 10 histidinovými zbytky, s výhodou šest histidinových zbytků. To je výhodné uspořádání, které napomáhá při čištění. Byla popsána oddělená exprese v kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae), proteinů Nef (Macreadie I. G. a další, 1993, Yeast 9 (6) 565 - 573) a Tat (Braddock M a další, 1989, Cell 58 (2) 269 - 79). Protein Nef a proteiny Gag p55 a p18 jsou myristilované. Exprese proteinů Nef a Tat odděleně v expresním systému Pichia • · · · ♦ *
- 5 (konstrukty Nef-His a Tat-His) a exprese fúzního konstrktu Nef-Tat-His byla již také popsána dříve ve WO 99/16884.
Aminokyselinové sekvence DNA reprezentativních fúzních proteinů Nef-His (SEQ ID No. 8 a 9), Tat-His (SEQ ID No. 10 a 11) a Nef-Tat-His (SEQ ID No. 12 a 13) se uvádějí v obr. 1.
Proteiny HIV podle předkládaného vynálezu mohou být použity ve své nativní konformaci, nebo mohou být výhodněji modifikovány pro použití ve vakcině. Tyto modifikace mohou být buď nutné z technických důvodů týkajících se způsobu čištění, nebo mohou být používány pro biologickou inaktivaci jedné nebo několika funkčních vlastností proteinu Tat nebo Nef. Předkládaný vynález tedy zahrnuje deriváty proteinů HIV, kterými mohou být například mutované proteiny. Termín „mutovaný“ se zde používá ve významu molekuly, u které byla provedena delece, adice nebo substituce jedné nebo více aminokyselin použitím dobře známých technik místně specifické mutageneze, nebo jakýmkoli jiným způsobem.
Mutantní protein Tat může být například mutován tak, že je biologicky neaktivní, zatímco si stále zachovává své imunogenní epitopy. Jeden možný mutovaný gen tat zkonstruovaný D. Clementsem (Tulane University), (původem z molekulárního klonu BH10) nese mutace v oblasti aktivního místa (Lys41->Ala) a v motivu RGD (Arg78->Lys a Asp80->Glu) (Virology 235: 48 - 64, 1997).
Mutovaný protein Tat je ilustrován na obr. 1 (SEQ ID No. 22 a 23) stejně jako Nef-Tat mutovaný His (SEQ ID No. 24 a 25).
Proteiny HIV Tat nebo Nef ve vakcině podle předkládaného vynálezu mohou být modifikovány chemickými metodami v průběhu procesu čištění, aby se proteiny převedly do stabilní a monomerní formy. Jeden způsob pro zabránění oxidativní agregaci proteinu jako je Tat nebo Nef je použití chemických modifikací thiolových skupin proteinů. V prvním kroku se disulfidové můstky redukují působením redukčního činidla jako je DTT, beta-merkaptoethanol nebo gluthation.
V druhém kroku se získané thioly blokují reakcí s alkylačním činidlem (protein může být např. karboxyamidován/karbamidomethylován použitím jodacetamidu). Tyto chemické modifikace nemodifikují funkční vlastnosti proteinu Tat nebo Nef, jak se zjišťuje analýzou vazby buněk a inhibici lymfoproliferace mononukleárních buněk lidské periferní krve. Protein HIV Tat a proteiny HIV gp120 mohou být čištěny způsoby uvedenými v následujících příkladech.
Vakcina podle předkládaného vynálezu bude obsahovat imunoprotektivní nebo imunoterapeutické množství antigenů Tat a/nebo Nef nebo NefTat a gp120, a může být připravena běžnými způsoby.
Příprava vakcin se obecně popisuje v publikaci New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do liposomů se popisuje např. v patentu Fullerton, US patent 4,235,877. Konjugace proteinů k makromolekulám se popisuje např. v patentech Likhite, US patent 4,372,945 a Armor a další, US patent 4,474,757.
Množství proteinu v dávce vakciny se volí jako množství, které v typických vakcinách indukuje imunoprotektivní odpověď bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Takové množství se bude lišit v závislosti na použitém specifickém imunogenu. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg každého proteinu, s výhodou 2 až 200 pg, nejvýhodněji 4 až 40 pg Tat nebo Nef nebo NefTat a s výhodou 1 až 150 pg, nejvýhodněji 2 až 25 pg gp120. Optimální množství pro určitou vakcinu je možno zjistit pomocí standardních studií zahrnujících pozorování titrů protilátek a jiných odpovědí pacientů. Jeden konkrétní příklad dávky pro vakcinaci bude obsahovat 20 pg NefTat a 5 nebo 20 pg gp120. Po počáteční vakcinaci mohou dostat pacienti zesilovací dávku během přibližně čtyř týdnů, a následně druhou zesilovací imunizační dávku.
Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou přítomny ve vakcině podle vynálezu, s výhodou společně s adjuvans. Různá adjuvans se obecně popisují v publikaci Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, ed. Powell a Newman, Plenům Press, New York, 1995.
Vhodná adjuvans zahrnují sůl hliníku jako je hydroxid hlinitý ve formě gelu (alum) nebo fosforečnan hlinitý, ale mohou být také použity sůl vápníku, železa nebo zinku, nebo nerozpustná suspenze acylovaného tyrosinu, nebo acylovaných cukrů, kationtově nebo aniontově derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny.
V prostředku podle vynálezu je výhodné, jestliže adjuvantní prostředek indukuje přednostní odpověď Th1. Bude však zřejmé, že nejsou vyloučeny jiné odpovědi, včetně humorálních odpovědí.
Imunitní odpověď na antigen se vytváří prostřednictvím interakce antigenů s buňkami imunitního systému. Výsledná imunitní odpověď se může zhruba rozlišit na dvě extrémní kategorie, a to humorální nebo buněčná imunitní odpověď (tradičně charakterizované protilátkovým, popřípadě buněčným mechanismem ochranného působení). Tyto kategorie odpovědi byly nazvány odpověď typu Th1 (buněčná odpověď) a odpověď typu Th2 (humorální odpověď).
Extrémní imunitní odpovědi typu Th1 mohou být charakterizovány tvorbou pro antigen specifických, haplotypově omezených cytotoxických T-lymfocytů a odpovědí přirozených buněk zabíječů. U myší jsou odpovědi typu Th1 často charakterizovány tvorbou protilátek subtypu lgG2a, zatímco u lidí odpovídají tyto odpovědi protilátkám typu lgG1. Imunitní odpovědi typu Th2 jsou charakterizovány tvorbou širokého spektra imunoglobulinových isotypů, včetně u myší lgG1, IgA a IgM.
Je možno předpokládat, že hnací silou vývoje těchto dvou typů imunitních odpovědí jsou cytokiny, tedy řada identifikovaných proteinových přenašečů, které pomáhají buňkám imunitního systému
-8- ·* ί * ί · · * · « · · · · · · · · · · · a řídí případnou imunitní odpověď buď ve směru Th1 nebo Th2. Vysoké hladiny cytokinů typu Th1 tedy upřednostňují indukci imunitních odpovědí na daný antigen zprostředkovaných buňkami, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu Th2 upřednostňují indukci humorálních imunitních odpovědí na antigen.
Je důležité uvědomit si, že rozlišení imunitních odovědí typu Th1 a Th2 není absolutní. Ve skutečnosti dojde u jedince k imunitní odpovědi, kterou je možno popsat jako převážně Th1 nebo převážně Th2. Často je však pohodlné uvažovat skupiny cytokinů podle hledisek popisovaných u myších klonů T-buněk CD4+ve autory Mosmann a Coffman (Mosmann, T. R. a Coffman, R. L. (1989) TH1 a TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immurtology, 7, str. 145 - 173). Tradičně jsou odpovědi typu Th1 spojovány s produkcí cytokinů INF-γ a IL-2 Tlymfocyty. Jiné cytokiny, jako je např. IL12, které jsou často přímo spojené s indukcí imunitních odpovědí typu Th1, nejsou produkovány T-buňkami. Naopak odpovědi typu Th2 jsou asociovány se sekrecí IL4, IL-5, IL-6, IL-10 a tumorového nekrózního faktoru-β (TNF-β).
Je známo, že některá adjuvans pro vakciny jsou zvláště vhodná pro stimulaci odpovědí cytokinů Th1 nebo Th2. Tradičně patří mezi nejlepší ukazatele rovnováhy Th1 : Th2 při imunitní odpovědi po vakcinaci nebo infekci přímé měření tvorby cytokinů Th1 nebo Th2 T-lymfocyty in vitro po restimulaci antigenem a/nebo měření poměru IgG 1 : lgG2a odpovědí protilátek specifických pro antigen.
Adjuvans typu Th1 je tedy adjuvans, které stimuluje izolované populace T-buněk k produkci vysokých hladin cytokinů typu Th1 při restimulaci antigenem in vitro, a indukuje odpovědi imunoglobulinů specifické pro antigen asociované s isotypem typu Th1.
Výhodné imunostimulační látky typu Th1, které mohou být formulovány pro získání adjuvans vhodného pro použití v rámci předkládaného vynálezu, zahrnují bez omezení následující látky.
- 9 Monofosforyllipid A, zvláště 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) je výhodné imunostimulans typu Th1 pro použití v předkládaném vynálezu. 3D-MPL je dobře známé adjuvans vyráběné firmou Ribi Immunochem, Montana. Chemicky se často uvádí jako směs 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A s buď 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci. Může být vyčištěný a připravený způsoby uváděnými v GB 2122204B, přičemž tento patent také popisuje přípravu difosforyllipidu A a jeho 3-O-deacylovaných variant. Byly také popsány jiné čištěné a syntetické lipopolysacharidy (US 6,005,099 a EP 0 729 473 B1; Hilgers a další, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol, 79 (4): 392 - 6; Hilgers a další, 1987, Immunology, 60 (1): 1416; a EP 0 549 074 B1). Výhodná forma 3D-MPL je forma částic s malou velikostí o průměru menším než 0,2 pm, jejíž způsob výroby se popisuje v EP 0 689 454.
Výhodné Th1-imunostimulační látky podle vynálezu jsou také saponiny. Saponiny jsou známá adjuvans popisovaná v LacailleDubois, M. a Wagner H. (1996), A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine díl 2, str. 363 386). Paří sem například Quil A (odvozený z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina) a jeho frakce, jak se popisuje v US 5,057,540 a v publikaci „Saponins as vaccine adjuvants“, Kensil, C. R., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1 - 2): 1 - 55; a EP 0 362 279 B1. Jako silná systémová adjuvans byly popsány hemolytické saponiny QS21 a QS17 (HPLC čištěné frakce Quil A), přičemž způsob jejich výroby se popisuje v US patentu No. 5,057,540 a EP 0 362 279 B1. V těchto odkazech se také popisuje použití QS7 (nehemolytická frakce Quil-A), který působí jako silné adjuvans pro systémové vakciny. Použití QS21 se dále popisuje v Kensil a další (1991), J. Immunology, díl 146, 431 - 437). Kombinace QS21 a polysorbátu nebo cyklodextrinu jsou také známé (WO 99/10008). Adjuvantní systémy ve formě částic obsahující frakce QuilA, jako je QS21 a QS7, se popisují ve WO 96/33739 a WO 96/11711.
» 9 · * · 9 9 9 9 » · · 99 9 9 9 · ·
9 9 9 9 9 9 9 _ j Q _ »* t ·····* ··«· ··· ··. *· ·· ····
Další výhodné imunostimulans je imunostimulační oligonukleotid obsahující nemethylované dinukleotidy CpG („CpG“). CpG je zkratka pro cytosin-guanosinové dinukleotidové motivy přítomné v DNA. CpG je v oboru známý jako adjuvans jak při systémovém podávání, tak i při podání přes sliznice (WO 96/02555, EP 468520, Davis a další, J. Immunol., 1998, 160(2): 870 - 876; McCIuskie a Davis, J. Immunol.,
1998, 161(9): 4463 - 6). Již dříve bylo pozorováno, že frakce DNA BCG by mohla mít antitumorový účinek. V dalších studiích bylo ukázáno, že syntetické oligonukleotidy odvozené z genových sekvencí BCG jsou schopné indukovat imunostimulační účinky (in vitro a in vivo). Autoři těchto studií došli k závěru, že tuto aktivitu nesly některé palindromické sekvence včetně centrálního motivu CG. Centrální úloha motivu CG při imunostimulaci byla později osvětlena v publikaci Krieg, Nátuře 374, str. 546, 1995. Podrobná analýza ukázala, že motiv CG musí být v kontextu určité sekvence, a že tyto sekvence jsou běžné v bakteriální DNA, ale jsou vzácné v DNA obratlovců. Imunostimulační sekvence je často následující: purin, purin, C, G, pyrimidin, pyrimidin; kde motiv CG není methylovaný, ale je známo, že imunostimulační účinky mají jiné nemethylované sekvence CpG, které mohou být použity v rámci předkládaného vynálezu.
V některých kombinacích šesti nukleotidů je přítomná palindromická sekvence. Některé z těchto motivů, buď jako opakování jednoho motivu nebo kombinace různých motivů, může být přítomno ve stejném oligonukleotidu. Přítomnost jednoho nebo více těchto oligonukleotidů s obsahem imunostimulačních sekvencí může aktivovat různé prvky imunity, včetně buněk-zabíječů (které produkují interferon γ a mají cytolytickou aktivitu) a makrofágů (Wooldrige a další, díl 89 (no. 8), 1977). Nyní také bylo ukázáno, že imunomodulační účinky mají také jiné nemethylované sekvence obsahující CpG, které neobsahují tuto konvenční sekvenci.
