CZ2001273A3 - Způsoby a přípravky pro stanovení funkce proteinů a identifikaci příslušných modulátorů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje způsoby a přípravky pro identifikaci fúzních proteinů, které mohou působit jako dominantní negativní modulátory určitých proteinových interakcí. Vynález se dále týká použití takových fúzních proteinů za účelem identifikace aminokyselinových sekvencí odpovědných za určité interakce protein-protein a stanovení biologické aktivity a funkce cílového proteinu, který se podílí na uvedených interakcích protein-protein.

Vynález dále popisuje testy pro identifikaci sloučenin, které zahrnují malé molekuly sloučenin, které upravují, například přerušují, cílovou proteinovou biologickou funkci a aktivitu. Vynález dále popisuje způsoby a přípravky vhodné pro modulaci, například přerušení interakcí protein-protein a tudíž biologické aktivity cílového proteinu.

Dosavadní stav techniky

V posledním desetiletí se zjišťuje, že řada onemocnění vzniká na základě genetických vad a na základě nadbytečné nebo nedostatečné produkce podstatných genových produktů. Taková onemocnění zahrnují stavy spojené s negativní regulací buněčné proliferace, jako je zhoubné bujení (Halaban, 1996, Semin. Oncol. 23: 673-681, Russell et al., 1995, Leuk. Lymphoma 16: 223-229), ateroskleróza (Libby et al., 1997, Int. J. Cardiol. 62 Suppl. 2: S23-S29, Schachter, 1997, Int. J. Cardiol. 62, Suppl. 2: S3-S7, Ruschitzka et al., 1997, Cardiology 88 Suppl 3: 3-19) a lupénka (Gniadeck, 1998, Gen. Pharmacol. 30: 619622, Van de Kerkhof and Van Erp, 1996, Skin Pharmacol. 9: 343354), stejně jako zánětlivé stavy, například revmatoidní artritida (Grimbacher et al., 1998, Arthritis Rheumatol. Int.

• ·9 9

9 99

99 •999 •· ·

999999 • 9 · 9 ·· ·

9 9 9 9 99

9999999 99 • 9 9 · ·· • 9 9 ··999 metabolická onemocnění, jako je diabetes mellitus (Blom et těchto onemocnění je založena aberujíci expresi proteinu, dalo podnět k vyhledávání nových možnosti pro řízení onemocnění, které zahrnují vytvářeni léků, které přímo působí na cílový gen nebo protein. Za účelem vyvinout vysoce specifické léky, které přímo interferují s cílovým genem nebo proteinem, je nutné nejdříve zjistit, který cílový gen nebo protein je zodpovědný za uvedené onemocněni.

Vývoj v oblasti klonování nových genů genového inženýrství velmi zrychlil a identifikaci jejich sekvencí. Existuje jeden hlavni problém, přiřazení funkcí genů a jejich genových produktů řadě nově objevených identifikace jej ich interakcí s jinými komponenty uvnitř vně buňky.

Je možné zj išťovat nukleotidovou sekvenci, jestliže to vede k identifikaci proteinového produktu, který je homologní s rodinou, která se charakterizovala dříve, například rodina tyrozinových kináz (popisuje se v publikaci Gullick,

1998,

Biochem. Soc.

Symp.

1998,

Semin. Oncol.

(1

63: 193-198, Haque and Williams,

Suppl. 1) : 14-22, O~Shea et al., 1997, J.

Clin. Immunol. 17: 431-44), proteáz (Estrov and Talpaz,

1996,

Cytokines Mol. Ther. 2: 1-11, Cawston, 1995,

Br.

Med.

Bulls.

51: 385-401, Powers et al. , 1993, Agents Action

Supi.,

42: 318), transkripční faktory a jiné proteiny vázající DNA (Ogbourne and Antalis, 1998,

Biochem. J. 331:

and Yamamoto, 1998, Nátuře and

Richmond,

1998, Curr. Opin. Struct.

Biol. 8: 41-48), atd..

V obecném identifikace funkce případě přetrvává problém znamená, jak kódovaný protein aktuálně působí v genu, to živé buňce.

Klasický přistup identifikace deaktivace genu a charakterizace účinků funkce takové proteinu deaktivace.

je

Pro jeho produktu se může deaktivaci genu nebo porušení funkce použit řada různých přístupů. Takové přístupy je možné najít

• · · · • · · · · · · • · • · • · v publikaci Herskowitz, 1987, Nátuře 329: 219-222 a popisuje se dále v textu.

Současná strategie použitelná při deaktivaci genů nebo jejich produktů.

Jednou metodou vhodnou pro objasnění funkci genů a produktů je porušeni genu způsoby homologni rekombinace. Jednou výhodou způsobu porušeni genu je, že funkce genu je zcela zrušena, což vede k velmi jasným výsledkům. Tato metoda je však účinná a jednoduše aplikovatelná pouze v případě kvasinek (popisuje se v publikaci Scheree and Davis, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 76: 4951-4955, Rothstein, 1983,

Meth. Enzym. 101: 202-211, Russell and Nurse, 1986, Cell 45:

145-153), Aspergilus (Miller et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1714-1721, May et al., 1985, Molecular Genetícs of

Filamentous Fungi (ed. Timberlake, W.E.), pp. 239-251) a Dictyostelium (De Lozanne and Spudich, 1987, Science 236: 1086-1091). U vyšších eukaryontů se mohou přidat segmenty DNA do genomu do náhodných poloh, avšak deaktivace ekvivalentního genu divokého typu, cílenou homogenní rekombinací je řídký jev. Vytvoření vyšších organizmů nesoucích vadu požadovaného genu je velmi náročné na čas a velmi pracné a velmi nákladné. Popisuje se řada způsobů a strategií za účelem vytvoření tzv. zvířat s porušeným genem. Ve většině případů to jsou myši (popisuje v publikaci Capechi, U.S. Patent No. 5,631,153 a Thomas et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 2919-2923). Fenotyp takových zvířat vykazuje u řady případů proniknutí do funkce genů a jejich produktů (popisuje se v publikaci James et al. , 1998, Circ. Res. 82: 407-415, Gingrich and Roder, 1998, Annu. Rev. Neurosci. 21: 377-405, Murakami and Honjo, 1997, Curr.

Opin. Immunol. 9: 846-850. Avšak celkový čas nutný pro získání zvířete s nefunkčním genem je stále velmi dlouhý.

Jiný přístup, který upoutal pozornost zahrnuje použití antisense nukleových kyselin, které blokují expresi genu tím, • · · 9 9 · ·«· • · · · 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99 · · · · ·····□♦«

9 9 99 9 9 9 9 9 999 9 že brání translaci transkriptů (popisuje se v publikaci Izant and Weintraub, 1984, Cell 36: 1007-1015, Melton, 1985, Proč.

Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82: 144-148. Tento přístup se úspěšně příkladů a je spojen s objasněním funkce jejich produktů řady organizmů, které zahrnují se v publikaci North, 1985, Nátuře 313: 635).

použije v řadě několika genů a savce (popisuje mutantů Drosophila Kruppel se produkuje zavedením

Kruppel RNA do embryí divokého typu pomocí injekcí al., Nátuře 313: 703Fenokopie antisense (popisuj e se v publikaci Rosenberg et

706. Hlenka s nedostatkem diskoidinu antisense oligonukleotidu diskoidinu v publikaci Crowley et al.,

1985, se vytvořila expresí in vivo (popisuje se Cell 43: 633-641) a demonstrovalo se, že antisense oligonukleotidy proto-onkogenu 3T3 inhibují růst indukovaný z krevních destiček (PDGF) c-fos v myších buňkách NIH růstovým faktorem získaným (popisuje se v publikaci Nishikura and Murray, 1987, Mol.

Cell. Biol. 7: 639-649). Avšak přístup, který antisense nukleovou kyselinu je velmi pracný identifikaci vhodných oblastí v mRNA, které jsou antisense oligonukleotidu. Tento přístup může používá a vyžaduje dostupné u v jistých případech bránit ve vyjevení fenotypu genu, popisuje vytvoření genu divokého typu (popisuje se

V jiných publikacích se fenotypu nadměrnou expresí v publikaci Meeks-Wagner and Princip tohoto přístupu je podjednotek proteinových komplexů formaci multiproteinových struktur, histonová konstrukce eukaryontních

Hartwell, 1986, Cell, ten, že nerovnovážná mutantního koncentrace může sloužit ke správné jako je cytoskeletová a chromozomů. Za použití uvedeného přístupu se ukázalo, že změněný poměr histonů H2AH2B až H3-H4, což je výsledkem nadměrné exprese genů v případě histonů H2A-H2b, vede ke ztrátě chromozomu (popisuje se v publikaci Meeks-Wagner and Hartwell, 1986, Cell, 44: 43-52). Toto inherentní omezení uvedeného přístupu je zjevné a může se • · použít pouze u genů, jejichž produkty jsou částí více proteinových komplexů.

Ačkoli používaný přístup inhibuje funkci genu, zahrnuje použití protilátek proti syntetickým antigenům založeným na předpovězené sekvenci genového produktu. Ukázalo se, že protilátky proti komponentům mikrotubulu může změnit morfologii prostředních vláken (popisuje se v publikaci Blose et al., 1984, J. Cell Biol. 98: 847-858, Wehland and

Willingham, 1983, J. Cell Biol. 97: 1476-1490). Protilátky proti proteinům ras mohou dočasně převrátit transformovaný fenotyp buněk transformovaných genem ras (popisuje se v publikaci Feramisco et al., 1985, Nátuře, 314: 639-642, Kung et al., 1986, Expl. Cell. Res. 162: 363-371). Ačkoli tato metoda je vhdoná pro analýzu jednotlivých buněk nebo dokonce skupin buněk, je limitována dočasnou perturbací funkce genu divokého typu vzhledem k ředění a rozkladu protilátek.

Před deseti lety se objevila nová strategie hodnocení funkce genu. Zahrnuje zablokování genové funkce na úrovni proteinu. Při tomto přístupu se klonovaný· gen mění tak, že kóduje mutantní produkt schopný inhibovat v buňce produkt genu divokého typu, čímž způsobuje nedostatečnost funkce genového produktu (popisuje se v publikaci Herskowitz, 1987, Nátuře 329: 219-222, Hozmeyer et al., 1992, Nucleic Acids Research

20: 711-717, Gudkov et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA

90: 3231-3235, Patent USA č. 5 665 550, 5 217 889. Mutace uvedného druhu je svou podstatou dominantní, protože její fenotyp se projevuje v přítomnosti genu divokého typu. Protože takoví mutanti deaktivují funkci genu divokého typu, nazývají se „dominantně negativními mutanty. Tento druh mutací se nazývá „antimorfní. To znamená, že „antagonistické mutantní geny mají účinek opačný ve srovnáni s účinkem genu, ze kterého se odvodil (popisuje se v publikaci Miller et al. ,

1985, Molec. Cell Biol. 5: 1714-1721).

Dominantní negativní inhibiční varianty jedním s několika mechanizmů. Řada, ne-li jsou funkční v multimérních komplexech, ího proteinu derivát schopný interagovat • · · ···· · ·· • · · · · ······· ·· · ·· · · · · *· ·· ···· φ· · ·····

Dominantní negativní mutanti

Takový přístup zahrnuje inhibici funkce produktu genu divokého typu s nadměrně produkovanou inhibiční variantou stejného produktu, genu mohou působit většina proteinů, V případě multimér s polypeptidovým řetězcem divokého typu, který je jinak defektní, bude působit inhibičně, jestliže způsobuje tvorbu nefunkčních multimérů. Například se ukázalo, že receptorové tyrozinové kinázy tvoří oligomérové komplexy jako odezvu na navázání jejich ligandu. Tato oligomerizace je nezbytná, aby se aktivovala enzymatická doména. Jak se ukázalo u řady členů rodiny receptorových tyrozinových kináz, defektní varianta receptoru, která je stále schopna oligomerizeca, působí jako inhibiční dominantní negativní mutant (popisuje se v publikaci Kashles et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 1454-1463, Redemann et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 491-498, Millauer, et al.,

1994, Nátuře 367: 576-579).

Je dále možné vytvořit inhibiční varianty monomerních proteinů. Jestliže například aktivita proteinu se omezuje dostupností substrátu, pak varianta schopná vázat substrát, ale nikoli provést následný katalytický krok, by mohla být inhibiční. V jiném případě dominantní negativní elementy ovlivňující monomérový protein by mohly působit ovlivňováním vhodného balení (popisuje se v publikaci Michaels et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 14452-14455).

Ačkoli se zkoušely velké systémy vhodné pro genetickou selekci dominantních inhibitorů, mají omezený úspěch. V jednom případě se například vyvinul systém k identifikaci dominantních inhibitorů dráhy odezvy na feromon u kvasinek tím, že se exprimovala knihovna DNA kódující fragmenty odvozené z genomu a náhodné peptidy v kvasinkových buňkách a to buď selekcí exprese vhodné reportní molekuly (přihláška PCT * ····« « · · • · · · ······· · · • · · · 9 · * · ···· * · · · · ·

WO 98/39483) nebo přímo selekcí buněk, které opouštějí zablokování buněčného cyklu pomocí α-faktoru (popisuje se v publikaci Caponigro et al., 1998, Proč. Nati. Acad. 7508-13).

Sci. 95:

peptidy v

Jiný způsob využívá expresi knihovný DNA buněčném typu a pak určitém zajímavém kódující následuj e testováni kandidátů, kteří interferují s určitým fenotypem uvedené buňky nebo tento v publikaci parent USA č. 5 217 88 uvedené metody mohou identifikovat fenotyp potlačují (popisuje se a 5 811 234). Ačkoli obě molekuly, které přerušují nějakou dráhu nebo buněčný fenotyp, k identifikaci fenotypu, je nutné podstatné úsilí ke stanovení mechanizmu působení peptidu a k lokalizaci cíle v hostitelské buňce.

Takové dříve popsané metody se omezují na to, že se elementy, které zahrnují alespoň tři dominantní negativní element, mechanizmus s jeho cílem a opírají o proměnné:

dominantního negativního elementu samotného cíle. Takové metody mají vysokoprostupného taková metoda zahrnuje identifikaci, vybraného neznámé interakce podstatu překážek při aplikaci sloučenin. Nejdříve každá a manipulaci expresi systému, systému.

například

Všechny buňky několik vážných testování terapeutických tkáňových fenotypy nemusí fenotypu v hostitelském kultur v případě savčího podstoupit genovou analýza, selekci.

aktivitě.

Dokonce jestliže je obtížné detekovat malé Dále je obtížné prostupnosti, genetická fenotypické být schopny je dostupná rozdíly ve dosáhnout v takových systémech vysoké prostupnosti, protože je nutné sledovat určitý, pravděpodobně odlišný, fenotyp pro libovolný daný protein. Za druhé peptidové fragmenty exprimované v buňce nebo do buňky zavedené nemusí být dostatečně velké ani stabilní, aby vznikla dostatečná překážka pro cílenou interakci. Nakonec dokonce když se definovala jednou z těchto metod dominantní negativní pochopit mechanizmus inhibice nebo se může předpovědět na základě fenotypu dominanntího negativního mutantu, je nutná následná aktivita, není jednoduché interakce. Ačkoli funkce analýza, aby se stanovily její mechanizmy působeni. Podobné fenotypy mohou být například výsledkem nežádoucích mechanizmů nebo v jiném případě poškození v jediné dráze může vést ke vzniku různých fenotypů. Taková analýza je pracná, časově náročná a nevhodná pro testovací metody s vysokým prostupem. Velké úsilí a nezbytné náklady ke stanovení působení sloučeniny limituje použitelnost uvedených metod vhodných k identifikaci léků a další vývoj vede ke vzniku sloučenin vhodných pro terapeutické účely.

Z těchto důvodů zatím nebyl popsán žádný účinný, citlivý a cílený systém, který se může použít při identifikaci specifických molekul funkčních interakcí protein-protein s vysokým prostupem nebo při identifikaci sloučenin vhodných pro modelování takových interakcí.

Podstata vynálezu

Vynález identifikaci popisuje metody fúzních proteinů, a sloučeniny vhodné pro které mohou působit jako dominantní negativní modulátory protein. Ve specifickém případě velké sbírky proteinových proteinů, které obsahují určitých interakcí vynález fragmentů, popisuj e například proteinvytvoření fúzních fragmenty cílového proteinu proteinem, mikrobiálních systémů ke genetickým testům takových fúzovaného s nosičovým značeným použití sbírek za účelem vyhledávání členů, které vykazují nebo přerušují určité interakce protein-protein, a k vytvoření samotných fúzních proteinů.

Demonstrace interakce protein-protein a/nebo porušení interakce protein-protein je například způsob identifikace částí cílového proteinu, který se podílí na interakcích protein-protein a na identifikaci a obohacení potencionálních dominantních negativních forem cílového proteinu.

Vynález popisuje vývoj metod, které používají fragmenty cílového proteinu exprimovaného jako fúzní nebo značené proteinové elementy, které se nazývají značené dominantní negativní elementy vytvoření interakcí nebo TDNE, aby specificky modifikovaly protein-protein. Vynález popisuje několik výhod ve srovnání s dříve publikovanými metodami vhodnými k identifikaci dominantních negativních supresorových elementů. Protože se u elementů testuje uvedenými metodami schopnost přerušit specifické interakce protein-protein a protože značené dominantní negativní elementy se mohou odvodit z genu kódujícího samotný cílový protein, mechanizmus působení dominantního negativního elementu se předem stanovilo navržením experimentu. To znamená, že dominantní negativní inhibiční element bude působit celkovou inhibicí interakcí protein-protein. Část značeného elementu může zvýšit inhibiční účinek dominantního negativního peptidu a tím zvýšit citlivost zde popsaných metod. Je to možné například stabilizací peptidového fragmentu a/nebo vytvořením prostorové překážky, jak se popisuje v příkladech dále v textu. Část tag elementu může také poskytovat další funkce, jako je manipulace, získání nebo detekce značeného dominantního negativního elementu. Zde popsané metody používají jediný dobře definovaný fenotyp (například exprese reportního genu) v mikrobiálních systémech k testování elementů a sloučenin, jejichž cílem jsou interakce protein-protein. Jasně definovaný a kvantifikovaný fenotyp, který je možné aplikovat v širokém rozmezí proteinů, a upravené metody s vysokým prostupem vhodné pro testování malých molekul léčiv, tvoří jistou výhodu ve srovnání s metodami, které spočívají na identifikaci, selekci nebo testování různých endogenních fenotypů.

Vynález dále popisuje způsoby a testy vhodné pro charakterizaci biologické funkce a aktivity cílového proteinu. Vzhledem k tomu, že interakce protein-protein jsou nutné pro normální funkci cílového proteinu v jeho přirozené buňce, dominanntí-negativní elementy se naopak mohou použít jako část metod, které slouží k identifikaci nebo dalšímu hodnocení

9 9

9999 · 9 • ·

9 9 ··

funkce odpovídajícího cílového proteinu v jeho přirozeném prostředí a jeho potencionálního vlivu při vývoji a manifestaci patologických podmínek. Vynález popisuje systémové a rychlé způsoby použití informací, které vznikly na základě sekvenování genomu, za účelem identifikovat funkce známých a nově objevených genů a jejich produktů.

Vynález dále popisuje identifikaci sloučenin například sloučenin s malými molekulami, které blokují určité interakce protein-proteir.. V takových metodách se zvláště využívají mikrobiální systémy podle vynálezu za účelem identifikace sloučenin, které upravují, například přerušují interakce mezi peptidovým fúzním proteinem a „partnerským proteinem, se kterým specificky reagují. Vynález popisuje rychlou identifikaci sloučenin, u kterých se může testovat jejich schopnost působit jako cílově specifické terapeutické sloučeniny.

Vynález dále popisuje metody a kompozice vhodné pro modulaci například poškození nebo inhibici určitých interakcí protein-protein a proto modulují biologickou funkci a aktivitu cílového proteinu, který se podílí na interakci proteinprotein. Vynález popisuje způsob identifikace a navržení použitelných změn, například u léků, sloučeniny založené na identifikaci dominantních negativních elementů. Vynález dále popisuje vývoj cytologických, diagnostických a terapeutických činidel založených na fúzních proteinech a znalostech získaných jejich charakterizací v obou mikrobiálních modelech a při dominantí negativní analýze.

Definice

Zde používané termíny se obecně používají v oboru. Následující termíny mají zde tento význam:

Termín „značený dominantní negativní element (TDNE) znamená fragment proteinu nebo peptidu, který ovlivňuje určité interakce protein-protein („dominantní negativní element), fúzovaný s ncsičovým proteinem fragment nebo který proteinu, může odvodit z fragment může („značkou). Proteinový peptid se může získat z vybraného cílového se podílí na interakci protein-protein nebo se libovolného jiného zdroje. Ačkoli proteinový vykazovat libovolnou délku, může například délky cílového proteinový fragment má délku aminokyselin upřednostňuj e dosáhnout celé nebo přibližně se délka 6 až proteinu, přibližně až upřednostňuj e protein může délka kolem 6 až vykazovat vybranou cytologickou oblast vázající DNA, značku nebo značku doména v typickém případě přibližně 500 aminokyselin, a nejvíce se

150 aminokyselin aminokyselin. Nosičový funkci. Může jít například o usnadňující čištění, jako je aktivátoru transkripce nebo sloučenina obsažená v mikroorganizmu, dále mohou sloužit pro výzkum malých molekul nebo jako rozkladu a jako podpory prostorové například jako nástroj stabilizátory proti struktury.

Zde popsané metody využívají kompozice při identifikaci a úpravě interakcí protein-protein (buď homotypické nebo heterotypické interakce protein-protein). Za účelem jednoduchosti a jasnosti popisu, jeden protein zahrnutý v interakci protein-protein se zde nazývá „cílovým proteinem a druhý protein se nazývá „partnerský protein. Rozumí se, že termín „cílový protein se může zaměnit s termínem „partnerský protein pro účely zde popsaných metod a sloučenin. Je nutné porozumět, že termíny zahrnují proteiny celé délky, které se podílejí na interakcích protein-protein, nebo na její část, která stále vykazuje interakce protein-protein. Knihovna TDNE se může použít v metodách vhodných k identifikaci a charakterizaci dominantních negativních elementů, které modulují, například poškozují, nebo interferují s funkcí cílového nebo partnerského proteinu, které se podílejí na interakcích prctein-protein.

• * · « · · · · ·

Je nutné poznamenat, že terminy „peptid, „polypeptid a „protein je možné zaměnit.

Vynález popisuje sloučeniny a metody vhodné pro identifikaci a izolaci fúznich proteinů, které působí jako dominantně negativní elementy, které se označily jako značené dominantní negativní elementy (TDNE) . Zvláště vynález popisuje testy vhodné pro identifikaci a izolaci dominanntích negativních elementů ze sbírky proteinových fragmentů. Jsou to například proteinové fragmenty získané z cílového proteinu, který se podílí na interakci protein-protein, který se fúzuje s nosičovým proteinem. Taková sbírka se označuje jako kandidát TDNE. Testy používají mikrobiální systémy, které umožňují genetické prozkoumání sbírky. Testy používají mikrobiální systémy, které umožňují genetické prozkoumání sbírky kandidátů TDNE, které vykazují nebo porušují specifické interakce protein-protein. Schopnost prozkoumat proteinové fragmenty a sbírku proteinových fragmentů založených na chimerové fúzi použitím postupem s vysokou prostupností založený na mikrobech dramaticky zjednodušuje postup identifikace kandidátů dominantně negativních elementů v systémech, jako jsou například savčí systémy.

Vynález popisuje vytvoření a použití fúznich proteinů, jako sbírky kandidátových TDNE. Fúzní proteiny jsou nutné jako zdroj dominantních negativních elementů v případě řady významů. Mechanizmus působení dominantně negativních mutantů v typickém případě zahrnuje specifické interakce proteinprotein, které jsou nutné v případě přirozené funkce. Krátké proteinové fragmenty nemají pravděpodobně schopnost účinně zesílit tuto funkci, stejně mohou působit jako podstatný sterický blok, který je zakotven na cílovém proteinu. Jako takové vytvoření rodiny proteinových fragmentů připojených k cizorodému nosičovému proteinu vede k vytvoření sady citlivějších, silnějších dominantně negativních mutantů.

9999 • · 99 • 99 • 999 • · 9 · 9 99 • 99

Nosičovy protein bude stabilizovat proteinové fragmenty před rozpadem a tak umožní soubor možných dominantně negativních interakcí, které není možné v jiném případě pozorovat, zvláště v případě malých proteinových fragmentů. Nosičový protein se může vybrat tak, aby proteinové fragmenty a peptidy získaly další požadované funkce. Takové nosičové proteiny mohou obsahovat funkční oblasti a motivy zahrnující cytologické značky, oblasti vázající DNA, oblasti transkripčních aktivátorů, malé molekuly založené na mikrobech, které slouží ;

jako prostředky pro objevování, fluorescenční peptidy a buněčné lokalizační motivy, jako jsou signální sekvence.

Dále vynález popisuje použití mikrobiálního zkoumání za účelem identifikace členů knihovny, která specificky aktivuje dobře definované fenotypy reportních genů. V typickém případě dominantně negativní fenotyp roste, protože dominantně negativní · protein, který je přítomen v nadbytku, blokuje normální interakci, která je podstatná pro funkci proteinu. Takto vytvořený dominantní negativní mutant musí sám chránit j alespoň část interakce protein-protein potencionálně kódovaný správně zbaleným segmentem přirozeného cílového proteinu. Řada proteinových segmentů cíle s takovým potenciálem interakcí je podstata možných proteinových fragmentů a použitím schémat schopných identifikovat takové fragmenty je možné dosáhnout zajímavých členů. Vytvoření chimérových knihoven, například fragmentů cílového proteinu, které se spojují s partnerským proteinem v interakci protein-protein, nebo fragmenty fúzované i s proteiny, které umožňují studovat takové chiméry v analyzačních systémech interakce založené na mikrobech, spočívají v identifikaci dominantně negativních elementů přítomných v těchto knihovnách chimér.

