CZ20012406A3 - Exprese a export proteinů působících proti obezitě jako Fc fúzních proteinů - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká obecně způsobů a preparátů pro přípravu a použití fúzních proteinů obsahujících protein působící proti obezitě. Konkrétněji se vynález týká způsobů a preparátů pro přípravu a použiti fúzních proteinů, které obsahují imunoglobulinovou FC oblast a protein leptin působící proti obezitě.

Dosavadní stav techniky

Obezita je hlavní fyziologická porucha sdružena s celou řadou onemocnění, jako jsou například diabetes, hypertenze, onemocnění srdce a určité typy nádorových onemocnění. Je odhadováno, že ve Spojených státech je více než 30% dospělé populace obézní, tj . mající více než alespoň 20% nad ideální tělesnou hmotnost. Také se čím dál tím více ukazuje, že obezita se rychle stává celosvětově závažným zdravotním problémem. Je uznáváno, že v mnoha případech samotná dieta a cvičení jsou nedostatečné ke snížení tělesné hmotnosti zejména u lidí, kteří zdědily genetické vlohy, které je predisponuji k obezitě. Proto existuje potřeba léku, který může pomoci lidem zhubnout a snížit rizika onemocnění sdružených s obezitou. Specifičtěji existuje potřeba léku proti obezitě s dostatečnou účinností na snížení tělesné váhy v přijatelných dávkách. Protože obezita je definována jako hmotnost 20% nad ideální váhu, je žádoucí snížení váhy alespoň o 20%. U závažnějších případů může být nezbytné snížení váhy o 30-60%, aby se hmotnost jedince dostala do zdravého rozmezí.

Obezita je multifaktoriální fenotyp, který být důsledkem kombinace fyziologických, psychologických a genetických » · faktorů, a faktorů zevního prostředí. Jedním z genů sdružených s obezitou je gen pro obezitu (ob) , který byl nyní klonován (Zhang et al. , (1994) Nátuře 372:425). U normální myši ob gene kóduje hormon nazývaný leptin (Friedman et al. , (1998) Nátuře

395:763). Za stavu sytosti je nadbytek energie přeměněn a uskladněn jako triglyceridy v adipocytech, které obratem vedou k sekreci leptinu do krevního řečiště. Leptin funguje jako posel vazbou na svůj receptor, jeho dlouhou formu, která má cytoplazmatickou doménu schopnou signálové transdukce, a která je nacházená převážně v hypotalamu. Je uvažováno, že vazba hormonu na receptor je signálním mechanismem, kterým může tuková tkáň informovat mozek o stavu energetických zásob. Je uvažováno, že leptin přestupuje hematoencefalickou bariéru, aby se dostal k leptinovým receptorům umístěným v hypotalamu (Spiegelman et al. (1996) Cell 87:377) . Když mozek obdrží zprávu, že energetických zásob je nadbytek, řekne tělu, aby podle toho snížilo příjem potravy a/nebo zvýšilo výdej energie.

Kmen morbidně obézních myší . nazývaných ob/ob myši má homozygotní mutaci s dvěmi mutovanými ob alelami. Mutantní alely produkují zkrácený leptin, který je nefunkční a pravděpodobně je rychle degradován za podmínek in vivo. Důsledky deficience leptinu u ob/ob myší zahrnují letargii, hypotermii, hyperglykémii, hyperinzulinémii a infertilitu. U lidí existuje také důkaz asociace deficience leptinu a přibývání na váze a obezity (Montague et al. (1997) Nátuře 387:903; Ravussin et al. (1997) Nátuře Medicine 3:238), ačkoli bylo zaznamenáno, že většina obézních lidí má vysoké hladiny cirkulujícího leptinu (Considine et al. (1995) N Engl J Med 334:292).

Symptomy sdružené s deficiencí leptinu u ob/ob myší mohou být zmírněny podáním rekombinantního leptinu. Denní intraperitoneální injekce leptinu mohou snížit příjem tekutin, tělesnou hmotnost, procento tělesného tuku a sérové koncentrace glukózy a inzulínu. Toto bylo doprovázeno zvýšením metabolického obratu, tělesné teploty a lokomočními aktivitami, ' které všechny vyžadují výdej energie «η» ···· ·· ·· ·· *

S 9 · · ·· · ···· • · · 9 9 9 9 9 99

9 999 99 999 99

9 9 · 9 9 9 9 9 99 •· · « ·· ·· · ·· · · (Pelleymounter et al. (1995) Science 269: 540; Halaas et al.

(1995) Science 269:543). Ve stejných studiích měly normální myši také prospěch z léčby leptinem, ačkoli snížení tělesné váhy, příjem potravy a tělesný tuk byly významně nižší. Rekombinantní leptin byl také použit k léčbě infertility u samic i samců ob/ob myší (Chebab et al. (1996) Nátuře Genetics

12: 318; Mounzib et al. (1997) Endocrinology 138:1190).

Recentní experimenty na transgenních myších dále naznačily, že okolo 5 až 10% obézních lidí majících relativně normální nebo nízké hladiny leptinu může odpovídat na léčbu leptinem (Ioffe et al. (1998) Proč Nati Acad Sci USA 95:11852).

Použití leptinu v jeho současných formách vyžaduje vysoké dávky proteinu, které musí být injekčně aplikovány mnohokrát denně po dobu několika měsíců, aby bylo dosaženo požadovaného klinického výsledku. Například v recentní klinické studii vyžadovali někteří dobrovolníci vysoké dávky, které byly injekčně aplikovány třikrát denně po dobu šesti měsíců (Wall Street Journal, červen 15, 1998). Předpokládá se, že časté a vysoké dávky jsou potřeba v důsledku kombinace nízké účinnosti a krátkého poločasu leptinu. Toto pozorování je také ve shodě s pozorováními na ob/ob myších modelech, u kterých byla potřebná intraperitoneální injekce 5 až 20 mg/kg/den leptinu k demonstraci významného snížení tělesné hmotnosti (Pelleymounter et al. (1995) Science 269:540; Hallas et al. (1995) Science 269:543; Chebab et al. (1996) Nátuře Genetics

12:318; Mounzih et al. (1997) Endocrinology 1328:1190). Aby bylo možno překonat suboptimální farmakokinetiku leptinu bylo k dosažení fyziologické hladiny leptinu u myší potřeba chronické infúze leptinu o rychlosti 400 ng/hodinu subkutánně (Halaas et al. (1997) Proč Nati Acad Sci USA 94:8878.).

Hlavní důvody častých, vysokých dávek se zdají být způsobeny jednou nebo více vnitřních vlastností, například velikostí leptinu a způsobem přípravy farmakologické látky. Leptin má molekulární váhu okolo 16 kD (Halaas et al (1995) Science 269:543) a je tedy dostatečně malý, aby mohl být vyloučen filtrací ledvinami. Proto může být nezbytné použít vysokou dávku, aby se kompenzoval krátký sérový poločas in vivo.

Navíc mohou být menši proteiny, jako je například leptin, produkovány v baktériích, například v E. coli. Za určitých podmínek je rekombinantní leptin produkován v E.coli ve formě nerozpustných inkluzní inkluzních tělísek. Před použitím musí tělíska solubilizována denaturační látkou hydrochloridem, purifikovány za a sbaleny za vhodných podmínek, aby Leptin navíc obsahuje dvě cysteinová guanidin podmínek protein.

participují v intramolekulové disulfidové vazbě.

být například děnaturačních vznikl funkční rezidua, která Proto, aby se maximalizoval výtěžek rozpustné, biologicky aktivní molekuly, potřebuje být sbalovací proces pečlivě kontrolován, aby se minimalizovala tvorba nerozpustných proteinových agregátů a intramolekulových disulfidových vazeb.

Výsledkem přípravy v prokaryotech, definovaný aktivitou. zmutování nebo glutamáty, z 5,84 na manipulace formulován proteinem, imunogenní.

takového leptinu je homogenní Pokusy některých čímž

5,5 vedou a uskladňován, který by komplikovaného z inkluzních fakt, že není vzorek proteinu zlepšit rozpustnost aminokyselinových se snižuje (US Patent k produktu, je mohl procesu produkce, tj. tělísek vytvořených možné zajistit dobře s plnou biologickou leptinu zahrnují reziduí na aspartáty izoelektrický bod (pí) leptinu Ačkoli být také zamýšleného

č. 5719266). který může tento produkt být u takové snadněj i mutovaným příj emce nízké

Při vysokých dávkách, velmi komplexnímu procesu existuje v oboru potřeba způsobů farmakologických vlastností této látky působící proti obezitě.