CpG, jestliže je formulován do vakcin, se obecně podává ve formě volného roztoku společně s volným antigenem (WO 96/02555;
- 11 • · ··*
McCIuskie a Davis, výše) nebo kovalentně konjugovaný k antigenů (WO 98/16247) nebo formulovaný s nosičem jako je hydroxid hlinitý (povrchový antigen hepatitidy, Hepatitis surface antigen) Davis a další, výše; Brazolot-Millan a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553 - 8).
Imunostimulační látky popisované výše mohou být formulovány společně s nosiči jako například liposomy, ve formě emulzí typu olej ve vodě a/nebo s kovovými solemi včetně solí hliníku (jako je hydroxid hlinitý). Například 3D-MPL může být formulován s hydroxidem hlinitým (EP 0 689 454) nebo emulzí typu olej ve vodě (WO 95/17210); QS21 může být s výhodou formulován s liposomy obsahujícími cholesterol (WO 96/33739), ve formě emulzi typu olej ve vodě (WO 95/17210) nebo s hydroxidem hlinitým (WO 98/15287); CpG může být formulován s hydroxidem hlinitým (Davis a další, výše; Brazolot-Millan, výše) nebo s jinými kationtovými nosiči.
Výhodné jsou také kombinace imunostimulačních látek, zvláště kombinace monofosforyllipidu A a derivátu saponinu (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), zvláště kombinace QS21 a 3D-MPL popisovaná ve WO 94/00153. Alternativně také představuje silné adjuvans pro použití v rámci předkládaného vynálezu kombinace CpG + saponin, jako je QS21.
Vhodné adjuvantní systémy tedy zahrnují například kombinaci monofosforyllipidu A, s výhodou 3D-MPL, spolu se solí hliníku. Zlepšený systém zahrnuje kombinaci monofosforyllipidu A a derivátu saponinu, zvláště kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak se popisuje ve WO 94/00153, nebo méně reaktogenní prostředek, kde aktivita QS21 je snížena v liposomech s obsahem cholesterolu (DQ), jak se popisuje ve WO 96/33739.
• · · · · » · > * ♦ • · 9 9 9 9 9 9
4 9 9·9·99 9
Zvláště účinná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě, se popisuje ve WO 95/17210, a je další výhodnou formulací pro použití v předkládaném vynálezu.
Další výhodná formulace obsahuje samotný oligonukleotid CpG nebo tento oligonukleotid spolu se solí hliníku.
V dalším provedení vynálezu může vakcina obsahovat DNA kódující jeden nebo více polypeptidů Tat, Nef a gp120 tak, že polypeptid se vytváří in šitu. DNA může být přítomná v řadě dodávacích systémů známých odborníkům v oboru, včetně expresních systémů nukleových kyselin jako plasmidové DNA, bakterií a virových expresních systémů. V oboru je znám velký počet způsobů pro dodávání genů, jako jsou způsoby popsané v Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143 - 198, 1998, a tam uváděných odkazech. Vhodné expresní systémy nukleových kyselin obsahují nezbytné sekvence DNA pro expresi v těle pacienta (jako je vhodný promotor a terminační signál). Jestliže je expresním systémem rekombinantní živý mikroorganismus jako je virus nebo bakterie, příslušný gen může být vložen do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Zaočkování a infekce in vivo tímto živým vektorem povedou k expresi antigenu in vivo a indukci imunitních odpovědí. Viry a bakterie používané k tomuto účelu jsou například poxviry (např. vakcinie, drůbeží neštovice, kanárčí neštovice, modifikované poxviry jako je např. modifikovaný virus Ankara (MVA)), alfaviry (Sindbis virus, Semliki Forest Virus, venezuelský viru koňské encefalitidy), flaviviry (virus žluté horečky, virus Dengue, virus japonské encefalitidy), adenoviry, virus asociovaný s adenoviry, pikornaviry (poliovirus, rhinovirus), herpetické viry (virus varicella zoster atd.), bakterie Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Tyto viry a bakterie mohou být virulentní nebo různými způsoby oslabené, aby byly získány živé vakciny. Tyto živé vakciny rovněž tvoří část vynálezu.
- 13 • 9 9 9 99 99
99999 9
99 999999 9
9 «99999
9999 999 999 99 99 9999
Složky Nef, Tat a gp120 výhodné vakciny podle vynálezu mohou být tedy poskytovány ve formě polynukleotidů kódujících požadované proteiny.
Imunizace podle vynálezu mohou být dále prováděny kombinací formulací založených na proteinu a na DNA. Primární - zesilovací imunizace .(prime-boost) jsou považovány za účinné při indukci širokých imunitních odpovědí. Vakciny na bázi proteinů s adjuvans indukují hlavně protilátkové imunitní odpovědi a odpovědi Tpomocných buněk, zatímco dodávání DNA ve formě plasmidu nebo živého vektoru indukuje silné odpovědi cytotoxických T-lymfocytů (CTL). Kombinace vakcinace proteinem a DNA bude tedy poskytovat široké spektrum imunitních odpovědí. To je zvláště důležité v souvislosti s virem HIV, protože pro imunitní obranu proti viru HIV jsou považovány za důležité jak neutralizační protilátky, tak i CTL.
Vakcinační schéma polypeptidy gp120, Nef a Tat samostatně nebo v kombinaci může podle vynálezu zahrnovat postupné (primární zesilující, „prime-boost“) nebo současné podání proteinových antigenů a DNA kódující výše uvedené proteiny. DNA může být dodána ve formě plasmidové DNA nebo ve formě rekombinantního živého vektoru, například poxvirového vektoru nebo jakéhokoli jiného vhodného živého vektoru, jako jsou výše popisované vektory. Proteinové antigeny mohou být injekčně podávány jednou nebo několikrát s následnými jedním nebo více podáními DNA, nebo může být DNA nejprve použita pro jedno nebo více podání a následuje jedna nebo více imunizací proteiny.
Konkrétní příklad primární - zesilovací imunizace podle vynálezu zahrnuje primární imunizaci DNA ve formě rekombinantního živého vektoru jako je vektor na bázi modifikovaného poxviru, např. modifikovaného viru Ankara (MVA) nebo alfaviru, například venezuelského viru koňské encefalitidy, s následnou zesilovací dávkou proteinu, s výhodou proteinu s adjuvans.
- 14 - ·* ·*···· • ·· < · · · · · ·
Vynález tedy dále poskytuje farmaceutický kit obsahující:
a) prostředek obsahující jeden nebo více proteinů gp120, Nef a Tat společně s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou; a
b) prostředek obsahující jeden nebo více polynukleotidů kódujících gp120, Nef a Tat, spolu s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou;
s podmínkou, že alespoň jedna z forem (a) nebo (b) obsahuje gp120 spolu s Nef a/nebo Tat a/nebo Nef-Tat.
Prostředky a) a b) mohou být podávány odděleně v jakémkoli pořadí nebo společně. Prostředek a) s výhodou obsahuje všechny tři proteiny gp120, Nef a Tat. Prostředek b) s výhodou obsahuje všechny tři DNA kódující gp120, Nef a Tat. Nejvýhodněji jsou Nef a Tat ve formě fúzního proteinu NefTat.
V dalším provedení předkládaného vynálezu se poskytuje způsob výroby vakciny popisované výše, kde tento způsob zahrnuje míšení kombinace proteinů podle vynálezu. Směs proteinů může být smíchána s vhodným adjuvans a popřípadě nosičem.
Zvláště výhodně kombinace adjuvans a/nebo nosičů pro použití v prostředcích podle vynálezu jsou následující:
i) 3D-MPL + QS21 v DQ ii) Hydroxid hlinitý + 3D-MPL iii) Hydroxid hlinitý + QS21 v DQ + 3D-MPL iv) Hydroxid hlinitý + CpG
v) 3D-MPL + QS21 v DQ + emulze olej ve vodě vi) CpG
Vynález bude nyní ilustrován na následujících příkladech a obrázcích.
- 15 to • · · · to· ·· • · · • to · • · · • · · ·· toto··
Příklady provedení vynálezu
Obecná část
Konstrukty z těchto experimentů byly získány selekcí z genu Nef z izolátu Bru/Lai (Cell 40: 9 - 17, 1985), protože tento gen patří mezi geny nejblíže příbuzné konvenčnímu genu Nef.
Výchozí materiál pro gen Nef Bru/Lai byl fragment DNA 1170bp klonovaný v savčím expresním vektoru pcDNA3 (pcDNA3/Nef).
Gen Tat pochází z molekulárního klonu BH10. Tento gen byl získán jako klon HTLV III cDNA nazvaný pCV1 a popsaný v Science, 229, str. 69 - 73, 1985.
Exprese genů Nef a Tat by mohla být prováděna v kvasince Pichia nebo jakémkoli jiném hostiteli.
Příklad 1
Exprese sekvencí HIV-1 nef a tat v Pichia pastoris
Protein Nef, protein Tat a fúzní protein Nef-Tat byly exprimovány v methylotrofní kvasince Pichia pastoris pod řízením indukovatelného promotoru alkoholoxidázy (AOX1).
Pro expresi těchto genů HIV-1 byla použita modifikovaná verze integrativního vektoru PHIL-D2 (INVITROGEN). Tento vektor byl modifikován takovým způsobem, aby exprese heterologního proteinu začínala bezprostředně po nativním kodonu ATG genu AOX1 a došlo k produkci rekombinantního proteinu zakončeného jedním glycinovým a šesti histidinovými zbytky. Tento vektor PHIL-D2-MOD byl zkonstruován klonováním oligonukleotidové propojovací části (linkeru) mezi sousedícími štěpícími místy Asull a EcoRI vektoru PHIL-D2 (viz obr. 2). Navíc k histidinovému zakončení nese propojovací skupina
- 16 ·<
• · » ·· »· · 9 · 9 · ·
9 9 · ·
99·· restrikční místa Ncol, Spěl a Xbal, mezi která byly vloženy geny nef, tat a nef-tat.
1,1 Konstrukce integrativních vektorů pRIT14597 (kódující protein
Nef-His), pRIT14598 (kódující protein Tat-His) a pRIT14599 (kódující protein Nef-Tat-His)
Gen nef byl amplifikován PCR z plasmidu pcDNA3/Nef s primery 01 a 02.
Ncol
Primer 01 (SEQ ID No. 1): 5’ATCGTCCATG.GGT.GGC.AAG.TGG.T 3’ Spěl
Primer 02 (SEQ ID No. 2): 5'CGGCTACTAGTGCAGTTCTTGAA 3’
Získaný fragment PCR a integrativní vektor PHIL-D2-MOD byly oba štěpeny Ncol a Spěl, čištěny na agarózovém gelu a ligovány za vytvoření integrativního plasmidu pRIT14597 (viz obr. 2).
Gen tat byl amplifikován metodou PCR z derivátu plasmidu pCVI s použitím primerů 05 a 04:
Spěl
Primer 04 (SEQ ID No. 4): 5’CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT 3’ Ncol
Primer 05 (SEQ ID No. 5): 5’ATCGTCCATGGAGCCAGTAGATC 3’
Restrikční místo Ncol bylo vloženo na 5’-konec fragmentu PCR, zatímco místo Spěl bylo vloženo na 3’-konec primerem 04. Získaný fragment PCR a vektor PHIL-D2-MOD byly oba štěpeny Ncol a Spěl, čištěny na agarózovém gelu a ligovány za vytvoření integrativního plasmidu pRIT14598.
9
9« 9999
99
- 17 Pro konstrukci plasmidu pRIT14599 byl fragment odpovídající kódující sekvenci nef-tat-V\\s o délce 910 bp ligován mezi zarovnaný EcoRI konec (T4 polymeráza) a Ncol vektoru PHIL-D2-MOD. Kódující fragment neř-řař-His byl získán štěpením Xbal a zarovnáním (T4 polymeráza) a štěpením Ncol plasmidu pRIT14596.
1.2 Transformace kmene Pichia pastoris GS115 (his4)
Pro získání kmenů Pichia pastoris exprimujících Nef-His, Tat-His a fúzní protein Nef-Tat-His, byl kmen GS115 transformován lineárními fragmenty Notl nesoucími příslušné expresní kazety + gen HIS4 pro doplnění his4 v genomu hostitele. Transformace kmene GS115 lineárními fragmenty Notl probíhá ve prospěch rekombinace na místě AOXI.
Selekce klonů s větším počtem integrovaných kopií byla prováděna kvantitativní tečkovací analýzou a byl zjišťován typ integrace, inzerce (Mut+fenotyp) nebo přesunu (Muťfenotyp).
Z každé transformace byl vybrán jeden transformant vykazující vysokou hladinu exprese rekombinantního proteinu:
Kmen Y1738 (Mut+fenotyp) produkující rekombinantní protein Nef-His, myristilovaný protein o délce 215 aminokyselin složený z:
0 kyseliny myristové ° methioninu, vytvořeného použitím klonovacího místa Ncol vektoru PHIL-D2-MOD 0 fragmentu o délce 205 aminokyselin proteinu Nef (začátek na aminokyselině v poloze 2 a pokračování až k aminokyselině 206) ° threoninu a šeřinu vytvořeného postupem klonování (klonování v místě Spěl vektoru PHIL-D2-MOD)
• · jednoho glycinu a šesti histidinů
Kmen Y1739 (Mut+fenotyp) produkující protein Tat-His, protein o délce 95 aminokyselin složený z:
° methioninu vytvořeného použitím klonovacího místa Ncol ° 85 aminokyselin proteinu Tat (začíná aminokyselinou v poloze 2 a končí aminokyselinou 86) ° threoninu a šeřinu zavedených klonováním 0 jednoho glycinu a šesti histidinů.