Existují dva primární typy schémat. Takový systém se může použít k identifikaci nebo k vystopování interakce mezi partnerským proteinem a zkráceným fragmentem fúzovaným s vhodným nosičem, který se získal z proteinu, se kterým • ♦ · interaguje. Izolace interakčních partnerů v knihovně chimér identifikuje členy, které definují konstituentní interakční peptidy. Tyto chiméry identifikuji ty členy, které s velkou pravděpodobností působí jako dominantně negativní elementy. Interakce je předpoklad dominantně negativního elementu. Druhý typ přístupu zahrnuje zablokování existující interakce. Takové existující interakce se mohou zakládat na interakcích definovaných v interakčním systému založeném na mikroorganizmech, jako jsou například kvasinky a bakterie. Chiméra definovaná svými blokačními vlastnostmi bude vykazovat vysokou pravděpodobnost být dominantně negativními elementy a tak je možné, že blokuje interakci protein-protein cílového proteinu nebo jeho fragmentu. Shora popsaný přístup také poskytuje způsob, který umožňuje, že se identifikovaly klony v rámci. Pouze jeden ze šesti náhodně vytvořených inzertů například sdílené fragmenty budou správné v případě, že jedna polovina bude mít správnou orientaci a jedna třetina z nich bude mít správný čtecí rámec. Identifikace blokačního a stopovacího fragmentu bude proto zkoumat knihovnu za účelem správně· orientovaných členů, které jsou v rámci a které demonstrují vlastnosti interakcí protein-protein s cílovým proteinem nebo s proteinem o nějž je zájem.

Obecné popsané přístupy mohou takto poskytovat jiná činidla, která jsou použitelná ve funkčních genomech založených na stejných knihovnách fúzního proteinu. Například jednotlivé chiméry je možné charakterizovat s ohledem na blokační a stopovací vlastnosti. Jak se diskutuje shora v textu, blokační chiemry s velkou pravděpodobností definují dominantní negativní elementy. Zahrnutí dalšího požadavku, že kandidát dominantních negativních elementů nevykazuje pouze blokační vlastnosti, ale také má záchytný fenotyp, který eliminuje některé třídy anomálních chimér. Je také možné identifikovat chiméry, které vykazují záchytný fenotyp, ale chybí jim schopnosti blokovat. Taková chiméra má schopnost interaktovat s cílovým proteinem, ale neblokuje definovanou interakci protein-protein. Mezi takové chiméry patři ty, které reprezentují cytologická činidla, které je možné použít při buněčné lokalizaci a při studiu distribuce v tkáni cílového nebo partnerského proteinu. Chiméra tímto způsobem využívaná a identifikovaná je založená ne běžných nosičových proteinech, které jsou jedinečné pro používané systémy. Tyto běžné nosičové proteiny Tag se sekvencemi, které se mohou použit k lokalizaci cílového proteinu po navázání chiméry na cílový protein v v buněčných nebo tkáňových přípravcích. Taková lokalizace poskytuje důležité informace, které spolu s jinými informacemi jako je přirozený dominantní negativní fenotyp definuje funkci cílového proteinu.

Mikrobiální postupy užívané k definici interagujicích proteinových fragmentů jsou založeny na specifických dobře definovaných fenotypech, které umožňují testovací techniku s vysokým prostupem. Například zachytávací fenotypy se mohou podílet na ztrátě testovaného existujícího trasnkripčniho signálu založené na interakci například exprese reportního genu. Specifický fenotyp k blokování se používá k identifikaci sloučenin například interakci fenotyp, velmi podobným způsobem se definuj ící definuje a zachytávací identifikuje blokovací chiméra.

Zde popsaná schémata mají s existujícími schématy. Jsou ve srovnání jasnou výhodu to malé molekuly, které ovlivňují interakce protein-protein. Jak se uvádí shora v textu cílové interakce jsou známy tím, že definují interakci, která se demonstrovala , jako část systematického postupu. Postupy užívané k definici dominantní negativní chiméry mohou definovat minimálně interagující peptid, který bude překrývat minimální interakční povrch. Redukovaný interakční povrch umožňuje identifikaci malých molekul, které není možné nalézt podle minimálního, ale funkčně definovaného dominantního negativního fenotypu.

φ φφ •· · • φφ φφ φ·ΦΦ

Popsané schéma napomáhá vytvořit chiméru, která se může testovat v mikrobiálních systémech, za účelem identifikace kandidátů, které mohou vykazovat dominantní negativní fenotyp. Jak se diskutuje shora v textu taková dominantní negativní chiméra se může využít k definici funkce genu. Dominantní negativní chiméra může odstranit funkci genu. V jistých provedeních vynálezu takové odstranění funkce genu se může využít jako část terapeutické strategie. V takových případech dominantní negativní elementy definují proteinové terapeutické prostředky. To je zvláště možné aplikovat v těch případech, kde cílové proteiny, ze kterých se odvodily dominantní negativní elementy, reprezentují buněčné povrchové proteiny. Dále minimální dominantní negativní element v obecném případě poskytuje menší antigen ve srovnání s větším proteinem a nosičový protein dominantního proteinového fragmentu se může například vybrat z přirozeného například lidského proteinu, čímž dále redukuje pravděpodobnost nechtěných imunologických problémů.

Cílový protein

V obecném případě je možné použít libovolný cílový protein za účelem stanovení jeho specifických interakcí proteinprotein, například interakcí s určitým proteinem v souladu s metodami podle vynálezu. V jednom provedení podle vynálezu se metody podle vynálezu mohou použít při charakterizaci nových genů, které se identifikovaly sekvenováním DNA například v souladu s projektem lidského genomu. V jiném provedení podle vynálezu je možné použít metody podle vynálezu za účelem identifikace funkce proteinů, které se vybraly na základě jejich určitého expresívního paternu nebo se předpokládá jejich vztah s určitým onemocněním.

Přístup TDNE se může také použít, ať existují nebo neexistují specifické znalosti o definovaném cílovém proteinu. Za účelem stanovení proteinů, které se nadměrně exprimují *

• · • · · · v patologickém stádiu onemocnění (jako je například transformované stádium zhoubného bujeni nebo zánětlivá tkáň), se může použíc diferenciální expresívní analýza (popisuje se například v publikaci Wang end Feuerstein, 1997, Cardiovasc. Res. 35: 414-42, Winkles, 1998, Prog. Nucleic Acid Res. Mol.

Biol. 58: 41-8). Diferenciálně exprimované proteiny se pak mohou analyzovat za účelem zjištění homodimérových a heterodimerovýoh interakcí. Homotypické interakce znamenají interakce, kde polypeptidový partner je stejný jako interakční část interakční oblasti protein-protein. Heterotypická interakce znamená interakci, ve které se polypeptidový partner liší od interakční části interakční oblasti protein-protein.

V případě proteinů, které demonstrují interakci, může se aplikovat na fragmenty cílového proteinu přístup TDNE, který ukazuje (samotný nebo jako člen chiméry) fenotyp blokující interakci. Takové identifikované členy fragmentů se mohou exprimovat v modelu nebo přirozeném systému, aby se zhodnotil účinek dominantního negativního kandidáta na patologické stádium. Libovolný TDNE, který obrací fenotyp (nebo částečně obrací fenotyp) spojený s patologickými stádii se stává jasným kandidátem terapeutického zásahu. Dále malé molekuly, které napodobují TDNE dominantní negativní aktivitu, se mohou identifikovat prostřednictvím zde popsaných metod a také reprezentují kandidáty vhodné pro terapeutický zásah v případě patologické situace, ve které TDNE demonstruje biologický účinek.

V jiném provedení podle vynálezu v případech, kdy je známo, že se cílový protein účastní určitých interakcí protein-protein, se mohou použít způsoby podle vynálezu za účelem stanovení specifických oblastí cílového proteinu, které se podílejí na interakcích protein-protein cílového proteinu. Mezi cílové proteiny patří ty, který se podílejí na interakci protein-protein, které korelují s určitým patologickým stádiem nebo se podílejí na fyziologickém procesu, který je nutný pro

9 9999999

9 9 9

9 funkci uvedeného proteinu. V různých provedeních podle vynálezu může cílový protein obsahovat vnitrobuněčný, extrabuněčný nebo transmembránový protein a/nebo virový nebo jiný patogenní protein. Interakce cílový protein-protein může být homotypickou nebo heterotypickou interakcí.

V jednom provedení vynálezu cílový protein obsahuje buněčný povrchový (transmembránový nebo s membránou spojený) receptor. V příkladech, kde interakce mezi interakční oblastí i protein-protein a jeho partnerem nebo partnery je závislá na ligandu, je možné zavést ligand. Ve specifickém provedení je možné použít za účelem identifikace homotypických nebo heterotypických interakcí nebo k identifikaci dominantních j negativních elementů, které modulují takové interakce, zde popsané testovací systémy. Analýza v mikrobiálních testovacích systémech se může použít ke stanovení zda probíhá homotypická nebo heterotypická dimerizace. Po té, co se prokáže interakce protein-protein, může se použít TDNE strategie popsaná shora v textu za účelem identifikace značených polypeptidových fragmentů, které blokují .další interakce. Specifické příklady zahrnují například protein společně exprimovaný s leptinovým >

receptorem (LRCEP, popisuje se v publikaci Bailleul et al.,i

1997, Nuoleic Acids Res. 25: 2752-2758) a leptinový receptor.

Jiné specifické příklady buněčných povrchových receptorů[ zahrnují, ale nejsou omezeny na členy třídy receptorůi;

podobných transmembránové tyrosinové receptorové kináze (TRK):

(popisuje se v publikaci Ullrich and Schlessinger, 1990, Cell 61:203-12, Hunter and Cooper, 1985, Ann Rev. Biochem. 54: 897930). V jiném provedení vynálezu cílový protein je členem' sedmé transmembránové třídy receptorů (například třída receptorů spojená s G-proteinem (GPRC) (popisuje se v publikaci Huang et al., 1997, J. Recept. Signál Transduct.

Res. 17: 599-607). V jiném provedení vynálezu cílový protein může být membránový protein iontového kanálku. Spojení mezi podjednotkami iontového kanálku poskytuje mechanizmus vhodný •* * · *· » •· · • ·· ·· · ·· * · · · » · • · • · ·· ···

pro modulaci funkce kanálku (Ludewig et al., 1998, Nátuře 383: 340-343, Fahike et al., 1997, J. Gen. Physiol. 109(1): 93-104, Unwin, 1989, Neuron 3: 665-76). Vynález dále popisuje rodinu receptorů iontového kanálu otevřeného napětím, jako jsou kanály citlivé na K⁺ a Ca²⁺ (popisuje se v publikaci Hille, B. „Ionic Channeis of Excitable Membranes, 1992, Sinauer Associates, Sunderland, MA, Catterall, W.A., 1991, Science 253: 1499-1500). V jiném provedení podle vynálezu může cílový protein obsahovat člena receptorové rodiny proteintyrozinfosfatázy nebo R-PTP. Dimerizace uvedené třídy proteinů může inhibovat jejich aktivitu a na rozdíl od aktivační úlohy, kterou dimerizace plní v případě mnoha receptorů (popisuje se v publikaci Weiss and Schlessinger, 1998, Cell 94: 277-80). V jiném provedení vynálezu cílový protein může obsahovat člena cytokinové receptorové rodiny (popisuje se v publikaci Vigers et al., 1997, Nátuře 386: 190-194). V jiném provedení cílový protein může obsahovat člena superrodiny receptorů jaderného hormonu (popisuje se například v publikaci Mangelsdorf et al·., 1995, Cell 83: 835-39).

V různých jiných provedeních podle vynálezu se může vybrat takový buněčný cílový protein, který se podílí na dráze signální transdukce. Zde popsané metody se^ mohou použít k identifikaci oblastí proteinové interakce a molekul (například chimerových dominantních negativních peptidů), které přeruší takové interakce, které jsou důležité při různých krocích dráhy signální transdukce z receptorů na buněčném povrchu s transkripční aktivací v jádru. Je známa řada takových jaderných proteinů, které vykazují domény a motivy, jako je SH2, SH3, PH, PTB, WW a WD40, repetice bohaté na leucin a motivy F-boxu, které se podílejí na buněčných interakcích protein-protein (popisuje se v publikaci Sudol et al., 1996, Trends Biocehm. 21: 1-3 a Koch et al., 1991, Science 252: 668-74). Ve specifickém provedeni vynálezu cílový protein může obsahovat heterotrimérový G-protein (popisuje se

«·	··	··	•	··	φ
• ·	♦ ·	• ·	•	• ·	• ·
• ·	•	• ·	• ·	• ·	•
• ·	•	• · «	····	• · ·	•
• ·	•	• ·	•	• ·	*
• 4		··	•

v publikaci Neer, 1995, Cell 80: 249-257, Clapham and Neer,

1993, Nátuře 365: 403-406). V jiném provedení cílový protein může obsahovat nereceptorovou proteinovou kinázu, jako je rodina src nebe Janus (popisuje se v publikaci Darnell et al.,

1994, Science, 264: 1415-21, Cantley et al., 1991, Cell 64:

281-302). Dále v jiném provedení vynálezu cílový protein může obsahovat protein transkripčního faktoru. Řada transkripčních faktorů se aktivuje homotypickou a heterotypickou dimerizací (popisuje se například v publikaci Lamb and McKnight, 1991, Trends Biochem. Sci. 16: 417-22). Cílové proteiny pak mohou zahrnovat například transkripční faktory obsahující dimerizační oblasti leucinového zipu, které zahrnují, ale nejsou omezeny na Fos/Jun (popisuje se v publikaci Bohmann et al., Science 238: 1386-92 a Angel et al., 1988, Nátuře 332:

166-71), C/EBP (popisuje se v publikaci Landshultz et al., 1988, Science 240: 1759-64), GCN4 (popisuje se například v publikaci Agre et al., 1989, Science 246: 922-926), oblast proteinů helix, smyčka helix (HLH), například Myc (popisuje se v publikaci Murre et al., 1989, Cell 56: 777-783) a MyoD a jiné myogenní proteiny HLH, které vyžadují heterooligomerizaci s proteiny podobnými E12/E47 ín vivo (popisuje se v publikaci

Lasser et al. ,

1991, Cell 66: 305-15) stejně jako jiné dimerizační transkripční faktory,.

které jsou dobře známy v oboru.

Metody podle vynálezu se mohou také použít při identifikaci a přerušení interakcí protein-protein, které jsou důležité při vnitrobuněčných interakcích. Buněčná adheze proteinů, jako jsou integriny, může vyžadovat spojení s partnerskými dezintegrinovými proteiny (Blobel, 1997, Cell 90: 589-92). Ve specifickém provedení cílový protein-integrinprotein se může použít při identifikaci dezintegrinového partnera nebo jako inhibiční molekula interakce integrin dezintegrin.

V jiném provedeni vynálezu cílový protein může obsahovat protein odvozený z viru, mikrobu nebo jiného patogenu. Peptidové inhibitory dimerizace proteáz HIV se mohou identifikovat za použití metod podle vynálezu s HIV proteázou jako s cílovým proteinem (popisuje v publikaci McKeever et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 1919-1921). ‘

Vedle zde uvedených proteinů cílový protein může obsahovat aminokyselinové zbytky získané z libovolného dimérového nebo multimérového polypeptidů uvedeného ve veřejné databázi, jako je například Swiss Protein Data Base (SWISS-PROT, popisuje se v publikaci Bairoch and Apweiler, 1998, Nucl. Acids Res. 26: 38-42, http://www.expasy.ch a http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Značené dominantní negativní elementy (TDNE), knihovny TDNE a jejich tvorba

Vynález popisuje TDNE, expresívní vektory kódující TDNE a knihovny obsahující velké množství kandidátů TDNE nebo vektory exprimující TDNE a metody použitelné.při konstrukci. i

TDNE obsahuje fragment kandidáta proteinu nebo peptid, například fragment získaný z cílového proteinu. Takový cílový protein se podílí na určitých interakcích protein-protein a fúzuje s nosičovým proteinem nebo se značkou. Značený TDNE se může vyskytovat jako fragment N-konce nebo karboxylového konce proteinu. Může jít například o fragment cílového proteinu. Značený TDNE a části proteinového fragmentu se fúzují nebo jsou operabilně spojeny prostřednictvím standardních vazeb, například prostřednictvím spojení peptidovou vazbou. Zvláštní vazby vhodné pro specifické značené elementy popsané dále i v textu jsou dobře známy v oboru.

Knihovna TDNE může obsahovat velké množství fúzních proteinů TDNE s alespoň jednou sadou členů knihovny TDNE, která obsahuje části proteinového fragmentu, které se vzájemně liší. V jiném provedení vynálezu knihovna TDNE obsahuje velké množství fúzních proteinů s TDNE, kde části fragmentu proteinu

členů knihovny TDNE se získala z určitého cílového proteinu. Upřednostňuje se, aby části fragmentu proteinu in toto reprezentovaly celou nebo v podstatě celou aminokyselinovou sekvenci cílového proteinu nebo celou nebo v podstatě celou část cílového proteinu známého tím, že se podílí na interakci protein-proteir..

Knihovna TDNE může také obsahovat velké množství expresivních vektorů TDNE, přičemž každý z nich exprimuj e fragment kandidáta proteinu nebo peptidu získaného z cílového proteinu fúzovaného s nosičovým proteinem nebo značkou. Knihovna TDNE může také obsahovat různé členy fúzního proteinu TDNE a/nebo obsahuje různé expresívní vektory TDNE, které se exprirr.ují a mohou být exprimovány v buňkách.

Ačkoli proteinový fragment může mit libovolnou délku může například dosahovat plné délky cílového proteinu (například přibližně 80 % nebo více celého cílového proteinu) . Tato část proteinu má v typickém případě délku přibližně šesti až přibližně 500 aminokyselin. Upřednostňuje se délka přibližně šesti až přibližně 50 aminokyselin nebo 6 až přibližně 150 aminokyselin a nejvíce se upřednostňuje délka přibližně 6 až 30 aminokyselin. Optimální délka proteinového fragmentu se bude měnit v závislosti na specifické struktuře testovaného proteinu a může se rutině stanovit strategií založené na mikroorganizmu a popsaných systémech, které umožňuji rychlé empirické stanovení preferované velikosti.

Jsou známy různé značky peptidů a mohou se použít jako u fúzních proteinů TDNE, které zahrnují, ale nejsou omezeny na polyhistidinovcu sekvenci (popisuje se v publikaci Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. and Wiley Interscience), glutathionovou

S-transferázu (GST, popisuje se v publikaci Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4: 220-229), protein z organizmu E. coli vázající maltózu (popisuje se v publikaci Guan et al., 1987, Gene 6: 21-30) a různé oblasti vázající celulózu • to toto ·· · ·· • · · · ··· to to to • · · · · *······ · ·· ···· ·· · ·· ··· (popisuje se v dokumentu patent USA5,496,934, 5,202,247,

5,137,819 Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7: 117-123) atd. Jiné možné peptidové značky jsou krátké aminokyselinové sekvence, proti kterým existují monoklonální protilátky. Jsou to například epitop FLAG, epitop myc v aminokyselinách v poloze 408 až 439, epitop hemaglutininu (HA) viru influenza. Jiné peptidové značky jsou rozeznávané specifickými vazebnými partnery a tak umožňují izolaci afinitnim navázáním na vazebného partnera, přičemž se upřednostňuje, aby se imobilizoval na povrchu pevné fáze. Je výhodné, že za účelem získání kódující sekvence shora uvedených peptidových značek je možné použít řadu metod. Tyto metody zahrnují, ale nejsou omezeny na klonování DNA, amplifikaci DNA a syntetické metody. Je možné běžně získat některé z peptidových značek a činidel vhodných pro detekci a izolaci. Vynález dále popisuje sekvence DNA kódující požadované peptidové značky, které je možné získat z knihoven nebo z komerčních zdrojů.

Mohou se také použít peptidové značky navržené pro cílové proteiny ve vnitřní buněčné membráně. Vedoucí sekvence spojené s proteiny, které se přirozeně nacházejí v periplazmě jsou například známy tím, že směřují sekreci cizorodých proteinů do periplazmy (popisuje se v publikaci Maclntyre et al., 1990,

Mol. Gen. Genet. 221: 466-474). Takové značky jsou částečně důležité při použití ve spojení které se popisují v sekci kandidáty dominantních

5.4.1 s testy založenými na CadC, dále v textu, aby zavedly elementů do periplazmatického prostoru, se popisují značky obsahující negativních preferovaném provedení vynálezu vedoucí sekvenci proteinu OmpA (popisuje se v publikaci Hobom et al., 1995, Dev. Biol. Stand. 84: 255-262). Je možné použít i jinou signální vedoucí sekvenci zahrnující vedoucí sekvenci pocházející z mikroorganizmu E. coli PhoA (popisuje se v publikaci Oka et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci 82: 7212-16), OmpT (popisuje se v publikaci Johnson et al., 1996, Protein Expression 7:

• · · • · · • · · • 9

9 99 9 9

104-113), LamB a OmpF (popisuje se v publikaci Hoffman Wright, 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 5107-5111), laktamáza (popisuje se v publikaci Kadonaga et al., 1984, Biol. Chem. 259: 2149-54), enterotoxiny (popisuje • · · • ·· • · ·· • · · · 9 «· • ··

999 and βJ.

se v publikaci Morioka-Fujimoto et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 1728-32), protein A z mikroorganizmu Staphylococcus aureus (popisuje se v publikaci Abrahmsen et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14: 7487-7500), endonukleáza z organizmu B. subtilis (popisuje se v publikaci Lo et al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 2287-2292) stejně jako umělé a syntetické sekvence (popisuje se v publikaci Maclntyre et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 221: 466-74, Kaiser et al., 1987, Scinece, 235: 312317) .

V provedení podle vynálezu se například kandidát TDNE může použít k charakterizaci genového produktu, ze kterého se odvodil dominantní negativní element. V tomto případě značka může obsahovat fluorescenční peptid, jako je GFP (zelený fluorescenční protein), který se může použít k identifikaci cílového genového produktu v určitém sub-buněčném kompartmentu například fluorescenční mikroskopií (popisuje se v publikaci Flach et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 8399-8407). V jiném provedení podle vynálezu se může značka obsahující antigenní peptid použít k imunohistochemickému barvení buněk za použití metod, které jsou dobře známy v oboru (popisuje se v publikaci Antibodies: A laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1988). Takové antigenní peptidové značky se mohou také použít k potvrzení skutečnosti, že kandidát TDNE interaguje s cílovým proteinem in vivo. V tomto provedení se TDNE může exprimovat ve vhodných hostitelských buňkách, které obsahují cílový protein a testy společné imu\Logické precipitace je možné použít k identifikaci interakcí in vivo a in vitro (popisuje se v publikaci Phizicky and Field, 1995 Microbiol. Rev. 59: 94-123). Mohou se použít jiné značky, které umožní stanovení třírozměrné struktury TDNE ♦ * ·Μ4 • · 9 9

9 9 φ

9 ♦ 9 9 9

pomoci metod stanovení standardní struktury jako je krystalografie pomocí paprsků X nebo jadernou magnetickou rezonancí (NMR). Stanovení struktury TDNE, který je slibný terapeutický kandidát vede k vývoji malých molekul, které napodobují účinek TDNE prostřednictvím struktury založených na navržení léku.,

Fúzní proteiny TDNE se kódují a exprimují prostřednictvím expresívních vektorů TDNE, které se popisují ve vynálezu. Expresívní vektor TDNE obsahuje počátek replikace vhodný pro uvažovanou hostitelskou buňku (například bakteriální nebo kvasinkovou buňku, selektovatelný markér a nukleotidové sekvence nutné pro expresi, přičemž se upřednostňuje indukovatelná exprese kandidáta TDNE v uvažované hostitelské buňce.

Detaily v případě konstrukce expresívních vektorů TDNE a knihoven se uvádějí dále v textu.

Nejdříve se připravují fragmenty DNA vhodné velikosti získané ze sekvencí nukleové kyseliny kódující cílový protein. Fragmenty je možné získat z nukleové kyseliny kódující cílový protein a z jiného zdroje. V typickém případě se fragmenty vyberou tak, že jejich kódované polypeptidy mají délku přibližně šest až 500 aminokyselin, upřednostňuje se délka přibližně šest až přibližně 50 aminokyselin nebo přibližně šest až 150 aminokyselin a nejvíce se upřednostňuje délka okolo šesti až 30-ti aminokyselin. Optimální délka proteinového fragmentu, který působí jako dominantní negativní element bude kolísat v závislosti na specifické struktuře testovaného proteinu, ale popsaná strategie založená na mikrobech umožňuje rychlé empirické stanovení preferované velikosti, která může mít různou formu od šesti do 12 aminokyselin, ale může být také tak velká, jako je velikost dosahující velikosti proteinu celé délky (například větší než 80 % velikosti celé délky).

Metody prc přípravu vhodně velkých fragmentů DNA zahrnují, ale nejsou omezeny na rozděleni DNA ultrazvukem kódující cílový protein, přednostně vznikají fragmenty o velikosti 200 až 700 párů baží za použití produktů PCR s náhodnými primery z cílového genu a konstrukce rodin fragmentů za použití sady restrikčních nukleáz, které vykazují sekvenční specifitu čtyř párů baží.

Ve specifickém provedení TDNE expresívní vektory a knihovny se mohou zkonstruovat za použití cílového genu rozděleného částečným štěpením restrikční nukleázou CviJI za uvolněných podmínek, které působí tak, že se štěpí v místech PyGCPy, PuGCPu a PuGCPy (popisuje se v publikaci Fitzgerald et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 3753-3762). V jiném případě je možné produkovat náhodné štěpeni za použiti směsi jiných restrikčních endonukleáz. Při částečném štěpení vznikají fragmenty, kdy se testuje přesná velikost (40 až 500 nukleotidů v případě

12-150 aminokyselinových proteinových fragmentů) a/nebo se vybírají podle velikosti za použití gelové elektroforézy. Sbírka takových kousků se může klonovat ve vhodném vektoru za vzniku požadované knihovny fragmentů (buď samotné nebo jako fúzní proteiny).

Dalším krokem při konstrukci expresívních vektorů a knihoven TDNE zahrnuje výběr značkového polypeptidu, který se používá při konstrukci fúzního proteinu. Volba značkových polypeptidů bude záviset na požadované aplikaci. Značky je možné vybrat tak, aby splňovaly různé funkce, které zahrnují, ale nejsou omezeny na subbuněčnou lokalizaci TDNE, umožňují získání a/nebo čištění TDNE, řetězení TDNE s okolními proteiny a imunologické srážení proteinových komplexů. V jiném případě může značka jednoduše sloužit jako nosičový protein, který zvýší stabilitu kandidáta dominantního negativního elementu nebo poskytuje další prostorový blok s proteinovou interakcí. Shora v textu se nepopisují žádné omezující příklady možných tag elementů.