účinnosti, přípravy a zvýšení krátkém poločasu a purifikace leptinu produkce a zlepšení

Popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobů a preparátů užitečných pro přípravu fúzních proteinů obsahujících protein působící proti obezitě, například leptin. Fúzní proteiny mohou usnadňovat vysokou expresi biologicky aktivních proteinů působících proti obezitě. Fúzní· protein může být před podáním savci, například ······ ♦· ·· ·· ♦

Ar· · » · · · · ···· <0 ·· ♦ ♦ ·· · · ·

A · · · A··· ·· · • A · · ·· · · ·· · · · člověku, zkombinován s farmaceuticky přijatelným nosičem. Za určitých okolností může být protein působící proti obezitě naštěpen ze sekvencí fúzního proteinu před svojí formulací a/nebo před podáním. Alternativně mohou být zkombinovány sekvence nukleové kyseliny kódující protein působící proti obezitě obsahující fúzni protein s farmaceuticky přijatelným nosičem a tento produkt může být podán savci.

Cílem tohoto vynálezu je poskytnout nové sekvence nukleové kyseliny, například DNA a RNA, které usnadňují produkci a sekreci leptinu. Cílem vynálezu je obzvláště (i) poskytnout nové sekvence nukleové kyseliny, které usnadňují účinnou produkci a sekreci leptinu; (ii) poskytnout konstrukty nukleové kyseliny pro rychlou a účinnou produkci leptinu v celé řadě savčích hostitelských buněk; a (iii) poskytnout způsoby pro produkci, sekreci a sbíráni rekombinantního leptinu nebo genetickým inženýrstvím připravených variant takového leptinu zahrnujících ne-nativní, biosyntetické nebo jinak umělé leptinové proteiny, jako jsou například proteiny, které byly vytvořeny podle racionálního návrhu.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout polynukleotidové sekvence, které, jsou-li fúzovány s polynukleotidem kódujícím leptin, kódují fúzni protein obsahující leptin, který může být purifikován za použití běžných činidel a technik. Ještě dalším cílem je vsunout proteolytické štěpící místo mezi sekreční kazetu a kódovaný leptinový protein, takže sekreční kazeta může být naštěpena z leptinové domény a leptin může být purifikován nezávisle.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout fúzni proteiny obsahující leptin. Fúzni proteiny, které jsou předmětem předkládaného vynálezu vykazují zlepšené biologické vlastnosti oproti nativnímu leptinu, jako jsou například zvýšená rozpustnost, prodloužený sérový poločas a zvýšená vazba na svůj receptor. Tyto vlastnosti mohou významně zlepšit klinickou účinnost leptinu. V přednostní formě vynálezu obsahuje fúzni protein v N- do C- terminálním směru imunoglobulinovou Fc oblast a leptin. Výsledný fúzni protein je přednostně syntetizován v normálních obvykle existují se spolupodílí, poločase fúzního v buňce, která glykosylačních v templátových alespoň částečně, proteinu.

glykosyluje místech, tj . protilátkách.

na zvýšeném

Fc oblast které Glykosylace cirkulačním

Dalším cílem vynálezu je multimerické formy leptinových poskytnout fúznich multivalentní a proteinů a jejich kombinaci .

Dalším cílem vynálezu je poskytnout způsoby léčby za použití fúzních proteinů, nebo naštěpeného leptinu. Souhrnným cílem vynálezu je poskytnout postupy, které jsou účinné i levné, a stejně tak vedou k získání biologicky aktivních proteinů působících proti obezitě.

Proto v jednom aspektu poskytuje předkládaný vynález molekuly nukleové kyseliny, například DNA nebo RNA, které kódují imunoglobulinovou Fc oblast-leptinový fúzní protein. Molekula nukleové kyseliny kóduje signální sekvenci, imunoglobulinovou Fc oblast a alespoň jeden cílový protein, také zde nazývaný jako protein působící proti obezitě, například leptin. V přednostní formě vynálezu kóduje molekula nukleové kyseliny sériově ve směru 5' do 3' signální sekvenci, imunoglobulinovou Fc oblast a sekvenci cílového proteinu. V další formě vynálezu kóduje molekula nukleové kyseliny sériově ve směru 5' do 3' signální sekvenci, cílovou oblast.

Nukleová kyselina sekvenci a imunoglobulinovou Fc může kódovat X-Fc nebo Fc-X strukturu, kde X je cílový protein, jako například leptin.

Přednostní formy vynálezu jsou Fc-X struktury pro jejich vysokou hladinu exprese.

V přednostní formě oblast oblast pantu a doménu imunoglobulinovou imunoglobulinovou imunoglobulinovou v závislosti na vynálezu obsahuje imunoglobulinová Fc obsahuje alespoň jednu například 2 (CH2), přednostně konstantní těžké oblasti, doménu doménu konstantní konstantní typu imunoglobulinu oblasti volitelně imunoglobulinovou těžké těžké oblasti oblasti (CH3) a používaného k doménu konstantní těžké tvorbě Fc ·· ···· ·· ·· ·· ♦ • · · ···· ···· tg · · ···· ··· • / · ··· · · · · · · · • · · · ···· · · · «· ·· ·· ·· · ♦ ··· oblasti 4 (CH4). V přednostnější formě vynálezu postrádá imunoglobulinová Fc oblast alespoň imunoglobulinovou doménu konstantní těžké oblasti 1 · (CH1) . Ačkoli imunoglobulinové Fc oblasti mohou být založeny na jakékoli imunoglobulinové třídě, například IgA. IgD. IgE. IgG a IgM, jsou preferovány imunoglobulinové Fc oblasti na základě IgG.

Nukleová kyselina vynálezu může inkorporována pro pracovní použití do replikovatelného expresního vektoru, který může být začleněn do kompetentní savčí, hostitelské buňky za účelem produkce fúzního proteinu založeném na leptinu. Výsledný fúzní protein založený na leptinu je účinně produkován a sekretován ze savčí hostitelské buňky. Sekretovaný fúzní protein založený na leptinu může být sbírán z kultivačního média bez lýzy savčí hostitelské buňky. Proteinový produkt může stanoven na aktivitu a/nebo purifikován za použití běžných činidel, jak je požadováno, a/nebo naštěpen z fúzního partnera, vše za použití konvenčních technik.

V dalším aspektu, poskytuje vynález fúzní protein obsahující imunoglobulinovou prostřednictvím

Fc oblast polypeptidové spojenou buďto přímo vazby, nebo nepřímo prostřednictvím spojovacího polypeptidu k cílovému proteinu.

Cílový protein může být fúzován prostřednictvím terminálního konce k N-terminálnímu konci imunoglobulinové Fc oblasti. Avšak v přednostnější formě vynálezu je cílový protein fúzován prostřednictvím N-terminálního konce k Cterminálnimu konci imunoglobulinové Fc oblasti.

V jedné formě vynálezu, jsou-li fúzní proteiny vynálezu podávány v dávce okolo 0,25 mg/kg/den po dobu 5 dnů ob/ob myši mající výchozí tělesnou hmotnost alespoň 50 gramů, dochází k indukci okolo 10% (okolo 5 gramů, přednostněji okolo 12% (okolo 6 gramů), nebo přednostněji okolo 15% (okolo 7,5 gramů) úbytku výchozí tělesné váhy. V přednostnější formě vynálezu, jsou-li fúzní proteiny vynálezu podávány v dávce okolo 0,1 mg/kg/den po dobu 5 dnů ob/ob myši mající výchozí tělesnou hmotnost alespoň 50 gramů, dochází k indukci okolo 10% (okolo 5 gramů, přednostněji okolo 12% (okolo 6 gramů) nebo φφ φφφφ φφ φ· ♦♦ ♦ φφ φ φφφφ φφφφ ΐ8 ϊ ·.. í i .·*φ φ ί : ;

φφφφ φφφφ φφ φ φφ φφ φφ φφ φ· φφφ přednostněji okolo 15% (okolo 7,5 gramů) úbytku výchozí tělesné váhy.

V další formě vynálezu může fúzní protein obsahovat druhý cílový protein, například zralý leptin o plné délce, nebo jeho bioaktivni fragment. U tohoto typu konstruktu .mohou být první a druhé cílové proteiny stejné nebo různé proteiny. První a druhé cílové proteiny mohou být navzájem spojeny buďto přímo, nebo prostřednictvím spojovacího polypeptidů. Alternativně mohou být oba cílové proteiny navzájem spojeny buďto přímo, nebo prostřednictvím spojovacího polypeptidů k imunoglobulinové Fc oblasti. V druhém případě může být první cílový protein připojen k N-terminálnímu konci imunoglobulinové Fc oblasti a druhý cílový protein může být připojen k C-terminálnímu konci imunoglobulinové Fc oblasti.

V další formě vynálezu mohou dva fúzní proteiny asociovat buďto kovalentně, například disulfidovou nebo polypeptidovou vazbou, nebo nekovalentně za vzniku dimerického proteinu.

V přednostní formě vynálezu jsou dva fúzní proteiny asociovány kovalentně prostřednictvím alespoň jednoho a přednostněji dvou meziřetězcových disulfidových vazeb prostřednictvím cysteinových reziduí přednostně umístěných v imunoglobulinových pantových oblastech umístěných v imunoglobulinových Fc oblastech každého řetězce.