Kmen Y1737 (Mutsfenotyp) produkující rekombinantní fúzní protein Nef-Tat-His, myristilovaný protein o délce 302 aminokyselin složený z:
° kyseliny myristové ° methioninu vytvořeného použitím klonovacího místa Ncol 0 205 aminokyselin proteinu Nef (zařátek v poloze 2, pokračuje až k aminokyselině 206) ° threoninu a šeřinu vytvořených klonováním ° 85 aminokyselin proteinu Tat (začátek na aminokyselině 2 a konec na aminokyselině 86) ° threoninu a šeřinu zavedených klonováním ° jednoho glycinu a šesti histidinů.
Příklad 2
Exprese mutantního proteinu HIV-1 Tat v Pichia pastoris
Byl také exprimován mutantní rekombinantní protein Tat. Mutantní protein Tat musí být biologicky neaktivní, přičemž si musí zachovat své imunogenní epitopy.
- 19 «« *· • · ♦ • · · • · ♦ • · · ·« ·»··
Pro tyto konstrukty byl zvolen dvojitý mutant genu tat zkonstruovaný D. Clementsem (Tulane University).
Tento gen tat (pocházející z molekulárního klonu BH10) nese mutace v oblasti aktivního místa (Lys41->Ala) a v motivu RGD (Arg78-»Lys a Asp80->Glu) (Virology 235: 48 - 64, 1997).
Mutantní gen tat byl získán jako fragment cDNA subklonovaný mezi místa EcoRI a Hindlll v expresním plasmidu CMV (pCMVLys41/KGE).
2.1 Konstrukce integrativních vektorů pRIT14912 (kódující protein mutantní Tat-His) a pR!T14913 (kódující fúzní protein Nef-mutantní
Tat-His)
Mutantní gen tat byl amplifikován PCR z plasmidu pCMVLys41/KGE s použitím primerů 05 a 04 (viz část 1.1 konstrukce pRIT14598).
Restrikční místo Ncol bylo zavedeno na 5’-konci fragmentu PCR, zatímco místo Spěl bylo zavedeno na 3’-konci pomocí primeru 04. Získaný fragment PCR a vektor PHIL-D2-MOD byly oba štěpeny Ncol a Spěl, čištěny na agarózovém gelu a ligovány za vytvoření integrativního plasmidu pRIT14912.
Pro konstrukci pRIT14913 byl mutantní gen tat amplifikován PCR z plasmidu pCMVLys41/KGE s použitím primerů 03 a 04.
Spěl
Primer 03 (SEQ ID No. 3): 5’ATCGTACTAGT.GAG.CCA.GTA.GAT.C 3’
Spěl
Primer 04 (SEQ ID No. 4): 5’CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT 3’ • · ·
- 20 ft ♦* • · · •ft ·»ί»
Získaný fragment PCR a pfasmid pRIT14597 (exprimující protein Nef-His) byly oba štěpeny restrikčním enzymem Spěl, čištěny na agarózovém gelu a ligovány za vytvoření integrativního plasmidu PRIT14913.
2.2 Transformace Pichia pastoris kmen GS115
Kmeny Pichia pastoris exprimující protein mutantní Tat-His a fúzní protein Nef-mutantní Tat-His byly získány použitím strategie integrace a selekce rekombinantního genu výše popsané v části 1.2.
Byly vybrány dva rekombinantní kmeny produkující protein mutantní Tat-His, tedy protein o délce 95 aminokyselin: Y1775 (Mut+fenotyp) a Y1776 (Mutsfenotyp).
Byl vybrán jeden rekombinantní kmen exprimující fúzní protein Nef-mutantní Tat-His, tedy protein o délce 302 aminokyselin: Y1774 (Mut+fenotyp).
Příklad 3
Fermentace Pichia pastoris produkující rekombinantní TAT-HIS
Typický postup se popisuje v následující tabulce.
Fermentace zahrnuje růstovou fázi (přívod živného média na bázi glycerolu podle příslušné křivky) poskytující kulturu s vysokou hustotou buněk a fázi indukce (přívod živného roztoku s obsahem methanolu a solí/látek přítomných ve stopovém množství). V průběhu fermentace se sleduje růst odebíráním vzorků a měřením jejich absorbance při 620 nm. V průběhu fáze indukce byl přidán methanol pomocí čerpadla a jeho koncentrace byla monitorována plynovou chromatografií (u vzorků kultury) a on line analýzou plynů hmotnostní spektrometrií. Po fermentaci byly buňky izolovány centrifugací při 5020 g po dobu 30 min při 2 až 8 °C a buněčná pasta byla uchována • 0
0 0
9
0*0
- 21 Λ ··*<· 0 «»* 00
0 0 • · 0 0 0 0 0 0 • 0 0* *0 0000 při -20 °C. Pro další práci byla buněčná pasta rozmražena, suspendována na OD (při 620 nm) 150 v pufru (Na2HPO4, pH7 50 mM, PMSF 5%, isopropanol 4 mM) a buňky byly rozbity čtyřmi průchody homogenizátorem DynoMill (objem 0,6 I, 3000 ot/min, 6 l/hod, průměr kuliček 0,40 - 0,70 mm).
Pro vyhodnocování exprese byly po dobu indukce odebírány vzorky, které byly rozbíjeny a analyzovány SDS-Page nebo westernovým přenosem. Na gelech SDS barvených coomassie modří byl jasně identifikován rekombinantní Tat-his jako intenzivní pruh, který dosahoval maximální intenzity po přibližně 72 až 96 hodinách indukce.
| Rozmražení a zpracování očkovací lahvičky | |
| Předkultivace na pevné půdě 30 °C, 14 až 16 hod | Syntetické médium: YNB + qlukóza + agar |
| i | |
| Předkultivace v kapalném médiu ve dvou 2I Erlenmeyerových baňkách 30 °C, 200 ot/min | Syntetické médium : 2 x 400 ml YNB + |
| glycerol Ukončení při OD >1 (při 620 nm) | |
| i | |
| Zaočkování 20I fermentoru | 5I startovacího média (FSC006AA) 3 ml odpěňovadla SAG471 (firmy Witco) Nastavení: teplota: 30 °C Přetlak: 0,03 MPa Průtok vzduchu: 20 Nl/min Rozpuštěný O2: regulace na >40% pH: regulace na 5 pomocí NH4OH |
| i |
| Vsádková fermentace s přísunem živin: růstová fáze v trváni přibližně 40 hod | Přívod média na bázi glycerolu FFB005AA Konečná OD mezi 200 - 500 OD (620 nm) |
| Vsádková fermentace s přísunem živin: fáze indukce v trvání až do 97 hod | Přívod methanolu a roztoku soli/mikroelementů (FSE021AB) |
| Centrifugace | 5020 g/30 min/2 - 8 °C |
| Izolace buněčné pasty a skladování při -20 °C | |
| Rozmražení buněk a resuspendování na OD 150 (620 nm) v pufru | Pufr: Na2HPO4 pH 7 50 mM, PMSF 5%, isopropanol 4 mM |
| Φ | |
| Rozbití buněk v homogenizátoru Dyno-mill 4 průchody | Dvno-mill: (objem 0,6 I, 3000 ot/min, |
| 6 l/hod, průměr kuliček 0,40 - 0,70 mm) | |
| Přenesení k extrakci/čištěni |
Média použitá pro fermentací
Předkultivace na pevné půdě: (YNB + glukóza + agar)
| Glukóza | 10 g/l | Na2MoO4. 2H2O | 0,0002 g/l | Kyselina listová | 0,000064 g/l |
| KH2PO4 | 1 g/l | MnSO4.H2O | 0,0004 g/l | Inositol | 0,064 g/l |
| MgSO4.7H2O | 0,5 g/l | h3bo3 | 0,0005 g/l | Pyridoxin | 0,008 g/l |
| CaCI2.2H2O | 0,1 g/l | Kl | 0,0001 g/l | Thiamin | 0,008 g/l |
| NaCI | 0,1 g/l | CoCI2.6H2O | 0,00009 g/l | Niacin | 0,000032 g/l |
• ·
| - 23 - | • · · • · • · • · · · · · · | • · · ·· • · · · • · · · • · · · · · · | |||
| FeCI3.6H2O | 0,0002 g/l | Riboflavin | 0,000016 g/l | Panthotenát | 0,008 g/l |
| Ca | |||||
| CuSO4.5H2O | 0,00004 g/l | Bíotin | 0,000064 g/l | Kyselina | 0,000016 g/l |
| para-amino- | |||||
| -benzoová | |||||
| ZnSO4.7H2O | 0,0004 g/l | (NH4)2SO4 | 5 g/l | Agar | 18 g/l |
| Předkultivace na kapalném médiu: (ΎΝΒ | + qlycerol) | ||||
| Glycerol | 2 % | Na2MoO4. | 0,0002 g/l | Kyselina | 0,000064 g/l |
| (obj./obj.) | 2H2O | listová | |||
| KH2PO4 | 1 g/l | MnSO4.H2O | 0,0004 g/l | Inositol | 0,064 g/l |
| MgSO4.7H2O | 0,5 g/l | H3BO3 | 0,0005 g/l | Pyridoxin | 0,008 g/l |
| CaCI2.2H2O | 0,1 g/l | Kl | 0,0001 g/l | Thiamin | 0,008 g/l |
| NaCI | 0,1 g/l | CoCI2.6H2O | 0,00009 g/l | Niacin | 0,000032 g/l |
| FeCI3.6H2O | 0,0002 g/l | Riboflavin | 0,000016 g/l | Panthotenát | 0,008 g/l |
| Ca | |||||
| CuSO4.5H2O | 0,00004 g/l | Biotin | 0,000064 g/l | Kyselina | 0,000016 g/l |
para-aminobenzoová
ZnSO4.7H2O 0,0004 g/l (NH4)2SO4 5 g/l
Startovací médium pro fermentor (FSC006AA)
| (NH4)2SO4 | 6,4 g/l | ||
| kh2po4 | 9 g/l | Na2MoO4.2 H2O | 2,04 mg/l |
| MgSO4.7H2O | 4,7 g/l | MnSO4.H2O | 4,08 mg/l |
| CaCI2.2H2O | 0,94 g/l | H3BO3 | 5,1 g/l |
| FeCI3.6H2O | 10 mg/l | Kl | 1,022 mg/l |
| HCI | 1,67 ml/l | COCI2.6H2O | 0,91 mg/l |
» · · ·
- 24 CuSO4.5H2O 0,408 mg/1
ZnSO4.7H2O: 4,08 mg/1
NaCl 0,06 g/l
Biotin 0,534 g/l
Živný roztok pro růstovou fázi (FFB005AA)
| Glycerol | 38,7% Obj./Obj. | Na2MoO4.2H2O | 5,7 mg/l |
| MgSO4.7H2O | 13 g/l | CuSO4.5H2O | 1,13 mg/l |
| CaCI2.2H2O | 2,6 g/l | CoCI2.6H2O | 2,5 mg/l |
| FeCI3.6H2O | 27,8 mg/l | h3bo3 | 14,2 mg/l |
| ZnSO4.7H2O | 11,3 mg/l | Biotin | 1,5 mg/l |
| MnSO4.H2O | 11,3 mg/l | Kl | 2,84 mg/I |
| KH2PO4 | 24,93 g/l | NaCl | 0,167 g/l |
Živný roztok solí a mikroelementů používaný při indukci (FSE021AB) :
| kh2po4 | 45 g/l | Na2MoO4.2H2O | 10,2 mg/l |
| MgSO4.7H2O | 23,5 g/l | MnSO4.H2O | 20,4 mg/l |
| CaCI2.2H2O | 4,70 g/l | H3BO3 | 25,5 mg/l |
| NaCl | 0,3 g/l | Kl | 5,11 mg/l |
| HCI | 8,3 ml/l | CoCI2.6H2O | 4,55 mg/l |
| CuSO4.5H2O | 2,04 mg/l | FeCI3.6H2O | 50,0 mg/l |
| ZnSO4.7H2O | 20,4 mg/l | Biotin | 2,70 g/l |
Příklad 4
Čištění fúzního proteinu Nef-Tat-His (Pichia pastoris)
Schéma čištění vycházelo ze 146 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 2 I homogenátu Dyno-mill s OD 55. Chromatografické kroky se provádějí při teplotě laboratoře. Mezi
- 25 jednotlivými kroky se frakce pozitivní na Nef-Tat udržují přes noc v chladicím boxu (+4 °C); po delší dobu se vzorky zamrazí při -20 °C.