0 ·· 00 · 0 0 · • ♦ · · «·· · * 0 · 0 · · 0 · 0 0 « 0 · • ♦ « 00 000000« · 0 • 00 · 0 0 «00 «00« ·· « «0 00«

Vynález popisuje expresívní vektor TDNE, který se může navrhnout tak, aby mohl upravit funkční značky. Různé expresívní vektory TDNE s kompatibilními klonovacími místy se sekvence kódující značky účely. Sekvence kódující mohou zkonstruovat tak, že obsahují navržené tak, že se hodí pro různé kandidáta dominantního negativního elementu se pak může přenést z j ednoho vektoru na jiný, který exprimuje element kandidáta fúzovaný s různými funkčními značkami. Kandidát TDNE se může například přenést z prvního vektoru, který kóduje značku užívanou pro stabilizaci nebo buněčnou lokalizaci v primárním testu do druhého vektoru, který kóduje antigenní značku, která se může použít při imunologickém srážení nebo imunohistochemické lokalizaci komplexů TDNE-protein. Metody a kompozice vhodné pro rutinní přesun sekvencí mezi vektory je dobře znám v oboru.

Další fragmenty DNA získané z genů, které kódují cílový protein nebo jiného kandidáta dominantního negativního elementu a nukleotidové sekvence kódující značky se klonovaly do vhodného expresívního vektoru buď ve společném nebo odděleném klonovacím kroku za použití standardních molekulárních biologických metod se například v publikaci Methods in Enzymology,

1987, vol.

154, Academie

Press, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd edítion, Cold spring Harbor Press, New York a Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (eds.), Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,

New York).

Jak se diskutuje shora v textu expresívní vektor TDNE obsahuje počátek replikace, selekční markér a vhodné regulační elementy a klonovací místa inzertu a exprese nukleotidových sekvencí kódující značku a kandidáta dominantního negativního elementu tak, že začlenění takového elementu vede ke schopnosti exprimovat TDNE přednostně regulačním způsobem

v hostitelské buňce (například mikrobiální buňka, jako je bakteriální nebo kvasinková buňka).

Při klonování a pomnožení v mikroorganizmu E. coli je možné použít libovolný počátek replikace mikroorganizmu E. coli, které jsou dobře známy v oboru. Příklady snadno dostupných plazmidových počátků replikace jsou počátky replikace získané z ColEl (popisuje se v publikaci Bolivar et al., 1977, Gene 2: 95-113, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd edition, Cold spring Harbor Press, New Yourk a Current Protocols in Molecular Biology), počátky pl5A, které se nacházejí na plazmidech, jako je například pACYC184 (Chang and Cohen, 1978, J. Bacteriol. 134: 1141-56, Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY pl0.4-10.11) a počátek pSCIOl dostupný expresí v plazmidech s nízkým počtem kopií. Jeden příklad plazmidu s vysokým počtem kopií obsahuje počátek replikace z plazmidu pUC19 a jeho derivátů (popisuje se v publikaci Yanish-Perron et al., 1985, Gene 33: 103-119). Vektory pUC existuji v množství 300 až 500 kopií na buňku a mají vhodná klonovací místa pro inzerci cizorodých genů.

V případě exprese fúzních proteinů TDNE expresívní vektor TDNE dále obsahuje DNA řídící elementy, které řídí expresi, přednostně regulují nebo indukují expresi v rozmezí různé síly exprese. V oboru jsou známy různé takové regulační sekvence. Schopnost vytvořit široké rozmezí exprese je výhodné pro využití metod podle vynálezu, jak se popisuje dále v textu.

Indukovatelná exprese vede širokému rozmezí síly exprese a je jí možné dosáhnout využitím různých indukovatelných regulačních sekvencí. Síla exprese z TDNE knihovny expresivních konstrukcí může být různá za použití promotorů o různé síle. V jednom provedení vynálezu například gen láci a jeho indukční činidlo IPTG se může využívat k indukcí silné exprese knihoven TDNE, kdy sekvence kódující takové polypeptidy se přepisují prostřednictvím regulačních sekvencí • Φ ·· · # · φ · φ φ φ φ · · · · · φ φ φ φ φ φ φ φ · · φ φ · φ φφ φφφφ »· φ φφ φ · φ lacOP. Jiné regulované expresívní systémy, které je možné využít, zahrnují promotor araC, který se indukuje arabinózou (AraC), systém TET (popisuje se v publikaci Geissendorfer and Hillen, 1990, Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 657-663), promotor p_L fága λ, který je možné vyvolat teplotou, a indukovatelný lambda represor CIg57 (popisuje se v publikaci Pirrotta, 1975, Nátuře 254: 114-117, Petrenko et al., 1989, ;

Gene 78: 85-91), systém promotoru a represoru trp (popisuje se v publikaci Bennett et al., 1976, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 73: 2351-55, Warne et al., 1986, Gene 46: 103-112), promotor lacUV5 (popisuje se v publikaci Gilbert and Maxam, 1973, Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 70: 1559-63), lpp (popisuje se v publikaci Nokamura et al., 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 289299), gen T7-10 promotor, PhoA (alkalická fosfatáza), recA (popisuje se v publikaci Horii et al. 1980) a promotor tac , fúzní promotor trp-lac, který je indukovatelný tryptofanem (popisuje se v publikaci Amann et al. , 1983, Gene 25: 167-78) .

Jsou to všechno běžně používané silné promotory, jejichž ί výsledkem je akumulace 1 až 10 % celkového buněčného proteinu v případě proteinu, jehož množství je řízeno každým promotorem. Jestliže je nutný silnější promotor pak je možné použít promotor tac, který je přibližně desetkrát silnější než lacUV5, ale výsledkem jeho použití je silnější exprese a měl by se použít pouze v případě, kdy má dojít k nadměrné expresi.

Jestliže je nutný slabší promotor je možné použít jiné bakteriální promotory. Jsou to například maltóza, galaktóza nebo jiný požadovaný promotor (sekvence takových promotorů jsou dostupné z genové banky (popisuje se v publikaci Burks et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 2227-2230).

Indukce exprese TDNE přednostně probíhá způsobem závislým na expresi polypeptidů cílového genu (například exprese jedné konstrukce je indukovatelná lac a jiná je indukovatelná ara) . Vybraný vektor může být kompatibilní s konstrukcemi užívanými v testech interakcí protein-protein, které se popisují v sekci dále v textu. Pro odborníka je výhodné ocenit kompatibilitu, která je nutná pro udržení více plazmidů v jedné buňce. Metody pro pomnožení dvou nebo více konstrukcí v mikrobiálních buňkách jsou dobře známy v oboru. Rutinním způsobem se mohou vybrat například buňky obsahující velké množství replikonů a mohou se udržovat využitím vektorů, které obsahují vhodné kompatibilní počátky replikace a nezávislé selekční systémy (popisuje se v publikaci Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd edition, Cold spring Harbor Press, New Yourk a Current Protocols in Molecular Biology, Miller 1992, A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).

S ohledem na expresi v kvasinkách a vektory využívané pro expresi v kvasinkách, vhodné počátky replikace, to znamená 2 μιη vektorů odvozených z kruhu, regulační sekvence vhodné pro expresi a to jak konstitutivní tak regulační, například indukovatelnou expresi. Ze zdrojů uvedených dříve v této sekci je možné získat počáteční buňky vhodné pro produkci systému založených na kvasinkových buňkách. V případě manipulace a udržování kvasinkových buněk je možné využít standardních metod. Standardní metody je možné také použít při rekombinantní expresi, která zahrnuje regulovatelnou expresi. Popisuje se v publikaci Kaiser, C., 1994, „Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbot Laboratory Press, New York a Spenser, J. F. T., 1989, „Yeast Genetics, Spring-Verlag, New York) .

Testovací systémy vhodné pro identifikaci značených dominantních negativních elementů

Při identifikaci dominantních negativních elementů, které vážou a/nebo vykazují inhibiční aktivitu na cílový protein se může použít řada testovacích systémů. V typickém případě testovací systém obsahuje buňku zahrnující fúzní protein TDNE a/nebo expresívní vektor TDNE, který se exprimuje nebo ·· ·· • · · • · t · ♦

• · ·· neexprimuje v buňce, přednostně regulovatelným například indukovatelným způsobem. Tento systém v typickém případě dále obsahuje partnerský systém, který se podílí na interakci protein-protein nebo část partnerského proteinu, který se podílí na interakci protein-protein, a/nebo expresívní vektor, který exprimuje elementy popsané dále v textu, které umožňují test interakce protein-protein.

V typickém případě takové testovací systémy odpovídají interakci protein-protein nebo jejich porušení detekovatelným signálem. Detekovatelný signál může představovat expresi identifikovatelného genového produktu, který se aktivuje při odezvě na interakci protein-protein nebo jeho porušením. Protein (X) a souhrn kandidátů dominantních negativních elementů (Y_x, složený z Yi, Y₂, ..., Y_a) se mohou exprimovat ve vhodném buněčném systému, kde každá složka se fúzuje s oblastí vázající DNA (DB) nebo s aktivační oblastí (AD) tak, že molekuly uvedené struktury DB-X a AD-Y_X se tvoří v buňce. V případě, že DB-X najde partnera vázajícího AD-Y výsledná DBX/AD-Y interakce bude znovu rekonstituovat funkční transkripční faktor, který aktivuje reportní gen řízený promotorem obsahujícím místa navázání DB.

V jiném provedení vynálezu cílový protein X se může fúzovat s aktivační oblastí AD tak, že se vytvořila AD-X a společně se exprimuje s knihovnou TDNE DB-Y_X složenou s potencionálními dominantními negativními elementy Y_x fúzovanými s oblastí vázající DNA DB. TDNE, který se váže na cílový protein X se může definovat aktivací reportního genového systému.

V jiném provedení vynálezu každý ze dvou cílových proteinů, o kterých se ví, že reagují in vivo, X a Z se mohou fúzovat s jedním z DB a AD, tak vznikají DB-X a AD-Z. Společně se exprimující DB-X a AD-Y způsobují konstitutivní aktivaci reportního genového systému. Společná exprese DB-X a AD-Y vede ke konstitutivní aktivaci reportního genového systému.

Společná exprese členů knihovny [T]DNE (za použiti takového přístupu dominantní negativní elementy nezbytně mají fúzní proteiny, ačkoli se fúzní proteiny preferují), která přerušuje uvedené interakce povede k potlačení exprese systému reportního genu. [T]DNE, které inhibují interakci X a Z, se mohou identifikovat uvedeným způsobem.

Popisuje se řada systémů, které se mohou upravit za účelem identifikace dominantních negativních elementů. Jeden dobře známý systém je kvasinkový dvouhybridní systém (popisuje se v publikaci Fields and Song, 1989, Nátuře 340: 245-246, White

1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 10001-10003, Warbick,

1997, Structure 5: 13-17), který se používá k identifikaci interagujícich proteinů a k izolaci odpovídajících kódujících genů. V tomto systému se používají prototrofní selektovatelné markéry, které umožňují výběr podle pozitivního růstu, jako reportni geny, které umožňují identifikaci interakce proteinprotein. Při aplikaci shora uvedeného obecného schématu, je možné identifikovat mezi nerostoucími koloniemi rostoucí kolonie buněk kvasinek exprimující proteiny interagující s DBX/AD-Y (popisuje se v publikaci Gyris et al., 1993, Cell 75:

791-803, Durfee et al., 1993, Genes Dev. 7: 555-569, Vojtek et al., 1993, Cell 74: 205-214). Příbuzné systémy, které se mohou použít, zahrnují kvasinkový tříhybridní systém (popisuje se v publikaci Licitra and Liu, 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 12817-12821, Tirode et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 22995-22999) a kvasinkový reverzní dvouhybridní systém (popisuje se v publikaci Vidal et al., 1996, Porc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 10321-10326, Vidal et al., 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 10315-10320).

V oboru jsou také dobře známy bakteriální systémy vhodné pro identifikaci interakcí protein-protein a mohou se upravit pro použití při metodách provedení vynálezu, jak se detekční systém založený na podle vynálezu. Například při popisuje dále v textu, dimerový CadC v mikroorganizmu E. coli se

I • Φ φφ • · ·

• · φ φφφ • Φ φφφφ může použit při identifikaci dominantních negativních elementů (přihláška PCT č. WO 99/ 23116 podaná 14.5.1999). V jiném provedení vynálezu se může použít bakteriální interakční systém založený na proteinu AraC, který reguluje L-arabinózový operon v mikroorganizmu E. coli (popisuje se v publikaci Bustot and Schleif, 1993, proč. Nati. Acad. Sci. uSA 90: 56385642, Soisson et al., 1997, Science 276: 421-425, Eustance et al., 1994, J. Mol. Biol. 242: 330-338). Jiné testovací systémy, které se mohou použít, zahrnují bakteriální systémy založené na lambda represorovém systému (popisuje se v publikaci Zeng et al., 1997, Protein Sci. 6: 2218-2226), operon lac (popisuje se v publikaci Gates et al., 1996, J. Mol. Biol. 255: 373-386), detekce interakčního signálu založená na proteinu lambda a lambdoidním proteinu (popisuje se Hollis et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 58345838), systémy založené na RNAP organizmu E. coli (popisuje se v publikaci Dove et al., 1998, Genes Dev. 12: 745-754, Dove et al., 1997, Nátuře 386, 627-630) a systémy založené na cAMP syntetáze (popisuje se v publikaci Karimova et al., 1998, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95: 5752-5756). Mohou se vyvinout systémy založené na bakteriálních proteinech, aby se detekovaly a kvantifikovaly interakce protein-protein. Takové systémy se mohou modifikovat, aby umožnily společnou expresy rodin fragmentů cílového proteinu fúzovaného s nosičovým proteinem, který umožňuje detekci TDNE a blokuje interakci protein-protein.

Obecné principy testů vhodných pro identifikaci TDNE, které interferují s navázáním cílového proteinu se popisují dále v textu. V této sekci se zvláště popisuje použití CadC dimerizačního detekčního systému založeného na organizmu E. coli, homodimérového detekčního systému založeného na AraC a kvasinkového dvouhybridního systému.

• · • · • · ♦ ···♦ 9

CadC dimerizační detekční testy v mikroorganizmu E. coli a jejich použití při identifikaci dominantních negativních elementů.

CadC je jednoduchý transmembránový receptorový protein nalezený u mikroorganizmu E. coli s duální funkcí a jiné fylogeneticky příbuzné druhy. U mikroorganizmu E. coli funkce CadC je citlivá na signály prostředí pH a lyzinu a odpovídat modulací transkripce z operonu cadBA (popisuje se v publikaci Meng et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 1221-1234). CadC se skládá ze tří funkčních domén. Je to periplazmatická snímací doména (PSD), transmembránová oblast (TMD) a cytoplazmatická oblast regulující transkripci (TRD). Aktivace transkripce regulační oblasti cadBA vyžaduje interakci, to znamená dimerizaci mezi periplazmatickými oblastmi CadC. Může se měřit síla exprese reportního genu, který je operativně spojený s regulační oblastí cadBA, aby se detekovala síla dimerizace CadC.

Tento systém se použil při vývoji expresívního systému závislého na dimerizaci. Tento systém se používá při vývoji expresívního systému závislého na dimerizaci, který se může použít při testování interakcí protein-protein u libovolného cílového proteinu (popisuje se v přihlášce PCT č. WO 99/23116). Fúzní polypeptidy s CadC se zkonstruovaly spojením sekvencí, které kódují aktivaci CadC a transmembránových oblastí se sekvencemi, které kódují aktivaci CadC a transmebránové oblasti se sekvencemi, které kódují interakční oblast protein-protein získanou ze známého cílového genu nebo z neznámého testovaného genu. Dimerizace, ať už je homotypická nebo heterotypická, periplazmatické oblasti vede k aktivace transkripce regulační oblasti cadBA a k expresi reportní genové sekvence. Sekvence „reportního genu, který reaguje na CadC, může obsahovat libovolnou genovou sekvenci, která exprimuje nebo kóduje detekovatelný genový produkt (RNA nebo protein). Takový genový produkt je detekovatelný buď na ♦ 9 základě své přítomnosti nebo na základě jeho aktivity, která vede k vyvinutí detekovatelného signálu. Reportní gen se používá v souladu s vynálezem k monitorování schopnosti testované sloučeniny aktivovat transkripční regulační oblast CadC. V preferovaném provedení vynálezu se například enzymatické značky a značky emitující světlo analyzovaly kolorimetrickými nebo fluorometrickými testy. Takové reportní geny zahrnují, ale nejsou omezeny na β-galaktozidázu (popisuje se v publikaci Roberts et al., 1989, Curr. Genet. 15: 177180), lucifarázu (popisuje se v publikaci Miyamoto et al., 1987, J. Bacteriol. 169: 247-253) nebo β-laktamázu. V jednom provedeni vynálezu sekvence reportního genu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje produkt genu lacZ, což je β-laktamáza. Enzym je velmi stabilní a vykazuje širokou specifitu, což umožňuje použití různých histochemických, chromogenních nebo fluorogenních substrátů, jako je 5-bromo-4chloro-3-indoyl^-D-galaktozid (X-gal), chlorofenolová červeň β-D-galaktozidu (CPRG, popisuje se v publikaci Eustice et al.,

1991, Biotechniques 11: 739-742), laktóza 2,3,5-trifenyl-2Htetrazolium (laktóza-tetrazolium) a fluorescenční galaktopyranozid (popisuje se v publikaci Nolan et al., 1988, citace uvedena shora v textu). Příklady uvedené shora v textu demonstrují úspěšnou identifikaci přerušení zprostředkované TDNE interakce fúzniho polypeptidu-CadC měřením síly aktivity reportního genu β-galaktozidázy. V oboru je známa a může se využívat řada sekvencí jiného reportního genu. Mezi ně patří bioluminiscenční, chemiluminiscenční a fluorescenční proteiny nebo proteiny, které potvrzují rezistenci na antibiotika. Může se použít

Mohou se napříkla chloramfenikolová transacetyláza (CAT).

také použít sekvence jiného selektovatelného reportního genu a zahrnují sekvence genu, který kóduje polypeptidy, které nesou rezistenci na zeocin (popisuje se v publikaci Hegedus et al.,

99	• 9	9*	•	99 9
•	♦	• 9	9	•	9	• 9	9 9
•	•	•	9 9	9 9	• 9	•
9	•	• 9	•	•	9999	9 9 ·	•
• 9	9	• 9	9	9 9	•
9 9	• · 9 9	99	9	9 9	9 9 9

1998, gene 207: 241-249) nebo kanamycin (Friedrich and Soriano, 1991, Genes. Dev. 5: 1513-1523). CadC-fúzni polypeptidy a cadBA reportni konstrukce se mohou zkonstruovat metodou standardní rekombinace DNA (například Methods in Enzymology, 1937 , vol. 154, Academie Press a Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd edition, Cold spring Harbor Press, New Yourk a Current Protocols in Molecular Biology, Miller 1992, A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY a Ausubel et al., Current Protocols in molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York).

V případě použití při testování TDNE fúzní polypeptid CadC se zkonstruoval za použití genové sekvence, která kóduje cílový protein v případě periplazmatické oblasti .fúzního polypeptidu CadC. V případě, že se analyzuje heterotypická interakce zkonstruoval se druhý fúzní polypeptid CadC za použití partnera cílového proteinu v případě periplazmatické oblasti fúzního polypeptidu CadC. Navíc se zkonstruovala knihovna TDNE, která zahrnuje velké množství vektorů TDNE, která je schopna exprimovat fragmenty cílového proteinu nebo v jiném případě fragmenty partnera cílového proteinu. Fúzní polypeptidy CadC se pak exprimují v buňce, která obsahuje oba CadC fúzní polypeptidy a konstrukce reportního genu CadBA. Zjistilo se, že z reportního genu se detekoval pozitivní signál, přičemž v knihovně TDNE se vyvolala exprese a buňky se nanesly na selektivní médium. Kde společná exprese vede k relativnímu zeslabení exprese reportního genu se identifikoval kandidát TDNE. Vybraly se buňky, ve kterých se porušil pozitivní signál a izolovala se plazmidová DNA kandidáta TDNE a dále se analyzovala.

Systémy založené na kvasinkách, které se používají k identifikaci dominanntích negativních elementů.

• 9 ·* 99 999

999· · 9 · · 99

9 999999

9·>9 9999 999

999 99999 • 9 999» 79 9 999

Zatímco shora popsaný systém založený na CadC poskytuje způsoby pro rychlé testování a definici interakce, které vedou identifikaci dominantních negativních elementů v případě mnoha tříd proteinů, existují jistá omezení při expresi a analýze eukaryontních proteinů v bakteriálních buňkách. Například tam, kde dochází k post-translačním úpravám, jevy, jako je fosforylace, glykosylace, palmitoylace, myristilace nebo proteolytické zpracování, jsou důležité při vytvoření a stabilitě interakcí protein-protein v eukaryontním hostiteli. Vyvinuly se modifikace příbuzné TDNE systému založených na kvasinkách, které jsou vhodné pro stanovení a charakterizaci obou heterotypických a homotypických interakcí proteinprotein .

V jiném provedení vynálezu se může použít úprava příbuzná TDNE kvasinkového duálního systému a může se upravit k testování dominantních negativních elementů, které se váží a/nebo inhibují cílový protein. Tento systém upravený a přizpůsobený metodám podle vynálezu je zobrazen na obrázku č. 2.

V souladu s vynálezem takový systém může obsahovat:

1) reportní gen spojený s operačním místem vázajícím LexA,

2) druhý reportní gen spojený se stejným vazebným místem, jako se popisuje v odstavci 1),

3) třetí reportní gen spojený s operačním místem vázající cl,

4) první fúzní gen a obsahující LexA a partnerský protein (nebo jeho část, která se podílí na interakci proteinprotein) , u kterého se dříve prokázala interakce,

5) druhý fúzní gen, který kóduje protein obsahující oblast proteinu aktivující transkripci, fúzovaný s cílovým proteinem (nebo jeho část, která se podílí na interakci protein-protein) partnerského proteinu popsaného v odstavci 4) , • 9

6) TDNE nebo knihovna TDNE získaná buď z partnerské sekvence popsané v odstavci 4) nebo cílové sekvence popsané v odstavci 5) fúzované s cl.

Ve shora uvedeném systému se může použit sekvence libovolného reportniho genu a/nebo ta, která je uvedena na obrázku č. 2. Aktivity produktů sekvenci reportniho genu popsaných v odstavci 1), 2) a 3) jsou od sebe odlišitelné.

V tomto systému za účelem exprimovat reportní geny popsané v odstavci 1) a 2), protein exprimovaný sekvencí 4) a protein exprimovaný sekvencí 5) musí interagovat tak, že se výsledný komplex váže na první reportní gen popsaný v odstavci 1) a 2) a aktivuje jeho expresi. Interakce proteinů popsaných v odstavci 4) a 5) se objevila prostřednictvím interakce protein-protein.

Může se identifikovat kandidáta TDNE, který moduluje interakci protein-protein, ko-expresí sekvencí popsaných v odstavci 4), 5) a 6) ve shora uvedeném systému a testováním exprese reportniho genu, která je vztažená na sílu získanou v systému, kdy nedochází k expresi sekvencí popsaných v odstavci 6) (zobrazeno na obr. č. 2B) . V příkladech, kde výsledky společné exprese vedou k relativnímu zvýšení exprese reportních genů popsaných v odstavci 1) a 2), se identifikoval kandidát TDNE. Zesílením exprese reportniho genu popsaného v odstavci 3) se také identifikoval kandidát TDNE.

Pozorování takového fenotypu „trap v případě fúzního proteinu cl popsaného v odstavci 3) potvrzuje fúzi v rámci a v některých případech reportní gen umožní přímou selekci fúze v rámci s fenotypem „trap. V této konfiguraci kmen, ve kterém se izolovala interakce „trap, se také testuje za účelem zjištění blokačního fenotypu, jak se pozorovalo prostřednictvím snížení exprese popsané v odstavci 1) a 2) .

Shora uvedený přístup založený na systému proto poskytuje strategii založenou na mikroorganizmu vhodnou k identifikaci kandidáta TDNE, který bude blokovat interakce protein-protein a tak bude identifikovat TDNE, které budou působit jako dominantní negativní sekvence. Očekává se, že porušení přirozené terciální struktury příbuzného rodičovského proteinu dominantním negativním elementem vede ke zrušení funkce. Zrušení funkce umožní testování hypotetické funkce. Zrušení funkce může vést k objevení funkce proteinu, aniž existuje hypotéza její existence. Navíc vedle existence chiméry, která může hodnotit funkci v modelových systémech, inhibiční TDNE identifikovaná v tomto systému může také mít hodnotu jako terapeutické činidlo v těch případech, kde ablace funkice má požadovaný konečný bod terapie.

Interakční chiméra TDNE vykazuje také potenciál, který se používá jako cytologická činidla na základě jejich demonstrované schopnosti reagovat s důležitými oblastmi. Postupy použité k definici interakčního potencionálu TDNE, to znamená jejich chování v blokačních a „trap testech budou doprovázeny interpretací libovolného cytologického pozorování. Běžná část cl všech TDNE získaných na základě uvedené strategie umožní ve všech pracích použít jediné činidlo založené na protilátkách. Informace o subbuněčném výskytu a distribuci v tkáních nového proteinu dále pomáhá definovat jeho funkci.

V případě, že identifikovaný TDNE interferuje s definovanou funkcí partnerského proteinu, může se ke stanoveni sloučenin, například malých molekul, stejný systém, který blokuje stejnou interakci protein-protein a nepřekrývá inhibiční účinek kandidáta TDNE. V tomto přístupu se testovaly dvě různé interakce a v případě sloučeniny, která obrací „trap interakci jsou možné dva výstupy. Sloučenina by mohla být komponentem blokačních interakcí aktivátorové fúze s oběmi zkrácenými oblastmi TDNE fúzovanými s cl a intaktní oblastí . To znamená původní fúzi LexA. V tomto případě značka získaná z ze značky spojené s cli se ztratí a odezva ze značky spojené s LexA zůstává neaktivní. V tomto scénáři reportní molekula spojená s LexA je v původně neaktivní, protože fúze cl se uchází o aktivátor a zůstává neaktivní, protože sloučenina, která rozrušuje interakci cl se zkrácenou oblastí také blokuje interakci fúze LexA plné délky. Je také možné, že sloučenina může blokovat interakci se zkrácenou fúzí cl, ale neblokuje více extenzivní interakci s fúzí LexA v plné délce.

Taková sloučenina vede ke ztrátě reportní aktivity cl a k znovu nastolení reportního signálu

LexA.

Zde popsaný systém se může použít nikoliv pouze k identifikaci sloučenin, ale také k jejich charakterizaci.

Při vývoji sloučenin je možné použít různé strategie , které spadají do dvou zde popsaných kategorií. V obou případech však sloučenina není zajímavá, protože demonstruje schopnost blokovat interakci , která se nejdříve ukázala být kritická na základě své schopnosti poskytnout kontakty nezbytné pro vytvoření základu dominantního negativního fúzního proteinu.