V dalším aspektu poskytuje vynález způsoby produkce fúzního proteinu obsahujícího imunoglobulinovou Fc oblast a cílový protein. Způsob zahrnuje kroky (a) poskytnutí savčí buňky obsahující molekulu DNA kódující takový fúzní protein buďto s nebo bez signální sekvence a (b) kultivaci savčí buňky za účelem produkce fúzního proteinu. Výsledný fúzní protein může být poté sbírán, znovu sbalen, pokud je to nezbytné, a purifikován za použití konvenčních purifikačních technik dobře známých a používaných v oboru. Za předpokladu, že fúzní protein obsahuje proteolytické štěpící místo umístěné mezi imunoglobulinovou Fc oblast a cílový protein, cíl může být naštěpen z fúzního proteinu za použití konvenčních

··	4 · • 4	• V ·· • · · · • · ··	99 9 9 9 9	9 9
•
··	• 4	·· ♦ ·	9 9	9 9

proteolytických enzymů, a pokud je před použitím.

to nezbytné, purifikován

V ještě dalším aspektu poskytuje zmírňovaných leptinem nebo jeho aktivními variantami, způsoby leptinu vynálezu vynálezu.

zmírňovaných leptinem nebo způsob se sestává z podání které

DNA nebo vektoru obsahujícího DNA předmětem předkládaného vynálezu.

se sestávají produkovaného a/nebo fúzního

Vynález také z podání savci podle způsobu, konstruktu, poskytuj e efektivního který který způsob je je léčby způsoby pro léčbu stavů kteréžto množství předmětem předmětem stavů jeho aktivními variantami, kterýžto savci s onemocněním DNA nebo jsou předmětem předkládaného vynálezu, například nebo RNA, které

RNA, nahé j sou

Předchozí i další cíle, rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmější z detailního popisu, obrázků a patentových nároků, které následují.

Stručný popis obrázků

Obrázky 1Ά-1Ε jsou schématické ilustrace příkladných fúzních proteinů působících proti obezitě ve shodě s vynálezem.

Obrázky zobrazují: Obrázek 1A dimerický Fc-leptin, Obrázek 1B dimerický Fc leptin-spojovací GlySer leptinový fragment, Obrázek 1C dimerický Fc leptin-spojovací GlySer leptin, Obrázek ID dimerický leptin-Fc a Obrázek 1E dimerický leptinspojovací GlySer-Fc. Vertikální linky představují volitelné disulfidické vazby spojující cysteinová rezidua umístěná v pantové oblasti každé imunoglobulinové oblasti.

Na Obrázku 2 je graf ukazující tělesnou váhu ob/ob myší v gramech léčených ip. injekcemi 0,25 mg/kg muLeptin-spojovací část-muFc (kosočtverce), 0,25 mg/kg muLeptin-muFc (čtverečky), 0,25 mg/kg muFc-muLeptin (trojúhelníky, nebo fosfátového pufru (PBS) (křížky).

Na Obrázku 3 je graf ukazující tělesnou váhu ob/ob myší léčených denními (denně po dobu prvních 12 dnů a poté pouze od pondělí do patku) intraperitoneálními (ip.) injekcemi buďto

• · • · · • · · • ··

0,25 mg/kg muFc-muLeptin (kosočtverce) nebo fosfátového pufru (PBS) (čtverečky).

Na Obrázku 4 je graf ukazující tělesnou váhu ob/ob myší léčených denními intravenózními (iv.) injekcemi 0,25 mg/kg muFc-muLeptin (trojúhelníky), 1,0 mg/kg muFc-muLeptin (kolečka), nebo PBS (čtverečky) po dobu 5 dnů následovaných obdobím bez léčby.

Na Obrázku 5 je graf ukazující efekt různých dávkovačích schémat na tělesnou váhu ob/ob myší léčených subkutánními (sc.) injekcemi muFc-muLeptinu (0,25 mg/kg (kosočtverce) a 0,1 mg/kg následovanými dávkou 1,0 mg/kg (čtverečky) nebo PBS (trojúhelníky).

Na Obrázku 6 je graf ukazující tělesnou váhu ob/ob myší léčených intraperitoneálními (iv.) injekcemi 0,1 mg/kg huFcmuLeptinu (kosočtverce), 0,5 mg/kg huFc-huLeptinu (čtverečky) nebo PBS (trojúhleníky).

Na Obrázku 7 je graf ukazující cirkulující sérové hladiny glykosylovaného huFc-huLeptinu (kosočtverce) a neglykosylovaného huFc (N-Q mutace)-huLeptinu (čtverečky) jako funkci času (hodiny) po podání. Cirkulující hladiny jsou exprimovány jako procento úvodní dávky.

Detailní popis vynálezu

Vynález poskytuje fúzní proteiny, které jsou užitečné pro přípravu proteinů působících proti obezitě. Fúzní proteiny, které jsou předmětem vynálezu a/nebo nukleové kyseliny kódující takové fúzní proteiny mohou být přímo podávány savcům potřebujícím léčbu proteinem působícím proti obezitě. Je však zamýšleno, že proteiny působící proti obezitě mohou být před použitím z fúzních proteinů naštěpeny.

Vynález tedy poskytuje fúzní proteiny obsahující imunoglobulinovou Fc oblast a alespoň jeden cílový protein, označovaný zde jako leptin. Na Obrázcích 1A-1E je ilustrováno pět exemplárních forem proteinových konstruktů tvořících ·· ·*♦·

99 99 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 99 ·_Ί..·· 9 9 99 9 9 9 · · 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 9 9 999 vynález. Protože jsou preferovány dimerické konstrukty, jsou všechny ilustrovány jako dimery zesíťované párem disulfidových vazeb mezi cysteiny v přilehlých podjednotkách. Na obrázcích jsou disulfidové vazby zobrazeny jako spojující dohromady prostřednictvím imunoglobulinové pantové oblasti v každé těžké oblasti dvě Fc oblasti imunoglobulinového těžkého řetězce a tvoří tak charakteristický rys nativních forem těchto molekul. Zatímco konstrukty zahrnující pantovou oblast Fc jsou preferovány a představují slibné terapeutické látky, vynález předpokládá, že pokud je požadováno, může být zvoleno zesíťování v jiných pozicích. Dále mohou být za určitých okolností produkovány dimery nebo multimery užitečné pro použití vynálezu nekovalentní asociací, například hydrofobní interakcí.

Protože homodimerické konstrukty jsou důležité formy vynálezu, ilustrují obrázky takové konstrukty. Mělo by být oceněno, že heterodimerické struktury jsou také užitečné pro použití vynálezu. Avšak mohou být zkonstruovány životaschopné konstrukty užitečné pro potlačení obezity u různých savčích druhů zahrnujících člověka, například jeden řetězec dimerického fúzního proteinu obsahujícího leptin o plné délce a další řetězec dimerického Fc fúzního proteinu obsahujícího leptinovou variantu.

Obrázek 1A ilustruje dimerický konstrukt produkovaný ve shodě s principy zde vyloženými (viz například Příklady 1 a 4). Příklad 1 popisuje myší konstrukt a Příklad 4 popisuje lidský konstrukt. Každý monomer homodimeru obsahuje imunoglobulinovou Fc oblast 1 zahrnující pantovou oblast, CH2 doménu a CH3 doménu. Leptin 2 je připojen přímo, tj. polypeptidovou vazbou, k C terminu Fc oblasti. Mělo by být rozuměno, že Fc oblast může být připojena k cílovému proteinu prostřednictvím spojovacího polypeptidu (není uvedeno).

Obrázky 1B a 1C ukazují proteinové konstrukty, které jsou předmětem vynálezu, které zahrnují jako cílový protein celou řadu proteinů působících proti obezitě uspořádaných do tandemu a spojených spojovací částí. Na Obrázku 1B zahrnuje cílový ·· ·«··

protein leptin 2_ o plné délce, polypeptidovou spojovací část tvořenou glycinovými a serinovými rezidui 2 ^a aktivní variantou leptinu 3. Obrázek 1C se liší od konstruktu z Obrázku 1B v tom, že většina C-terminální proteinové domény obsahuje kopii leptinu 2 o plné délce.

Ačkoli Obrázky 1A-1C představují Fc-X konstrukty, kde X je cílový protein, je zamýšleno, že při použití vynálezu mohou být také užitečné konstrukty typu X-Fc. Proto Obrázky 1C a IE zobrazují konstrukty typu X-Fc vytvořené ve shodě s principy zde uvedenými (viz například Příklady 5 a 6) . Konstrukt typu X-Fc zobrazený na Obrázku ID obsahuje ve svém N-terminu leptin 2' o plné délce. K C-terminu leptinu je přímo připojena Fc oblast 1' včetně pantové oblasti. Na Obrázku IE má ilustrovaný konstrukt ve svém N-terminu leptin 2' o plné délce. Na rozdíl ke konstruktu z Obrázku ID je však leptin 2' zobrazený na Obrázku IE připojen spojovacím polypeptidem 4' k Fc oblasti 1' . Dále je zamýšleno, že užitečné proteiny vynálezu mohou být také zobrazeny vzorcem X-Fc-X, kde X' mohou představovat různé cílové proteiny.

Jak je zde používáno, znamená termín spojovací polypeptid peptidovou sekvenci, která může spojovat dva proteiny, které se v přírodě nevyskytují spojené.