146 g buněk Pichia pastoris
Homogenizace Pufr: 2 I 50 mM PO4 pH 7,0 finální OD: 50
Rozbití buněk přístrojem Dyno-mill (4 průchody)
Φ
Centrifugace
Φ
Centrifugát z kroku Dyno-mill
Φ
Promytí (1 hod - 4 °C) ;
Centrifugace i
Centrifugát
Φ
Solubilizace (přes noc - 4 °C)
Rotor JA10 /9500 ot/min/ 30 min/ teplota laboratoře
Pufr: +2 I 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 0,5% empigen
Rotor JA10 /9500 ot/min/30 min/ teplota laboratoře
Pufr: + 660 ml 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI - 4,0M GuHCI
Φ
Redukce (4 hod - laboratorní teplota v temnu)
Φ
Karbamidomethylace (1/2 hod - teplota laboratoře v temnu)
Φ
Afinitní chromatografie s imobilizovanými kovovými ionty na materiálu Ni++-NTA-Agarose (Qiagen - 30 ml pryskyřice)
Φ
Ředění
Φ + 0,2M sodná sůl kyseliny 2-merkaptoethansulfonové (přídavek prášku)/pH nastaveno na 7,5 (0,5M roztok NaOH) před inkubací + 0.25M jodacetamid (přídavek prášku)/pH upraveno na 7,5 (0,5M roztok NaOH) před inkubací
Ekvilibrační pufr: 10 mM PO4pH
7,5 150 mM NaCI - 4,0M GuHCI Promývací pufr:
1) Ekvilibrační pufr
2) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina
3) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina 25 mM imidazol
Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina 0,5M imidazol
Až na iontovou sílu 18 mS/cm2 Ředicí pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 6M močovina • · ·«··· ·
| . 27 _ · ......... £ í · · ·«···« ···· ··· ··· ·· ·· ···· | |
| Kationtová iontoměničová | Ekvilibrační pufr: 10 mM PO4 pH |
| chromatografie na materiálu SP Sepharose FF (Pharmacia 30 ml pryskyřice) | 7,5 150 mM NaCl 6,0M močovina Promývací pufr: 1) Ekvilibrační pufr 2) 10 mM PO4 pH 7,5 250 mM NaCl 6M močovina Eluční pufr: 10 mM borát pH 9,0 2M NaCl 6M močovina |
| Ψ | |
| Zakoncentrování | Na koncentraci 5 mg/ml membrána 10 kDa Omega (Filtron) |
| Chromatografie s gelovou filtrací na materiálu Superdex200 XK 16/60 | Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 6M močovina 5 ml vzorku/nástřik-» 5 nástřiků |
| (Pharmacia - 120 ml pryskyřice) | |
| i | |
| Dialýza (přes noc - 4 °C) | Pufr: 10 mM PO4 pH 6,8 150 mM NaCl 0,5M arginin* |
| Φ | |
| Sterilní filtrace | Millex GV 0,22 pm |
* Použitý poměr: 0,5M arginin na koncentraci proteinu 1600 pg/ml.
Čistota
Míra čistoty odhadovaná metodou SDS-PAGE je ukázána na obr. 3 při použití barvení Daiichi Silver Staining a na obr. 4 při použití barvení Coomassie blue G250.
- 28 Po kroku Superdex200: > 95 %
Po krocích dialýzy a sterilní filtrace : > 95%
Izolace mg proteinu Nef-Tat-his se vyčistí ze 146 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (= 2 l homogenátu Dyno-mill OD 55).
Příklad 5
Čištění oxidovaného fúzního proteinu Nef-Tat-His v Pichia pastoris
Schéma čištění vycházelo ze 73 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 1 I homogenátu Dyno-mill OD 50. Chromatografické kroky se provádějí při laboratorní teplotě. Mezi jednotlivými kroky se frakce pozitivní na Nef-Tat udržují přes noc v chladicím boxu (+4 °C); po delší dobu se vzorky uchovávají zamražené při -20 °C.
g buněk Pichia pastoris
Homogenizace Pufr: 1 I 50 mM PO4 pH 7,0
Pefabloc 5 mM konečná OD: 50
Rozbití buněk Dyno-mill (4 průchody)
Centrifugace
Rotor JA10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota
Pufr: +1 I 10 mM PO4 pH 7,5
150 mM NaCl 0,5 % Empigen
| • 4 · | 4 44 | 99 49 |
| 4 4 9 4 | 4*4 · | 4 9 4 |
| 4 4 | • · · | 4 4 4 |
| 9 4 | * · · | 9 4 4 |
| 4944 449 | • · 4 4 9 | 4 4 4444 |
Centrifugát z kroku Dyno-mill Φ
Promytí (2 hod - 4 °C)
Φ
Centrifugace
Φ
Centrifugát ;
Solubilizace (přes noc - 4 °C)
Afinitní chromatografie s imobilizovanými kovovými ionty na materiálu Ni++-NTA-agarose (Qiagen 15 mi pryskyřice)
Rotor JA10 /9500 ot/min /30min/ laboratorní teplota
Pufr: + 330 ml 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 4,0M GuHCI
Ekvilibrační pufr: 10 mM PO4 pH
7,5 150 mM NaCl 4,0M GuHCI Promyvací pufr:
1) Ekvilibrační pufr
2) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 6M močovina
3) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 6M močovina 25 mM imidazol
Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 6M močovina 0,5M imidazol
- 30 Ředění
Kationtová iontoměničová chromatografie na materiálu SP Sepharose FF (Pharmacia 7 ml pryskyřice)
Zakoncentrování
Dialýza (přes noc - 4 °C)
Na iontovou sílu 18 mS/cm2 Ředicí pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 6M močovina
Ekvilibrační pufr: 10mM PO4pH 7,5 150 mM NaCl 6,0M močovina Promývací pufr:
1) Ekvilibrační pufr
2) 10 mM PO4 pH 7,5 250 mM NaCl 6M močovina
Eluční pufr: 10 mM borát pH 9,0 2M NaCl 6M močovina
Na 0,8 mg/ml membrána 10 kDa Omega (Filtron)
Pufr: 10 mM PO4 pH 6,8 150 mM NaCl 0,5M arginin
Millex GV 0,22 pm
Sterilní filtrace
-> Míra čistoty odhadnutá na základě SDS-PAGE je ukázána na obr. 6 (Daiichi Silver Staining, Coomassie blue G250, westernový přenos):
Po krocích dialýzy a sterilní filtrace: > 95 %
-» Izolace (vyhodnocení kolorimetrickým testem na proteiny: DOC TCA
BCA)
- 31 • · · · ·* toto ·· ·· ····« to • ·· ······ · • · ······ ···· ··· ··· ·· ·· ····
2,8 mg oxidovaného proteinu Nef-Tat-his se vyčistí ze 73 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 1 I homogenátu Dyno-mill OD 50.
Příklad 6
Čištění redukovaného proteinu Tat-His (Pichia pastoris)
Schéma čištění vycházelo ze 160 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 2 I homogenátu Dyno-mill OD 66. Chromatografické kroky se provádějí při laboratorní teplotě. Mezi jednotlivými kroky se frakce pozitivní na Tat uchovávají přes noc v chladicím boxu (+4 °C); po delší dobu se vzorky uchovávají zamražené při -20 °C.
160 g buněk Pichia pastoris
Homogenizace
Pufr: +2 I 50 mM PO4 pH 7,0 4 mM PMSF konečná OD: 66
Rozbití buněk Dyno-mill (4 průchody)
T
Centrifugace
T
Centrifugát z kroku Dyno-mill
Rotor JA 10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota
- 32 «« ·· • · · • · · • · · ·· ····
Promytí (1 hod - 4 °C)
Φ
Centrifugace
Centrifugát
Φ
Solubilizace (přes noc - 4 °C)
Φ
Centrifugace
Φ
Redukce (4 hod - laboratorní teplota v temnu)
Φ
Karbamidomethylace (1/2 hod - laboratorní teplota v temnu)
Pufr: +2 I 10 mM PO4 pH 7,5
150 mM NaCl 1% Empigen
Rotor JA10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota
Pufr: + 660 ml 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 4,0M GuHCI
Rotor JA 10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota + 0,2M sodná sůl kyseliny 2-merkaptoethansulfonové (přídavek prášku)/pH nastaveno na 7,5 (1M roztok NaOH) před inkubací + 0,25M jodacetamid (přídavek prášku)/pH nastaveno na 7,5 (1M roztok NaOH) před inkubací
- 33 ft · · · · ·
Afinitní chromatografie s imobilizovanými kovovými ionty na materiálu Ni++-NTA-agarose (Qiagen 60 ml pryskyřice)
Zředění
Φ
Kationtová iontoměničová chromatografie na materiálu SP Sepharose FF (Pharmacia 30 ml pryskyřice)
Φ
Zakoncentrování
Ekvilibrační pufr: 10 mM PO4 pH
7,5 150 mM NaCI 4,0M GuHCI Promývací pufr:
1) Ekvilibrační pufr
2) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina
3) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina 35 mM imidazol
Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina 0,5M imidazol
Na iontovou sílu 12 mS/cm Ředicí pufr: 20 mM borát pH 8,5 6M močovina
Ekvilibrační pufr: 20 mM borát pH
8,5 150 mM NaCI 6,0M močovina Promývací pufr: Ekvilibrační pufr Eluční pufr: 20 mM borát pH 8,5 400 mM NaCI 6,0M močovina
Na 1,5 mg/ml membrána 10 kDa Omega (Filtron)
- 34 Dialýza (přes noc - 4 °C) i
Sterilní filtrace «· *·«♦· · • · · ······ · • · ······ «·«« ··· ··· ·· »« ··*·
Pufr: 10 mM PO4 pH 6,8 150 mM NaCl 0,5M arginin
Millex GV 0,22 pm
-» Míra čistoty odhadnutá metodou SDS-PAGE je ukázána na obr. 7 (Daiichi Siiver Staining, Coomassie blue G250, westernový přenos:
Po krocích dialýzy a sterilní filtrace: > 95%
-> Izolace (vyhodnoceno kolorimetrickým testem na proteiny: DOC TCA BCA) mg redukovaného proteinu Tat-his se vyčistí ze 160 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 2 I homogenátu Dyno-mill OD 66.
Příklad 7
Čištění oxidovaného proteinu Tat-His (Pichia pastoris)
Schéma čištění vycházelo ze 74 g rekombinančních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 1 I homogenátu Dyno-mill OD60. Chromatografické kroky se provádějí při laboratorní teplotě. Mezi jednotlivými kroky se frakce pozitivní na Tat udržují přes noc v chladicím boxu (+4 °C); po delší dobu se vzorky uchovávají zamražené při -20 °C.
g buněk Pichia pastoris
Φ
Homogenizace Pufr: +1 I 50 mM PO4 pH 7,0 5 mM
Pefabloc konečná OD: 60 • ♦· ·· ·· ·· · · · · · • · « · · ·
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
999 99 99 9*99
- 35 Rotor JA10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota
Rozbití buněk na přístroji Dynomill (4 průchody)
Centrifugace ;
Centrifugát z kroku Dyno-mill Φ
Promytí (1 hod - 4 °C)
Φ
Centrifugace
Φ
Centrifugát
Solubilizace (přes noc - 4 °C)
Φ
Centrifugace
Φ
Afinitní chromatografie s imobilizovanými kovovými ionty na materiálu Ni++-NTA-agarose (Qiagen 30 ml pryskyřice)
Pufr: +1 I 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 1% Empigen
Rotor JA 10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota
Pufr: + 330 ml 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 4,0M GuHCI
Rotor JA10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota
Ekvilibrační pufr: 10 mM PO4 pH
7,5 150 mM NaCI 4,0M GuHCI Promyvací pufr:
1) Ekvilibrační pufr • 9
- 36 9 99 9 *9 99 ·<
• 9 9 9 * 9 9
9 9 9 9 9 • · 9 9 9 · · · · 9 9 9
999 9» ·· 9999
Ředění
Kationtová iontoměničová chromatografíe na materiálu SP Sepharose FF (Pharmacia 15 ml pryskyřice)
2) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 6M močovina
3) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 6M močovina 35 mM imidazol
Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl 6M močovina 0,5M imidazol
Na iontovou sílu 12 mS/cm Ředicí pufr: 20 mM borát pH 8,5 6M močovina
Ekvilibrační pufr: 20 mM borát pH
8,5 150 mM NaCl 6,0M močovina Promyvací pufr:
1) Ekvilibrační pufr
2) 20 mM borát pH 8,5 400 mM NaCl 6,0M močovina
Eluční pufr: 20 mM piperazin pH 11,0 2M NaCl 6M močovina
Zakoncentrování
Φ
Dialýza (přes noc - 4 °C) Φ
Sterilní filtrace na 1,5 mg/ml membrána 10 kDa Omega (Filtron)
Pufr: 10 mM PO4 pH 6,8 150 mM NaCl 0,5M arginin
Millex GV 0,22 pm ft ftlft ftft *>
ftft 9 9 9 9 9
9 9 9 9 * • ft · ♦ · · * ftftft ftftft ftftft ftft <« 9999
- 37 1» 9
9 99 • · • 9 · • · ···· ftftft
-> Míra čistoty odhadnutá na základě SDS-PAGE je ukázána na obr. 8 (Daiichi Silver Staining Coomassie blue G250, westernový přenos):
Po krocích dialýzy a sterilní filtrace: > 95 %
-» Izolace (vyhodnocení kolorimetrickým testem na proteiny: DOC TCA BCA) mg oxidovaného proteinu Tat-His se vyčistí ze 74 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 1 I homogenátu Dyno-mill OD 60.
Příklad 8
Čištění redukovaného proteinu SIV Nef-His (Pichia pastoris)
Schéma čištění vycházelo ze 340 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 4 I homogenátu Dyno-mill OD 100. Chromatografické kroky se provádějí při laboratorní teplotě. Mezi jednotlivými kroky se frakce pozitivní na Nef udržují přes noc v chladicím boxu (+4 °C); po delší dobu se vzorky uchovávají zamražené při -20 °C.