V jednom specifickém příkladu takového systému podle vynálezu systém zahrnuje specifické kvasinkové pozadí obsahující modidikované duální schéma založené na buňkách kvasinek vhodné pro identifikaci TDNE získaného z lidského HARas, lidského c-Rafl a lidského aktivovaného Rafl.

Systém vhodný pro identifikaci TDNE z lidského HA-Ras obsahuj e:

1) fúzní gen LexA-dfRas (df v případě mutagenizovaného boxy CAAX) začleněný do kvasinkového chromozomu SKY191 a řízený promotorovou oblastí ADH,

2) fúzní gen cI-operátor-LacZ v plazmidu o velikosti 2 mikronů řízený promotorovou oblastí minimální promotorovou oblastí Gall závislou na aktivátoru,

3) fúzní gen aktivační oblast-c-Rař (ΆΌ-cRaf) v plazmidu o velikosti dva mikrony řízený galaktózovým indukovatelným promotorem Gall,

4) reportní fúzní gen LexA-operátor-LacZ v plazmidu o velikosti dvou mikronů řízený promotorovou oblastí minimální promotorovou oblastí Gall závislou na aktivátoru,

5) fúzní knihovnu cI-TDNE v plazmidu s velkým množstvím kopií o velikosti 2 mikrony řízenou promotorovou oblastí ADH.

Kvasinkové buňky SKY-191 s integrovaným fúzním genem LexAdfRas a s fúzním genem aktivační oblast-cRafl v plazmidu o velikosti dvou mikronů se kultivují na kultivačním médiu s galaktózou. Oba fúzní proteiny se syntetizují a tvoří diméry. Vytvoření diméru vede k aktivaci transkripce dvou reportních genů: LexA-operátor-gen Leu2 v chromozomu a LexAoperátor-reportní gen LacZ v plazmidu o velikosti dvou mikronů. Kvasinky pak mohou růst na syntetickém kultivačním médiu bez leucinu a produkují modrou barvu na kultivačním médiu, které obsahuje XGal. Když se nadměrně exprimuje knihovna potencionálního TDNE, to znamená fúze cI-dfRas také se nadměrně exprimují ty fúzní proteiny cI-TDNE (z plazmidu s velikostí dvou mikronů), které účinně interagují s fúzí AdcRafl při transkripční aktivaci reportní fúze cl-operátorLys2. Tato aktivace umožňuje kvasinkám s fúzemi TDNE cI-dfRas, aby se selektovaly na kultivačním médiu s lyzinem. Sada fúzí vybraných na základě lyzinu může interagovat silně s fúzi ADcRafl a způsobují úplnou ztrátu (nebo úpravu) aktivace prvních dvou reportních genů. To znamená LexA-operátor-ieu2 a LexAoperátor-ňacZ. Takové fúze vykazují jak „záchytný tak blokační fenotyp a považují se proto za kandidáty dominanntích negativních elementů, které se testují v tkáňových kultivačních modelech za účelem zjištění, zda vykazují vratný transformační fenotyp Ras.

Je možná řada alternativních provedeních vynálezu. Například v některých provedeních vynálezu dominantní negativní elementy se mohou přímo vybrat na základě blokačního fenotypu a mohou se vybrat nefúzni proteinový formát.

Tento přístup zahrnuje následující elementy:

• · • · ·· • · · ·· • ·· ·· fúzni gen d-dfRas na plazmidu s velkým množstvím kopii velikosti 2 mikrony řízený promotorovou oblastí ADH, mikrony řízený fúzní gen AJ-cRafl na plazmidu o velikosti 2 galaktózovým indukovatelným promotorem Gall knihovnu fragmentů DNA dfRas na plazmidu o velikosti 2 mikrony s genem rezistence na případě, že buňky kvasinek antibiotika.

SKY 191 rostou na kultivačním médiu, které obsahuje galaktózu, syntetizuje se cI-dfRas a ADcRafl.

Interakce mezi těmito fúzními proteiny způsobuje aktivaci transkripce v chromozomu reportního genu cI-operátor-Lys2 kvasinek SKY191. K odumírání buněk dojde, když se takové buňky kultivují na kultivačním médiu, které obsahuje a aminoadipat.

Nadměrná exprese dominantního negativního fragmentu dfRas a dfRas poruší nebo zcela

Ztráta této odstraní interakci mezi claktivace umožňuj e

AD-cRafl.

transkripce reportního kvasinkám růst na interakce vede ke genu cI-operátor-Lys2, kultivačním médiu ztrátě který s aaminoadipátem. Tato element založený na strategie nezahrnuje dominantní negativní fúzi. To však umožňuje řídit selekci a identifikaci antisense sekvencí, které mohou blokovat expresi

Ras a umožňují identifikaci různé třídy elementů supresorů vedle dominantních negativních elementů založených na proteinu.

Molekuly nukleových kyselin podle vynálezu se mohou nacházet ve vektorech, které vedou k expresi těchto molekul v širokém rozmezí síly exprese. Například v jednom provedení vynálezu fúzní gen AexA-dfRas se začlení do chromozomu kmene SKY191 za použití integračního vektoru, aby se snížila síle exprese. Taková modulace exprese fúzního proteinu LexA-dfRas umožňuje řízené soutěžení mezi proteiny LexA-dfRas a TDNE cldfRas při interakci s AD-cRafl.

Sloučenina podle vynálezu dále zahrnuje knihovny TDNE obsahující vazebnou část DNA cl kovalentně fúzovanou s peptidy získanými z proteinů. Podobné knihovny je možné konstruovat • · · · · · »

s jinými proteiny vázajícími DNA, které jsou vhodné pro hostitelské buňky.

Metody podle vynálezu zahrnují přípravu knihoven TDNE proteinu. Takové metody zahrnují, ale nejsou omezeny na porušení DNA ultrazvukem na fragmenty v rozmezí velikostí 200 až 700 párů baží, použití produktů PCR s náhodnými primery z uvedených genů a konstrukce rodin fragmentů za použití aplikace sady restrikčních nukleáz, které vykazují uspořádání sekvence po čtyřech párech baží.

Metody podle vynálezu dále zahrnuji metody identifikace fragmentů TDNE obsahující inkubaci kvasinkových buněk podle vynálezu, kde knihovna TDNE prvního proteinu se exprimovala po dlouhou dobu se dvěma proteiny fúzovanými s navázanou DNA nebo s transkripční aktivační oblastí. Interakce TDNE s aktivační doménovou fúzí druhého proteinu způsobí expresi specifických reportních genů. Exprese těchto reportních genů umožní kultivaci kvasinkových buněk podle vynálezu na specifickém syntetickém médiu a povede k izolaci TDNE z proteinu. Při použití jiné metody při identifikaci TDNE bude TDNE modulovat interakci dvou proteinů. Taková modulace způsobí aktivaci transkripce odpovídajícího transkripčního genu a povede k růstu kvasinkových buněk podle vynálezu na specifickém syntetickém kultivačním médiu.

Metody podle vynálezu dále zahrnují metody vhodné pro identifikaci sloučenin, které modulují interakce proteinprotein. Je to například interakce mezi TDNE a uvedeným proteinem. Takové metody zahrnují inkubaci kvasinkových buněk podle vynálezu a testovanou sloučeninu, která porušuje interakci mezi TDNE a fúzi aktivační oblasti druhého proteinu, což vede k přerušení exprese reportního genu cI-operátor-Lys2. Buňky kvasinek podle vynálezu mohou růst v přítomnosti testované sloučeniny na syntetickém kultivačním médiu obsahujícím α-aminoadipát. Sloučenina, která porušuje interakci mezi TDNE a druhým proteinem se může identifikovat *· ·· φ · ··· ···« · · φ ·« φ φ · φ φ · · φφ φ φ · φ · φ φ φ φ φ φ φ* • · * φ · · φ· φφ φφφφ φ« ·· · růstem na α-aminoadipátu. Může se také hodnotit účinek identifikované sloučeniny na interakci protein-protein prvního a druhého proteinu. Při jiné metodě identifikace sloučeniny, se testuje aktivace reportního genu cI-operátor-LacZ vznikla z interakce mezi TDNE a aktivační doménovou fúzí druhého proteinu. V případě, že síla exprese LacZ v buňkách kvasinek inkubovaných se sloučeninou je nižší ve srovnání s kontrolními kvasinkovými buňkami inkubovanými ve stejném růstovém médiu, které neobsahuje testovanou sloučeninu, identifikoval se anatgonista interakce protein-protein. V případě, že se pozoruje silnější exprese reportního produktu LacZ, definuje se agonista interakce protein-protein.

Identifikace TDNE prostřednictvím homodimérních detekčních systémů založených na AraC mikroorganizmu E. coli

Mikrooragnizmus E. coli může metabolizovat pentózový cukr arabinózu expresí operonu araBAD. Enzymy kódované araBAD se produkují pouze, když je přítomna arabinóza a buňky se vyskytují ve stádiu nízké energie. Regulační protein AraC řídí expresi AraBAD.

AraC pozitivně reguluje operon araBAD. Tento mód regulace je doprovázen alternantivním navázáním homodiméru AraC. V nepřítomnosti arabinózy se dimér AraC váže na dvě odlišná místa v operonu ara. Jedna podjednotka proteinu AraC přichází do kontaktu s místem araO₂, zatímco druhá podjednotka přichází do kontaktu s místem araOj. Tato konformace způsobuje smyčku DNA regulační oblasti, která prostorově interferuje se schopnosti polymerázy RNA interagovat s promotorovými oblastmi obou proteinů araC a araBAD. V přítomnosti arabinózy naopak homodimér AraC disociuje z ara02 a arali a váže se na arali a aral2. V této konfiguraci protein AraC aktivuje transkripci.

Protein AraC, který obsahuje 292 aminokyselinových zbytků se skládá ze tří funkčních oblastí AraC popisuje se v publikaci Stoner and Schleif, 1982, J. Mol. Biol. 152: 649652). Zbytky jedna až 170 se podileji na dimerizaci molekul AraC a váži se na arabinózu. Flexibilní oblast linkeru, to znamená aminokyselinových zbytků 171 až 178, váže dimerizačni oblast oblasti vázající DNA a definuje se pomocí aminokyselinových zbytků 179 až 292. Funkce aktivace transkripce proteinu AraC je blízce spojena s oblastí vázající DNA.

Modulační protein AraC se může experimentálně manipulovat. Linkerová oblast se může například prodloužit. Dimerizačni oblast AraC se může nahradit heterologními dimerizačními oblastmi. Chiméra AraC, kde heterologní oblast vykazuje dimerizačni funkci, modulace dimerizace se může monitorovat změnami funkce aktivace transkripce AraC. Tato funkce se může testovat prostřednictvím detekce exprese reportního genu, která závisí na AraC. Libovolné sekvence reportního genu, například sekvence reportního genu, jak se popisují shora v textu, a testy detekující expresi reportního genu se mohou použít jako část testů.

V souladu s vynálezem sekvence cDNA pocházející například z nových zajímavých genů, buď celé nebo části se mohou fúzovat s oblastí navázání DNA/aktivace AraC. Dimerizačni kapacita takto vytvořených chimér se může testovat měřením jejich schopnosti aktivovat transkripci promotoru závislého na AraC. Dimerizačni kapacita vytvořených chimér se může testovat měřením jejich schopnosti aktivovat transkripci promotoru závislého na AraC, které jsou přednostně operativně spojeny s reportním genem (popisuje se v sekci 5.4.1 shora v textu). V případech, dochází k aktivaci, kde vznikají knihovny, které se skládají ze subfragmentů dimerizujících sekvencí fúzovaných s nosičovým proteinem tak, že vzniká knihovna TDNE. Testovací systém založený na AraC je znázorněn na obrázku č. 1. Preferované nosičové proteiny zahrnují, ale nejsou omezeny na GFP nebo GST v bakteriálních homodimérových interakčních

6 • · systémech a protein systému. Řada jiných

Ci v upraveném duálním dvouhybridním proteinů nebo proteinových fragmentů mohou být preferované nosiče závisející na zkoumané otázce.

Odborník je schopen stanovit nejvhodnější nosičovy protein pro libovolný specifický přístup. U členů knihovny se následně testuje jejich schopnost blokovat transaktivační kapacitu chiméry AraC. Tyto členové knihovny zahrnující fragmenty s blokační aktivitou budou kandidáty fúzí, které jsou vhodné pro další testování jako dominantní negativní elementy.

Shora uvedený přístup založený na systému AraC je možné zvláště použít jako první testovací systém při charakterizaci neznámého cílového proteinu. Je to velmi jednoduchý a levný systém, který se může provést v mikroorganizmu E. coli, způsobem s vysokou prostupností a s vysokou časovou účinností. Tento systém umožňuje získat relativně rychlý pohled na oligomerizační kapacitu genových produktů. Sytém založený na AraC se v obecném případě může použít k identifikaci heterodimérních a homodimérních interakcí protein-protein. Tento systém se přednostně používá k identifikaci a charakterizaci homodimérové interakce protein-protein.

Dokonce, jestliže se aplikuje za účelem identifikace homodimérových interakcí, přístup založený na AraC poskytuje hodnotné informace týkající se proteinové terciální struktury velmi ekonomickým způsobem. Řada známých proteinů vykazuje homodimerizaci. Dokonce proteiny, které podléhají vyšším stádiům agregace zahrnující spojení více jednotek často vykazují homodimérní komponent.

Analýza homodimérových interakcí založených na AraC může proběhnout v okamžiku, kdy je známa nová sekvence nebo její část. Analýza spojení více podjednotek vyššího řádu může vyžadovat identifikaci dalších potencionálních interakčních komponentů. Analýzu nového proteinu za účelem zjištění dominantních negativních fúzí založených na homodimérových interakcí je možné provést tak, že potencionální interakční ·· «I · · · ♦ · ·· • · * ·· ····♦♦· · · • · » · · · 9 99

9 9 99 9 9 9 9 9999 9 protein se může stanovit za využití metod podobných například kvasinkovému dvouhybridnimu systému.

Očekává se, že TDNE, který blokuje homodimérní interakci v testovacím systému AraC, blokuje homodimérní interakce odpovídajícího cílového proteinu, který nefúzuje s AraC ve své přirozené formě. Proto se očekává, že blokační TDNE může proto porušit přirozenou terciální strukturu jeho kognatálniho rodičovského proteinu. Očekává se, že to vede k ablaci funkce. Ablace funkce umožní testovat libovolnou hypotetickou funkci a může dokonce vést k objevení proteinové funkce dokonce v případě, kdy neexistuje hypotéza. Vedle TDNE, který může hodnotit funkci cílového proteinu v modelových systémech (jak se popisuje dále v textu) takový dominantní negativní fúzní protein může také mít hodnotu jako terapeutické činidlo v těch případech, kdy ablace funkce vykazuje požadovaný konečný terapeutický účinek. Dále v případě, kdy TDNE stanovený v testovacím systému založeném na AraC vykazuje dominantní negativní aktivitu ve funkčních testovacích systémech například v systémech tkáňových kultur nebo v systémech in vivo (jak se popisuje dále v textu) stejný systém založený na AraC, který se v původním případě použil při identifikaci malých molekul, které blokují stejnou interakci proteinprotein, se může použít k identifikaci malých molekul, které blokují stejnou interakci protein-portein, kterou původně nepokrývá inhibiční TDNE. Taková malá molekula může být počátečním bodem při vývoji terapeutických sloučenin, které zahrnují sloučeniny s malými molekulami.

Testovací systémy pro ověření dominantní negativní aktivity

Zde popsané strategie testovacích systémů se navrhly za účelem stanovení TDNE, které vykazují kapacitu blokovat interakci protein-protein. Taková interakce protein-protein a/nebo TDNE, které modulují takové interakce protein-protein

se mohou identifikovat v mikrobiálních systémech nezávisle na znalosti proteinové funkce. Identifikované interakce proteinprotein a TDNE identifikované prostřednictvím takových mikrobiálních systémů se pak mohou ověřit a dále charakterizovat adresováním funkce interakce protein-protein a/nebo aktivity nebo vedou k exprimujícímu TDNE v prostředí, které je přirozené pro cílový protein (to znamená buněčné prostředí, ve kterém se cílový protein normálně exprimuje a normálně se tam také nachází interakce protein-protein). Metody vhodné pro uskutečnění takového ověření jsou v souladu s vynálezem.

V jednom provedení vynálezu, kde cílový gen/protein je savčí, například lidský gen/protein, se mohou použít testovací systémy založené na savčích nebo lidských buňkách. Standardní savčí transfekce, exprese zahrnující regulovatelnou expresi se může využívat v případě takových metod. V jiném provedení vynálezu může být testovaný protein virového, fungálního nebo bakteriálního původu a může se testovat v typu hostitelské buňky, který je přirozený pro cílový protein. Systém vhodný pro stanovení podstatnosti interakce protein-protein pro funkci proteinu in vivo se může navrhnout tak, že blokování poruší interakce přirozeného proteinu vedoucího k ablaci přirozené funkce. Když se interpretuje ztráta funkce, což je výsledkem exprese TDNE, může se naopak použít k podpoře definice proteinové funkce.

Systémy založené na tkáňových kulturách

Experimentálně nejzajímavější systémy pro testování cílových proteinů jsou buňky tkáňových kultur, ačkoli se musí čelit expresi v transgenních zvířecích modelech. Exprese v těchto systémech jsou dobře známy v oboru.

V preferovaných provedeních vynálezu se exprese reguluje. Regulovaná exprese umožní řídit hodnocení potencionálních fenotypů, které mohou zahrnovat letalitu v případě podstatných

99999999

9 9··

9·· genů. U savčích buněk expresívní plazmidy Tet-on vyvinuté Bjuardem poskytují základní kostru pro většinu provedení vynálezu (popisuje se v publikaci Gossen et al., 1995, Science 268: 1766-1769). V tomto systému se blokující chiméra subklonuje tak, aby byla řízena tetracyklinovým indukovatelným promotorem. V buněčné linii exprimující aktivátor Tet-on vznikly stabilní transfektanty a fenotyp se v přirozeném prostředí hodnotí následující expresí chiméry blokující interakci.

Bakteriální testy

Při testování aktivity cílových proteinů, které se přirozeně nacházejí v bakteriálních nebo jiných mikrobiálních buňkách se používají vhodné bakteriální nebo mikrobiální hostitelské buňky. V provedení vynálezu se zde popsané testy mohou použít při identifikaci molekul, které porušují kritické interakce protein-protein nutné při kultivaci bakteriálních buněk, a mohou se použít například jako antibiotika. V tomto případě se preferuje, že systém interakcí protein-protein založený na kvasinkách se používá k identifikaci kandidáta TDNE, protože inhibitor důležité interakce protein-protein kritického bakteriálního proteinu bude pravděpodobně toxický vůči svému bakteriálnímu hostiteli. V případě, že se identifikuje kandidát, exprese cílového proteinového přirozeného bakteriálního hostitele se může použít k testováni aktivity a síly TDNE. Metody vhodné pro expresy a analýzu proteinu v bakteriích popsaných v sekci 5.4.1 shora v textu se mohou použít při expresi a analýze kandidáta TDNE v jejich přirozených mikrobiálních hostitelských buňkách.

Transgenní zvířata, která nadměrně exprimují TDNE

V jednom provedení podle vynálezu se na transgenních zvířatech testoval TDNE, o němž se zjistilo, že ovlivňuje interakce protein-protein cílového proteinu. Transgenní ·· · zvířata, která nadměrně exprimují vybraný TDNE se vybrala za použití metod, které jsou dobře známy v oboru. V oboru je známa řada strategií, které produkují geneticky manipulovaná zvířata. Tyto metody zahrnují mikroinjekce DNA, transfer embryonálních kmenových buněk nebo transfer zprostředkovaný retrovirem. Obecné protokoly a vektorové systémy vhodné pro přípravu transgenních zvířat, které nadměrně exprimují vybrané TDNE se nacházejí například v publikaci Transgenic Animal

Technology: A Laboratory Handbook, 1994, ed. Pinkert, C.A.

Academie Press, lne. San provedeních vynálezu se jako myši, ale může se za účelem

Diego, CA. V preferovaných hostitelská zvířata používají vytvoření transgenních zvířat použít řada jiných specií, která zahrnují krávy, krysy, drůbež, ryby, kozu, ovce a prasata.

Tvorba a použití protilátek k dosažení identifikace funkcí cílových proteinů.

Jak se popisuje dále v textu, vytvořily se protilátky řízené k identifikaci dominantního elementu. Protože tyto prilátky jsou přirozeně nasměrovány na vazebnou oblast cílového proteinu, je pravděpodobné, že vykazují inhibiční účinky na funkci cílového proteinu. Tyto protilátky se proto mohou použít v tkáňové kultuře nebo in vivo za účelem zjištění nebo potvrzení biologické funkce cílového proteinu. Takové protilátky by měly vést k podstatně stejnému výsledku, jako podobné přístupy za použití identifikovaného TDNE nebo dominantních negativních elementů. Popisuje se shora v textu.

Vytvoření a použití protilátek směrovaných proti identifikovaným dominantním negativním elementům

Různé postupy, které jsou známy v oboru, se mohou použít při produkci protilátek vůči epitopům identifikovaných dominanntích negativních elementů, které se identifikovaly a izolovaly za použití systémů podle vynálezu. Takové protilátky zahrnuji, ale nejsou omezeny na polyklonálni, monoklonální, chimérové, jednořetězcové protilátky, fragmenty Fab a fragmenty produkované expresívní knihovnou Fab.

Takové protilátky se mohou použit například jako diagnostická nebo terapeutická činidla nebo jako činidla vhodná pro identifikaci funkce cílového proteinu in vivo (popisuje se shora v textu).

Vytvoření protilátek za použití dominantních negativních elementů identifikovaných metodami podle vynálezu je zvláště možné použít v případě, že vytvoření neutralizačních protilátek slouží jako terapeutické činidlo. To platí v případě, že protilátky určené proti dominantnímu negativnímu elementu působí jako neutralizační protilátky, což znamená, že interferují s aktivitou cílového proteinu.

V případě použití jako diagnostická činidla, monoklonální protilátky, které se vážou na dominantní negativní element a tak na cílový protein, jsou radioaktivně značené, umožňují detekci jejich polohy a distribuce v těle po jejich zavedení injekcí. Radioaktivně značené protilátky se mohou použít jako

neinvazivní přítomnosti diagnostický nástroj pro znázornění nádorů a metastáz spojených s expresí in vivo cílového proteinu.

Mohou se také navrhnout imunotoxiny, které zaváděj í cytotoxická protilátky činidla do specifických míst v těle. Monoklonální s vysokou afinitou mohou vytvářet kovalentní komplexy s bakteriálními nebo rostlinnými toxiny, jako je toxin difterie abrin nebo ricin. Obecná metoda přípravy protilátek/hybridních molekul může zahrnovat použití thiolových řetězících činidel, jako je

SPDP, které napadaj í primární aminoskupiny na protilátkách a výměnou disulfidů připoutávají protilátky k toxinu. Hybridy protilátek použít ke specifické eliminaci buněk, které exprimují se mohou cílový protein, což může být nutné, když cílový protein je spoj en s onemocněním, které je založeno na neregulované proliferaci buněk, jako je zhoubné bujení.

v

V případě produkce protilátek různá hostitelská zvířata se imunozují injekcí s dominantním negativním elementem. Mezi tato zvířata patří králíci, myši, krysy atd. Za účelem produkce protilátek se odstraní nespecifická část, například cl TDNE, tak, že při imunizaci se použije pouze dominantní negativní element. Dominantní negativní element se může fúzovat neimunogenním nosičovým proteinem za účelem zvýšit jeho stabilitu. Ke zvýšení imunologické odezvy je možné použít různá adjuvans. V závislosti na druzích hostitelů je možné použít Freundovo (úplné nebo neúplné) adjuvans, minerální gely, takové jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky, jako je lyzolecitinpluronní polyoly, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemocyanin přílipkovitých plžů, dinitrofenol a potencionálně použitelné lidské adjuvans, jako je BCG (bacil Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.

Monoklonální protilátky proti dominantnímu negativnímu elementu se mohou připravit libovolným způsobem, který je vhodný při produkci molekul protilátek kontinuální buněčnou linií v kultuře. Tyto metody zahrnují, ale nejsou omezeny na metody hybridomů, které se původně popisují v publikaci Kohler and Milstein, 1975, Nátuře 256: 495-497, jako je metoda hybridomů lidských B-buněk (popisuje se v publikaci Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72, Cote et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci U.S.A. 80: 2026-2030) a metody hybridomů EBV (popisuje se v publikaci Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., pp. 77-96). Navíc se mohou použít metody vyvinuté pro produkci chimerových protilátek (popisuje se v publikaci Morrison et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A 81: 6851-6855, Neuberger et al., 1984, Nátuře 312: 604-608, Takeda et al., 1985, Nátuře 314: 452-454) sestřihem genů z molekuly myších protilátek vhodné antigenní specifity spolu s geny s lidské protilátkové molekuly vhodné biologické aktivity. V jiném případě metody popsané v případě produkce jednořetězcových protilátek φ · · φ · φφ φφφφ «φφ «φφ φφ · φφφφ «φ φ φ · φφ φφφφφφφ φ φφφ φφφ φφ φφφφφφ φφ φ · · · (popisuje se v dokumentu patent USA č. 4,946, 778) se mohou přizpůsobit produkci jednořetězcových protilátek, které jsou specifické pro dominantní negativní element.

Fragmenty protilátek, které obsahují specifická vazebná místa dominantního negativního elementu se mohou vytvořit použitím známých technik. Takové fragmenty například zahrnují, ale nejsou omezeny na fragmenty F(ab')2_ř které se mohou produkovat štěpením pepsinu molekul protilátek a fragmenty Fab, které se mohou vytvořit snížením počtu disulfidových můstků fragmentů F(ab')₂. V jiném případě se může zkonstruovat expresívní knihovna Fab (popisuje se v publikaci Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281), aby se umožnila rychlá a jednoduchá identifikace monoklonálních fragmentů Fab s požadovanou specifitou k dominantnímu negativnímu elementu.

Použití dominantních negativních elementů při identifikaci genové funkce.

Použití TDNE se může použít k objevení funkce známých dobře definovaných genů a produktů, které tyto geny kódují. V jiném případě se TDNE mohou použít k definici a popisu funkce genů a jejich proteinových produktů, které nejsou vůbec nebo jen částečně charakterizovány. Tato aplikace je zvláště důležitá při zjištění, že velké množství genů, které není pokryto sekvenováním produktů genomu může mít známé homology a proto jejich funkce nemůže být odvozená. Aby se vysvětlila funkce genů za použití TDNE, může se použít několik obecných přístupů.

Použití izolovaných dominantních negativních elementů pro identifikaci sloučenin použitelných pro léčbu onemocnění příbuzných k cílovému proteinu.