Spojovací polypeptid zahrnuje přednostně celou řadu aminokyselin, jako například alanin, serin, nebo kombinace takových aminokyselin. Spojovací polypeptid zahrnuje přednostně celou řadu glycinových a serinových peptidu o délce 10-15 reziduí. Viz například US Patent č. 5258698, jehož uvedení je tímto začleněno jako reference. Je však zamýšleno, že optimální délka spojovacího polypeptidu a složení aminokyselin mohou být určeny rutinními experimenty.

Jak je zde používáno, týká se termín multivalentní rekombinantní molekuly, která obsahuje dva nebo více biologicky aktivních segmentů. Proteinové fragmenty tvořící multivalentní molekulu mohou být spojeny prostřednictvím

0 0 00« a umožňuje • · ·« 00 ··

0 0 0 0 · 0

0 · 0« 0 0 00 0000 00 • 0 0« 00 0 0 • 00 spojovacího polypeptidu, nezávisle jejich fungování.

který spojuje části

Jak je zde používáno, multivalentní rekombinantní molekuly mající konfiguraci Fc-X nebo X-Fc, kde X je cílová molekula. Imunoglobulinové Fc asociovat například prostřednictvím za vzniku konstruktů uvedených fúzní konstrukt, který Fc-X-X, je výsledná

1C. Dva cílové proteiny spojovacího peptidu.

1A mohou zvýšit zjevnou molekulou a jeho receptorem. jedna leptinová část Fc-leptinového na buněčný receptor s určitou afinitou, může druhá leptinová část stejného Fc-leptinového fúzního k druhému receptoru na stejné buňce s mnohem vyšší může dojít v důsledku části a receptoru po na receptor. V případě zjevná afinita zvýšit Každá proteinová podjednotka, nezávislou funkci, takže funkce proteinových

X-Fc, oblasti mohou disulfidických vazeb Obrázcích předmětem dimerová

IA a ID. vynálezu, molekula uvedená týká se termín

Pokud má konfiguraci na Obrázku mohou být spojeny prostřednictvím Konstrukty typu uvedeného na Obrázku vazebnou afinitu mezi cílovou Například pokud se váže fúzního proteinu se vázat proteinu aviditou receptoru na (zjevnou afinitou). K tomu blízkosti druhé leptinové fyzikální uskutečnění vazby první leptinové části vazby protilátky k antigenu se alespoň desettisíckrát, tj. 10⁴.

tj . X” má svou vlastní v multivalentní molekule mohou být podjednotek aditivní nebo synergistické.

může

Jak je zde používáno, asociace dvou nebo buďto kovalentně, interakce, například například hydrofobní že zahrnuje jak homomultimery, stejně tak jako heteromultimery, bivalentní na je

Fc týká se termín multimerický·' stabilní více polypeptidových řetězců spojených například prostřednictvím kovalentní disulfidickou vazbou, nebo interakcí.

Termín multimer nekovalentně, je zamýšlen, jsou stejné, kde podjednotky kde podjednotky jsou odlišné.

Jak je zde používáno, multimerické molekuly, stabilně asociovány nekovalentních’ interakcí.

týká se kde dva prostřednictvím

Mělo by termín dimerický·' specifické polypeptidové řetězce kovalentních být rozuměno, j sou nebo že • Φ φφφφ •Φ ·· ··φ • φ φ φφφφ φφφφ φφφ φφφφφ φ φ <14· φ·φ *· φφφ <♦ r ^φ · · φφφφ φφ φ φφ φφ φφ · * ·< *· φ imunoglobulinová Fc oblast zahrnující alespoň část pantové oblasti a CH2 domény a CH3 domény tvoří typicky dimer. 0 mnoha proteinových ligandech je známo, že se váží na své receptory ve formě dimerů. Pokud proteinový ligand X dimerizuje přirozeně, bude část X v Fc-X molekule dimerizovat v mnohem větším rozsahu, protože dimerizační proces je závislý na koncentraci. Fyzikální blízkost dvou částí X spojených pomocí Fc vede k dimerizaci intramolekulárního procesu výrazně posunujíce rovnováhu ve prospěch dimeru a zvyšujíce jeho vazbu k receptoru.

Jak je zde používáno, neznamená termín leptin pouze zralý leptinový protein o plné délce (viz například SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4, které představují zralý lidský leptin a respektive myší leptin), ale také jeho varianty a bioaktivní fragmenty. Termín bioaktivní fragment se týká jakéhokoli leptinového proteinového fragmentu, který má alespoň 30%, přednostněji alespoň 70%, a nejpřednostněji alespoň 90% biologické aktivity zralého templátového leptinového proteinu, j ak zahrnuj e přirozeně varianty, inženýrství, nebo nebo určeno použitím ob/ob druhy a alelické se vyskytující, například kteréžto identické, identické, identické ze ze ze nebo sekvencí myším modelu, varianty, stejně nebo nepřirozeně podle j sou

Termín tak varianty jako další vyskytuj ící genetického 70% se vytvořené podle protokolů varianty jsou alespoň ze 60% identické, přednostněji alespoň ze 65% identické, a nejpřednostněji alespoň z 70% identické s každým z přirozeně se vyskytujících leptinu zde uvedených.

75%

80% podobné podobné podobné

Aby bylo možno určit, zdali kandidátní polypeptid má potřebné procento podobnosti nebo identity s referenčním polypeptidem, jsou kandidátní aminokyselinové aminokyselinová sekvence dynamického sekvence a seřazeny popsaného referenční

Watermanem nejprve algoritmu

Biol 147:195-197), v substituční programového ((1981) J Mol matricí BLOSUM62 popsané na Obrázku 2 ((1992), 'Aminoacid substitution matrices from za použití

Smithem a kombinaci se

Henikoffem a

Henikoffem protein blocks, Proč Nati Acad Sci USA 89:10915-10919) . Pro předkládaný vynález je příslušná hodnota mezerové inzerční ·· ··· ·· ·· ·» · s · · ········ '1Γ> f · · ♦*»·· •15» »·· »· » · · ·· • · e · ···· ··· ·« ·· »· »· »· »·· sankce -12 a příslušná hodnota mezerové extenzní sankce -4. Počítačové programy provádějící seřazení za použití algoritmu Smithe-Watermana a matrice BLOSUM62, jako je například programový soubor GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, Anglie), jsou komerčně dostupné a široce používané osobami znalými oboru.

Jakmile je provedeno seřazení mezi kandidátní sekvencí, může být proveden vypočet skóre procentuální podobnosti. Jednotlivé aminokyseliny každé sekvence jsou sekvenčně mezi sebou porovnány. Pokud je hodnota matrice BLOSUM62 odpovídající dvěma seřazeným aminokyselinám nula nebo je to negativní číslo, je skóre párové podobnosti nula; jinak je skóre párové podobnosti 1,0. Skóre hrubé podobnosti je sumou skóre párové podobnosti seřazených aminokyselin. Hrubé skóre je poté normalizováno jeho rozdělením počtem aminokyselin v menší z kandidátní nebo referenční sekvence. Normalizované hrubé skóre je procentuální podobnost. Alternativně jsou k výpočtu procentuální identity opět sekvenčně porovnány seřazené aminokyseliny každé sekvence. Pokud nejsou aminokyseliny identické, je párová identita nula, jinak je párová identita 1,0. Skóre hrubé identity je sumou identicky seřazených aminokyselin. Hrubé skóre je poté normalizováno jeho rozdělením počtem aminokyselin v menší z kandidátní nebo referenční sekvence. Normalizované hrubé skóre je procentuální identita. Inzerce a delece jsou pro účely výpočtu procentuální podobnosti a identity ignorovány. Z tohoto důvodu nejsou v tomto výpočtu používány mezerové sankce, ačkoli jsou používány v počátečním seřazení.

Varianty mohou také zahrnovat jiné mutanty leptinu mající aktivitu podobnou leptinu. Viz například patent US Patent č. 5719266, jehož uvedení je tímto zde začleněno jako reference. Druhové varianty zahrnují, ale nejsou omezeny na lidské a myší leptinové sekvence (viz například SEQ ID NO 2 a respektive 4) a druhové varianty kódované nukleotidovými sekvencemi uvedenými v databázích Genbank a/nebo EMBL, například pod přístupovými čísly U72873 (Pongo pygmaeus), U96450 (Pan troglogytes) , -U66254 (Sus scrota) , U50365 (Bos taurus) , D49653

(Rattus norvegicus), U58492 (Macaca mullata), U72872 (Gorilla gorilla), U62123 (Ovis aries)

AF082501 (Melagris gallopavoo), AF097582 (Equuus caballus) crassicaudata), jejichž uvedeni reference.