340 g buněk Pichia pastoris Φ
Homogenizace Pufr: 4 I 50 mM PO4 pH 7,0 PMSF mM konečná OD: 100
Φ
Rozbití buněk na přístroji Dynomill (4 průchody)
Centrifugace
Rotor JA10 /9500 ot/min/60 min/ laboratorní teplota
Φ
Centrifugát z kroku Dyno-mill ;
Solubilizace (přes noc - 4 °C)
Φ
Centrifugace
Φ
Redukce (4 hod - laboratorní teplota v temnu)
Karbamidomethylace (1/2 hod - laboratorní teplota v temnu)
Afinitní chromatografie s imobilizovanými kovovými ionty na materiálu Ni++-NTA-agarose (Qiagen 40 ml pryskyřice)
Pufr: + 2,6 I 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 4,0M GuHCI
Rotor JA10 /9500 ot/min/30 min/ laboratorní teplota + 0,2M sodná sůl kyseliny 2-merkaptoethansulfonové (přídavek prášku )/pH nastaveno na 7,5 (1M roztok NaOH) před inkubací + 0,25M jodacetamid (přídavek prášku)/pH upraveno na 7,5 (1M roztok NaOH) před inkubací
Ekvilibrační pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 4,0M GuHCI Promývací pufr:
1) Ekvilibrační pufr
2) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina 25 mM imidazol
Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina
Φ
Zakoncentrování
Φ
0,5Μ imidazol
Na 3 mg/ml membrána 10 kDa Omega (Filtron)
Chromatografie s gelovou filtrací na materiálu Superdex 200 (Pharmacia 120 ml pryskyřice)
Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina
Zakoncentrování
Dialýza (přes noc - 4 °C)
Φ
Na 1,5 mg/ml membrána 10 kDa Omega (Filtron)
Pufr: 10 mM PO4 pH 6,8 150 mM NaCI Empigen 0,3 %
Sterilní filtrace
Millex GV 0,22 pm
-> Míra čistoty odhadnutá na základě SDS-PAGE ukázaná na obr. 9 (Daiichi Silver Staining, Coomassie blue G250, westernový přenos):
Po krocích dialýzy a sterilní filtrace: > 95 %
-» Izolace (vyhodnoceno kolorimetrickým testem na proteiny: DOC TCA BCA).
mg SIV redukovaného proteinu Nef-his se vyčistí ze 340 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 4 I homogenátu Dyno-mill OD 100.
-40 • · · fc · · fcfcfcfc
• fcfcfc fcfcfc fcfcfc fcfc ·· fcfcfcfc
Příklad 9
Čištění HIV redukovaného proteinu Nef-His (Pichia pastoris)
Schéma čištění vycházelo ze 160 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 3 I homogenátu Dyno-mill OD 50. Chromatografické kroky se provádějí při laboratorní teplotě. Mezi jednotlivými kroky se frakce pozitivní na Nef udržují přes noc v chladicím boxu (+4 °C); po delší dobu se vzorky uchovávají zamražené při -20 °C.
160 g buněk Pichia pastoris i
Homogenizace
Φ
Rozbití buněk na přístroji Dynomill (4 průchody)
Pufr: 3 I 50 mM PO4 pH 7,0 Pefabloc 5 mM konečná OD: 50
Zamražení/Roztátí
Centrifugace Rotor JA10 /9500 ot/min/60 min/ laboratorní teplota
Centrifugát z kroku Dyno-mill
Solubilizace (přes noc - 4 °C)
Pufr: + 1110 mM PO4 pH 7,5 150mM NaCI 4,0M GuHCI
Centrifugace
Φ
Redukce (3 hod - laboratorní teplota v temnu)
Φ
Karbamidomethylace (1/2 hod -laboratorní teplota v temnu)
Φ
Afinitní chromatografie s imobilizovanými kovovými ionty na materiálu Ni++-NTA-agarose (Qiagen 10 ml pryskyřice)
Rotor JA10 /9500 ot/min/60 min/ laboratorní teplota + 0,1 M sodná sůl kyseliny 2-merkaptoethansulfonové (přídavek prášku)/pH nastaveno na 7,5 (1M roztok NaOH) před inkubací +0,15 M jodacetamid (přídavek prášku)/pH nastaveno na 7,5 (1M roztok NaOH) před inkubací
Ekvilibrační pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 4,0M GuHCI Promývací pufr:
1) Ekvilibrační pufr
2) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina
3) 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina 25 mM imidazol
Eluční pufr: 10 mM citrát pH 6,0 150 mM NaCI 6M močovina 0,5M imidazol
Zakoncentrování
Na 3 mg/ml membrána 10 kDa Omega (Filtron)
-42 Chromatografie s gelovou filtrací na materiálu Superdex 200 (Pharmacia 120 ml pryskyřice)
Eluční pufr: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCI 6M močovina
Dialýza (přes noc - 4 °C)
Pufr: 10 mM PO4 pH 6,8 150 mM NaCI 0,5M arginin
Sterilní filtrace
Millex GV 0,22 pm
-> Míra čistoty odhadnutá metodou SDS-PAGE je ukázána na obr. 10 (Daiichi Silver Staining, Coomassie blue G250, westernový přenos):
Po krocích dialýzy a sterilní filtrace: > 95%
-> Izolace (vyhodnoceno kolorimetrickým testem na proteiny: DOC TCA BCA).
mg HIV redukovaného proteinu Nef-his se vyčistí ze 160 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (mokrá hmotnost) nebo 3 I homogenátu Dyno-mill OD 50.
Příklad 10
Exprese SIV sekvence nef v buňkách Pichia pastoris
Aaby bylo možno vyhodnotit účinky antigenů Nef a Tat v modelu testovacího podání patogenního viru SHIV, autoři vynálezu exprimovali protein Nef viru opičího imunodeficitu (SIV) makaků, SIVmac239 (Aids Research and Human Retroviruses, 6: 1221 - 1231, 1990). V kódující oblasti Nef má SIV mac 239 stopkodon ve čtecím rámci po 92 aminokyselinách, což ukazuje na tvorbu zkráceného produktu o velikosti pouze 10 kD. Zbytek čtecího rámce Nef je otevřený
- 43 a předpokládalo by se, že ve své úplně otevřené formě kóduje protein o délce 263 aminokyselin (30 kD).
Výchozím materiálem autorů vynálezu pro gen nef SIVmac239 byl fragment DNA odpovídající úplné kódující sekvenci klonované do plasmidů LX5N (získaný od Dr. R. C. Desrosierse, Southborough, MA, USA).
Gen SIV nef je mutován na předčasném stopkodonu (nukleotid G v poloze 9353 nahrazuje původní nukleotid T), aby bylo možno dosáhnout exprese proteinu Nef SIVmac239 s úplnou délkou.
Pro expresi genu nef SIV v buňkách Pichia pastorís byl použit vektor PHIL-D2-MOD (dříve použitý pro expresi sekvencí nef a tat HIV1. Rekombinantní protein je exprimován pod řízením indukovatelného promotoru alkoholoxidázy (AOX1) a C-konec proteinu je prodloužen o histidinové zakončení umožňující čištění afinitní metodou.
10.1 Konstrukce integrativního vektoru pRIT 14908
Pro konstrukci vektoru pRIT 14908 byl amplifikován gen nef SIV metodou PCR z plasmidů pLX5N/SIV-NEF s použitím primerů SNEF1 a SNEF2.
PRIMER SNEF1: 5’ATCGTCCATG.GGTGGAGCTATTTT 3’
Ncol
PRIMER SNEF2: 5’CGGCTACTAGTGCGAGTTTCCTT 3’
Spěl
Amplifikovaná oblast SIV DNA nef začíná na nukleotidu 9077 a končí na nukleotidu 9865 (Aids Research and Human Retroviruses, 6: 1221 - 1231, 1990).
Restrikční místo Ncol (které nese kodon ATG genu nef) bylo zavedeno na 5’-konec fragmentu PCR, zatímco místo Spěl bylo zavedeno na 3’-konec. Získaný fragment PCR a integrativní vektor
PHIL-D2-M0D byly oba štěpeny Ncol a Spěl. Protože v amplifikované sekvenci SIV nef je přítomné pouze jedno restrikční místo Ncol (v poloze 9286), byly získány dva fragmenty o délce ±200 bp a ±600 bp, které byly čištěny na agarózovém gelu a ligovány do vektoru PHILD2-MOD. Získaný rekombínantní plasmid dostal po ověření amplifikované oblasti nef automatizovaným sekvenováním označení pRIT 14908.
10.2 Transformace kmene Pichia pastoris GS115 (his4)
Pro získání kmene Pichia pastoris exprimujícího SIV neZ-His, byl kmen GS115 transformován lineárním fragmentem Notl nesoucím pouze expresní kazetu a gen HIS4 (obr. 11).
Tento lineární fragment DNA Notl s homologními oblastmi s genem AOX1 P. pastoris na obou koncích zvýhodňuje rekombinaci v místě AOX1.
Metodou kvantitativní tečkovací analýzy byly vybrány klony integrantů s větším počtem kopií. Jeden transformant s nejlepší hladinou produkce rekombinantního proteinu byl vybrán a označen
Y1772.
Kmen Y1772 produkuje rekombínantní protein SIV Nef-His, tedy protein o délce 272 aminokyselin, který je složený z:
0 kyseliny myristové 0 methioninu vytvořeného použitím klonovacího místa Ncol vektoru PHIL-D2-MOD 0 262 aminokyselin (aa) proteinu Nef (počínaje aminokyselinou 2 a konče aminokyselinou 263, viz obr.12) 0 threoninu a šeřinu vytvořených klonovacím postupem (klonování místa Spěl vektoru PHIL-D2-MOD (obr. 11) • « ·
- 45 • * · 9 9 9 ··· ·· ·» ···· ° jednoho glycinu a šesti histidinů.
Nukleotidové a proteinové sekvence jsou ukázány na obr. 12.
10.3 Charakterizace exprimovaného produktu kmene Y1772
Míra exprese
Po 16 hodinách indukce v médiu obsahujícím 1% methanol jako zdroj uhlíku byl nadbytek rekombinantního proteinu Nef-His odhadován na 10 % z celkového proteinu (obr. 13, dráhy 3 - 4). Rozpustnost
Indukované kultury rekombinantního kmene Y1772 produkující protein Nef-His byly centrifugovány. Centrifugáty buněk byly resuspendovány v rozbíjecím pufru, rozbity 0,5 mm skleněnými kuličkami a buněčné extrakty byly zcentrifugovány. Proteiny obsažené v nerozpustném centrifugátu (P) a v rozpustném supernatantu (S) byly porovnávány metodou SDS-PAGE s použitím 10% gelu a s barvením Coomassie Blue.
Jak je ukázáno na obr. 13, většina rekombinantního proteinu z kmene Y1772 (dráhy 3 - 4) je asociována s nerozpustnou frakcí.
Kmen Y1772, který vykazuje uspokojivou míru exprese rekombinantního proteinu, se použije pro produkci a čištění proteinu SIV Nef-His.
Příklad 11
Exprese gp120 v buňkách CHO
Byla vytvořena stabilní buněčná linie CHO-K1, která produkuje rekombinantní glykoprotein gp120. Rekombinantní glykoprotein gp120 je rekombinantní zkrácená forma obalového proteinu gp120 izolátu * ·· • 9 · ·
W61D HIV-1. Protein je vylučován do kultivačního média buněk, ze kterého se potom čistí.
Konstrukce gp120-transfekčního plasmidu pRIT 13968
Byla získána sekvence DNA kódující obal (včetně 5’exonu tat a rev) HIV-1 izolátu W61D (Dr. Tersmette, CCB, Amsterdam) jako genomový plasmid obsahující obalový protein gp160 W61D (NcoXhol). Tento plasmid byl označen pRIT13965.
Pro konstrukci expresní kazety gp120 musel být vložen stopkodon v místě kodonu aminokyseliny glu 515 kódující sekvence gp160 v plasmidu pRIT13965 s použitím primerové oligonukleotidové sekvence (DIR 131) a technologie PCR. Primerová sekvence DIR 131 obsahuje tři stopkodony (ve všech otevřených čtecích rámcích) a restrikční místo Sall.
Úplná obalová sekvence gp120 byla potom rekonstituována z Nkoncového fragmentu BamHl-Dral (170 bp) plasmidového subklonu gp160 pW61d env (pRIT13966) odvozeného z pRIT13965, a fragmentu Dral-Sall (510 bp) vytvořeného metodou PCR z pRIT13965. Oba fragmenty byly vyčištěny na gelu a společně ligovány do plasmidu E. coli pUC 18, vyříznuty nejprve Sall a potom BamHI. Tak byl získán plasmid pRIT13967. Byla sekvenována genová sekvence fragmentu Xmal-Sall (1580 bp) obsahující kódující kazetu gp120 a bylo zjištěno, že je identická s předpovězenou sekvencí. Plasmid RIT13967 byl ligován do CHO GS expresního vektoru pEE14 (Celltech Ltd., UK) štěpením nejprve Bell a potom Xmal.Získaný plasmid byl označen pRIT13968.
Příprava hlavní banky buněk
Konstrukt gp120 (pRIT13968) byl transfekován do buněk CHO klasickým postupem srážení CaPO4/glycerolový šok. O dva dny později byly buňky CHOK1 vystaveny selektivnímu růstovému médiu (GMEM + methioninsulfoximin (MSX) 25 μΜ + glutamát + asparagin + • · · · *· ·* ····
10% fetální telecí sérum). Tři vybrané transfekované klony byly dále pomnoženy v baňkách 175 cm2 a několik zásobních lahviček s buňkami bylo uloženo při -80 °C. Pro další množení byl zvolen C-env 23,9.