TDNE a peptidové sekvence identifikované za použití metod podle vynálezu se mohou použít přímo při metodách genové terapie, přičemž se modulují interakce protein-protein. Navíc • · ·· 4 ·

TDNE vytvořený za použiti metod podle vynálezu se může dále upravovat, aby se vybraly požadované vlastnosti. V závislosti na konečné aplikaci se mohou jisté biochemické vlastnosti TDNE změnit. Tyto vlastnosti zahrnují vazebné afinity, vazebné specifity, stabilitu, terapeutické účinky atd. (popisuje se v publikaci Moore and Arnold, 1996, Nat. Biotech. 14: 458467). TDNE se mohou dále použít k testování jiných sloučenin, jako jsou například malé molekuly, které interferují s interakcí protein-protein. Popsané metody se mohou použít při identifikaci nových sloučenin, které jsou použitelné jako terapeutika.

TDNE se zlepšenou specifitou

Specifické vlastnosti TDNE se mohou upravit tak, že se gen vystaví náhodné mutagenezi, přičemž vzniká sub-knihovna TDNE, která se může využívat při následných testech, které jsou vhodné při identifikaci požadované vlastnosti. Tento proces se může opakovat několikrát, aby se optimalizovaly vlastnosti. Tato metoda se jeví jako přímý vývoj (popisuje se v publikaci Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26: 681-683). Změny biochemických vlastností rodičovského TDNE se mohou účinně monitorovat za použití testovacích systémů popsaných podle vynálezu nebo jiných testů, které se mohou využívat a jsou vhodnější k identifikaci změn speifické vlastnosti TDNE. TDNE se může například identifikovat jako kandidát terapeutického činidla. Může být nutný lepší kandidát, který vykazuje zvýšenou vazebnou afinitu v případě svého receptoru/partnera. Zvýšení své vazebné afinity by se mohlo identifikovat mutací genové sekvence za vzniku podknihovny TDNE. Tato podknihovna TDNE se může použít ve zde popsaných testech, které umožňují rychlou identifikaci zvýšené vazebné afinity specifického TDNE jednoduchou kolorimetrickou nebo fluorometrickou metodou.

Za účelem replikace specifických sekvencí DNA se mohou použít různé metody jako je produkce chyb, to znamená varianty ·· • 0 ·· 4 ··· • * · « · 4 4 · ·· 4 • · » 4 · 4 · · ·4 t « * «4 ···♦··· *4 • · * 4 4··0·· «» ««·· 4« · 4·· · · sekvence DNA. Tyto metody jsou jednoduše přístupné odborníkům a zahrnují, ale nejsou omezeny na PCR s nepřesnou reparací (Cline et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 3546-3551), přesun rodiny DNA (popisuje se v publikaci Chrisitans et al., 1999, Nat. Biotech. 17: 259-264), kombinační mutageneze (popisuje se v publikaci MecBeath et al., 1998, Prot. Sci., 7: 1757-1767). Tyto metody se používají ke změně specifických biochemických vlastností 4. až 5. stupně důležitosti a poskytují silnou metodu pro zlepšení aktivity TDNE identifikované způsoby podle vynálezu.

Navržení léků

TDNE se může také používat k navržení nových léků a terapeutik s malými molekulami. To se provádí na základě znalostí peptidové sekvence TDNE. Může se například stanovit trojrozměrná struktura TDNE a může se modelovat aktivní místo interakce TDNE-cílový protein-protein. To se může uskutečnit známými metodami, které zahrnují krystalografii s paprsky X., přičemž tato metoda může stanovit · úplnou molekulární strukturu. Na druhé straně pevná a kapalná fáze NMR se může použít ke stanovení jistých mezimolekulových vzdáleností. Libovolná další experimentální metoda pro stanovení struktury se může použít za účelem získání částečné nebo úplné geometrické struktury. Geometrické struktury cílového proteinu se mohou stanovit za použití komplexu TDNE a ligandu, který může zvýšit přesnost stanovení struktury aktivního místa.

Jestliže se stanoví neúplná nebo nedostatečně přesná struktura, počítačové metody založené na numerickém modelování se mohou použít za účelem doplnit strukturu nebo zvýšit její přesnost. Může se použít libovolná rozeznávaná modulační metoda, která zahrnuje parameterizované modely, které jsou specifické pro určité biopolymery, jako jsou proteiny nebo nukleové kyseliny, molekulární dynamické modely založené na vypočítání pohybu molekul, statistické mechanické modely ·· ·* ·· · ·* * ·»·· · · · «··· • · · · · · ♦ · ·· • e · · · · ···» · « ·· • · · ··· · ♦· ···· ·· · «···· založené na termálních uspořádání nebo kombinovaných modelech. V případě většiny typů modelů standardní molekulové silové pole reprezentující síly mezi atomy a skupinami jsou nezbytné a mohou se vybrat ze silového pole známého v oboru fyzikální chemie. Neúplné nebo méně přesné experimentální struktury mohou sloužit jako omezení úplných a přesnějších struktur vypočítaných těmito modulujícími metodami.

Nakonec při stanovení struktury aktivního místa se může kandidát modulačních sloučenin identifikovat vyhledáváním v databázích, které obsahují sloučeniny, spolu s informacemi o jejich molekulové struktuře. Takové vyhledávání hledaných sloučenin, které mají struktury odpovídající stanovené struktuře aktivního místa a které interagují se skupinami definujícími aktivní místo. Takový průzkum se může uskutečnit manuálně, ale upřednostňuje se použití počítače. Tyto sloučeniny zjištěné tímto zkoumáním jsou potencionální sloučeniny, které blokují funkci ribozomálního proteinu .

Za použití těchto metod se může sloučenina TDNE upravit a strukturální účinky modifikace se ' mohou stanovit za použití experimentálních a počítačových modulačních metod popsaných shora v textu, které se aplikují na novou sloučeninu. Tato změněná struktura se pak může porovnat se strukturou aktivního místa TDNE, za účelem stanovit, zda tato struktura lépe vyhovuje, nebo jaké jsou výsledky interakce. Tímto způsobem se mohou rychle vyhodnotit systematické variace ve sloučenině, jako jsou různé vedlejší skupiny, čímž se získají inhibiční sloučeniny zvýšené specifity nebo aktivity.

Dále metody experimentálního a počítačového modelování jsou založené na identifikaci místa interakce protein-protein nebo povrchového cílového proteinu. Tyto metody jsou v oboru dobře známy. Příklady molekulových modulačních systémů jsou programy CHARMm a QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, MA) . Program CHARMm umožňuje minimalizaci energie a molekulární dynamické funkce. Program QUANTA umožňuje konstrukci, grafické

modelování a analýzu molekulární struktury. Program QUANTA umožňuje interaktivní konstrukci, modifikaci, vizualizaci a analýzu vzájemného chování molekul.

V řadě článků se popisuje počítačové modelování léků interaktivních se specifickými proteiny. Jsou to například publikace Rotivinen et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166), Ripka et al., 1988, New Scientist 54-57,

McKinaly and Rossmann et al., 1989, Annu Rev. Pharmacol.Toxiciol. 29: 111-122, Perry and Davies, OSAR: Quantitative Scructure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193, Alan R. Liss, lne. 1989, Lewis and Dean et al., 1989, Proč. R. Soc. Lond. 236: 125-140 a 141-162) a s ohledem na modelové receptory pro komponenty nukleových kyselin se popisují v publikaci Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc.

111: 1082-1090). Jiné počítačové programy, které testuji a graficky znázorňují chemikálie jsou dostupné u firem BioDesign, lne. (Pasadena, CA), Allelix, lne. (Mississauga, Ontario, Canada) a Hypercube, lne. (Cambridge, Ontario).

Protein s více interakčními oblastmi se může rozdělit do jednotlivých oblastí, což poskytuje příležitosti objevení léků, které nejsou dostupné za použití proteinů v celé délce

Dělení velkého, povrchu interakcí na části poskytuje příležitosti způsoby získáni léků. Zatímco může být obtížné přímo identifikovat léky s malými molekulami, mohou se objevit ty molekuly, které blokuji velké povrchy interakcí. Zjistilo se, že molekula koan blokuje menší komponenty velkých interakcí. V kombinačním procesu se zjistilo, že malé molekuly, aby mohly blokovat komponenty větších interakcí protein-protein se mohou kovalentně vázat za vzniku velkých molekul, které blokují větší úplný interakční povrch. Tyto systémy užívané k potvrzení interakcí konstituentů (například signál testu ELISA) se mohou použít k identifikaci malých molekul, které blokují tyto menší interakce konstituentů • · · k · · ♦··· · • · · · · ······· • · · · · · ♦ • · ···· ♦ ♦ · molekul, které blokuji tyto menší interakce konstituentů testováním ztráty jejich interakčního signálu. V tomto paradigma je možné postupně dosáhnout molekuly, která blokuje větší interakce, které zahrnují suboblasti konstituentů.

Jak se například popisuje dále v textu v sekci 6.5, zjistilo se, že nejmenší úseky receptorové extrabuněčné oblasti TNFa (TNFaR ECD), které mohou konkurovat, je úsek C77172 obsahující 95 aminokyselin. Naismyth a Spanger (uvádí se shora v textu) popisuje daleko menší moduly (moduly „A, obsahující 12 až 17 zbytků a moduly „B, které obsahují 21 až 24 zbytků), které se objevují jako běžné strukturální podjednotky přes celou rodinu receptorů TNFa. Úsek C77-172 se skládá s několika takových jednotek a očekává se, že úsek C77172 se může dále dělit na menší funkční podjednotky. Toho se dosáhne navržením specifických primerů PCR, které by se mohly použít k vytvoření fúze MalE, která se specificky navrhla tak, aby obsahovala moduly konstituentů. V jiném případě se mohou pro přípravu knihovny použít méně časté přístupy, jako například strategie CviJI popsaná v příkladu 4 dále v textu (nebo jiné zde popsané). U libovolného typu knihovny se může testovat přítomnost členů, které jsou schopny soutěžit s celým ECD konstrukce CadC-TNFaR a identifikovat moduly konstituentů, které se podílejí na definici interakce protein-protein.

Když se identifikovaly takové soutěžící moduly, může se různými způsoby testovat jejich schopnost interagovat TNFaR ECD. TNFaR plné délky se může například klonovat jako chiméra oblasti vázající LexA (nebo Cl) v systémech popsaných v příkladu 3 a 4 dále v textu, zatímco suboblasti kandidáta se mohou testovat fúzí s aktivační oblastí. Pozorování signálu v systémech umožňuje potvrzení, že oblasti vykazují blokování v systému založeném na CadC a ve skutečnosti se to provádí fyzikálními interakcemi. V jiném případě se mohou interakce testovat přímými fyzikálními technikami, jako je například

Μ ·

ELISA. Část MalE fúzi MalE povede k přípravě požadovaných činidel ELISA).

Identifikace sloučenin

Při identifikaci a izolaci sloučenin zahrnující malé molekuly se používají dva obecné typy systémů testů. Mezi tyto sloučeniny patří například peptidy inhibující funkci cílového proteinu, přičemž se zjistilo, že vykazuje specifickou biologickou funkci a/nebo se podílí na vývoji onemocnění. Nejdříve se používají testovací systémy, který měří schopnost sloučeniny interferovat se samotnou interakcí protein-protein. To znamená sledovaným parametrem je interference sloučeniny s navázáním proteinu na jeho partnera. Může se porovnávat řada vhodných testovacích systémů. Tyto testovací systémy mohou měřit buď interakci navázání cílového proteinu plné délky nebo jeho fragmentu. V typickém případě však bude měřit interference sloučeniny s navázáním identifikovaných TDNE (nebo izolovaný dominantní negativní element) s cílovým proteinem. Například systémy takové jako je testovací systém založený na araC, CadC nebo modifikované duální systémy exprimující cílový protein a identifikovaný TDNE se mohou použít přímo při identifikaci sloučenin, které inhibují jejich interakce protein-protein (popisuje se shora v textu). Takové testy jsou zvláště vhodné pro testování sloučenin s vysokým prostupem a pro identifikaci vedoucích sekvencí. Mohou se použít testovací systémy, které zhotovené na míru specifickému typu cílového proteinu a jeho funkci. Mohou se vyvinout testy in vivo nebo in vitro, které měří inhibici specifické biologické funkce cílového proteinu, který se stanovil za použití shora popsaných testů a zvířecích modelů. Tento druhý obecný typ testů nevyžaduje společnou expresi identifikovaného TDNE vzhledem k tomu, že se měří interference chemických sloučenin s biologickou funkcí cílového proteinu.

• · založen na

První typ testovacího systému je konceptu jako testovací systémy vhodné stejném pro identifikaci a izolaci dominantních negativních elementů v textu). Jestliže se (popisuje se shora systém používá pro testování sloučenin, navrhne se tak, že se vzájemně fúzují dva identifikovaní vazební partneři.

Například cílový protein X a dříve identifikovaný TDNE fúzuje s jedncu (popisuje se oblastí vázající

DNA (DB) nebo se každý aktivační oblast (AD) testovacího systému. V jiném případě dva cílové proteiny obsahuj e s DB a působení plné délky a místo, které je AD. Euňky exprimující knihoven sloučenin, libovolný typ jeho fragmentu, který pro interakci, se může fúzovat fúze DB a AD se nutné vystavily například sloučenin s malými molekulami (popisuje se v publikaci Gallop et al.,

1233-1251) a přerušení interakce

Med. Chem. 37:

protein se měří

Druhý typ

1994, J.

proteinsnížením exprese reportniho genu.

testovacího systému zahrnuje libovolný druh systému in sloučenin, vitro které proteinu.

Průběh nebo in vivo, který umožňuje identifikaci interferují s biologickou aktivitou cílového takového testu závisí na typu cílového proteinu a na typu jeho biologické aktivity. Jestliže cílový například regulátorem buněčné proliferace, účinek protein je testovaných sloučenin na buněčnou proliferaci se může měřit ve vhodném systému. Jestliže cílový protein je promotorem buněčné proliferace, může se například měřit inhibice proliferace v testech v buněčné kultuře značené ³H-thymidinem. (DetrickHooks et al., 1975, J. Immunol. 114: 287-290, dean et al.,

1977, Int. J. Cancer 20: 359-370), transformační testy (popisuje se v publikaci Petengill et al., 1980, Ex. Cell. Biol. 48: 279-297, Kahn et al., 1979, J. Cell. Biol. 82: 1-16) nebo testy tvorby kolonií na měkkém agaru (popisuje se v publikaci Schlag and Flentje, 1984, Cancer Treat. Rev. 11 Supi. A: 131-137, Osborne et al., 1985, Breast Cancer Res.

Treat. 6: 229-235).

V případě, že cílový protein ukázal, že mají určitou enzymatickou aktivitu, například kinázovou aktivitu, inhibice enzymatické aktivity se může měřit in vitro nebo in vivo za použití radioaktivně značeného susbtrátu nebo vhodných protilátek za účelem měření enzymatické aktivity. Upřednostňuje se, aby tyto testovací systémy se navrhly tak, aby umožnily testováni sloučenin s vysokou prostupností. Tyto sloučeniny jsou z libovo-lného zdroje a testy umožňují identifikovat molekuly, které mají požadovaný účinek na biologickou funkci cílového proteinu. U řady případů testovací systémy měřící účinky chemických sloučenin na biologickou funkci cílového proteinu se uskuteční jako druhý krok za použití pozitivních zásahů se systémy s vysokou prostupností, které měří účinek testovacích sloučenin na interakce proteinprotein, které se stanovily za za použití knihoven TDNE podle vynálezu.

Nukleotidové sekvence kódující TDNE, dominantní negativní elementy a cílové proteiny identifikované a izolované za použití testovacích systémů podle vynálezu se mohou použít při produkci odpovídajících čištěných proteinů za použití dobře známých metod technologie rekombinace DNA. Mezi publikace, které popisují metody exprese genů, patří Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol.: 185, ed. Goeddel, Academie Press, san Diego, California (1990).

Molekuly nukleotidových kyselin se mohou exprimovat v různých hostitelských buňkách, které jsou buď prokaryontní nebo eukaryontní. V mnoha případech hostitelské buňky jsou eukaryontní, upřednsotňuje se, aby hostiteslké buňky byly savčí. Hostitelské buňky mohou pocházet ze stejných nebo odlišných druhů, než jsou specie, ve kterých jsou přirozeně přítomen cílový protein, to znamená endogenně. Výhody produkce cílového proteinu technologií rekombinace DNA zahrnují získání vysoce obohacených zdrojů proteinů vhodných pro čištění a dostupnost zjednodušených čistících postupů. Metody • · • * rekombinantní produkce proteinů jsou v obecném případě dobře známy a mohou mezi jinými a jsou v oboru uvedeny v publikaci

Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning

A laboratory manual,

2^nd edition,

Cold spring

Harbor Press, New

York.

V jednom provedení podle vynálezu buňk transformované expresivnímy vektory kódující cílový protein a/nebo odpovídáj ící kultivují za

TDNE nebo a získání dominanntí negativní elementy se podmínek, které jsou výsnamné pro jejich expresi rekombinantně produkovaného proteinu z buněčné kultury. Cílový protein, TDNE nebo dominantní negativní element produkovaný rekombinantní buňkou nebo může obsahovat intracelulární cílový se může protein vylučovat a nebo se může použít určitá genetická konstrukce. V obecném případě je vhodnější připravit formě. Čisticí krok rekombinantní proteiny sektrotvané závisí na podstatě produkce na určitém cílovém proteinu,

TDNE nebo produkovaném dominantním

Metody čištění jsou dobře známy negativním elementu.

odborníkovi je zřejmé jak optimalizovat podmínky v oboru a čištění.

v případě

Obecné protokoly, jak optimalizovat podmínky čištění určitého protinu se popisují v publikaci Protein Purification:

Principles and Practice, 1982, Springer-Verlag New York, Heidelberg, Berlin.

Vedle rekombinantní produkce se mohou peptidové fragmenty produkovat přímou syntézou peptidů za použití metod na pevné fázi (popisuje se v publikaci Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1969), W.H.freeman Co., San Francisco a Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154.

Syntéza polypeptidů in vitro se může uskutečnit za použití Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California) podle instrukcí poskytnutých výrobcem.

V jednom provedení vynálezu cílový protein, TDNE nebo dominantní negativní element a/nebo exprimující buněčné linie se používají k testováni protilátek, peptidů, organických molekul nebo jiných ligand, které působí jako agonisty nebo • · « · • · • · · ·’ ·· antagonisty jejich biologické aktivity. Protilátky schopné například interferovat s aktivitou (například s enzymatickou aktivitou cílového proteinu) nebo s jeho interakcí s ligandem, adaptorovou molekulou nebo susbstrátem se mohou použít k inhibici biologické funkce. V případech, kde je potřeba amplifikace funkce cílového proteinu mohou se vyvinout protilátky, které napodobují například ligand, adaptorovou molekulu nebo substrát odpovídající dráhy signálu transdukce. Jestliže je to nutné mohou se vytvořit protilátky, které modifikují aktivitu, funkci nebo specifitu cílového proteinu.

V jiném případě testování peptidových knihoven nebo malých molekul organických sloučenin s rekombinantně exprimovaným cílovým proteinem, TDNE nebo dominantní negativní element nebo buněčné linie exprimující uvedené látky se mohou použít pro identifikaci terapeutických molekul, které inhibují, zvyšují nebo modifikují svou biologickou aktivitu.

Syntetické sloučeniny, přirozené produkty a jiné zdroje potencionálně biologicky aktivních materiálů se mohou testovat řadou způsobů. Schopnost testované sloučeniny inhibovat, zesilovat nebo modulovat funkci cílového protřenu se může stanovit vhodnými testy měření funkce cílových proteinů. Odezvy takové, jako je například jejich aktivita (například enzymatická aktivita nebo schopnost látek vázat ligand, adaptorovou molekulu nebo substrát se může stanovit testy in vitro. Mohou se vyvinout buněčné testy za účlem monitorování modulace produkce informační RNA, změn buněčného metabolizmu nebo účinků buněčné proliferace. Tyto testy se mohou uskutečnit za použití běžných metod vyvinutých pro tyto účely. Nakonec schopnost testované sloučeniny inhibovat, zvyšovat nebo modulovat funcki cílového proteinu se měří na vhodných zvířecích modelech in vivo. Myší modely se například používají k monitorování schopnosti sloučenin inhibovat vývoj pevných nádorů nebo účinně redukovat velikost pevného nádoru.

• ·

• ♦ · · · · · ·· ······· * · • · · · · · • to » ·· ···

V provedeni podle vynálezu náhodné peptidové knihovny obsahuji všechny možné kombinace aminokyselin připojených na pevnou fázi se mohou použit k dentifikaci peptidů, které jsou schopny interferovat s funkci cílového proteinu. Peptidy se mohou identifikovat například na základě navázání na vazebné místo ligandu, adaptorové molekuly nebo substrátu daného cílového proteinu nebo jiných funkčních oblastí cílového proteinu, jako je enzymatická oblast. Testovací peptidové knihovny mohou vést ke vzniku sloučenin, které mají terapeutickou hodnotu, jako například, že interefrují s jejich aktivitou.

Identifikace molekul, které jsou schopny se vázat na cílový protein může doprovázet testování peptidové knihovny s rekombinantním rozpustným cílovým proteinem, TDNE nebo dominantním negativním elementem. Metody vhodné pro expresi a čištění vybraných buněčných proliferačních genů jsou v obecném případě dobře známy v oboru (popisuje se v publikaci Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning- A laboratory manual, 2^nd edition, Cold spring Harbor Press, New York, Ausubel et al., Current Protocols in molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York) a mohou se použít k expresi rekombinantního buněčného cílového proteinu celé délky nebo jeho fragmentu v závislosti na zajímavých funkčních doménách.

Za účelem identifikovat a izolovat peptid/podklad pevné fáze, který reaguje a tvoří komplex s cílovým proteinem, TDNE nebo dominanntím negativním elementem, je nezbytné označit tyto uvedené látky nebo jejich fragmenty. Cílový protein, TDNE nebo dominanntí negativní element se může konjugovat s enzymy, jako je alkalická fosfatáza nebo křenová peroxidáza nebo jiná činidla, jako jsou fluorescenční značky, které mohou zahrnovat izothiokyanát fluoresceinu (FITC), fykoerytrin (PE) nebo rodamin. Konjugace libovolné dané značky s cílovým proteinem, • · • · · ·· ······· · · « · · · · · · · · •« · · · · < · · ·· ·♦·

TDNE nebo s dominantním negativním elementem se může uskutečnit za použití metod, které jsou dobře známy v oboru.

Vedle použití rozpustných molekul cílového proteinu nebo jeho fragmentů při identifikaci vazebných partnerů se v jiném provedení vynálezu mohou při identifikaci peptidů, které inhibují vazbu s cílovým proteinem, použít intaktní buňky. Použití intaktních buněk se preferuje při použití s cílovým proteinem, který obsahuje povrchové receptory, které vyžaduje lipidová oblast buněčné membrány, aby byla funkční. Metody vhodné pro přípravu buněčné linie exprimující cílové proteiny, TDNE nebo dominantní negativní elementy identifikované způsoby podle vynálezu jsou v obecném případě dobře známy v oboru a jsou uvedeny v publikacích Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2^nd edition, Cold spring Harbor Press, New York a Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (eds.), Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York. Buňky používané při těchto metodách se mohou být buď živé nebo fixované. Buňky se inkubovaly s náhodnou peptidovou knihovnou a budou se vázat na určité peptidy v knihovně. Takto vytvořený komplex mezi cílovými buňkami a podkledem relevantní pevné fáze se může izolovat standardními metodami, které jsou dobře známy v oboru a které zahrnují diferenciální centrifugaci.

Vedle testů s celými buňkami v případě receptorů vázaných na membráně nebo receptorů, které vyžadují, aby lipidová oblast buněčné membrány byla funkční, se mohou rekonstituovat na lipozomy, kam se může připojit značka.

V jiném provedení vynálezu buněčné linie, které mohou exprimovat cílový protein nebo jeho fragmenty, se mohou použít k testování molekul, které inhibují, zesilují nebo modulují aktivitu cílového proteinu nebo signál transdukce. Takové molekuly mohou zahrnovat malé organické nebo anorganické sloučeniny nebo jiné molekuly, které ovlivňují účinek aktivity cílového proteinu nebo které podporují nebo brání tvorbě komplexu se svým ligandem, adaptorovými molekulami nebo susbstráty. Syntetické sloučeniny, přirozené produkty a jiné zdroje potencionálně biologicky aktivních materiálů se mohou testovat řadou způsobů, které jsou v obecném případě dobře známy v oboru.

Například schopnost testované molekuly interferovat s funkcí cílového proteinu se může měřit za použití standardních biochemických metod. V jiném případě se mohou také zaznamenávat buněčné odezvy, jako je aktivace, potlačení katalytické aktivity, fosforylace nebo defosforylace jiných proteinů, aktivace nebo modulace druhé produkce mRNA, změny v množství buněčných iontů, asociace, disociace nebo translokace signalizačních molekul nebo transkripce nebo translace specifických genů. Tyto testy se mohou provést za použití běžných metod vyvinutých pro tyto účely během testování.

Za účelem testování, identifikace a hodnocení sloučenin, které interagují s cílovým proteinem podle vynálezu a stanovení, které sloučeniny mohou ovlivňovat různé buněčné procesy za řízení uvedeného cílového proteinu se mohou použít různé technologie.

Cílový protein nebo jeho funkční derivát v čisté nebo semičisté formě, v membránových přípravcích nebo v celých živých nebo fixovaných buňkách se inkuboval se sloučeninou. Následně za vhodných podmínek se sleduje účinek sloučeniny na funkci cílového proteinu, například měření jeho aktivity nebo jeho transdukčního signálu a porovnání aktivity s aktivitou cílového proteinu inkubovaného za stejných podmínek, přičemž není přítomna sloučenina, která určuje zda sloučenina stimuluje nebo inhibuje cílovou proteinovou aktivitu.

Vedle použití celých buněk, které exprimují cílový protein, TDNE nebo dominantní negativní element v případě testování sloučenin, vynález také popisuje metody za použití rozpustného nebo imobilizovaného cílového proteinu, TDNE nebo • ·

dominantního negativního elementu. Molekuly, které jsou například schopné vázat se na cílový protein se mohou identifikovat v biologických a chemických prostředcích. Cílový protein nebo jejich funkční fragmenty (například fragmenty obsahující specifickou oblast) se imobilizují na pevnou matrici, následně chemický nebo biologický prostředek přijde do kontaktu s imobilizovaným cílovým proteinem v časovém intervalu, který je dostatečný, aby umožnil navázání sloučeniny. Libovolný nevázáný materiál se pak vymyje z matrice pevné fáze a detekuje se přítomnost sloučeniny navázáné na pevnou fázi, přičemž se identifikuje sloučenina. K vymyti navázané sloučeniny se pak používají vhodné způsoby.