AF082500 (Gallus gallus),

AB020986 (Canis familiaris), a AF159713 (Sminhopsis je tímto zde začleněno jako

Dále může leptinová sekvence obsahovat část nebo celou koncensuální sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:20, kde leptin má alespoň 30%, přednostněji alespoň 70% a nejpřednostněji alespoň 90% biologické aktivity zralého lidského leptinu o plné délce, jak určeno při použití ob/ob myšího modelu. Koncensuální sekvence SEQ ID NO:20 byla vytvořena ze sekvencí leptinu odvozených z myši, potkana, kuřete, člověka, šimpanze, krávy, ovce, nížinné gorily, makaka, prasete, orangutana a psa. Leptin může například obsahovat část nebo celou koncensuální sekvenci:

Val

Pro

Xaa

Xaa

Xaa

Gin

Asp

Asp,

Thr

Lys

Thr Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Xaa

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr Xaa

ser

Val

Ser

Xaa

Xaa

Gin

Xaa

Val

Xaa

Gly

Leu

Asp,

Phe

Ile Pro

Gly

Leu

Xaa

Pro

Xaa

Leu

Xaa

Leu

Ser

Xaa

Met

Asp

Gin

Thr Leu

Ala

Xaa

Tyr

Gin

Gin

Xaa

Leu

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Asn

Xaa

Xaa Gin

Ile

Xaa

Xaa

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

Leu

His

Xaa Leu

Ala

Xaa

Ser

Lys

Ser

Cys

Xaa

Leu

Pro

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Ser Leu

Xaa

Xaa

Val

Leu

Glu

Ala

ser

Xaa

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

Val Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Xaa

Xaa

Leu

Gin

Asp

Xaa

Leu

Xaa

Xaa Leu

Asp

Xaa

ser

Pro

Xaa (

Sys

(SEQ

ID

NO:

20)

, kde může 1

být volitelně

Xaa3 Ile nebo

Cys,

Xaa4

může být Arg, Trp, Gin,

nebo

His,

Xaa5 může být Lys.,

Arg,

nebo

Ile

, Xaa6 může

být

Val

nebo

Phe,

Xaal9 může

být

Ala

nebo

Thr,

Xaa28 :

může

být

Gin

nebo peptidová vazba, Xaa32

může

být

Ser

nebo

Ala, Xaa33

může

být

Lys

nebo

Arg

, Xaa35

může

být

Arg

nebo

Lys

, Xaa37

může

být

Ala

nebo

Thr,

Xaa46 může

být

Gin

nebo

His,

Xaa

může být Val, Ile,

nebo

Lys,

Xaa50 může

být

Ser

nebo

Thr,

Xaa53

může

být

Arg

, Lys, nebo

Gin,

Xaa60 může

být

Ile

nebo

Val

, Xaa68

může

být

Leu

nebo

Met,

. Xaa69 může

být

His

nebo

Pro,

Xaa71 můž’e

být

Arg nebo

Gin,

Xaa73 může být Val nebo

Met,

• · • · · · • · · ···· ♦ · ·

9·· · ♦ ♦· ·· • · ··· ·· ··· ·

					• ·	• · · ·	• ·	• · ·	•
Xaa74	může	být Val,	Ile,	nebo	Leu,	Xaa77	může	být	Ser,	nebo
Ala,	Xaa7 8	může být	Asn,	nebo	His,	Xaa89	může	být	Leu	nebo
Val,	Xaa92	může být	Ser,	Phe,	nebo	Ala, Xaa97	může	být	Pro,
His,	nebo Ser, XaalOO může	být	Arg,	Qln, Trp, nebo Leu, XaalOl
může	být ALA, Val,	nebo	Thr,	Xaal02 může	být	Arg	nebo	Ser,

Xaal03 může být Gly, nebo Ala, Xaal05 může být Glu, nebo Gin, Xaal06 může být Thr, Ser, nebo Lys, Xaal07 může být Phe, Leu, nebo Pro, Xaal08 může být Glu nebo Aspm Xaalll může být Gly nebo Asp, Xaall2 může být Gly, Asp, nebo Via, Xaall8 může být Leu, nebo Gly, Xal31 může být Ala, Gly, nebo Arg, Xaal32 může být Ala, nebo ser, Xaal36 může být Met nebo Ile, Xaal38 může být Arg, Trp, nebo Qln, Xaal39 může být Arg, nebo Gin, Xaal42 může být Leu, nebo Val, nebo Xaal45 může být Gly, nebo Glu.

V přednostní formě vynálezu zahrnuje cílový protein zralou sekvenci leptinu o plné délce. Nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence definující lidské a myší leptinové proteiny jsou uvedeny v SEQ ID BO: 1-4.

Cílové proteiny zde uvedené jsou exprimovány jako fúzní proteiny s Fc oblastí imunoglobulinu. Jak je známo, obsahuje každá imunoglobulinová konstantní oblast těžkého řetězce čtyři nebo pět domén. Domény jsou pojmenovány sekvenčně následujícím způsobem: CHl-pant-CH2-CH3(-CH4). DNA sekvence domén těžkého řetězce mají zkříženou homologii mezi imunoglobulinovými třídami, například CH2 doména IgG je homologní k CH2 doméně IgA a IgD, a k CH3 doméně IgM a IgE.

Jak j e oblast zde používáno, znamená termín carboxy-terminální imunoglobulinového imunoglobulinového

Imunoglobulinová Fc doménu, CH2 doménu a řetězce, těžkého oblast část přednostně řetězce, může

CH3 doménu,

3) CH1 doménu a CH3 doménu, 4) kombinaci dvou nebo více domén oblasti. V přednostní imunoglobulinová Fc konstantní konstantní nebo j eho například obsahovat 2)

CH1 doménu a CH2

CH2 formě vynálezu oblasti oblast část.

1) CH1 doménu, doménu a CH3 doménu, 5) imunoglobulinové pantové obsahuje imunoglobulinová

Fc oblast alespoň imunoglobulinovou pantovou oblast a CH2 doménu a CH3 dbménu a přednostně postrádá CH1 doménu.

• ·· · · · ·· ·· • · · · · · · · · · ··* ···· ·· • · · · · · · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ···

V současnosti přednostní třída imunoglobulinů, z které je odvozena konstantní oblast těžkého řetězce, je IgG (Igy) (γ podtřídy 1, 2, 3 nebo 4) . Nukleotidové a aminokyselinové sekvence lidského Fc γ-l jsou uvedeny pod SEQ ID NO: 5 a 6. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence myšího Fc y-2a jsou uvedeny pod SEQ ID NO: 7 a 8. Mohou být použity další třídy imunoglobulinů, IgA (Iga) , IgD (Igó) , IgE (Igs) a IgM (Igp) . Volba konstantních oblastí příslušného imunoglobulinového těžkého řetězce je diskutována detailně v patentech US Patent č. 5541087 a 5726044. Volba sekvencí konstantních oblastí konkrétního imunoglobulinového těžkého řetězce z různých imunoglobulinových tříd a výsledku je na rozvaze osoby podtříd k dosažení konkrétního znalé oboru. Část DNA konstruktu kódujícího imunoglobulinovou alespoň část pantové domény

Fc oblast přednostně a přednostně alespoň zahrnuj e část CH₃ domény Fcy nebo homologních domén v jakémkoli IgA,

IgD, IgE nebo IgM.

V závislosti na aplikaci mohou být použity geny pro konstantní oblast z jiných druhů než je člověk, například od myši nebo potkana. Imunoglobulinová Fc oblast použitá jako fúzní partner v DNA konstruktu může být obecně z jakéhokoli savčího druhu. Kde je nežádoucí vyvolat imunitní odpověď v hostitelské buňce nebo zvířeti proti Fc oblasti, může být Fc oblast odvozena ze stejného druhu, jako je hostitelská buňka nebo živočich. Lidská imunoglobulinová Fc oblast může být například použita, je-li hostitelským živočichem nebo buňkou člověk. Podobně, myší imunoglobulinová oblast může být použita, je-li hostitelským živočichem nebo buňkou myš.

Nukleové sekvence kódující a aminokyselinové sekvence definující lidské a myší imunoglobulinové Fc oblasti užitečné k aplikaci vynálezu jsou uvedeny pod SEQ ID NO: 5-8. Je však uvažováno, že mohou být nalezeny sekvence jiných imunoglobulinových Fc oblastí užitečné pro použití vynálezu, například takové, které jsou kódovány nukleotidovými sekvencemi uyedenými v databázích Genbank a/nebo EMBL, například AF045536,! (Macaca fuscicularis), AF045537,! (Macaca •· ····

19:

mulatta), AB016710 (Felix catus), K00752 (Oryctolagus cuniculus), U03780 (Sus scrofa), Z48947 (Camelus dromedarius), X62916 (Bos taurus). L07789 (Mustela vision), X69797 (Ovis aries), U17166 (Cricetulus migratorius) , X07189 (Rattus rattus), AF57619,1 (Trichosurus vulpecula) , nebo AF035195 (Monodelphis domestica), jejichž uvedeni je tímto začleněno jako reference.

Dále je uvažováno, že mohou být užitečné pro použití vynálezu substituce nebo delece aminokyselin v konstantních oblastech imunoglobulinového těžkého řetězce.

Jedním příkladem je substituce horní CH2 oblasti, aby došlo k vytvoření

Fc varianty se sníženou afinitou pro Fc receptory (Cole et al.