Byla připravena malá předběžná banka buněk a bylo zamraženo 20 ampulí. Pro přípravu této předběžné banky a hlavní banky buněk byly buňky pěstovány v kultivačním médiu GMEM doplněném 7,5 % fetálního telecího séra a obsahujícím 50 μΜ MSX. Tyto buněčné kultury byly testovány na sterilitu a přítomnost mykoplasmat a bylo zjištěno, že jsou negativní.
Hlavní banka buněk CHOK1 env 23,9 (pasáž 12) byla připravena z buněk odvozených z předběžné banky buněk. Dvě ampule očkovací kultury z předběžné banky buněk byly zaočkovány do média doplněného 7,5 % dialyzovaného fetálního bovinního séra. Buňky byly rozděleny do čtyř kultivačních lahví a kultivovány při 37 °C. Po přichycení buněk bylo kultivační médium vyměněno za čerstvé médium doplněné 50 pM MSX. Při dosažení konfluence byly buňky izolovány trypsinizací a subkultivovány s dělicím poměrem 1/8 v jednotkách Tflasks-roller bottle-cell factory units. Buňky byly z každé jednotky odděleny trypsinizací a centrifugací. Zcentrifugované buňky byly resuspendovány v kultivačním médiu doplněném DMSO jako kryogenní ochrannou látkou. Ampule byly předem označeny, autoklávovány a uzavřeny teplem (250 ampulí). Potom byly testovány na těsnost a uchovány přes noc při -70 °C před uložením do kapalného dusíku.
Buněčná kultura a produkce buněk
Dvě ampule z hlavní banky buněk byly rychle rozmraženy. Buňky byly spojeny a zaočkovány do dvou T-lahví při teplotě 37 ±1 °C do vhodného kultivačního média doplněného 7,5 % dialyzovaného fetálního bovinního séra (FBS). Při dosažení konfluence (13 pasáží) • · ·♦··»· ···· ··· ··» *· ·* ···« byly buňky odděleny trypsinizací, spojeny a pomnoženy v deseti Tlahvích jako výše. Konfluentní buňky (pasáž 14) byly trypsinizovány a pomnoženy sériově ve dvou jednotkách cell factory units (po 6000 cm2; 15 pasáží), potom v deseti jednotkách cell factory units (16 pasáží). Růstové kultivační médium je doplněno 7,5 % dialyzovaného fetálního bovinního séra (FBS) a 1 % MSX. Při dosažení konfluence buněk se růstové médium odlije a nahradí „produkčním médiem“ obsahujícím pouze 1 % dialyzovaného fetálního bovinního séra a žádné MSX. Supernatant se odebírá každé dva dny (48 hod interval) po dobu 32 dnů. Sklizené kultivační kapaliny se ihned přefiltrují přes
1,2 až 0,22 pm filtr a udržují se před čištěním při teplotě -20 °C.
Příklad 12
Čištění HIV GP 120 (W61D CHO) z kultivační kapaliny z buněk
Všechny kroky čištění se provádějí v chladicím boxu při teplotě 2 až 8 °C. pH pufrů se upravuje při této teplotě a roztoky se filtrují přes filtr 0,2 pm. Provádí se test na obsah pyrogenních látek (test LAL). Optická densita se měří při 280 nm a trvale se monitoruje pH a vodivost eluátů z kolony.
(i) Vyčiřená kultivační kapalina
Vyčiřená kultivační kapalina z buněk (CCF) se sterilizuje filtrací a přidá se pufr Tris, pH 8,0) na konečnou koncentraci 30 mM. CCF se uchovává v zamraženém stavu při -20 °C až do čištění.
(ii) Chromatografie s hydrofobními interakcemi
Po roztáni se k vyčiřené kultivační kapalině přidá síran amonný na koncentraci 1M. Roztok se přes noc převede přes kolonu TSK/TOYOPEARL-BUTYL 650 M (TOSOHAAS), ekvilibrovanou v 30 mM pufru Tris pH 8,0 - 1M síran amonný. Za těchto podmínek se antigen váže na gelovou matrici. Kolona se promyje postupným klesajícím gradientem síranu amonného. Antigen se eluuje za podmínek 30 mM pufr Tris - pH 8,0 - 0,25M síran amonný.
(iii) Aniontová iontoměničová chromatografie
Po snížení vodivosti roztoku na hodnotu 5 až 6 mS/cm se spojené frakce obsahující gp120 nanesou na kolonu Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia), ekvilibrovanou fyziologickým pufrem - Tris - pH 8,0. Kolona se provozuje v negativním modu, tj. gp120 se na gel neváže, zatímco většina nečistot se zachytí.
(iv) Zakoncentrování a diafiltrace ultrafiltrací
Aby se zvýšila koncentrace proteinu, spojené frakce obsahující gp120 se nanesou na membránu FILTRON („Omega Screen Channel“), s prahovou hodnotou 50 kDa. Když je zakoncentrování u konce, pufr se diafiltrací vymění za 5 mM fosfátový pufr obsahující CaCI2 0,3 mM, pH 7,0. Jestliže se další zpracování neprovádí ihned, zásobní gp120 se uchovává zamražený při -20 °C.Po roztátí se roztok filtruje na membráně 0,2 pm pro odstranění nerozpustného materiálu.
(v) Chromatografie na hydroxyapatitu
Roztok gp120 po ultrafiltrací se nanese na kolonu macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite, typ II (Biorad) ekvilibrovanou 5mM fosfátovým pufrem + CaCI2 0,3 mM, pH 7,0.Kolona se promyje stejným pufrem. Antigen přes kolonu projde a nečistoty se navážou.
(vi) Kationtová iontoměničová chromatografie
Zásobní roztok gp120 se nanese na kolonu CM/TOYOPEARL650 S (TOSOHAAS) ekvilibrovanou v acetátovém pufru 20 mM, pH 5,0.Kolona se promyje stejným pufrem, potom 20 mM acetátem, pH 5,0 a NaCl 10 mM. Antigen se potom eluuje stejným pufrem obsahujícím 80 mM NaCl.
- 50 (vii) Ultrafiltrace
Aby se zesílila schopnost čisticího procesu odstranit virus, provede se další krok ultrafiltrace. Roztok gp120 se ultrafiltruje na membráně FILTRON „Omega Screen Channel, prahová molekulová hmotnost 150 kDa. Membrána s touto velikostí pórů nezachytí antigen. Po ukončení se zředěný antigen zakoncentruje na membráně stejného typu (Filtron), ale s prahovou hodnotou 50 kDa.
(viii) Gelová chromatografie size exclusion
Roztok gp120 se nanese na kolonu SUPERDEX 200 (PHARMACIA) s cílem vyměnit pufr a odstranit zbytkové kontaminující látky. Kolona se eluuje fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS).
(ix) Sterilní filtrace a uchovávání
Frakce se sterilizují filtrací na 0,2 pm membráně PVDF (Millipore).Po sterilní filtraci se vyčištěná látka uchová zamražená při -20 °C až do použití. Schéma čištěni je shrnuto v následující části.
=> Čistota vyčištěného roztoku odhadnutá analýzou SDS-PAGE (barvení stříbrem/Coomassie Blue/westernový přenos) > 95%.
=> Výtěžek je přibližně 2,5 mg/l CCF (koncentrace zjištěna Lowryho metodou) - celkový výtěžek purifikace je přibližně 25% (zjištěno testem Elisa).
=> Vyčištěný materiál je stabilní 1 týden při 37 °C (na základě analýzy westernovým přenosem).
Čištění gp120 z kultivační kapaliny
Značka V označuje kroky, které jsou kritické pro odstranění viru.
Vyčiřená kultivační kapalina Φ
Chromatografie s hydrofobní interakcí (BUTYL-TOYOPEARL 650 M)
Φ
Aniontová iontoměničová chromatografie Ί (negativní mod) (Q-SEPHAROSE)
Φ
Ultrafiltrace 50 kD (zakoncentrování a výměna pufru)
Φ (Skladování -20 °C)
Φ
Chromatografie na hydroxyapatitu (negativní mod) (MACROPREP CERAMIC HYDROXYAPATIT II)
Φ
Kationtová iontoměničová chromatografie (CM-TOYOPEARL 650 S)
Φ
Ultrafiltrace 150 kD Ί (OMEGA MEMBRANES/FILTRON)
Φ
Ultrafiltrace 50 kD (zakoncentrování) ··
- 52 • · 9
9· ·9 9 9
Φ
Chromatografíe size exclusion λ/ (SUPERDEX 200) sterilní filtrace
Φ
Vyčištěný zásobní roztok skladování -20 °C
Příklad 13
Příprava vakciny
Vakcina připravená podle vynálezu obsahuje expresní produkty jedné nebo více rekombinantních DNA kódujících antigen. Formulace dále obsahuje směs 3 de-O-acylovaného monofosforyllipidu A 3D-MPL a QS21 v emulzi typu olej ve vodě nebo oligonukleotid obsahující nemethylované dinukleotidové motivy CpG a hydroxid hlinitý jako nosič.
3D-MPL
Je chemicky detoxifikovaná forma lipopolysacharidu (LPS) gramnegativní bakterie Salmonella minnesota.
Experimenty prováděné firmou SmithKline Beecham Biologicals ukázaly, že 3D-MPL v kombinaci s různými vehikuly silně zvyšuje jak humorální imunitu, tak i buněčnou imunitu typu Tm.
QS21
Je saponin vyčištěný ze surového extraktu kůry strojů Quillaja Saponaria Molina, který má silnou adjuvantní účinnost; indukuje jak lymfoproliferaci specifickou pro antigen, tak i odpovědi CTL vůči několika antigenům.
• fl • flfl • · · *· flfl fl···
Experimenty prováděné firmou SmithKline Beecham Biologicals ukázaly jasný synergický účinek kombinací 3D-MPL a QS21 při indukci jak humorální odpovědi, tak i buněčné odpovědi typu Tm.
Emulze typu olej ve vodě
Je složena z dvou olejů (tokoferol a skvalen) a pufru PBS obsahujícího Tween 80 jako emulgátor. Emulze obsahuje 5 % skvalenu, 5 % tokoferolu, 2 % Tweenu 80, a má průměrnou velikost částic 180 nm (viz WO 95/17210).
Experimenty prováděné firmou SmithKline Beecham Biologicals ukázaly, že přídavek této emulze typu olej ve vodě k 3D-MPL/QS21 dále zvyšuje jejich imunostimulační vlastnosti.
Příprava emulze typu olej ve vodě (dvojnásobný koncentrát)
Tween 80 se rozpustí ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS) za získání 2% roztoku v PBS. Pro získání 100 ml emulze koncentrátu s dvojnásobnou koncentrací se důkladně míchá 5 g DL alfa-tokoferolu a 5 ml skvalenu. Přidá se 90 ml roztoku PBS/Tween a směs se opět důkladně míchá. Získaná emulze se potom protlačí stříkačkou a provede se konečná mikrofluidizace použitím přístroje M110S Microfluidics machine. Získané olejové kapičky mají velikost přibližně 180 nm.
Příprava prostředku obsahujícího emulzi typu olej ve vodě
Antigeny (100 pg gp120, 20 pg NefTat a 20 pg SIV Nef, samostatně nebo v kombinaci) byly zředěny v desetinásobné koncentraci PBS pH 6,8 a H2O před přídavkem emulze typu olej ve vodě, 3D-MPL (50 pg), QS21 (50 pg) a 1 pg/ml thiomersalu jako ochranné látky v intervalu 5 min. Objem emulze je roven 50 % celkového objemu (250 pl na dávku 500 pl).
Všechny inkubace se provádějí při laboratorní teplotě za míchání.
• ·* φφφφ • · · · φ · φ • · · φ · · • ♦ · · · · φφφ φφ φφ φφφφ
Oligonukleotid CpG (CpG) je syntetický nemethylovaný oligonukleotid obsahující jeden nebo několik sekvenčních motivů CpG. CpG je velmi silný induktor imunity typu Tm ve srovnání s formulací typu olej ve vodě, která indukuje hlavně smíšenou odpověď THi/Th2· CpG indukuje nižší hladinu protilátek než formulace typu olej ve vodě a dobrou imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami. Očekává se, že CpG bude indukovat nižší lokální reaktogenicitu.
Příprava roztoku oligonukleotidu CpG: suchý prášek CpG se rozpustí v H2O na roztok s koncentrací 5 mg/ml CpG.
Příprava formulace CpG
Proti NaCl 150 mM byly dialyzovány tři antigeny pro odstranění fosfátových iontů, které inhibují adsorpci gp120 na hydroxid hlinitý.
Antigeny zředěné v H2O (100 pg gp120, 20 pg NefTat a 20 pg SIV Nef) byly inkubovány s roztokem CpG (500 pg CpG) po dobu 30 min před adsorpci na AI(OH)3, aby došlo přednostně k možné interakci mezi histidinovým zakončením antigenů NefTat a Nef a oligonukleotidem (byl popsán silnější imunostimulační účinek CpG, jestliže byl navázán na antigen, ve srovnání s volným CpG). Potom byly postupně v intervalu 5 min přidány AI(OH)3 (500 pg),desetinásobně koncentrovaný NaCl a 1 pg/ml thiomersalu jako ochranné látky.
Všechny inkubace se prováděly v laboratorní teplotě za míchání.