Zdroj kandidátů testovaných sloučenin

Testované sloučeniny vhodné pro uvedené účely se získaly z komerčních zdrojů mezi něž patří firmy Aldrich (1001 West St. Paul Ave., Milwaukee, WI 53233), Sigma Chemical (P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178), Fluka Chemie AG (Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs, Switzerland (Fluka Chemical Corp. 980 South 2^nd Street, Ronkonkoma, NY11779) ) , Eastman Chemical Company, Fine Chemicals (P.O. Box 431, Kingsport, TN37662), Boehringer Mannheim GmbH (Sandhofer Strasse 116, D-68298 Mannheim), Takasago (4 Volvo Drive, Rockleigh, NJ 07647), SST Corporation (635 Brighton Road, Clifton, NJ 07012), Ferro (11 West Irene Road, Zachayr, LA 70791), Riedel-deHaen Aktiengesellschaft (P.O. Box D-30918, Seelze, Germany), PPG Industries lne., Fine Chemicals (One PPG Plače, 34 th Floor, Pittsburgh, PA 15272). Dále je možné testovat libovolný přirozený produkt za použití testovací kaskády podle vynálezu zahrnující mikrobiální, fungální nebo rostlinné extrakty.

Dále kombinační knihovny testovaných sloučenin zahrnující testované sloučeniny s malými molekulami se mohou běžně získat u firmy Specs and BioSpecs B.V. (Rijswijjk, The Nederlands), Chembridge Corporation (San Diego, CA), Contract Service • · Φ · · v ···· · · · • · · · · · · · ····«· 4 ♦ · ··

Company (Dolgoprudny, Moscow Region, Russia), Comgenex USA lne. (Priceton, NJ) , Maybridge Chemicals Ltd. (Cornwall PL34 OHW, United Kingdom) a Asinex (Moscow, Russia) nebo se mohou vytvořit, jak se popisuje v publikaci Eichler and Houghten, 1995, Mol. Med. Today 1: 174-180, Dolle, 1997, Mol. Divers. 2: 223-236, Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145-167.

V těchto publikacích se dále popisují testovací metody, které se mohou použít při identifikaci a izolaci terapeutických sloučenin, které vykazují požadovaný účinek na fyziologickou aktivitu a/nebo funkci cílového proteinu podle vynálezu.

Indikace pro použití sloučenin, které interferují s interakcemi protein/protein identifikovanými za použití testů podle vynálezu

Sloučeniny identifikované shora popsanými metodami jsou v obecném případě modulátory aktivity cílového proteinu. Jako takové, se uvedené sloučeniny produkují způsoby a hodnotí testy podle vynálezu a jsou použitelné při léčbě onemocnění příbuzných abrantní, nekontrolované nebo nevhodné funkci nebo aktivitě cílového proteinu. Metody podle vynálezu vhodné pro identifikaci dominantních negativních elementů, které inhibují funkci cílového proteinu, přičemž umožňují vysvětlení jejich biologické funkce a úlohu při vývoji onemocnění, se neomezují na libovolný určitý typ nebo na skupinu cílových proteinů.

V závislosti na fyziologické úloze každého specifického cílového proteinu se sloučeniny podle vynálezu mohou použít při léčbě různých typů onemocnění, která zahrnují, ale nejsou omezeny na metabolické poruchy, na poruchy proliferace buněk, poruchy endokrinních žláz, dysfunkci centrálního a periferního nervového systému, infekční onemocnění, bakteriální, infekční a zánětlivé onemocnění.

Jestliže například se cílový protein podílí na regulaci metabolických procesů, jako je například syntéza aminokyselin, post-transkripční zpracování enzymů a jiné buněčné komponenty, *

99 ··	• ·	9	• 9
• 9 9 9	• 9	9	9 9 9
• · ·	9 9	9 9	• ·
• · 9	♦ · ·	• 999	9 · ·
9 9 9	♦ 9	9	• ·
99 9999	99	•	99 9

respirační a trávicí procesy, kardiovaskulární a neurologické procesy, procesy tvorby kostí, imunologické a jiné zánětlivé procesy a jiné procesy ovlivňující metabolizmus orgánů a tkání, identifikovaná terapeutická sloučenina se použije při léčbě poruch metabolizmu zahrnující cukrovku, fenylketonurii,

ADA, porfyrii, deprese, Alzheimerovu nemoc, stárnutí, poruchy spánku, kožní poruchy, arytmie, renální vizuální poruchy a poruchy sluchu.

obezitu, poruchy,

V jiném případě cílový protein se podílí na buněčné proliferace. Velký počet stádií onemocnění regulaci zahrnuj e nadměrnou nebo nedostatečnou buněčnou proliferaci.

případě řada těchto onemocnění se může léčit aplikací sekvencí

V obecném

DNA, proteinů nebo malých molekul, které ovlivňují buněčnou proliferaci.

V některých případech cílem je stimulovat proliteraci v jiném případě zabránit nebo inhibovat proliferaci buněk.

Seznam onemocněni, které přímo zahrnuj i buněčný růst, jako je například rakovina, lupénka, zánětlivé onemocnění, jako je revmatoidní artritida, restenóza, imunologická aktivace nebo suprese zahrnující odmítnutí tkáně, neurodegeneraci nebo expanzi neuronálních buněk a virovou infekci.

Farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství sloučeniny identifikované metodami podle vynálezu se použije při léčbě onemocnění řízeného poruchou metabolizmu zahrnující cukrovku, plenylketonurii, ADA, porfyrii, deprese, Alzheimerovu nemoc, stárnutí, obezitu, poruchy spánku, kožní poruchy, arytmii, renální poruchy, poruchy vidění a poruchy sluchu nebo nevhodná nebo neregulovaná proliferace buněk zahrnující zhoubné bujění, jako je gliom, melanom, Kaposiho sarkom, lupénka, hemangiom a zhoubné bujení vaječníků, prsu, plic, pankreasu, prostaty, střev a epidermoidní rakovina, revmatoidní artritida, lupénka, restenóza, imunologická aktivace nebe suprese zahrnující odmítnutí tkáně, neurodegeneraci nebo expanzi neuronových buněk.

♦ ♦ · ♦

Prostředky a způsoby aplikace

Identifikované sloučeniny se mohou aplikovat lidskému pacientovi samotné nebo ve formě farmaceutických prostředků, kde tvoří směs s vhodnými nosiči nebo ekcipienty v terapeuticky účinných dávkách za účelem léčit nebo zlepšit různé poruchy. Terapeuticky účinná dávka znamená množství sloučeniny dostatečné pro zmírnění symptomů, jak se stanoví v souladu se symptomy určitého onemocnění. V případě léčby zhoubného bujení zmírnění symptomů se stanoví zpomalením růstu buněk. Metody vytvoření a aplikace sloučenin se popisují v publikaci Remington'sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, pozdější ydání.

Způsoby aplikace

Vhodné způsoby aplikace mohu být například orální, rektální, do svalu nebo intestinální, parenterální zavedení zahrnující injekce do svalu, podkožní a intramedulární injekce stejně jako intratekální, přímá intravertikulární, intravenózní, intraperitonální, intranasální intraokulární injekce.

V jiném případě je možné aplikovat sloučeninu podle vynálezu spíše lokálně než systémově, například přímé zavedení sloučeniny injekcí do pevného nádoru, nebo depotní nebo nepřerušovaným uvolněním sloučeniny.

Dále je možné zavést lék prostřednictvím systému cíleného zavádění například pomocí lipozomů potažených nádorově specifickými protilátkami. Lipozomy budou selektivně cíleny a pohlceny nádorem.

Sloučenina/prostředek

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou vyrábět způsobem běžného smíchání, rozpuštění, granulací, přípravou *

• · • · ·

9 · • · · ·· · · · · dražé, rozmělněním, vytvořením emulze, kapsulizací, uzavřením a lyofilizací.

Farmaceutické sloučeniny vhodné pro použití podle vynálezu se tak mohou vytvořit vhodným způsobem za použití jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosičů, které obsahují ekcipienty a pomocné prostředky, které umožňují zpracování aktivních sloučenin za vzniku prostředků, které se mohou použít pro farmaceutické účely. Vhodné prostředky závisí na způsobu formulace.

V případě injekce se činidla podle vynálezu mohou vytvořit jako vodné roztoky, upřednostňují se fyziologicky kompatibilní pufry, jako je Hanksonův, Ringerův roztok nebo fyziologický roztok. V případě transmukozální aplikace se dále používají činidla usnadňující prostup bariéry. Taková činidla jsou obecně známy v oboru.

V případě orální aplikace se sloučeniny vytvořily jednoduchou kombinací aktivních sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči, které jsou dobře známy v oboru. Takové nosiče umožňují sloučenině podle vynálezu se připravit jako tablety, pilule, dražé, kapsule, roztok, gely, syrupy, kaše, suspenze a podobně vhodné pro orální požití pacientem, který se léčí. Farmaceutické prostředky vhodné pro orální požití se mohou získat jako pevné ekcipienty, rozemleté, přičemž vzniká směs, která se zpracuje na granule a po přidání doplňkových prostředků vznikají tablety nebo dražé. Vhodné ekcipienty zahrnují plnidla, jako jsou cukry zahrnující laktózu, sacharózu, manitol nebo sorbitol, celulózové přípravky, jako je kukuřičný, pšeničný, rýžový, bramborový škrob, želatinu, tragant, metylcelulózu, hydroxypropylmetylcelulózu, karboxymetylcelulózu sodíku a/nebo polyvinylpyrolidon (PVP). Jestliže je to nutné, mohou se přidat dezintegrační činidla, jako je polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová nebo její sole, jako je alginát sodný.

···· ··» · · ·· « « ····· · · J • · « · · ·»····» · · «·* · · · »·· ·· ···· ·· · ·· ···

Draže vykazuji vhodný potah. Pro tyto účely se mohou použít koncentrované roztoky cukrů, které se mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrolidon, karbopolový gel, polyetylenglykol a/nebo oxid titaničitý, lakové roztoky a vhodné organické rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. Do tablet a dražé se mohou přidat pigmenty nebo barviva, aby se mohly identifikovat nebo charakterizovat různé kombinace dávek aktivních látek.

Farmaceutické prostředky, které se mohou použít orální cestou zahrnují želatinové kapsule, stejně jako měkké, uzavřené kapsule připravené z želatiny a změkčovadla, jako je glycerol nebo sorbitol. Kapsule spojené vzájemným zasunutím mohou obsahovat aktivní látky ve směsi s plnidly, jako je laktóza, pojidly, jako je škrob, a/nebo lubrikanty, jako je talek nebo stearát hořečnatý, a dále mohou obsahovat stabilizátory. V měkkých kapsulích se aktivní sloučeniny mohou rozpustit nebo suspendovat ve vhodných roztocích, jako jsou mastné oleje, kapalný parafin nebo kapalný polyethylenglykol. Navíc se mohou přidat stabilizátory. Všechny formulace vhodné pro orální aplikaci se mohou aplikovat v dávkách vhodných pro takovou aplikaci.

V případě bukální aplikace se mohou sloučeniny vyskytovat ve formě tablet nebo pastilek vytvořených normálním způsobem.

V případě aplikace inhalací se sloučeniny vhodné pro aplikaci podle vynálezu mohou zavádět ve formě aerosolu z předem natlakovaných nádob nebo rozprašovače, přičemž se použije vhodná hnací látka, například dichlorodifluorometan, trichlorofluorometan, dichlorotetrafluoroetan, oxid uhličitý nebo jiný vhodný plyn. V případě předem natlakovaného aerosolu se může stanovit jednotková dávka pomocí ventilu, který umožní aplikovat odměřené množství. Kapsule a patrony (například želatinové) se mohou použít jako inhalátor nebo insuflátor a mohou se formulovat tak, aby obsahovaly práškovou směs ···« · · · · · • · · ···· * · * · · ·· ······· · ··· · » · · · • w · · · · ·♦ · ·· sloučeniny a vhodnou práškovou bázi, jako je laktóza nebo škrob.

Sloučeniny se mohou formulovat tak, aby se daly použít pro parenterální aplikaci injekcí, například jednorázovou aplikací nebo kontinuální infuzí. Prostředky vhodné pro injekci mohou být přítomny v jednotkové formě (například v ampulích nebo v kontejnerech s několika dávkami) s přidaným konzervačním činidlem. Sloučeniny se mohou vyskytovat v takových formách, jako je suspenze, roztoky nebo emulze v olejových nebo vodných roztocích a mohou obsahovat formulační činidla, jako je suspendační, stabilizační a/nebo dispergační činidla.

Farmaceutické formulace vhodné pro parenterální aplikaci zahrnují vodné roztoky aktivních sloučenin ve formě, která je rozpustná ve vodě. Suspenze aktivních sloučenin se mohou připravovat jako vhodné olejové injekční suspenze. Vhodné lipofilní rozpouštědla nebo vehikly zahrnují mastné oleje, jako je sezanový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je etyloleát nebo triglyceridy nebo lipozomy. Vodné injektovatelné suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je karboxymetylcelulóza sodíku, sorbitol nebo dextran. Suspenze může také obsahovat vhodné stabilizátory nebo činidla, která zvyšují rozpustnost sloučenin, přičemž umožňují přípravu vysoce koncentrovaných roztoků.

V jiném případě aktivní látka může být ve formě prášku a může se před použitím rekonstituovat s vhodným vehiklem, jako je sterilní voda bez pyrogenu.

Sloučeniny se mohou také připravit ve formě rektálních přípravků, jakc jsou čípky nebo nálev proti zácpě obsahující například běžné báze čípků, jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

Vedle dříve popsaných formulací sloučeniny se mohou také vyskytovat ve formě depotních přípravků. Takové dlouho působící formulace se mohou aplikovat implantací (například podkožně nebo do svalu) nebo injekci do svalu. Sloučeniny mohou být ve formě s vhodným polymerickým nebo hydrofóbnim materiálem (například jako emulze v přijatelném oleji) nebo na pryskyřicích vhodných pro výměnu iontů nebo jako těžko rozpustné sole.

Farmaceutický nosič pro hydrofóbní sloučeniny podle vynálezu je systém rozpouštědel, které obsahuji benzylalkohol, nepolární povrchově aktivní látky, s vodou mísitelný organický polymer a vodnou fázi.

Systém rozpouštědel může být tzv. systém VPD. VPD je roztok 3 % (hmotn./objem) benzylalkoholu, 8 % (hmotn./objem) nepolárního povrchově aktivního polysorbátu 80 a 65 % (hmotn./objem) polyetylenglykolu 300 a objem se doplní absolutním etanolem. Systém VPD (VPD:5W) obsahuje VPD ředěný 1:1 s 5% dextrózou ve vodném roztoku. V tomto systému rozpouštědel se dobře rozpouští hydrofóbní sloučeniny a jsou vhodné pro systémovou aplikaci s nízkou toxicitou. Přirozeně poměry v systému rozpouštědel mohou být různé, aniž dojde porušení charakteristik rozpustnosti a toxicity.

Identita komponentů rozpouštědel může kolísat. Například místo polysorbátu 80 je možné použít jiné nepolární povrchově aktivní činidla. Velikost frakcí polyetylenglykolu může být různá, polyetylenglykol mohou nahradit jiné biokompatibilní polymery, například polyvinylpyrolidon a dextrózu mohou nahradit jiné cukry nebo polysacharidy.

V jiném případě se mohou použít jiné zaváděcí systémy vhodné pro hydrofóbní farmaceutické sloučeniny. Lipozomy a emulze jsou dobře známé příklady zaváděcích vehiklů nebo nosičů vhodných pro hydrofóbní léky. Mohou se také použít jistá organická rozpouštědla, jako jsou dimetylsulfoxid, ačkoli obvykle vykazují vyšší toxicitu.

Sloučeniny se mohou zavést za použití systému se stálým uvolňováním, jako jsou semipermeabilní matrice pevných hydrofóbních polymérů, které obsahují terapeutické činidlo.

9999

9 9· •· ·

9 ·· • ·· ·· ·*·· ·· · ·· • · · ·· e 9 · · ·· • »······ · « · · «♦ t· ···

Vznikly různé materiály pro nepřerušované zavádění a jsou dobře známy v oboru. Kapsule vhodné pro nepřerušované zavádění v závislosti na jejich chemické podstatě mohou uvolňovat sloučeniny několik týdnů až do 100 dní.

V závislosti na chemické podstatě a biologické stabilitě terapeutických činidel se může použít další strategie pro stabilizaci proteinu.

Farmceutické kompozice mohou také obsahovat vhodnou pevnou látku nebo ncsič gelové fáze nebo ekcipienty. Příklady takových nosičů nebo ekcipientů zahrnují, ale nejsou omezeny na uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, jako jsou polyetylenglykoly.

Řada sloučenin identifikovaných testy podle vynálezu se mohou vyskytovat jako sole s farmaceuticky kompatibilními protiionty. Farmaceuticky kompatibilní sole se mohou tvořit s mnoha kyselinami, které zahrnují, ale nejsou omezeny na kyselinu chlorovodíkovou, sírovou, octovou, mléčnou, vinnou, maleinovou, jantarovou atd. Sole mají tendence být více rozpustné ve vodných nebo jiných protonových rozpouštědlech, které odpovídají formám volných baží.

Genové sekvence TDNE identifikované způsoby podle vynálezu se mohou aplikovat jako činidla vhodná pro genovou terapii. Genové sekvence kódující identifikované TDNE a vykazující požadovaný terapeutický účinek se mohou zavést in vivo nebo ex vivo do buněk vhodných pro expresi v savci. Genové sekvence TDNE vyvinuté podle vynálezu se mohou aplikovat metodami, které jsou vhdoné pro zavedení nukleové kysleiny do buňky nebo organizmu (zahrnující bez omezení virové vektory nebo odhalenou DNA). Buňky se mohou také kultivovat ex vivo v přítomnosti proteinů podle vynálezu za účelem proliferovat nebo produkovat požadovaný účinek nebo aktivitu v takových buňkách. Ošetřené buňky se pak mohou pro účely terapie zavést in vivo.

··	• 4	44	0	··
•	4	• 4	4	9	4		9	4	9
•	•	0	4 ·	4	4	9	4
•	•	9	4 ·	•	0444	4 4	0
•	•	4	0	•		4	4	•
	00	9999	99		9		99	9

Účinná dávka

Farmaceutické kompozice vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují kompozice, ve kterých se nacházejí aktivní látky v účinném množství, aby se předcházelo vývoji nebo se zmírnily existující symptomy u subjektu, který se léčí. Stanovení účinného množství je pro odborníka jednoduché zvláště, když postupuje podle zde uvedeného detailního popisu.

V případě libovolné sloučeniny použité v metodě podle vynálezu se může terapeuticky účinná dávka odhadnout z testů za použití buněčné kultury. Dávka se například může formulovat ve zvířecích modelech tak, aby se dosáhlo rozmezí cirkulující koncentrace, která zahrnuje IC50, jak se stanovilo v kultuře buněk (to je koncentrace testované sloučeniny, která dosáhne polovinu maximální inhibice biologické aktivity cílového proteinu). Takové informace se mohou použít za účelem přesněji stanovit dávku použitelnou u lidí.

Terapeuticky účinná dávka znamená množství sloučeniny, které zmírní symptomy nebo prodlouží přežití pacienta. Toxicita a terapeutická účinnost takových látek se může stanovit standardními farmaceutickými postupy v buněčné kultuře nebo na experimentálních zvířatech. Může to být stanovení hodnoty LD₅₀ (dávka, která je letální pro 50 % popuslace) a ED₅₀ (dávka terapeuticky účinná pro 50 % populace). Poměr dávky mezi terapeutickými a toxickými účinky se nazývá terapeutický index a může se vyjádřit jako poměr mezi LD50 a ED_5C· Preferují se sloučeniny, které vykazují vysoké terapeutické indexy.

Data získaná z testů za použití buněčných kultur a zvířecích studií se mohou použít při stanovení rozmezí dávky pro použití u člověka. Dávka takové sloučeniny přednostně leží v rozmezí cirkulujících koncentrací, které zahrnují ED50 a vykazují nízkou nebo žádnou toxicitu. Dávka může kolísat v tomto rozmezí v závislosti na použité dávce a na způsobu aplikace. Skutečnou použitelnou sloučeninu, způsob aplikace a dávku může zvolit lékař na základě stavu pacienta (popisuje se v publikaci Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch 1, pl).

Dávka a interval aplikace dávky se může zvolit individuálně tak, aby množství aktivní látky v plazmě bylo dostatečné pro udržení účinků upravujích kinázu nebo minimální účinné koncentrace (MEC). Hodnota MEC bude pro každou sloučeninu různá a může se odhadnout z dat in vitro (například koncentrace nezbytná pro dosažení 50 až 90 % inhibice kinázy za použití zde popsaných testů. Dávky nezbytné pro dosažení MEC závisí na jednotlivých charakteristikách a způsobu aplikace. Testy HPLC nebo biotesty se však mohou použít ke stanovení koncentrací v plazmě.

Intervaly aplikace dávky se mohou stanovit za použití hodnoty MEC. Sloučeniny by se měly aplikovat za použití režimu, který udržuje množství aktivní látky v plazmě po dobu 10 až 90 % času na hodnotou MEC. Upřednsotňuje se, aby se tato koncentrace udržovala v rozmezí 30 až 90 % času a více se upřednostňuje v rozmezí 50 až 90 % času. V případech lokální aplikace nebo selektivního pohlcení účinná lokální koncentrace léku nemůže být podobná koncentraci aktivní látky v plazmě.

Množství aplikované sloučeniny bude samozřejmě záležet na subjektu, který se bude léčit, na hmotnosti subjektu na vážnosti stavu na způsobu aplikace a uvážení lékaře.

Balení

Sloučeniny, je-li to nutné, se mohou nacházet v balíčku nebo v zásobníku, který může obsahovat jednu nebo více forem jednotkové dávky, které obsahují aktivní látku. Balíček může například obsahovat kovovou nebo plastikovou folii, jako je měkké průhledné balení. Balíček instrukce pro aplikaci. Mohou se obsahující sloučeninu podle nebo zásobník obsahuje také vytvořit prostředky vynálezu vytvořenou v kompatibilním farmaceutickém nosiči, mohou se uložit do vhodného kontejneru a označí se za účelem léčby uvedeného stavu. Vhodné stavy uvedení na nálepce mohou zahrnovat inhibici buněčné proliferace, léčbu nádorů, léčbu artritidy a podobně.

Přehled obrázků na výkresu

Na obrázku č. 1A až 1C jsou znázorněny schémata přístupu založeném na AraC vhodného pro identifikaci značených dominanntich negativních elementů (TDNE). Obrázek č. 1A znázorňuje schéma organizace AraC.Obrázek č. 1B znázorňuje schéma organizace chiméry AraC a závislost aktivity lac na dimerizaci fúzovaných domén. Obrázek č. 1C znázorňuje identifikaci TDNE, které blokují dimerizaci chiméry araC:araC. Obrázek č. 1A znázorňuje schéma upraveného systému s duální návnadou vhodného

Obrázek č.

s duální návnadou

Obrázek pro izolaci a identifikaci TDNE.

2A znázorňuje schéma upraveného systému vhodného pro izolaci a identifikaci TDNE.

2B znázorňuje různé možné fenotypy spojené s kandidáty

TDNE identifikované v upraveném systému s duální návnadou.

Obrázek

č. 3 znázorňuje různé fúzní a reportní konstrukce vhodné pro upravené testy s duální návnadou vhodné pro identifikaci izolací TDNE interferuj ících s interakcí

Obrázek znázorňuje fúzní konstrukce a reportní konstrukce chodné pro pozitivní selekci blokačních fragmentů.

Obrázek č.

znázorňuje schématické diagramy fúzních plazmidu AraC leucinovým zipem divokého typu a substituci

L19P.

Obrázek č. 6 znázorňuje mapu plazmidu, která ukazuje mutaci Ras G12V klonovanou do vektoru pSV-neo.

Obrázek č. 7 znázorňuje mapu plazmidu Tet-ON, který se používá v této studii.

• ·

Obrázek č. 8A znázorňuje reportni plazmid Tre-Luc.

Obrázek č. 8B znázorňuje reportni plazmid Fos-Luc.

Obrázek č. 8B znázorňuje expresívní plazmid Zeocin používaný při experimentech společné transformace.

Obrázek č. 9 znázorňuje sílu aktivity β-galaktozidázy zjištěné u transformantů SKY48, které rostou ve 2% galaktóze a 1% Raffinose (část A) a sílu aktivity β-galaktozidázy zjištěné v transformantech SKY48, které se kultivují v 2% galaktóze a 1% Raffinose a 0,2 % glukóze (část B) .

Obrázek č. 10 znázorňuje (v horní části) mapu obecného plazmidu, který se používá při vytvoření fúzí s doménou vázající Cl DNA za vzniku Ras fragmentu TDNE. V nižší části obrázku jsou znázorněny detaily klonovacího místa v plazmidech pVJl,2,3, aby se ilustrovaly změny vytvořené za účelem přizpůsobení začlenění náhodných fragmentů, které mohou být přítomny v libovolném ze tří možných čtecích rámců.

Obrázek č. 11 zobrazuje sekvenci genu Ras. V tečkovaných a čárkovaných segmentech je podtržením zvýrazněn Rfrag, který se isoloval s TDNE za použití strategie fragmentace nukleázou CviJI. Tučným písmem je zvýrazněn fragment RBD popsaný jako ležící mezi proteiny Ras:Raf. Fragment CER je označen podtrženým segmentem. Přesah Rfrag s kousky, o kterých se ví, že leží v mezi prostoru Ras:Raf.

Obrázek č. 12 znázorňuje (v horní části) plazmid používaný pro expresi chiméry CadC: : Tnfot. Sekvence kódující tuto chiméru je zobrazena v nižší části obrázku.

Obrázek č. 13 znázorňuje (v horní části) aktivitu CadBALac (osa y) , kterou je schopen podpořit CadC::Tnfa. Když se zvýší exprese CadC::Tnfoc zvýšením množství IPTG (osa X) , zesílí se také exprese CadBA-Lac. Spodní část obrázku znázorňuje, že společná exprese TNFa, ale nikoli pro-izulin je schopen redukovat signál řízený CadC::Tnfcc.

Obrázek č. 14 znázorňuje plazmid zkonstruovaný tak, aby společně exprirr.oval fúzní proteiny MalE s chimérou CadC.