(1997) J Immunol 159:3613).

Osoba běžně znalá oboru může připravit takové konstrukty za použití dobře známých molekulárně biologických technik.

Použití lidského Fcyl jako sekvence Fc oblasti má několik výhod. Je-li například Fc fúzní protein použit jako biofarmaceutikum, může Fcyl doména udělit efektorové funkční aktivity fúznímu proteinu. Efektorové funkční aktivity zahrnují biologické aktivity, jako je například placentární transfer a zvýšený sérový poločas. Imunoglobulinová Fc oblast také poskytuje možnost detekce technikou anti-Fc ELISA a purifikaci prostřednictvím vazby k proteinu A baktérie Staphylococus aureus (Protein A). V určitých aplikacích však může být žádoucí odstranit specifické efektorové funkce z imunoglobulinové Fc oblasti, jako je například vazba k Fc receptorů a/nebo fixace komplementem.

Ve fúzních proteinech, které jsou předmětem vynálezu, usnadňují Fc oblasti správné sbalení leptinového proteinu, by byly získány aktivní leptinové proteiny a také vedou tyto oblasti k rozpustnosti aktivních částí, alespoň v extracelulárním médiu. Protože imunoglobulinová Fc oblast je hydrofilní, je fúzní protein obsahující leptin rozpustný na rozdíl od leptinových protějšků exprimovaných v bakteriální hostitelské buňce. DiMarchi et al. (US Patent č. 5719266) zlepšil rozpustnost leptinu mutací určitých aminokyselinových

reziduí na aspartáty nebo glutamáty, čímž snížil izoelektrický bod (pí) leptinu z 5,84 na méně než 5,5. Použití imunoglobulinové Fc oblasti jako fúzního partnera snižuje potřebu vytvoření mutant leptinu s nižším pí, protože Fc je glykosylován a vysoce nabitý při fyziologickém pí a tudíž účinkuje jako nosič solubilizujíci leptin. Výsledkem je, že leptin obsahující fúzni protein je kompletně rozpustný ve vodných roztocích, například, ve farmaceuticky přijatelných nosičích.

předkládaný

DNA pro pro použití vynález tvorbu vynálezu.

využívá

Fc fúzních proteinů fúzni proteiny jsou konvenčních

Je rozuměno, že metodik rekombinantní užitečných přednostně tvořeny na úrovni DNA a expresních jsou předmětem vynálezu.

vektor sekvenci vektorů a exprimované

Jak je

Fc výsledné DNA integrované do produkují proteiny, které zde používáno, znamená termín nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou inkorporována do hostitelské s a integrována do genomu autonomně jako nukleové kyseliny, virové vektory, a vektoru zahrnují virus. Jak je zde jakoukoli kompetentní, aby byla aby byla rekombinována replikovala lineární vektory, virového buňky a hostitelské buňky, nebo aby se epizóm. Takové vektory zahrnují plazmidy, fagemidy, cosmidy, RNA podobně. Nelimitující příklady retrovirus, adenovirus a adeno-asociovaný používáno, znamená termín genová exprese nebo exprese cílového proteinu transkripci sekvence DNA, translaci mRNA transkriptu a sekreci produktu Fc fúzního proteinu.

Užitečným expresním vektorem je pdCs (Lo et al. Engineering 11:495, jehož uvedení je tímto reference), enhancer/promotor polyadenylačního použitého lidského cytomegaloviru byly odvozeny 601 až +7 sekvence poskytnuté Cell 41:521, jejíž uvedení je Vektor také obsahuje mutovaný jako selekční markér (Simonsen

11:495, jehož uvedení je kterém přepis Fc-X genu lidského cytomegaloviru signálu. Sekvence enhanceru a

nukleotidů promotoru v práci Boshart et al. (1985) tímto začleněno jako reference, gen pro dihydrofolát reduktázu a Levinson (1983) Proč Nat Acad ·· · · · e> · · · ··· · ·· · · · · · · ·· · • · · · · · I» ♦ ·· • · ··· · · ··· ·· • · · · ♦ ♦ · · · ·· • · · · · · ·· ·· ···

Sci USA 80:2495, uvedeni této práce je tímto začleněno jako reference) .

Příslušná hostitelská buňka může být transformována nebo transfektována sekvencí DNA, která je předmětem vynálezu a využita pro expresi a/nebo sekreci cílového proteinu. V současnosti přednostní hostitelské buňky pro použití vynálezu zahrnují nesmrtelné hybridomové buňky. NS/O myelomové buňky, 293 buňky, ovariální buňky čínského křečka, HELA buňky a COS buňky.

Jedním expresním systémem, který byl použit k produkci vysoké exprese fúzních proteinů v savčích buňkách je DNA konstrukt kódující v 5' do 3' směru sekreční kazetu zahrnující signální sekvenci a imunoglobulinovou Fc oblast a cílový protein. Několik cílových proteinů bylo úspěšně exprimováno v takovém systému a tyto proteiny zahrnují například IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, pIG-H3, IgE receptor, PSMA a gpl20. Tyto expresní konstrukty jsou uvedeny v patentech US Patent č. 5541087 a 5726044 autoři Lo et al., jejichž uvedení je tímto začleněno jako reference.

Jak je zde používáno, znamená termín signální sekvence segment, který směřuje sekreci leptinového fúzního proteinu a poté je naštěpen s následnou translací v hostitelské buňce. Signální sekvence, která je předmětem vynálezu, je polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci, která iniciuje transport proteinu přes membránu endoplazmatického retikula. Signální sekvence, které jsou užitečné ve vynálezu, zahrnují signální sekvence lehkého řetězce protilátky, například protilátky 14,18 (Gillies et al. (1989) J Immunol

Meth 125:191), signální sekvence těžkého řetězce protilátky, například MOPC141 signální sekvence těžkého řetězce protilátky (Sakano et al. (1980) Nátuře 286:5774) a jakékoli další signální sekvence, které jsou známé v oboru (viz například Watson (1984) Nucleic Acids Research 12:5145) . Každá z těchto referencí je tímto začleněna jako reference.

22:

Signální sekvence byly dobře charakterizovány v oboru a je známo, že typicky obsahují 16 až 30 aminokyselinových reziduí a mohou obsahovat více nebo méně aminokyselinových reziduí.

Typický signální peptid se skládá ze tří oblastí: bázické Nterminální oblasti, centrální hydrofobní oblasti a polárnější C-terminální oblasti. Centrální hydrofobní oblast obsahuje 4 až 12 hydrofobních reziduí, které ukotvují během transportu nascentního polypeptidu signální peptid přes membránovou lipidovou dvojvrstvu. Po iniciaci je signální peptid obvykle naštěpen v lumen endoplazmatického známými jako signální peptidázy.

signálního peptidu obecně sledují typický signální peptid má malá, retikula buněčnými enzymy Potenciální míst štěpení pravidlo (-3,-1). Proto neutrální aminokyselinová rezidua v pozicích -1 a -3 a postrádá prolinová rezidua v této oblasti. Signální peptidáza štěpí takový signální peptid mezi -1 a +1 aminokyselinami. Signální sekvence může být tedy během sekrece naštěpena z amino terminu fúzního proteinu. To vede k sekreci Fc fúzního proteinu skládajícího se z imunoglobulinové Fc oblasti a cílového proteinu. Detailní diskuse sekvencí signálního peptidu je. poskytnuta v práci von Heijne (1986) Nucleic Acid Res. 14:4683, jejíž uvedení je tímto začleněno jako reference.

Jak bude zřejmé osobě znalé oboru, může vhodnost konkrétní signální sekvence pro použití v sekreční kazetě vyžadovat některé rutinní experimenty. Tyto experimenty budou zahrnovat určení schopnosti signální sekvence řídit sekreci Fc fúzního proteinu a také určení optimální konfigurace, genomické nebo cDNA, sekvence, která má být použita, aby bylo dosaženo účinné sekrece Fc fúzních proteinů. Osoba znalá oboru je navíc schopna vytvořit syntetický signální peptid podle pravidel prezentovaných v práci von Heijne uvedené výše, a otestovat účinnost takové signální sekvence rutinními experimenty. Signální sekvence může být také označována jako signální peptid vedoucí sekvence, nebo vedoucí peptidy.

Fúze signální sekvence a imunoglobulinové Fc oblasti je zde někdy nazývána jako sekreční kazeta. Příkladnou sekreční kazetou užitečnou pro použití vynálezu je polynukleotid kódující v 5' do 3' směru signální sekvenci genu lehkého řetězce imunoglobulinu a Fcyl oblasti genu lidského imunoglobulinu yl. Fcyl zahrnuje přednostně alespoň doménu, nebo přednostněji doménu a CH3 doménu. Jak imunoglobulinové pantové pantu, rezidua kóduj ící nebo ve výhodné lidského část používáno, část

Fcyl

CH3

CH2 lidského oblast genu část pantové alespoň j e zde oblasti který obsahuje alespoň jeden, schopná tvořit meziřetězcové sekreční kazetu může být své cDNA konfiguraci. Za produkovat Fc imunoglobulinu imunoglobulinu imunoglobulinu domény a alespoň pantové domény, znamená část imunoglobulinového přednostně dvě cysteinová disulfidické vazby. DNA ve své genomické konfiguraci určitých okolností sekvencí mohou Fc fúze na základě oblast ze těžkého může být řetězce

Fcy2. Ačkoli yl a y2 se y2 sekvenci fúze na chováj í základě sekvencí myší vykazovat u podobně, člověka lepší farmakokinetiku.