Příklad 14
Imunizace a experiment s testovacím podáním SHIV na opicích rhesus
První studie
Skupiny čtyř opic rhesus byly intramuskulárně imunizovány v čase 0, 1 a 3 měsíce následujícími vakcinami:
Skupina 1: Adjuvans 2 + gp120 +NefTat +NefTat* +Nefrat +Nef Tat fc* 99 99
9 9 9 9
9 9 9 *
9 9 9 9 9
9 9 9 9
9 9 9 999 9
Skupina2: Skupina 3 Skupina 4 Skupina 5 Skupina 6
Adjuvans 2 Adjuvans 2 Adjuvans 6 Adjuvans 2 Adjuvans 2 + gp120 + gp120 +SIV Nef +SIV Nef +SIV Nef +SIV Nef
Adjuvans 2 obsahuje skvalen/tokoferol/Tween a adjuvans 6 obsahuje hydroxid hlinitý a CpG.
80/3D-MPL/QS21
Tat* je mutovaný Tat, kde jsou provedeny mutace Lys41-»Ala a v motivu RGD Arg78-^-Lys a Asp80-»Glu (Virology 235: 48 - 64, 1997).
Měsíc po poslední imunizaci byl všem zvířatům podán patogenní SHIV (kmen 89.6p). Počínaje týdnem podání (týden 16) byly periodicky v určitých časových intervalech odebírány vzorky krve pro stanovení procenta CD4-pozitivních buněk mezi mononukleárními buňkami periferní krve analýzou FACS (obr. 14) a koncentrace RNA virových genomů v plasmě testem bDNA (obr. 15).
Výsledky
Všechna zvířata byla po podání SHIV89.6P infikována.
Procento CD4-pozitivních buněk klesá po testovacím podání u všech zvířat ve skupinách 1, 3, 5 a 6 kromě jednoho zvířete v každé ze skupin 1 a 6 (kontrolní skupina). U všech zvířat ve skupině 2 dochází k mírnému poklesu CD4-pozitivních buněk a v průběhu času k návratu na výchozí úroveň. Podobný trend se pozoruje u zvířat ve skupině 4 (obr. 14).
Množství přítomného viru (virus load) je téměř inverzní funkcí údajů CD4. Množství viru klesá pod hladinu detekce u 3/4 zvířat ze skupiny 2 (a u jednoho kontrolního zvířete, které si udržuje CD4pozitivní buňky), a čtvrté zvíře má pouze okrajové množství viru. Většina dalších zvířat si udržuje vysoké nebo střední množství viru (obr. 15).
- 56 Překvapivě byly titry protilátek anti-Tat a anti-Nef měřené metodou ELISA 2 až 3 x vyšší ve skupině 3 (s mutovaným Tat) než ve skupině 5 (ekvivalentní skupina s nemutovaným Tat) v celém průběhu studie.
V týdnu 68 (56 týdnů po testovacím podání) byla všechna zvířata ze skupin, která dostala úplnou kombinaci antigenů (skupiny 2 a 4) stále naživu, zatímco většina zvířat ve druhé skupině musela být usmrcena pro příznaky spojené s AIDS. Počet zvířat, která přežila v jednotlivých skupinách byl následující:
| skupina 1: | 2/4 |
| skupina 2: | 4/4 |
| skupina 3: | 0/4 |
| skupina 4: | 4/4 |
| skupina 5: | 0/4 |
| skupina 6: | 1/4 |
Závěry
Kombinace gp120 a NefTat (v přítomnosti SIV Nef) zabraňuje úbytku CD4-pozitivních buněk, snižuje množství viru u zvířat infikovaných patogenním SHIVsg.ep a zpožďuje nebo zabraňuje vyvinutí příznaků onemocnění podobných AIDS, zatímco gp120 nebo NefTat/SIV Nef samostatně nechrání před patologickými důsledky testovacího podání SHIV. Adjuvans 2, což je emulze typu olej ve vodě obsahující skvalen, tokoferol a Tween 80 společně s 3D-MPL a QS21, má pravděpodobně silnější vliv na výsledky studie než adjuvans hydroxid hlinitý/CpG.
Druhá studie
Byla potvrzena druhá studie testovacího podání SHIV opicím rhesus pro potvrzení účinnosti výhodné vybrané vakciny gp120/NefTat
+ adjuvans a pro porovnání různých antigenů na bázi Tat. Tato studie byla prováděna v jiné laboratoři.
Uspořádání této studie bylo následující.
Skupiny šesti opic rhesus byly imunizovány v týdnech 0, 4 a 12 i.m. injekcemi a v týdnu 16 jim byla podána dávka patogenního SHIV89 6p.
Skupina 1 je opakováním skupiny 2 z první studie.
| Skupina 1: | Adjuvans 2 | +gp120 | +NefTat +SIVNef |
| Skupina 2: | Adjuvans 2 | +gp120 | +Tat (oxidovaný) |
| Skupina 3: | Adjuvans 2 | +gp120 | +Tat (redukovaný) |
| Skupina 4: | Adjuvans 2 | ||
| Sledované | konečné hodnoty | při testu | byly opět procenta CD4- |
pozitivních buněk, množství viru zjištěné RT-PCR, příznaky nemoci a úmrtnost.
Výsledky
Všechna zvířata kromě jednoho ve skupině 2 byla po testovacím podání SHIV89.6p infikována.
Procento CD4-pozitivních buněk významně klesá po testovacím podání u všech zvířat kontrolní skupiny 4 a skupiny 3, a u všech zvířat kromě jednoho ze skupiny 2. Pouze jedno zvíře ve skupině 1 má významný pokles CD4-pozitivních buněk. Na rozdíl od zvířat z první studie dochází u opic ve druhém experimentu ke stabilizaci hladiny CD4-pozitivních buněk jeden měsíc po testovacím podání viru na jiných úrovních (obr. 16). Stabilizace je obecně nižší než počáteční procento CD4-pozitivních buněk, ale nevede nikdy k úplné ztrátě těchto buněk. To může být ukazatelem nižší vnímavosti k onemocnění indukovanému SHIV v populaci opic použité pro druhou studii. Prospěšný účinek vakciny gp120/NefTat/SIV Nef a dvou vakcin gp120/Tat je nicméně prokazatelný. Počet zvířat s procentam CD4• 0 «0 • 0 0 0
0 0 0
0 0 0 0 • 0 0 0
0 0 00 0000 pozitivních buněk vyšším než 20 je u všech vakcinovaných zvířat 5, zatímco žádné z kontrolních zvířat, kterým bylo podáno adjuvans, se nad tuto úroveň nedostalo.
Analýza množství virové RNA v plasmě potvrzuje relativně nízkou vnímavost zvířat použitých při studii (obr. 17). Pouze u dvou ze šesti kontrolních zvířat se udržuje vysoké množství viru, zatímco u jiných zvířat virus z plasmy vymizí. Pro parametr množství viru je tedy účinek vakciny těžko dokazatelný.
Závěry
Analýza CD4-pozitivních buněk ukazuje, že vakcina gp120/NefTat + adjuvans (v přítomnosti SIV Nef) zabrání poklesu procenta CD4-pozitivních buněk u většiny vakcinovaných zvířat. To je potvrzení výsledků získaných v první studii SHIV. Pro nedostatek vnímavosti studovaných zvířat nemohl být pro prokázání účinku vakciny použit parametr množství viru. Celkově je možno říci, že kombinace antigenů gp120 a Tat a Nef HIV poskytuje ochranu proti patologickým důsledkům infekce HIV, jak je prokázáno v modelu SHIV.
Samotné antigeny Tat v kombinaci s gp120 poskytují také určitou míru ochrany před úbytkem CD4-pozitivních buněk. Tento efekt je méně vyjádřený než v případě antigenní kombinace gp120/NefTat/SIV Nef, ale ukazuje, že gp120 a Tat jsou schopny zprostředkovat určitou míru ochrany proti projevům onemocnění indukovaného SHIV.
Druhá studie s testovacím podáním SHIV byla prováděna na opicích rhesus ze zdroje zcela nepříbuzného zvířatům z první studie. Oba parametry, tedy procento CD4-pozitivních buněk a množství viru v plasmě ukazují, že zvířata ve druhé skupině byla méně vnímavá na onemocnění indukované SHIV, a že byla podstatně větší variabilita mezi jednotlivými zvířaty. Prospěšný účinek na udržení CD400
0 ·
0
000 0
- 59 0 >00
0^ 0 0 0
0 0 0 0 » • 0 0 0 0
0000 000 300 00 pozitivních buněk u vakciny gp120/NefTat/SIV Nef byl však pozorován v případě experimentální vakciny obsahující gp120/NefTat a SIV Nef. To ukazuje, že účinek vakciny byl v této oddělené studii nejen zopakován, ale dále prokázán v populaci nepříbuzných opic.
Claims (4)
1. Použití a) proteinu nebo polynukleotidu HIV Tat; nebo
b) proteinu nebo polynukleotidu HIV Nef; nebo
c) proteinu nebo polynukleotidu HIV Tat navázaného na protein nebo polynukleotid HIV Nef, označeného jako Nef-Tat;
a proteinu nebo polynukleotidu HIV gp120 při výrobě vakciny pro preventivní nebo léčebnou imunizaci člověka proti HIV, přičemž Tat, Nef nebo NefTat působí při léčbě nebo prevenci HIV synergicky s gp120.
2. Použití podle nároku 1, kde použitá vakcina snižuje množství viru u zvířat infikovaných HIV.
3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde použití vakciny vede k zachování hladin CD4+ na vyšších úrovních než bez vakcinace HIV Tat, Nef nebo Nef-Tat a HIV gp120.
4. Použití podle některého z nároků 1 až 3, kde vakcina dále obsahuje antigen zvolený ze skupiny gag, rev, vif, vpr, vpu.
5. Použití podle některého z nároků 1 až 4, kde protein Tat je mutovaný protein.
6. Použití podle některého z nároků 1 až 5, kde protein Tat, Nef nebo Nef-Tat je redukovaný.
7. Použití podle některého z nároků 1 až 6, kde protein Tat, Nef nebo Nef-Tat je karbamidomethylovaný.
8. Použití podle některého z nároků 1 až 5, kde protein Tat, Nef nebo Nef-Tat je oxidovaný.
9. Použití podle některého z nároků 1 až 8, kde navíc je obsaženo adjuvans.
10. Použití podle nároku 9, kde adjuvans je adjuvans indukující odpověď TH1.
11. Použití podle nároku 9 nebo 10, kde adjuvans obsahuje monofosforyllipid A nebo jeho derivát, jako je 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A.
15. Použití podle nároku 14, kde dále je obsažena sůl hliníku.
• «
- 62
16. Použití a) proteinu nebo polynukleotidů HIV Tat; nebo
b) proteinu nebo polynukleotidů HIV Nef; nebo
c) proteinu nebo polynukleotidů HIV Tat navázaného na protein nebo polynukleotid HIV Nef;
a proteinu nebo polynukleotidů HIV gp120 při výrobě vakciny vhodné pro primární - zesilovací aplikaci pro preventivní nebo léčebnou imunizaci člověka proti HIV.
17. Způsob imunizace člověka proti HIV podáváním vakciny obsahující proteiny HIV Tat nebo HIV Nef nebo HIV NefTat v kombinaci s HIV gp120, nebo je kódující polynukleotidy.
18. Vakcina pro použití u člověka, vyznačující se tím, že obsahuje proteiny HIV Tat nebo HIV Nef nebo HIV NefTat v kombinaci s HIV gp120, nebo je kódující polynukleotidy.
19. Schéma pro vakcinaci s použitím gp120, Nef a Tat, které zahrnuje postupné podávání proteinových antigenů a DNA kódující gp120, nef a tat.
20. Schéma podle nároku 19, kde proteinové antigeny jsou vstříknuty jednou nebo několikrát a následuje jedno nebo více podání DNA.
21. Schéma podle nároku 19, kde pro jedno nebo více podání se nejprve použije DNA a následuje jedno nebo více podání proteinů.
- 63
22. Použití (a) prostředku obsahujícího proteiny gp120 Nef, Tat a gp120; a (b) prostředku obsahujícího DNA gp120, Nef a Tat při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení HIV, kde složky (a) a (b) mohou být použity odděleně, v jakémkoli pořadí nebo společně.
23. Použití proteinových antigenů gp120, Nef a Tat při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení HIV u pacienta, kterému byla podána DNA kódující proteinové antigeny gp120, Nef a Tat.
24. Použití DNA kódující proteinové antigeny gp120, Nef a Tat při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení HIV u pacienta, kterému byly podány proteinové antigeny gp120, Nef a Tat.
Zastupuje:
• * ♦ * · • · · · · • · · · · · • · · · · • ·· ·· 4···
Obr. 1
Je ukázána DNA a aminokyselinové sekvence Nef-His; Tat-His; NefTat-His a mutovaného Tat.