Obrázek č. 15 znázorňuje plazmid pWE84 exprimujici fúzi MalE se zbytky C7ý-T172. Ve spodní části obrázku je znázorněna sekvence uvedené fúze.

Obrázek č. 15A znázorňuje plazmid pWE85 exprimujici fúzi MalE se zbytky D1-V84. Spodní část obrázku znázorňuje sekvenci této fúze.

Obrázek č. 15B znázorňuje plazmid pWE90 exprimujici fúzi MalE se zbytky D1-L154. Ve spodní části obrázku je znázorněna sekvence této fúze.

Obrázek č. 16 znázorňuje sílu aktivity CadBA-Lac (osa X) v kmenu, kde tento signál interakce je řízen chimérou CadC::Tnfa. Obrázek znázorňuje, že společná exprese fúze MalE se segmenty TNFaR D1-L154 a C77-T172 zahrnuje signál, ale segment D1-V84 tento signál neobsahuje.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Identifikace a izolace TDNE pro interakce Ras-Raf

Charakterizovaly se interakce Ras a Raf a vytvořil se modelový systém, ve kterém je možné demonstrovat úspěšné použití metod a prostředků podle vynálezu. Určité zprávy ukazují, že interakce syntetického Raf-Raf mohou podpořit konstitutivní dráhu signálu Ras (popisuje se v publikaci Flory et al., 1998, J. Virol. 72: 2788-2794, Mineo et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 10345-10348). Následující příklad popisuje úspěšné použití modifikované strategie duálních nástrah založené na kvasinkách a systém založený na AraC za účelem identifikace TDNE, který blokuje interakce protein-protein ras-raf.

Zavedení do signálu transdukce zprostředkovaného Ras a interakce Ras-Raf • · ·· ♦· · ·· • · · · ··· · · · • · · · · · · · · • · · · · ······· ·

Proteiny Ras jsou GTPázy vázané na plazmatické membráně, které funguji jako přepínače transdukčních extrabuněčných signálů v jádru. V normálních buňkách proteiny Ras obíhají mezi neaktivními a aktivními formami GDP, přičemž regulují buněčnou proliferaci a diferenciaci. Detaily o kaskádě signálu transdukce vedoucí k aktivaci transkripčních faktorů, podobných cFos se popisuje v řadě publikací (například McCormick, 1994, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 71-76, Marrrshall, 1996, Curr. Opin. Cell. Biol. 8: 197-204). U velkého počtu lidských karcinomů je Ras blokovaný ve své formě vázané na GTP, což způsobuje mutace aminokyselin 12, 13 a 61 vedoucí ke konstitutivní signalizaci (popisuje se v publikaci Lim et al. , 1996, Eur. J. Biochem. 242: 171-185). Výsledkem je, že dráha Ras dále nevyžaduje v horní části růstový signál a komponenty Ras ve spodní části dráhy, jako je c-Raf-1, MEK a MAPK se aktivují, což způsobuje fenotypy transformující buňky. Transformační fenotypy zahrnují ztrátu kontaktní inhibice růstu, růst v semi-pevném kultivačním médiu, jako je například měkký agar, zvýšenou rychlost proliferace a disorganizovaná vlákna aktinu. Ukázalo se, že dominantní negativní mutanti Ras a Raf blokují uvedené transformované fenotypy, které závisí na interakci Ras s Raf.

Schopnost izolovat úspěšně identifikovaný TDNE za použití upravené strategie duální nástrahy založené na kvasinkách podle vynálezu ekcelentně demonstruje použití podle vynálezu. U TDNE identifikovaného zde v mikrobiálním systému se pak může testovat jeho schopnost obrátit transformovaný fenotyp buněk transformovaných Ras.

Identifikace a izolace TDNE blokujících interakcí založených na Raf a Ras v kvasinkovém systému

Zde využívaný upravený systém duálních nástrah založený na kvasinkách zahrnuje specifické kvasinkové upravené dvouhybridní dominantní negativní schéma dvou nástrah vhodné pro identifikaci TDNE vznikl z lidského HA-Ras, lidského cRafl a lidského aktivovaného Rafl.

Tento systém vhodný pro identifikaci TDNE z lidského HARas obsahuje:

1) fúzní gen LexA-dfRas (df z mutagenizovaného boxu CAAX) integrovaný do kvasinkového chromozomu SKY191 a řídí ho promotorové oblast ADH

2) reportní fúzní gen cl-operátor-hacZ v plazmidu o velikosti dvou mikronů řízený minimální promotorovou oblastí Gall závislou na aktivátoru

3) fúzní gen aktivační oblast-c-Rafl (ΆΌ-cRAfl) v plazmidu o velikosti dva mikrony řízený promotorem Gall indukovaným galaktózou

4) reportní fúzní gen LexA-operátor-LacZ v plazmidu o velikosti dvou mikronů řízený minimální promotorovou oblastí Gall závislou na aktivátoru

5) fúzní knihovnu cI-TDNE v plazmidu o velikosti dvou mikronů tvořící více kopií řízený promotorovou oblastí ADH.

V případě, že kvasinkové buňky SKY-191 s integrovaným fúzním genem LexA-dfRas a fúzní gen aktivační oblast-cRafl v plazmidu o velikodti dva mikrony se kultivuje na kultivačním médiu s galaktózou syntetizují se oba fúzní proteiny a tvoří diméry. Tvorba dimerů vede k aktivaci transkripce dvou reportních genů: genu LexA-operátor-řeu2 na chromozómu a reportního genu LexA-operátor-LacZ v plazmidu o velikosti dvou mikronů. Výsledkem je, že kvasinky mohou růst na syntetickém kultivačním médiu bez leucinu a produkují modrou barvu na kultivačním médiu, které obsahuje XGal. V případě, že se nadměrně exprimuje knihovna potencionálních TDNE (to je fúze cI-dfRas) (z plazmidu o velikosti dvou mikronů) ty proteiny fúzí cI-TDNE, které účině reagují s fúzí ΑΌ-cRafl vedou k aktivaci transkripce reportní fúze cI-operátor-Lys2. Tato aktivace umožňuje, aby se kvasinky s fúzemi TDNE cI-dfRas vybraly na základě růstu na kultivačním médiu bez lyzinu.

· • · · · · · · · · « · · ···· · · • · · · · ······· · ··· · · · · · θ2 ·· ···· ·· · ··

Podsada fúzí vybraných na základě lyzinu může silně reagovat s fúzí AD-cRafl a způsobuje úplnou ztrátu (nebo modulaci) aktivace prvních dvou reportních genů. To znamená genu LexAoperátor-Leu2 s AexA-operátor-LacZ. Takové fúze vykazují záchytný a blokační fenotypy a tvoří proto kandidáta dominantních negativních elementů, které se testují v modelech tkáňovách kultur za účelem zjistit přítomnost obrácení Ras transformačního fenotypu.

Izolace TDNE blokující interakce Raf v systému AraC v organizmu E.coli

Ačkoli chiméra AraC je už popsaná v publikaci Bustos and Schlief, 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5638-5642, Soisson et al., 1997, Science 276: 421-425 kmeny a plazmidy používané při aplikaci AraC vhodné pro izolaci TDNE popisuje tento vynález.

Hostitelský kmen reportního systému a schéma konstrukce

Hostitelský kmen E. coli SAD4 kombinuje několik chromozomálních modifikací, aby umožnil citlivou a účinou detekci dimerizace AraC_DNA. Divoký typ E.coli araC musí být neaktivní, aby se zabránilo soutěžení mezi vytvořeným fúzním proteinem AraC_DNA a AraC. Hostitelský kmen musí také obsahovat reportní gen, který se exprimuje ve zvýšeném množství v přítomnosti dimerizovaného fúzního proteinu AraC_DNA.

SAD4 zkonstruovaný transdukcí Pl_Vir· Markér TnlO z kmene LJ2808 (F, fruRll::TnlO) se přenesl do kmene M8834(F~, Δ1109 (araC-leu), rpsL150), přičemž se produkuje kmen SAD3. Plvir(SAD3) přenesený do kmene RH8669(F , thi, AU169 (lacIPOZYA argF) , fla, relA rpsL araD139, araB: :Mu_cts62/Xpl, ÁW209 (trplocO)) , přičemž vzniká kmen SAD4. Tento kmen vykazuje genotyp {AaraC, ::lacZ) v případě reportního kmene.

• · 9 · · ······· · · ··· · · · · · 9

9 99 9 9 99 9 99 999

Konstrukce pozitivního a negativního kontrolního plazmidu.

Aby se ověřila schopnost vytvořeného fúzního proteinu AraC_DNA produkovat detekovatelný signál v tomto systému, zkonstruovala se sada kontrolních plazmidů. Kontrolní plazmidy kódovaly polypeptid obsahující známou dimerizační oblast, oblast leucinového zipu z kvasinkového proteinu GCN4, fúzovaného s oblastí araC_DNA. Plazmid pKM19-C170 sloužil jako zdroj oblasti vázající DNA araC. Zkrácený gen araC kóduje zbytky 170 až 292. Dimerizační oblast leucinového zipu se amplifikovala z plazmidu pGCN4-leu za použití primerů DAE3 5'-CCC CTC GCA GTA TTA CTG CTC ACT AAC-3' a DAE4 5'-ACG TTC ACC AAC TAG TTT TTT CAG G-3'. Nefunkční leucinový zip se také amplifikoval z plazmidu pGCN4-pro za použití primerů DAE3 a DAE4. Produkty PCR se odděleně klonovaly do pKM19-C170 tak, že fragment kódující dimerizační oblast leucinového zipu byl v rámci s oblastí kódující AraC. Výsledné plazmidy pWEl a pWE2 obsahovaly fúzní protein GCN 4 _dimer:: Ar a C_DNA řízený promotorem lac. Promotor lac a oblast GCN4_dimer: : AraC_DNA z plazmidu pWEl a pWE2 se aplifikovala PCR za použití primerů DAE1 5'-CTG ATC CCC GGG ACC GAG CGC AGC GAG TCA G-3' a DAE2 5'-CTG ATC CCC GGG CTG CAA CTA TGC TAC-3' a klonovaly se do plazmidu pMS421 do restrikčního místa Xmal. Plazmid pMS421 je vektor s malým počtem kopií a také obsahuje gen láci, který kóduje protein represoru lac. Plazmid pWE3 a pWE4 jsou plazmidy založené na plazmidu pMS24, které obsahují buď GCN4_dimer: : AraC_DNA divokého typu nebo konstrukce GCN4_mut. _di_mer::AraC_DNA (zobrazeno na obrázku č. 5). Pouze fúze GCN4 divokého typu aktivuje reportní gen, mutant GCN4, který netvoří dimery tento gen neaktivuje. Tyto aktivační hodnoty poskytují standardy, se kterými je možné porovnat aktivaci jinými fúzovanými oblastmi.

Vektor vhodný pro testování v rámci značených fragmentů

Značené fragmenty se exprimovaly v kmenu mikroorganizmu E. coli, který už exprimuje fúzní protein AraC regulovaný Lac • · z plazmidu zaleženého na pSCIOl, který se selektivně udržuje na spektinomycinu. Vektor pASK75 se používal jako substrát v případě exprese kandidátů TDNE. Tento vektor je založen na počátku replikace colEl, selekce je možná na ampicilinu a zahrnuje promotor tet indukovatelný anhydrotetracyklinem (popisuje se v publikaci Freudlieb et al., 1997, Methods Enzymol. 283: 159-173) a je tak kompatibilní s vektorem exprimujícím AraC. Gen kódující zesílený zelený fluorescenční protein (EGFP) se klonoval po směru exprese genu od promotoru tet. Oblast oddělující promotor tet od genu EGFP je oblast DNA, která obsahuje více kopií transkripčního terminátoru (oblast T4). Po vyjmutí oblasti T4 následuje opětná ligace a vzniká plazmid, který má gen EGFP mimo rámec s ohledem na signál počátku translace promotoru tet. Začlenění náhodně vytvořených fragmentů genových segmentů, které kódují subfragmenty dimerizačního polypetidu fúzovaného s oblastí vázající DNA AraC, může opět vzniknout čtecí rámec genu EGFP translační fúzi takových subfragmentů polypeptidů s genem EGFP. Exprese fúzního produktu se kontroluje promotorem tet. Fúze v rámci se opraví a identifikují se kandidáti TDNE na základě jejich flurescenčního fenotypu indukovatelného anhydrotetracyklinem. Vhodné klony se pak testují za účelem zjištění fenotypu TDNE tak, že se vyhledává změna aktivační funkce AraC (fenotyp Lac⁺ se stává Lac) .

Konstrukce Raf

	Gen raf v	plné	délce	se	pak amplifikoval PCR tak,	aby
obsahoval konce	Pstl	a BamHI	za	použití	primerů
DAE5	5'-GAC	ATA	CTG	CAG GAT	GGA	GCA CAT	AC-3' a
DAE6	5'-CTG	TAT	GGA	TCC AGG	AAG	ACA GGC	AG-3'.
	Tento	fragment	PCR se	: klonoval	do plazmidu pKM19-	-C170

štěpeného restrikčními enzymy Pstl a BamHI tak, že produkt genu raf byl v jednom rámci s genovým produktem araC_DNA. Celá fúze se amplifikovala PCR, aby obsahovala konce Xmal s primery

DAEI a DAE2 (popisují se shora v textu) a klonovaly se do plazmidu pMS421 štěpeného restrikčním enzymem

Xmal.

Dimerizačni potenciál se hodnotil transformací kmene do

SAD4 a měřením množství β-galaktozidázy.

Mikrobiální přístupy popisované shora v textu (modifikovaný přístup s duální nástrahou v kvasinkách a

AraC v mikroorganizmu E.

úspěšně identifikovaly řadu kandidátů TDNE, které inhibuji interakce protein-protein rasraf.

Příklad 2: Hodnocení kandidáta Ras a Raf TDNE

Příklad shora v textu popisuje úspěšnou identifikaci kandidáta TDNE, který blokuje interakce protein-protein rasraf. Hodnocení jejich podstaty jako funkční TDNE vyžaduje expresi buněk transformovaných Ras a stanovení buněk, které vykazují účinný TDNE.

Identifikace TDNE, které inhibují onkogenní interakci Ras s Raf a proto přerušuje signalizační dráhu Ras a redukuje buněčný transformační potenciál, může probíhat na základě uvedených testů. V případě takových studií je možné připravit onkogenní buněčnou linii transformovanou ras s indukovatelným genovým expresívním systémem. Například savčí buňky transformované lidským onkogenním genem Ras se transformovaly plazmidy expresívního systému Tet-on (Clontech, Palo Alto, CA, zobrazeno na obrázku č. 7). Kandidát DNA fragmentů Ras TDNE identifikovaný v mikrobálních systémech (popisuje se shora v textu) se začlenily do Tet-on plazmidu pTRE (popisuje se dále v textu). V tomto plazmidu se fragment DNA exprimuje v hostitelských buňkách a jeho přítomnost se kontroluje na základě schopnosti buněk růst na kultivačním médiu s doxycyklinem (Dox) nebo tetracyklinem (Tc) . Změna buněčného transformačního potenciálu řízením exprese dominantních negativních fragmentů DNA Ras se hodnotila měřením rychlosti

9* 9*9·· « · 9 9 9 »«99

9 999999

9 9 99 999«9·99

999*99 »9 9 · »· buněčné proliferace, syntézou DNA, aktivitou MAPK, růstem buněk na měkkém agaru a aktivací promotoru c-Fos.

Buněčná kultura

Vynález popisuje savčí buněčné linie, které jsou onkogenní na základě jejich transformace Ras. Buď buňky CHO nebo NIH 3T3 se transfekovaly plazmidy expresívního systému Ras a Tet-on. Buňky se udržovaly při teplotě 37 °C na Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM) s 10 % fetálním bovinním sérem (FBS), 2 mM L-glutaminem, 100 jednotek/ml penicilinu a

100 pg/ml streptomycinu v komorách s vysokou vlhkostí a s atmosférou 5 až 10 % CO2.

Plazmidy

V savčích buňkách gen ras kóduje rodinu úzce příbuzných proteinů o molekulové hmotnosti 21 000, mezi něž patří N-ras, K-ras a H-ras. Aktivované onkogeny ras se identifikovaly v různých formách lidského zhoubného bujení, které zahrnují karcinomy plic, střev a pankreasu. Zde používaný gen ras je onkogen H-ras klonovaný z buněk lidského karcinomu močového měchýře, které nesou mutaci v kodonu 12 (glycin substituuje valin). Genomová DNA o velikosti 6,6 kb (obrázek č. 6) (Parada et al., 1982, Nátuře 297: 474-478) se začlenil do restrikčního místa BamHI vektorového plazmidu pSV2-neo (popisuje se v publikaci Berg, 1982, J. Mol. Applied Genet. 1: 327-341) za vzniku plazmidu pSV-neo-EJ (obrázek č. 6) .

Příprava buněčné linie s indukovatelnou expresí genu

Plazmidy expresívního systému onkogenního Ras a Tet-on se zavedly metodou elektroporace zprostředkovanou lipozomy. V případě stabilní transfekce se 10 pg plazmidové DNA v savčích buňkách rostoucích v kultivačním médiu bez séra a antibiotik se nejdříve smíchá s 5 μΐ lipozomů (Lipofektin, 1 mg/ml, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) a inkubovaly

	88	44 ·· 4 4 4 4 • · · • · · t • · · 44 4···	·· * • »4 4 4 4 4 • 4 4444 • 44 ·· ®
se při teplotě	místnosti po dobu	30	minut.	Směs
plazmid/lipozom se	pak přidala k suspenzi	recipientních	buněk
(3 x 10s buněk) a	zavedly se elektroporací	při	napětí 180 V a
700 μΓ (BTX Electro Cell Manipulátor 600,	Genetronics,	lne. ,

San Diego, CA). Po elektroporaci se buňky rozdělily na Petriho misky o průměru 60 mm s normálním buněčným médiem. Druhý den se buněčné kultivačně medium zaměnilo za kultivační medium s 0,5 mg/ml G418. Dva až tři dni po zavedení selekce se izolovaly kolonie rezistentní vůči G418 a z jednotlivých kolonií se připravily nezávislé buněčné linie. U buněčných linií rezistentních na G418 se pak testovala luciferázová aktivita podle následujícího protokolu (Promega, Madison, WI) . Za účelem zavedení do plazmidů indukovatelných Tc nebo Dox stabilní transfekcí, jak se popisuje shora buněčná linie s nejvyšší luciferázovou linie se vybraly na základě rezistence kolonií rezistentních na hygromycin se v textu, se vybrala aktivitou. Buněčné na hygromycin. U testovala exprese sekvence dominantní negativní DNA, přičemž buněčné kultivační médium obsahovalo nebo neobsahovalo Tc nebo Dox.

Na základě funkčních testů se vybraly nejlepší kolonie.

V jednom provedení vynálezu se buňky transfekované Pas-dominantnínegativní sekvencí se přeměnily na on nebo off pomocí Tc nebo

Dox a pak se testuje transformační potenciál buněk.

Metody vhodné pro měření buněčných transformačních potenciálů.

Při testování účinnosti DNA dominantní-negativní sekvence, které přerušuje interakci protein-protein v savčích buňkách, se používají specifické funkční testy. V jednom provedení podle vynálezu Ras dominantní-negativní sekvence je dosažitelná změnami buněčného fenotypu v onkogenních buňkách transformovaných Ras. Onkogenní buňky transformované Ras v obecném případě vykazují zvýšenou proliferaci buněk a rychlost syntézy DNA, růst na semi-pevném kultivačním mediu, jako je například měkký agar, aktivaci například MAPK a c-Fos.

φφφφ φ φ · φ

« φ φ •

φ· φφφφ

Syntéza DNA se měřila začleněním [³H]thymidinu. Buňky CHO se transfekovaly různými dominantními negativními inzerty a nanesly se na plotny s 24 prohlubněmi při hustotě buněk 3xl0⁴ v jedné prohlubni v růstovém médiu při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Buňky se pak třikrát promyly fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS) a inkobovaly se v růstovém mediu, které obsahuje 5 gCi/ml [³H]thymidinu a dále obsahuje nebo neobsahuje Dox. Buňky se inkubovaly po dobu 16 hodin a radioaktivita začleněná ve frakcích rozpustných v kyselině trichloroctové se stanovila kapalnou scintilační spektrometrií.

V případě testů růstu na měkkém agaru se buňky CHO transfekovaly různými dominantními negativními inzerty nanesly na plotny s 6 prohlubněmi při hustotě buněk lxlO⁴ v jedné prohlubni (kultivační médium neobsahuje Dox) nebo lxlO⁵ (v případě, že kultivační médeium obsahuje Dox) . Plotny s měkkým agarem zahrnují vrstvu 6 ml 0,5 % agaru Noble a střední základní vrstvu, na jejímž povrchu se nacházejí buňky, tvoří

1,5 ml 0,3 % střední agar Noble, který obsahuje nebo neobsahuje indukční činidlo Dox. Buňky se inkubovaly po dobu 3 týdnů při teplotě 37 °C a hodnotil se počet kolonií s průměrem větším jak 0,1 mm.

Rychlost růstu buněk se stanovila buď metodou exkluze barviva Trypanovy modře nebo sadou proliferace buněk od firmy Clontech (Palo Alto, CA).

Za účelem stanovení, jak Ras dominantní negativní sekvence ovlivňují aktivitu MAPK v onkogenních Ras transformovaných buňkách se buňky nechaly růst v tkáňové kultuře v kultivačním médiu, které buď obsahovalo nebo neobsahovalo indukční činidlo Dox po dobu 48 hodin. Buňky se pak promyly 10 ml PBS a lyžovaly se v pufru (50mM Tris -HC1 (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 % kyselina deoxycholová, 1% NP-40, 10 % glycerol, 50 mM NaF s 10 gg/ml leupeptinu a aprotinu, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid a 1 mM Na₃VO₄ ( po dobu 30 minut na ledu). Při umunologickém sráženi se používá 200 μ9 buněčného lyzátu z každé buněčné linie spolu s 1 μς séra kinázy 2 regulované proti extrabuněčnému signálu (ERK2). Imunologické sraženiny se pak dvakrát promyly lyzinovým pufrem, dvakrát s kinázovým promývacím pufrem, který obsahuje 50 mM Tris/HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂ a 1 mM dithiotreitol (DTT), a jednou se promyl kinázovým pufrem, což kinázový promývaci pufr obsahující 50 mM ATP. Každá reakční směs MAPK obsahuje 30 μΐ kinázového pufru, 5 μΐ [γ-³²Ρ]-ΑΤΡ (1 μθί/μ1) a 2 μΐ substrátu MBP (5 μg/μl) . Po inkubaci při teplotě 30°C po dobu 15 min se reakce zastavila a přidalo se 8 μΐ 6 x koncentrovaného vzorkového pufru a vše se zahřálo na teplotu 95 °C po dobu 5 min. Vzorek se analyzoval na 12 % SDS polyakrylamidovém gelu a exponoval se na film vhodný pro paprsky X nebo se kvantifikoval počítáním kapalinovou scintilací.

Transkripčni faktor c-Fos je jeden z časných genů, který se stimuluje mítogennimi signály. Věří se, že mitogenní signály indukované Ras způsobují fosforylaci proteinů vázající promotor c-Fos_f což vede k expresi c-Fos. Při testováni, zda Ras dominantní negativní sekvence, které se identifikovaly z mikrobiálních systémů, mohou přerušit signály Ras onkogeních savčích buňkách transformovaných ras. Tímto způsobem se dá stanovit exprese c-Fos. V případě jednoduché detekce oblast promotor cFos/zesilovací oblast (polohy -711 až +41, uvádí se na obrázku č. 8A) nahrazuje oblast TRE plazmidu pTRE-Luc za vzniku plazmidu pFos-laic zobrazeného na obrázku č. 8B. Plazmid pFos-Luc je pak transfekován společně s plazmidem rezistentním na zeomycin uvedeným na obrázku č. 8C do buněk obsahujících Ras dominantní negativní plazmidy. Vybraly se buňky rezistentní na zeomycin s nejvyšší luciferázovou aktivitou (za použití kitu pro luciferázovou aktivitu od firmy Promega, Madison, WI). Účinek Ras dominantní negativní sekvence na expresi c-Fos se stanoví kultivací buněk v kultivačním médiu, • · · · · 9 · které obsahuje nebo neobsahuje indukční činidlo Dox a porovnáním luciferázové aktivity.

Příklad 3: Analýza kompetice mezi sekvencemi aktivační oblasti a partnerského proteinu v modifikovaném systému duálních nástrah tomto příkladu se popisuje kompetice LexA-dfRas a

Cldf Ras při interakci s Ad-cRafl u kvasinek S.cerevisiae kmen

SKY48.

Za účelem izolovat

TDNE z knihovny soutěží HA-Rasl plné délky (C186G) fúzovaný s proteinem vázající DNA LexA (DBP) a kandidáti TDNE fúzováni s

CI-DBP o navázáni s fúzním proteinem

AD-cRaf1. V případě, že je přítomen fúzní protein AD-cRaf v nadbytku, nedojde k soutěžení. Za podmínek, při kterých v normálním případě dochází k testům interakci kvasinkového proteinu (2% galaktóza,

1% rafinóza) není možné spatřit takové interakce (uvádí se na obrázku č. 9A) . Za účelem pozorovat takovou soutěž množství reguluje systematicky slouží jako inhibitor fúzního proteinu Ad-cRafl se negativně se měniči koncentraci glukózy (která exprese regulované promotorem gal) v růstovém médiu.

Aby došlo ke konstrukci relevantních sérií kmenů, SKY48 se transformoval buď Cl nebo CI-dfRas a pak následuje selekce na zeocinu. Současně se vytvořila druhá sada transformantů tak, že se zavedly tři plazmidy obsahující buď AD (samotný) nebo AD-cRAFl, partnera LexA oblasti vázající druhou DNA a to buď samotný nebo fúzovaný s dfRas a jeden ze dvou reportních plazmidu, které nesou fúze buď CI-operátor-LacZ nebo LexAoperátor-LacZ. Po konečném kole transformace se izolovalo 8 oddělených klonů pro každý z 12 kmenů, které jsou zobrazeny na obrázku č. 9. Tyto klony se inkubovaly v testovacím médiu. Uvedené kmeny se nechaly růst v minimálním kultuvačním médiu, které obsahuje 2% galaktózu a 1% rafinózu (obrázek č. 9A) , přičemž dochází k plně indukované expresi AD nebo (AD~cRafl) nebo v jiném případě se inkubovaly ve stejném médiu, které obsahuje 2% galaktózu, 1 % refinózu a 0,2 % glukózu (obrázek č. 9B), přičemž se částečně indukuje exprese AD (nebo AdcRaf) . Výsledek zobrazený na obrzku č. 9B demonstruje optimální soutěžení mezi CI-dfRas a LexA-dfRas. Kmeny se nechaly růst pc dobu 6 hodin v indikačním médiu a uskutečnily se standardní β-galaktozidázové testy. Obrázek č. 9 zobrazuje průměry výsledků osmi testovaných izolátů se standardní odchylkou 10 %.