V jiné formě vynálezu kóduje DNA sekvence proteolytické štěpící místo vsunuté mezi sekreční kazetu a cílový protein. Štěpící místo poskytuje proteolytické štěpení kódovaného fúzního proteinu a tedy vede k separaci Fc domény od cílového proteinu. Jak je zde používáno, znamená proteolytické štěpící místo aminokyselinové sekvence, které jsou přednostně štěpeny proteolytickým enzymem nebo jinými proteolytickými štěpícími látkami. Užitečná proteolytické štěpící místa zahrnují aminokyselinové sekvence, která jsou rozpoznávána proteolytickými enzymy, jako jsou například trypsin, plasmin, nebo enterokináza K. Je známo mnoho párů štěpících míst/štěpících látek. Viz například patent US Patent č. 5726044, jehož uvedení je tímto začleněno jako reference.

V Příkladech zde uvedených byly produkovány vysoké koncentrace Fc-leptinových fúznich proteinů. Úvodní klony produkovaly okolo 50 ug/ml Fc-leptinu, který mohl být snadno purifikován do homogenity pomocí Protein A chromatografie. Stupeň exprese může být často několikrát zvýšen subklonováním. Fc-leptinové fúzní proteiny mohou být navíc naštěpeny a dále purifikovány, například afinitni purifikací. Jak je uvedeno výše, je zjištěno, že je-li leptin exprimován jako Fc fúzní molekuly, ♦ φ φ · φ ·

24: : .·

Φ φ φ · • φ φ φ φφ φφ je získán vysoký stupeň exprese, pravděpodobně protože Fc část účinkuje jako nosič, čímž pomáhá polypeptidů v C-terminu se správně sbalit a být účinně sekretován. Navíc je Fc oblast při fyziologickém pH glykosylována a vysoce nabita, čímž může Fc oblast pomoci solubilizovat hydrofobní proteiny.

Navíc k vysokému . stupni exprese vykazují leptinové fúzní proteiny delší sérový poločas ve srovnání se samotným leptinem částečně v důsledku jejich větší molekulární váhy. Myší Fc myší leptin má ve srovnání s níže). Leptin, dostatečně malý, leptinový fúzní kD, protože připoj ená například cirkulační poločas 8,8 hodin u myši 18 minutami myšího leptinu (viz Příklad který má molekulovou váhu okolo aby byl účinně vyloučen rénální protein má na rozdíl molekulovou se zde vyskytují dvě leptinové k imunoglobulinové Fc oblasti, kde Fc kD, filtrací. váhu okolo 90 části, každá oblasti jsou je

Fckovalentně spojeny k sobě. Taková dimerická struktura by měla vykazovat vyšší vazebnou afinitu k leptinovému receptorů, jehož sekvence naznačuje, že obsahuje dvě domény vážící ligand (Tartaglia et al. (1995) Cell 83:1263). Protože aktivita leptinu se zdá být zprostředkovaná receptorem, budou leptinové fúzní proteiny potenciálně účinnější než samotný leptin.

O mnoha proteinových ligandech je navíc známo, že se váži na své receptory jako dimer. Pokud leptin patří do třídy dimerických proteinových ligandů, fyzikální omezení způsobené imunoglobulinovou Fc oblastí leptinu vyvolá intramolekulární proces dimerizace, čímž dochází k posunu rovnováhy ve prospěch dimeru a ke zvýšeni jeho vazby k jeho receptorů. Cysteinová rezidua mohou být také začleněna pomocí standardní techniky rekombinantní DNA do monomerů v příslušných místech, aby došlo ke stabilizaci dimeru prostřednictvím tvorby kovalentní disulfidické vazby.

Fúzní proteiny, které jsou předmětem vynálezu, poskytují několik důležitých klinických výhod. Jak bylo demonstrováno na ob/ob myším modelu, byla intraperitoneální nebo subkutánní injekce 0,1 mg/kg/den myšího leptinu ve formě muFc-muLeptinu dostatečná k dosaženi srovnatelného snížení tělesné váhy ve

♦ · φφφφ · φ φ φ φ φφ φ φ φφφ φφ φφφ • φ φφφ φφφφ φ • Φ φφ «φ φφ

srovnání s dávkami 5 až 20 mg/kg/den bakteriálně produkovaného leptinu (Pelleymounter et al. (1995) Science 269:540; Hallas et al. (1995) Science 269:543;Chebab et al. (1996) Nátuře Genetics 12:318; Mounzih et al. (1997) Endocrinology 138:1190). Častost injekcí může být snížena na třikrát týdně, pokud je použita dávka 0,25 mg/kg. Navíc ob/ob myši s denní injekční dávkou 0,25 mg/kg muFc-muLeptinu po. dobu 4 měsíců ještě příznivě odpovídaly na léčbu bez detekovatelných vedlejších účinků. Myši byly vskutku velmi zdravé se sníženou chutí k jídlu a zvýšenou termogenezí a lokomotorními aktivitami. Ve světle těchto výsledků poskytuje schopnost zkonstruovat různé strukturální konformace Fc-Leptinu, který je předmětem vynálezu, molekuly, které mohou demonstrovat zlepšenou účinnost oproti nativnímu proteinu působícímu proti obezitě.

Jsou-li fúzní proteiny, které jsou předmětem vynálezu, podány injekcí v dávce okolo 0,25 mg/kg/den po dobu 5 dnů ob/ob myši mající iniciální tělesnou váhu alespoň okolo 50 gramů, indukují zhruba 10% (okolo 5 gramů), přednostněji zhruba 12% (okolo 6 gramů, nebo dokonce ještě přednostněji zhruba 15% (okolo 7,5 gramů) úbytku iniciální tělesné váhy. Přednostněji, jsou-li fúzní proteiny, které jsou předmětem vynálezu, podány injekcí v dávce okolo 0,1 mg/kg/den po dobu 5 dnů ob/ob myši mající iniciální tělesnou váhu alespoň okolo 50 gramů, indukují zhruba 10% (okolo 5 gramů), přednostněji zhruba 12% (okolo 6 gramů, nebo dokonce ještě přednostněji zhruba 15% (okolo 7,5 gramů) úbytku iniciální tělesné váhy. Takové dávky vedou přednostně k 10-20% snížení tělesné váhy.

Další forma předkládaného vynálezu poskytuje konstrukty mající různé strukturální konformace, například bivalentní nebo multivalntní konstrukty, dimerické nebo multimerické konstrukty a jejich kombinace. Takové funkční kombinace molekul, které jsou předmětem vynálezu, umožňují zkoumat synergistický efekt leptinu a dalších proteinů působících proti obezitě na zvířecích modelech.

··<· • φ ·· • φ ·φ • φ · ·· • · · ♦4 • Φ • Φ Φ Φ • ΦΦ Φ

Φ · Φ Φ

Předkládaný vynález také poskytuje způsoby produkce leptinu nepocházejících od člověka jako fúzních proteinů. Leptinové fúzní proteiny nepocházející od člověka jsou užitečné pro preklinické studie leptinu, protože před testováním na člověku musí být provedeny na zvířecím modelu studie na účinnost a toxicitu proteinového léku. Lidský protein nemusí za určitých okolností fungovat na myším modelu, protože protein může vyvolávat imunitní odpověď a/nebo vykazovat různou farmakokinetiku, čímž ovlivňuje výsledky testu. Proto může být ekvivalentní myší protein za určitých okolností lepší náhradou pro testování lidského proteinu na myším modelu.

Předkládaný vynález poskytuje způsoby léčení obezity a příbuzných stavů a jejích příčin sestávající se z podání DNA, RNA nebo proteinů, které jsou předmětem vynálezu savci trpícímu tímto stavem. Příbuzné stavy mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na diabetes, hypertenzi, srdeční onemocnění, rakovinu a příbuzná onemocnění. S ohledem na široké účinky leptinu na modulaci neuroendokrinních odpovědí (Freidman a Halaas (1998) Nátuře 395:763), poskytuje předkládaný vynález také způsoby léčby stavů zmírňovaných podáním leptinu. Tyto způsoby zahrnují podání účinného množství preparátu, který je předmětem vynálezu savci trpícímu stavem, který může i nemusí být v přímém vztahu k obezitě.