Konstrukty exprimované v Pichia (čisté konstrukty)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0002200A GB0002200D0 (en) | 2000-01-31 | 2000-01-31 | Novel use |
| GB0009336A GB0009336D0 (en) | 2000-04-14 | 2000-04-14 | Novel use |
| GB0013806A GB0013806D0 (en) | 2000-06-06 | 2000-06-06 | Novel use |
| PCT/EP2000/005998 WO2001000232A2 (en) | 1999-06-29 | 2000-06-28 | Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022643A3 true CZ20022643A3 (cs) | 2003-02-12 |
Family
ID=27255504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022643A CZ20022643A3 (cs) | 2000-01-31 | 2001-01-29 | Farmaceutický prostředek |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20030158134A1 (cs) |
| EP (1) | EP1251870A2 (cs) |
| JP (1) | JP2003529559A (cs) |
| KR (2) | KR20070073987A (cs) |
| CN (1) | CN1326873C (cs) |
| AP (1) | AP2002002592A0 (cs) |
| AU (1) | AU783005B2 (cs) |
| BG (1) | BG106964A (cs) |
| BR (1) | BR0107972A (cs) |
| CA (1) | CA2398611A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20022643A3 (cs) |
| DZ (1) | DZ3286A1 (cs) |
| EA (1) | EA200200724A1 (cs) |
| HK (1) | HK1051317A1 (cs) |
| HU (1) | HUP0204250A3 (cs) |
| IL (1) | IL150756A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02007413A (cs) |
| NO (1) | NO20023616L (cs) |
| NZ (1) | NZ520327A (cs) |
| OA (1) | OA12168A (cs) |
| PL (1) | PL211762B1 (cs) |
| SK (1) | SK11122002A3 (cs) |
| WO (1) | WO2001054719A2 (cs) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| IT1297090B1 (it) * | 1997-12-01 | 1999-08-03 | Barbara Ensoli | Tat di hiv-1 o suoi derivati, da soli od in combinazione, a scopo vaccinale, profilattico e terapeutico, contro l'aids i tumori e le |
| BR9910643A (pt) | 1998-05-22 | 2001-10-30 | Loeb Health Res Inst At The Ot | Processos e produtos para a indução de imunidadede mucosa |
| WO2000039304A2 (en) | 1998-12-31 | 2000-07-06 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US20050226890A1 (en) * | 1999-08-12 | 2005-10-13 | Cohen David I | Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same |
| IL150961A0 (en) | 2000-02-04 | 2003-02-12 | Univ Duke | Human immunodeficiency virus vaccine |
| US20080044435A1 (en) * | 2004-03-16 | 2008-02-21 | Cohen David I | Tat-Based Tolerogen Compositions and Methods of Making and Using Same |
| WO2003004620A2 (en) | 2001-07-05 | 2003-01-16 | Chiron, Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| EP1279404A1 (en) | 2001-07-26 | 2003-01-29 | Istituto Superiore di Sanità | Use of HIV-1 tat, fragments or derivatives thereof, to target or to activate antigen-presenting cells, to deliver cargo molecules for vaccination or to treat other diseases |
| GB0118367D0 (en) * | 2001-07-27 | 2001-09-19 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel use |
| FR2828404B1 (fr) * | 2001-08-10 | 2005-07-15 | Neovacs | Superimmunogene composite a usage vaccinal bifonctionnel pour le traitement des maladies associees a un desordre tissulaire stromal |
| CA2466431C (en) | 2001-11-21 | 2014-08-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use |
| EP1944043A1 (en) | 2001-11-21 | 2008-07-16 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use |
| GB0206359D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| CA2484044A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-10-02 | Powdermed Limited | Imidazoquinolineamines as adjuvants in hiv dna vaccination |
| GB0210682D0 (en) * | 2002-05-09 | 2002-06-19 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel use |
| KR20120106894A (ko) | 2002-05-16 | 2012-09-26 | 버베리안 노딕 에이/에스 | Ｈｉｖ 조절/부속 단백질의 융합 단백질 |
| EP1523557A2 (en) | 2002-07-24 | 2005-04-20 | Intercell AG | Antigens encoded by alternative reading frame from pathogenic viruses |
| EP2402026A3 (en) | 2002-09-13 | 2012-04-18 | Intercell AG | Method for isolating hepatitis C virus peptides |
| SI2241325T1 (sl) | 2002-10-29 | 2012-05-31 | Coley Pharm Group Inc | Uporaba CPG oligonukleotidov pri zdravljenju okužbe z virusom hepatitisa C |
| GB0225788D0 (en) * | 2002-11-05 | 2002-12-11 | Glaxo Group Ltd | Vaccine |
| GB0225786D0 (en) * | 2002-11-05 | 2002-12-11 | Glaxo Group Ltd | Vaccine |
| EP1578954A4 (en) | 2002-12-11 | 2010-08-11 | Coley Pharm Group Inc | 5'-CPG NUCLEIC ACIDS AND USE METHOD |
| ES2351489T3 (es) * | 2003-03-24 | 2011-02-07 | Intercell Ag | Vacunas mejoradas. |
| EP1608402B1 (en) | 2003-03-24 | 2010-10-20 | Intercell AG | Improved vaccines |
| US7943139B2 (en) | 2004-01-09 | 2011-05-17 | Morehouse School Of Medicine | Methods of generating a humoral immune response against human immunodeficiency virus (HIV) comprising administering Nef apoptotic motif-containing polypeptide-conjugates |
| GB0405480D0 (en) | 2004-03-11 | 2004-04-21 | Istituto Superiore Di Sanito | Novel tat complexes,and vaccines comprising them |
| WO2005090968A1 (en) * | 2004-03-16 | 2005-09-29 | Inist Inc. | Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use |
| FR2868318B1 (fr) * | 2004-04-01 | 2012-11-16 | Commissariat Energie Atomique | Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih |
| AR053833A1 (es) | 2005-03-23 | 2007-05-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Composicion inmunogenetica |
| KR101696727B1 (ko) | 2006-07-17 | 2017-01-16 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 인플루엔자 백신 |
| US8926993B2 (en) * | 2006-07-17 | 2015-01-06 | Aduro Biotech | Methods and compositions using Listeria for enhancing immunogenicity by prime boost |
| JP2010510226A (ja) * | 2006-11-17 | 2010-04-02 | デューク ユニバーシティ | 多構成要素ワクチン |
| US20100055166A1 (en) * | 2007-03-02 | 2010-03-04 | Gerald Hermann Voss | Novel method and compositions |
| US9717788B2 (en) | 2007-03-02 | 2017-08-01 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant |
| PE20090146A1 (es) | 2007-04-20 | 2009-03-23 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Composicion inmunogenica contra el virus influenza |
| WO2009073104A2 (en) | 2007-11-28 | 2009-06-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian e adenoviruses sadv-39, -25. 2, -26, -30, -37, and -38 |
| EP2463362B1 (en) | 2007-11-28 | 2017-11-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian subfamily c adenovirus SAdv-31 and uses thereof |
| JP5661476B2 (ja) | 2008-03-04 | 2015-01-28 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | サルアデノウイルスＳＡｄＶ−３６、−４２．１、−４２．２および−４４ならびにそれらの用途 |
| EP2774985B1 (en) | 2008-10-31 | 2016-12-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenovirus SAdV-43 and uses thereof |
| DK2411043T3 (da) | 2009-03-23 | 2013-10-21 | Pin Pharma Inc | Behandling af cancer med immunostimulatorisk hiv tat derivat-polypeptider |
| WO2010138675A1 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenovirus 41 and uses thereof |
| WO2012071318A2 (en) | 2010-11-23 | 2012-05-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Subfamily e simian adenoviruses a1321, a1325, a1295, a1309, a1316 and a1322 and uses thereof |
| WO2013173702A2 (en) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Subfamily e simian adenoviruses a1302, a1320, a1331 and a1337 and uses thereof |
| AU2014329393B2 (en) | 2013-10-04 | 2020-04-30 | Pin Pharma, Inc. | Immunostimulatory HIV Tat derivative polypeptides for use in cancer treatment |
| PL3142750T3 (pl) | 2014-05-13 | 2021-03-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Kompozycje zawierające aav eksprymujące konstrukty podwójnych przeciwciał i ich zastosowania |
| CN104001155B (zh) * | 2014-06-12 | 2016-04-13 | 中山大学 | 一种Tat蛋白及其制备方法和应用 |
| US10188749B2 (en) | 2016-04-14 | 2019-01-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers |
| EP3565535A4 (en) * | 2017-01-05 | 2020-12-30 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | SYSTEMS AND METHODS FOR IMPROVING THE EFFECTIVENESS OF A VACCINE |
| JP2023515908A (ja) * | 2020-03-01 | 2023-04-14 | ヴァルネヴァ・オーストリア・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ＣｐＧアジュバント化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスワクチン |
| KR20240011714A (ko) | 2021-04-27 | 2024-01-26 | 제너레이션 바이오 컴퍼니 | 치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 dna 벡터 및 이의 용도 |
| WO2023177655A1 (en) | 2022-03-14 | 2023-09-21 | Generation Bio Co. | Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5863542A (en) * | 1991-03-07 | 1999-01-26 | Virogenetics Corporation | Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts |
| SG90042A1 (en) * | 1992-06-25 | 2002-07-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition containing adjuvants |
| AU710626B2 (en) * | 1995-03-08 | 1999-09-23 | Neovacs | Non-toxic immunogens derived from a retroviral regulatory protein, antibodies, preparation process and pharmaceutical compositions comprising them |
| US20050033022A1 (en) * | 1997-09-26 | 2005-02-10 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | Fusion proteins comprising HIV-1 Tat and/or Nef proteins |
| GB9720585D0 (en) * | 1997-09-26 | 1997-11-26 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| FR2773156B1 (fr) * | 1997-12-26 | 2000-03-31 | Biovacs Inc | Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida |
-
2001
- 2001-01-29 KR KR1020077013960A patent/KR20070073987A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-01-29 IL IL15075601A patent/IL150756A0/xx unknown
- 2001-01-29 OA OA1200200228A patent/OA12168A/en unknown
- 2001-01-29 NZ NZ520327A patent/NZ520327A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-01-29 MX MXPA02007413A patent/MXPA02007413A/es active IP Right Grant
- 2001-01-29 AP APAP/P/2002/002592A patent/AP2002002592A0/en unknown
- 2001-01-29 EA EA200200724A patent/EA200200724A1/ru unknown
- 2001-01-29 AU AU57910/01A patent/AU783005B2/en not_active Ceased
- 2001-01-29 PL PL357210A patent/PL211762B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-01-29 BR BR0107972-7A patent/BR0107972A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-29 HU HU0204250A patent/HUP0204250A3/hu unknown
- 2001-01-29 CZ CZ20022643A patent/CZ20022643A3/cs unknown
- 2001-01-29 CN CNB018071562A patent/CN1326873C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-29 CA CA002398611A patent/CA2398611A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-29 EP EP01946790A patent/EP1251870A2/en not_active Withdrawn
- 2001-01-29 WO PCT/EP2001/000944 patent/WO2001054719A2/en active IP Right Grant
- 2001-01-29 DZ DZ013286A patent/DZ3286A1/fr active
- 2001-01-29 JP JP2001554702A patent/JP2003529559A/ja active Pending
- 2001-01-29 SK SK1112-2002A patent/SK11122002A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2001-01-29 US US10/203,013 patent/US20030158134A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-29 KR KR1020027009825A patent/KR100808348B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-07-30 NO NO20023616A patent/NO20023616L/no unknown
- 2002-07-30 BG BG106964A patent/BG106964A/bg unknown
-
2003
- 2003-03-20 HK HK03102061.7A patent/HK1051317A1/zh unknown
-
2005
- 2005-04-29 US US11/119,212 patent/US20050266025A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-05-08 US US12/117,205 patent/US20090104229A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20070073987A (ko) | 2007-07-10 |
| SK11122002A3 (sk) | 2003-01-09 |
| CN1326873C (zh) | 2007-07-18 |
| JP2003529559A (ja) | 2003-10-07 |
| OA12168A (en) | 2006-05-08 |
| NO20023616D0 (no) | 2002-07-30 |
| KR100808348B1 (ko) | 2008-02-27 |
| HUP0204250A3 (en) | 2005-06-28 |
| PL211762B1 (pl) | 2012-06-29 |
| KR20020073569A (ko) | 2002-09-27 |
| CN1419456A (zh) | 2003-05-21 |
| CA2398611A1 (en) | 2001-08-02 |
| DZ3286A1 (fr) | 2001-08-02 |
| WO2001054719A2 (en) | 2001-08-02 |
| HUP0204250A1 (hu) | 2003-03-28 |
| EP1251870A2 (en) | 2002-10-30 |
| HK1051317A1 (zh) | 2003-08-01 |
| US20050266025A1 (en) | 2005-12-01 |
| AP2002002592A0 (en) | 2002-09-30 |
| AU783005B2 (en) | 2005-09-15 |
| BR0107972A (pt) | 2002-11-05 |
| US20090104229A1 (en) | 2009-04-23 |
| NO20023616L (no) | 2002-09-17 |
| PL357210A1 (en) | 2004-07-26 |
| MXPA02007413A (es) | 2004-07-30 |
| EA200200724A1 (ru) | 2003-02-27 |
| BG106964A (bg) | 2004-01-30 |
| WO2001054719A3 (en) | 2001-12-20 |
| US20030158134A1 (en) | 2003-08-21 |
| NZ520327A (en) | 2004-06-25 |
| IL150756A0 (en) | 2003-02-12 |
| AU5791001A (en) | 2001-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU783005B2 (en) | Novel use | |
| EP2130921B1 (en) | Vaccine for prevention and treatment of HIV-infection | |
| US20080102085A1 (en) | Vaccine comprising gp120 and nef and/or tat for the immunization against hiv | |
| KR20100109555A (ko) | 백신 | |
| EP1017283A1 (en) | Polynucleotide vaccine formulations | |
| CN112770770A (zh) | 共定位施用疫苗组分诱导针对人类免疫缺陷病毒的免疫应答的方法 | |
| ZA200205968B (en) | Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against HIV. |