Výsledky indikují, že při podmínkách standardního testu nedochází k podstatné soutěži LexA-dfRas a CI-dfRas. Zavedení soutěžícího fúzního proteinu LexA-dfRas nesnižuje sílu exprese β-galaktozidázy s fúzním proteinem CI-operátor-Lac reportér, při fúzi CI-dfRas s aktivní oblastí.

Zavedení soutěžícího fúzního proteinu Ci-dfRas pouze slabě (33%) redukuje sílu exprese β-galaktozidázy s LexA-op-Lac reportní molekulou, přičemž

LexA-dfRas směřuje do aktivační oblasti. V případě, že se snižuje exprese aktivační oblasti (přidáním 0,2 % glukózy) v nestandardním testu, je možné detekovat podstané soutěžení. Fúzní protein LexA-dfras (s 0,2 % glukózou) redukuje sílu exprese β-galaktozidázy s CI-op-Lac reportní molekula, přičemž CI-op-Lac reportní molekula a CI-dfRas směřují do aktivační oblasti. K dvounásobnému snížení dochází tam, kde dříve k redukci nedošlo. K více jak pětinásobnému snížení dochází v případě soutěžení fúzního proteinu CI-dfRas s 0,2 % potlačení glukózy, přičemž ve standardním testu s LexA-op-Lac reportní molekul, kdy do aktivační oblasti směřuje LexA-dfRas, dochází pouze k 35 % omezení.

Příklad 4: Testování knihovny fragmentů Ras za účelem vyhledávání členů, kteří interagují s Raf a blokují interakční signál Ras-Raf

V tomto příkladu se popisuje úspěšné vytvoření a testování knihovny TDNE ras proteinových fragmentů. Zvláště se ukázalo, že použitím modifikovaného systému s duální nástrahou podle • · vynálezu je možné titrovat interakční signál ko-expresí jednoho z interakčních partnerů. Signál, který je výsledkem interakce LexA-Ras::Rař-Adby se mohl titrovat ko-expresí CIRas. Systém, ve kterém je možné interakční signál utlumit koexpresí jednoho interakčních partnerů v plné délce, je důležitým předpokladem pro vyhledávání fragmentů takového partnera, který může redukovat interakční signál.

Shora v textu se uvádí, že standardní zavedení kvasinkového dvouhybridního systému postrádá dvouhybridní interakční signál, který je předmětem soutěže. Modifikace uvedeného systému prostřednictvím obou genetických manipulací (počet kopií) a regulace genů umožňuje negativní regulaci partnera aktivační oblasti tak, že dochází k soutěžení.

Vedle toho, že interakční signál je předmětem titrace, aplikace uvedené strategie vede k fragmentaci cílové DNA na menší fragmenty velikosti domény pro produkci knihovny TDNE.

Knihovna fragmentů vzikla na základě proteinu Ras. 300 ng DNA z plazmidu pJD4-5-dfRas se vytvořilo částečným štěpením restrikčním enzymem CviJI za uvolněných podmínek. Restríkční nukleáza CviJI v normálním případě štěpí DNA mezi RG a CY za uvolněných podmínek (10 mM Tris_HCl pH 8,0, 10 mM NaCl, 20 % DMSO, 20 mM DTT a 1 mM ATP) bude štěpit DNA mezi PuG a Cpy, PuG a Cpu a PyG a CpPy, přičemž dochází ke štěpení po každých 16-ti nukleotidech. Takto naštěpená DNA má tupé konce, což obchází požadavek pro aplikaci enzymu před následným klonováním. Protože restríkční místo CviJI je náhodně umístěné s ohledem na čtecí rámec cílového proteinu ( v tomto příkladu jde o protein Ras) daný fragment má pouze 1/3 šanci být klonován do rámce fúze s cílovm nosičovým proteinem (Cl, v modifikovaném dvouhybridním systému s duálními nástrahami). Aby se zajistil potenciál pro fúze v rámci, z derivátu pGKS6 se zkonstruovaly tři deriváty fúzního vektoru Cl (jeden z každého čtecího rámce) (popisuje se v publikaci Serebriishii, I. Khasek, V. and Golemis, EA., 1999, J. BIO.

• »

Chem. 274: 17080-17087) začleněním syntetizovaných nukleotidů podle standardních technik (uvedeno na obrázku č. 10). Rozmezí úrovně částečného štěpení se testovalo různým množstvím nukleáz a vybraly se podmínky vykazující plné rozmezí částečných produktů. Soubor fragmentů větších než přibližně 30 párů baží se čistilo na gelu, zvýšila se jejich koncentrace a ligovaly se podle standardního postupu. 300 ng čištěných fragmentů se ligovalo s 30 ng vektoru pVJl,2,3 štěpeného restrikčním enzymem Ecl36 a defosforylovaného. Vektor byl v ekvimolární směsi tří různých vektorů ve čtecím rámci, jak se popisuje shora v textu. Tato směs se transfromovala do hostitelského kmene mikroorganizmu E. coli DH5a a transformanty se vybraly na základě rezistence na kanamycin (v koncentraci 30 gg/ml) na plotnách s půdou LB při kultivaci při teplotě 37 °C. Vybralo se přibližně 4 500 kolonii a amplifikovaly se v kapalném kultivačním médiu po dobu 5-ti hodin a izolovala se plazmidová DNA (pVJ-knihovna) pomocí sady Wizard Midi prep podle instrukcí výrobce (Promega, Madison, WI) . Šest mikromolů pVJ-knihovny se transformovalo do kvasinkového kmene SKY48 (popisuje se shora v extu) a selekce se provedla na pevném agaru s lyzinem na kultivačním médiu s galaktózou a rafinózou doplněném zeocinem. Samotný vektor a vektor Cl fúzovaný s Ras v plné délce se použil jako negativní a pozitivní kontrola.

Po třech dnech inkubace při teplotě 30 °C se na testovacích plotnách objevily kolonie 545 Lys⁺. Tyto kolonie se testovaly za účelem zjištění, zda dochází k aktivaci exprese fúze Ci-op-LacZ reportní gen (popisuje se v publikaci Serebriiski, L., Khasak, V., and Golemis, EA., 1999, J. Biol. Chem. 274: 17080-17087). Všechny tyto kolonie produkovaly stejnou sílu exprese Lac, ať už rostou na glukóze (produkuje se neaktivační fúze Raf) nebo rafinóze/galaktóze (indukovala se aktivační fúze Raf), což indikuje, že se izolovala pouze samo se aktivující Cl-fúze. Po 5-ti dnech inkubace se objevilo • · dalších 1 500 kolonií a 360 z nich se čistilo a testovalo za účelem zjištěni schopnosti samoaktivace. Mezi 360 koloniemi 20 vykázalo aktivaci závislou na Raf (Lys⁺ a Lac⁺ jsou pouze na kultivačním médiu s galaktózou/rafinózou). Těchto 20 vybraných klonů se čistilo a plazmidové inzerty se charakterizovaly pomocí analýzy PCR za použití primerů lemující inzertní místa. Jsou to 5'-ATG ATC CCA TGC AAT GAG AG-3' (přímý primer pro cl) a 5'-TTC GCC CGG AAT TAG CTT GG-3' (reverzní primer). Produkty PCR indikovaly, že jsou přítomny 4 třídy velikostí klonů. Sekvence DNA se stanovila (za použití primerů PCR) v případě několika reprezentativních členů každé třídy podle standardních postupů. Nejvíce frekventovaná třída obsahovala sekvenci Ras (zvýrazněnou na obrázku č. 11, (Rfrag)) fúzovanou v rámci s proteinem vázající DNA Cl. Potvrdilo se, že další tři třídy klonů překvapivě obsahovaly anti-sense segmenty genu Ras. Všechny uvedené anti-sense inzerty se také nacházely v rámci s produktem Cl a obsahovaly běžný (anti-sense) fragment CviJI. Vyslovila se hypotéza, že běžný anti-sense fragment reprezentuje peptid vázající Raf.

Fragment Ras identifikovaný uvedeným postupem odpovídá datům, které charakterizují interakci Ras-raf. Obrázek č. 11 uvádí segment Ras identifikovaný v této studii (Rfrag) . Je to segment, který se nachází ve středu meziprostoru interakce Ras-Raf (RBD, popisuje se v publikaci Marshall M., 1995, Mol. Reprod. 42: 493-9, Terada T., et al., 1999, J. Mol. Biol. 286: 219-32) a ukázalo se, že fragment Ras se váže na Raf (CER, popisuje se v publikaci Fujita-Yoshigaki, J. , et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 4661-7). Tento postup identifikoval vhodný fragment CviJI přesahující oblast Ras, o které je známo, že je centrální oblastí interakce Ras-Raf.

Příklad 5: Demonstrace, že interakční signál založený na CadC je předmětem titrace druhého společně exprimovaného interakčního partnera • · · · · · · « · • · · · · · · · · · · · · · · · ♦ · • · · * · ······· ·

P, _r ··· .···· yo ·· ···· «· ♦ ·· ·

Tento přiklad ukazuje úspěšnou identifikaci TDNE za použití dimerizačního detekčního systému mikroorganizmu E. coli založeném na CadC a dále popisuje skutečnost, že signál vytvořený v systému založeném na CadC je subjektem kompetice a důležitou nutnou podmínkou při vyhledávání a identifikaci TDNE, které obsahují fragmenty proteinu, který se podílí na určité interakci protein-protein.

Za účelem demonstrovat, že interakční signál EDDS je předmětem kompetice. Zkrácená forma CadC 1 (zobrazeno na obrázku č. 2, WO 99/23116) se použila jako základní bod pro vytvoření chiméry CadC-TNFa.

Aby se získaly sekvence TNFa, použily se vhodné primery pro amplifikaci PCR 5'-TCT CCC CTG GAA AGG ACA CCA TGA GC-3' a 5'-GGC GTT TGG GAA GGT TGG ATG TTC G-3' TNFa z lidské placentární cDNA knihovny Marathon (Clontech, Palo Alto, CA) za použití sady pro PCR Advantage-HF (od firmy Clontech) v souladu s doporučením výrobce. Fragmenty PCR se klonovaly do vektoru pGEM-T a transformovaly se do hostitelského kmene JM109 (Pormega, Madison, WI). Přesnost produktu se ověřila analýzou sekvence DNA v souladu se standardním postupem a souhlasila s publikovanou sekvencí TNFa (popisuje se v publikaci Marmenout, A. et al., 1985, Eur. J. Biochem. 152, 515-522) .

Aby se vytvořila chiméra CadC-TNFa, izolovalo se TNFa za použití následujících PCR primerů:

5 '-AAG TCT GTC	GAC AGT	CAG	ATC	ATC	TTC	TCG (restrikční	místo
Sáli 5' konce) a
5 '-GCG GGA TCC	TCA CAG	GGC	AAT	GAT	CCC	AA (restrikční	místo
BamHI 5'konce).
Požadovaná	chiméra	CadC	vznikla	vyjmutím TNFaR	ECD

z plazmidu pCCT-1 (přihláška patentu EDDS) štěpením restrikčními enzymy Sáli a BamHI a nahrazením fragmentem Sáli a BamHI, který vznikl štěpením fragmentu PCR extrabuněčné • ·

Λ · oblasti TNFa za použiti metod standardní molekulové biologie (popisuje se shora v textu). Za účelem potvrzení integrity se stanovila sekvence DNA chiméry ve výsledném plazmidu (pWE43). Restrikční mapa pWE43 a sekvence chiméry CadC-TNFa jsou dány na obrázku č. 12.

Plazmid pWE43 se transformoval do E2088 (popisuje se v publikaci WO 99/23116) a izolavaly se transformanty. Transformanty se přenesly do jednotlivých prohlubní mikrotitrační destičky a nechaly se kultivovat v 200 μΐ půdy LB s 25 μς/ιηΐ spektinomycinu (bez míchání) při teplotě 30 °C po dobu 14 hodin. Nakonci počáteční růstové doby se buňky naředily (1:40) a nechaly růst při uvedené koncentraci IPTG po dobu 5 hodin. Hustota buněk se měřila při vlnové délce 600 nm. Buňky se ošetřily chloroformem a staly se permeabilní a odebraly se alikvoty a testovala se u nich β-galaktozidázová aktivita za použití substrátu chlorofenolové červeně β-Dgalaktozidu (CRPG, Eustice, et al, 1991, Biotechniques 11: 739-742), jak se popisuje v publikaci Menzel R. , 1990, Anal. Biochem 181: 40-50, WO 99/23116). Data na obrázku č. 13 (horní panel) ukazuji, že výsledkem indukce konstrukce CadC-TNFa je transkripce CadBA, jak se monitorovalo pomocí β-galaktozidázové aktivity.

Aby se zjistilo, zda tento signál je předmětem titrace, je nezbytné společně exprimovat TNFa (a kontroly) s konstrukcí

CadC-TNFa. Za účelem tohoto dosáhnout se navrhl druhý plazmid, aby byl kompatibilní s pCCT-I, který exprimuje exprimovaný protein do periplazmy. Tento vektor počátku replikace colEl a jako selekční markér

CadC a zavádí je založen na se používá ampicilin. Uvedený vektor je pak selektovatelnými s vektory

CadD s pSCIOla kompatibilní spektinomycinu.

na pBADa (popisuje se začleněním signální

Periplazmatický expresivni vektor v dokumentu WO 99/23116) se vytvořil sekvence OmpA mezi restrikční místa EcoRl a Xhal plazmidu • 9 ·· · · · 999 • · 9 ·99·· ·· 9 «999 99· • 9 9 · ♦ 9 ···· 9 9 ·9 • 9 ♦ ···999 • 9 999« 99 · 9 ·9«9 pBAD18 (popisuje se v publikaci Guzman et al., 1995, J: becteriol. 177:4121-4130). Vedle konstruování tohoto základního vektoru uvedený patent dále popisuje klonování cytokinu TNFa a proinzulinu do periplazmatického expresivního vektoru. Tato sada plazmidu poskytuje činidla nutná pro testování systému CadC v případě kompetice.

Testování kompetice signálu CadC-TNFa se provedlo transformací plazmidu pBAD18 (vektor), pASI (plazmid exprimující proinzulin) a pAST (plazmid exprimující TNFa.) spolu s pWE43 (indukovatelný CadC-TNFa) do kmene E2088 za použití standardních postupů a současně se provedla selekce na ampicilinu (100 μg/ml) a streptomycinu (25 μς/πιΐ) na pevné LB agaru. Kultury těchto 3 kmenů (200 μΐ na mikrotitračních destičkách) se kultivovaly přes noc v kapalném LB (aniž se míchaly) při teplotě 30 °C se 100 μρ/ml ampicilinu a 25 μρ/ιηΐ spektinomycinu. Na konci počáteční doby růstu se buňky naředily zpátky v poměru 1:40 a nechaly se růst při uvedených koncentracích IPTG po dobu 5 hodin. Provedly se testy způsobem popsaným shora v textu a výsledky jsou zobrazeny na obrázku č. 13 (spodní panel). Výsledky indikovaly, že signál TNFa v chimeře CadC je předmětem kompetice koexprimovaného TNFa, nikoliv však nepříbuzného proteinu proinzulinu. Kompetice vyjádřena (až 50 x) na úrovni spodní hranici exprese chiméry (malé množství IPTG), jak se očekávalo v případě fixovaného množství kompetitoru řízeného bazální expresí promotoru dosáhlo

Použily se různé přístupy, aby se ara.

izolace fragmentů

TNFa, které by mohly soutěžit případě, že se exprimuj i s jinými jako fúze fragmenty.

například stabilizaci fragmentů značkou, se nepozorovala Fúze jednoho nebo více fragmentů se z nosičovým proteinem může vést ke

OmpAi_eader ·

Kompetice a/nebo další prostorového uspořádání, které bude blokovat interakci. Fúze s nosičovým proteinem MalE se konstruovala za účelem testování uvedené hypotézy. MalE se • · použil úspěšně k řízení exprese řady proteinů do periplazmy mikroorganizmu E. coli (popisuje se v publikaci Yanish-Perron, C et al., 1985, Gene 33, 103-119, Guan, C., et al., 1987, Gene 67, 21-30) a poskytuje vhodnou metodu pro afinitní čištění libovolným blokováním fúzi (popisuje se v publikaci Kellerman, O. K. and Ferenci, T., 1982, Methods in Enzymol. 90, 459-463, LaVallie, E., Ausebel, F.M. et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology Greene Associates/Wiley Interscience, New York pp. 16.4.1.-16.4.17).

Vhodný protein fúzního vektoru MalE, který je kompatibilní se systémem CadC se zkonstruoval pomocí amplifikace genu malE z vektoru pMAL-p2K (New England Biolabs, Beverly MA) za použití následujících primerů PCR:

5' -GGA ATT CAG GAG GAA TTA ACC ATG AAA ΑΤΑ AAA ACA GGT GCA CGC ATC-3', restrikční místo EcoRI a syntetický RBS a

5' -GCG GTG GAG CTC TAC GTA AGT CTG CGC CGT CTT TCA GGG CTT CAT CGA CA-3', GTCTG, restrikční místo SnaBI a Sací.

Produkt PCR se štěpil restrikčnim enzymem EcoRI a Sací a klonoval se do plazmidu pBAD18 (popisuje se shora v textu) štěpeného restrikčnim enzymem Sací a EcoRI za použití metod standardní molekulární biochemie za vzniku plazmidu pWE67 s restrikční mapou, která je zobrazena na obrázku č. 14. Tento vektor je kompatibilní se systémem CadC (pWE67 obsahuje ColEl ori a vykazuje β-laktamázovou selekci) a klastr restrikčních míst SnaBl-HindlII poskytuje způsoby generující fúze s proteinem MalE.

Za použití pWE67 jako expresívního vektoru se zjistilo, že různé fragmenty spolu soutěží v různém rozsahu. Tyto stejné fragmenty, jestliže se exprimuji bez značky nevykazují však žádnou kompetici, což naznačuje, že značka, v tomto případě nosičový protein, je nezbytný buď ke stabilizaci blokačních fragmentů a/nebo k přidání prostorového uspořádání.

100 • ··· · ·

Přiklad 6: Izolace fragmentů, které soutěži nebo nesoutěži s TNFaR

Extrabuněčná oblast TNFaR je rozsáhlé uspořádání s dobře definovanou suboblastí, která může poskytnout ideální test podle vynálezu pro experimentální definování vhodných fragmentů proteinu, které může působit jako dominantní genetické elementy. Receptorová rodina TNFaR se charakterizovala modulární organizací suboblastí bohatých na cystein, jejichž výsledkem je prodloužená extrabuněčná oblast (popisuje se v publikaci Naisymth JH and Sprang SROV., TIBS 23 (1998) 74-79). Struktura zjištěná paprsky X extrabuněčné oblasti TNFaR typl (55K) v komplexu s ligandem TNFa se publikovala v publikaci Banner et al. , Cell7 (1993) 431-54 a vykazuje apikálně vázaný trimérový ligand. Dříve se zjistilo, že chiméra CadC-TNFaR(typll) je schopna podpořit interakční signál v systému CadC (popisuje se shora v textu). Za účelem zjištění schopnosti různých segmentů receptoru ECD blokovat interakční signál CadC-TNFaR, vytvořila se fúzováním segmentů kódujících TNFaR ECD se sekvencí kódující značku MalE ve vektoru popsaném shora v textu fúze různých sekvencí TNFaRTDNE.

Následující fragmenty TNFaR ECD se amplifikovaly za použití primerů uvedených na seznamu:

C77-T172

5' -GCT CTA GAT GCA CAG TGG ACC GGG ACA CCG TG, primer s restrikčním místem Xbal a

5'-AGG AGA AAG CTT TCA TGT GGT GCC TGA GTC CTC AGT, primer s restrikčním místem HindlII.

D1-V84

5'-GCT CTA GAG ATA GTG TGT GTC CCC AAG GAA, primer s restrikčním místem Xbal a

5'-TCC TCT AAG CTT TCA CAC GGT GTC CCG GTC CAC TGT GCA, primer s restrikčním místem HindlII.

101 ·· ·· ·» · ♦· · ···· · · · · · · ♦ • · · · · · · · · · • · · 99 »···»·· · · ··· «·· «·· ···· ·· · ♦· ···

D1-L154 '-GCT CTA GAG ATA GTG TGT GTC CCC AAG GAA, primer s restrikčnim místem Xbal a

5'-TCC TCT AAG CTT TCA CAA CTT CGT GCA CTC CAG GCT TTT, primer s restrikčnim místem HindlII.

Amplifikované produkty se štěpily restrikčnim enzymem Xbal a HindlII a klonovaly se do plazmidu pWE67 štěpeného restrikčními enzymy Xbal a HindlII za vzniku fúzních plazmidů pWE84 (MalE::TNFaR segmentu C77-T172), pWE85 (MalE::TNFaR segmentu D1-V84) a pWE90 (MalE::TNFaR segmentu D1-L154). Analýza sekvence DNA se uskutečnila za účelem ověření integrity fúzí MalE. Restrikční mapa a sekvence plazmidů jsou dány na obrázku č. 15 A, Ba C.

Aby se testovala kompetice signálu CadC-TNFaR, plazmidy pWE67 (vektor, samotný MalE), pWE84, pWE85 a pWE90 se každý jednotlivě transformovaly spolu s pCCT-1 (indukovatelný CadCTNFaR, popisuje se v dokumentu wO 99/23116) do kmen E2088 za použití standardních postupů transformace DNA současnou selekcí na ampicilinu (100 μg/ml) a spektinomycinu (25 μρ/ml) na pevném agaru LB. Kultury (200 μΐ na mikrotitračních destičkách) těchto 4 kmenů se nechaly kultivovat společně přes noc v kapalném médiu LB se 100 μρ/ml ampicilinu a 25 μρ/ml spektinomycinu při teplotě 30 °C (bez míchání). Na konci počátečního období růstu se buňky neředily v poměru 1: 20 000 a nechaly se růst přes noc na LB s 80 μΜ IPTG. Provedly se testy, jak se popisuje v příkladu 5 a výsledky jsou zobrazeny na obrázku č. 16.

Výsledky ukazují, že aminoterminální segment receptoru TNFa (zbytky D1-V84) se neúčastní kompetice, zatímco delší zbytky (D1-L154) se účastní. Segment se sekvencí bližší Ckonci, který ale obsahuje deleci v aminoterminálním segmentu (C77-T172) vykazuje značně lepší kompetici. Síla transkripční aktivity CadC-TNFaR uvedená pro fúzní protein MalE je • ·· · · 4

102 srovnatelná s aktivitou, kterou vykazuje kmen bez koexprimovaného proteinu MalE a TNFaR ECD v plné délce fúzovaný s MalE soutěží při srovnatelném množství jako je možné spatřit u fragmentu D1-L154 (data nejsou uvedena). Specifita je indikována zjištěním, že ne všechny fragmenty získané z TNFaR ECD fúzovaly s MalE vykazují kompetici.

Krystalická struktura TNFaR formy o molekulární hmotnosti 55 000 vázané na trimerický cytokin TNFa získaná paprsky X indikovala, že aminoterminální zbytky se podílejí na interakcích receptor-cytokin a že segmenty receptoru ležící blíže membráně se podílejí na interakcích receptor-receptor. Skutečnost, že apikální fragment Dl-84 TNFaR formy o molekulové hmotnosti 75 000 vykazující kompetici je konzistentní s tímto fragmentem, který se nepodílí na interakcích receptor-receptor.

« φ

103

Claims (1)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Způsob identifikace značeného dominantního negativního elementu (TDNE), který interferuje s interakcí mezi cílovým proteinem a partnerským proteinem, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   a) expresi TDNE v mikrobiální buňce obsahující cílový protein a partnerský protein, přičemž interakce mezi cílovým proteinem a partnerským proteinem vede k expresi reportního genu, kde uvedený TDNE obsahuje fúzní protein zahrnující část cílového proteinu,

   b) měření exprese reportního genu a

   c) porovnání síly exprese reportního genu popsané v odstavci b) se silou exprese získanou za nepřítomnosti TDNE tak, že když síla popsaná v odstavci b) je nižší v porovnání se silou exprese získanou za nepříromnosti TDNE, identifikuje se TDNE, který interferuje s interakcí mezi cílovým a partnerským proteinem.

   2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že část cílového proteinu má délku asi 6 až asi 150 aminokyselin.

   3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že část cílového proteinu má délku asi 6 až asi 30 aminokyselin.

   4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cílový a partnerský protein jsou každý operativně spojeny s oblastí CadC.

   5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cílový protein je operativně spojen s oblastí vázající DNA.

   i

   6.

   Způsob podle

   7.

   104 nároku

   5, se t m, že oblast vázající DNA je oblast Cl.

   Způsob podle nároku

   5, yznačuj se t m, že oblast vázající DNA je oblast Gall.

   Způsob podle nároku

   5, se t m, ze uvedená oblast vázaj ící

   DNA je oblast

   ADH.

   9.

   Způsob podle nároku

   1, jící se t m, že cílový protein je operativně spojen s oblastí vázaj ící

   DNA a partnerský protein je operativně aktivující transkripci.

   oblastí spojen s

   10. Způsob se t podle í m, že nároku oblast vázč 9, ající DNA v je y z n a č oblast Le: u j KA. í c í 11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č U j i c í se t i m, že cílový a partnerský protein je každý operativně spojen s oblastí AraC.

   vyznačuj ící

   12. Způsob podle se tím, že

   13. Způsob podle se tím, že

   14. Způsob podle se tím, že nároku1, reportní gen je Leu2.

   nároku 1,v reportní gen je LacZ.

   nároku 1,v reportní gen je Lys2.

   yznačuj ící yznačuj ící

   I

   A:

   Organizace AraC

   • 9 » 9 • 9 9 • 9 9 9 • 9 • • 9 9 9 < 9 9 • 9 9 • · · 9··· 9 9 9 9 9 • 9 9 • 999 99 9

   zbytky 1-170-dimerizace zbytky 171-178-oblast linkeru zbytky 179-292—oblast vázající DN a aktivace

   B'. Chiméra AraC

   Aktivita lac je závislá

   Fragment dimerizační oblasti a fúze s nosičem t^gs^klon. a exprim. fragmenty jako N^hybridy GFP blokuj i araC:araC.

   Jisté fúze dimerizaci Identifikuje je fenotyp Lac’