Proteiny, které jsou předmětem vynálezu, nejsou pouze užitečné jako terapeutické látky, ale osoba znalá oboru rozpozná, že tyto proteiny jsou užitečné pro tvorbu protilátek pro diagnostické použití. Podobně je zahrnuto ve způsobech použití vynálezu příslušné podání DNA nebo RNA, například ve vektoru nebo v jiném transportním systému pro taková použití. Navíc jsou konstrukty, které jsou předmětem vynálezu, užitečné z kosmetických důvodů pro kontrolu váhy savců. Kosmetický účel spočívá v kontrole váhy savce za účelem zlepšení vzhledu těla. Savec není nezbytně obézní. Takové kosmetické použití tvoří část předkládaného vynálezu. Použití Fc-Leptinů odvozených od jiných savců je navíc užitečné pro chov zvířat na libové maso.

• · ·· * 499 • · ·· • · ·» • 44· •4 •·

4· •4 •4

Není známo, hematoencefalickou bariéru, aby v hypotalamu. Pokud Fc-leptinový hematoencefalickou bariéru, poté proti obezitě existují leptinové receptory mimo mozek. Jako zdali Fc-Leptinový fúzni protein dostal se fúzni může látky působící účinku, nebo že j eho naznačuj e přestupovat k receptoru protein nepřestupuje vysoká účinnost jako nový mechanismus fúzni protein s imunoglobulinovou Fc oblastí může mít Fc leptinový fúzni protein velmi příznivé rozložení v tkáních a mírně odlišný způsob účinku, aby dosáhl klinické účinnosti a dokonce překonal leptinovou rezistenci obzvláště s ohledem na dlouhý sérový poločas a vysokou dávku rozpustného proteinu, který může být podán. Data od myší léčených subkutánními injekcemi naznačují, že intramuskulární injekce u člověka by měly být stejně účinné. Může být také žádoucí podávat FcLeptinový fúzni protein jako nosní sprej, inhalační preparát, dermální náplast, nebo oční kapky. Pokud má být Fc-Leptinový fúzni protein podáván jako inhalační preparát, je užitečné formulovat fúzni protein tak, aby byl agregován do malých částic, které podstupují transcytózu přes plicní epitel.

DNA konstrukty (nebo genové konstrukty, které jsou předmětem vynálezu, mohou být také použity jako část protokolu genové terapie k dopravení nukleových kyselin kódujících leptin nebo jeho fúzni proteinový konstrukt. Vynález charakterizuje expresní vektory pro transfekci in vivo a expresi leptinu nebo jeho fúzního proteinového konstruktu v konkrétních buněčných typech, aby se rekonstituovala nebo nahradila funkce leptinu. Expresní konstrukty leptinu nebo jeho fúzních proteinových konstruktů mohou být podávány v jakémkoli biologicky účinném nosiči, například v jakémkoli preparátu schopném účinného transportu genu pro leptin nebo jeho fúzního proteinového konstruktu buňkám za podmínek in vivo. Tyto přístupy zahrnují inzerci předmětného genu do virových vektorů zahrnujících rekombinantní retroviry, adenovirus, adeno-asociovaný virus a herpes simplex-virus 1 nebo rekombinantní bakteriální a eukaryotické plazmidy.

Je zamýšleno, že preparáty, které jsou předmětem předkládaného vynálezu mohou být poskytnuty živočichovi jakýmkoli vhodným *· *·4· Μ Λ Λ«Μ

0Q * · · 9 9 9 9 99

Z-U 9 · 4 * 9 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 99

99 ·« 4«·· •

9 způsobem, přímo (například lokálně jako injekcí, implantací nebo topickým podáním do určitého místa tkáně), nebo systémově (například parenterálně nebo perorálně. Je-li poskytnut preparát pro parentrální použití, jako je například použití intravenózní, subkutánní, oční, intraperitoneální, intramuskulární, bukální, rektální, vaginální, intraorbitální, intracerebrální, intrakraniální, intraspinální, intraventrikální, intrathekální, intracisternální, intrakapsulární, intranazální nebo pomocí aerosolu, obsahuje preparát část vodné nebo fyziologicky kompatibilní tekuté suspenze nebo roztoku. Nosič nebo vehikulum jsou tedy fyziologicky přijatelné, takže navíc k transportu požadovaného preparátu pacientovi neovlivňuje jinak nežádoucím způsobem elektrolytovou a/nebo objemovou rovnováhu. Tekuté médium pro látku může tedy tvořit normální fyziologický roztok.

Přednostní dávky pro podání fúzních proteinů, které jsou předmětem vynálezu, jsou v rozmezí 50 ng/m² až 1 g/m², přednostněji 5 ug/m² až 200 mg/m² a nejpřednostněji 100 ug/m² až 10 mg/m². Přednostní dávky pro podání nukleových kyselin kódujících fúzní .proteiny, které jsou předmětem vynálezu, jsou v rozmezí 1 ug/m² až 100 mg/m², přednostněji 20 ug/m² až 10 mg/m² a nejpřednostněji 400 ug/m² až 4 mg/m². Je však zamýšleno, že optimální způsoby podání a dávkování může být určeno rutinními experimenty dobře známými v oboru.

Vynález je dále ilustrován nelimitujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1. Exprese muFc-muLeptinu

Vzorek mRNA byl připraven z tukových buněk normální myši

C57/BL6 a reverzně tanskriptázy. Výsledná polymerázovou řetězovou leptinu klonována a muLeptinový fúzní protein.

GTG CCT ATC CAG ΑΆΑ GTC C (SEQ ID NO: (Xmal restrikční místo) následované přepsané mRNA za cDNA byla použita reakci (PCR), aby adaptována pro

Dopředný primer byl 9), kde

ΤΑΆΆ reverzní templát pro cDNA myšího jako muFcCCC GGT ΆΑΆ použití jako byla expresi

5'C sekvence CCCGGG kóduje karboxy terminus imunoglobulinového těžkého řetězce. Sekvence uvedená ······ ·· · · · · <· ·· ♦ ···· ···· • · · ···· ··· • · · · · ·· ··· · · ···· ···· ·· · • · · · ·· ·· ·· ··· tučně kóduje N-terminus myšího leptinu. Reverzní primer byl 5'CTC GAG TCA GCA TTC AGG GCT AAC ATC (SEQ ID NO: 10), který kóduje C terminální sekvenci s jeho translačním STOP kodónem (antikodón, TCA) a toto bylo následováno Xhol místem (CTCGAG). Výsledný PCR produkt o 450 párech bází byl klonován a sekvenován. Sekvenční analýza potvrdila, že produkt kódoval zralý myší leptin adaptovaný pro expresi, tj. s Xmal místem na svém 5'konci a Xhol místem na jeho 3' konci.

Expresní vektor pdCs-muLeptin byl zkonstruován následujícím způsobem. Xmal-Xhol restrikční fragment obsahující myší leptinovou cDNA byl poté ligován k Xmal-Xhol fragmentu pdCsmuFc vektoru podle Loo et al. (Protein Engineering (1998) 11:495). muFc fragment je myší Fc fragment myšího imunoglobulinu y2a. Výsledný vektor, pdCs-muFc-muLeptin byl použit k transfekci savčích buněk pro expresi muFc-muLeptinu.

Příklad 2 Transfekce a exprese proteinu

Pro přechodnou transfekci byl do buněk lidské ledviny 293 vložen plazmid . pomocí koprecipitace fosforečnanem vápenatým (Sambrook et al. Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring plazmidové DNA (1989) Molecular

Harbor, NY) nebo pomocí lipofekce za použití Lipofectaminu Plus (Life

Technologies, Gaithersburg, MD) ve shodě s instrukcemi výrobce.

Abychom získali stabilně transfektované klony, DNA vložena elektroporací kultivovány v Dulbecco suplementovaném 10% fétálním pěnicilínem/streptomycinem.

promyto pomocí linearizované do NSO buněk.

modifikovaném bovinním sérem, Okolo 5xl0⁶

PBS a resuspendováno plazmidové DNA inkubováno na ledu s buňkami jedenkrát .

Deset ug minut

BioRad).

Gene ] byla plazmidová NS/0 buňky byly Eagle médiu mM glutaminem a buněk bylo v 0,5 ml PBS.

bylo poté po dobu v Gene Pulser Cuvette (0,4 Elektroporace byla provedena Pulser (BioRad, Hercules, cm za

CA) a 500 uF. Buňky byly regenerovány po dobu electrodová mezera, použití přístroje s nastavením 0,25 V minut na ledu a poté byly resuspendovány v růstovém médiu a umístěny na dvě 96 jamkové desky. Stabilně transfektované

klony byly vybrány podle růstu v přítomnosti 100 nM metotraxátu (MTX), který byl přidán dva dny po transfekci. Buňky byly krmeny každé 3 dny dva až třikrát a MTX rezistentní klony se objevily za 2 až 3 týdny. Supernatanty klonů byly analyzovány pomocí anti-Fc ELISA za účelem identifikace buněk s vysokou produkcí. Vysoce produkující klony byly izolovány a pomnoženy v růstovém médiu obsahujícím 100 nM MTX.

Pro rutinní charakterizaci gelovou fúzní proteiny v upravených médiích

Sepharose (Repligen, Cambridge, MA) elektroforézou byly Fc zachyceny na Protein A a poté eluovány varem v pufru s proteinovým vzorkem s nebo bez 2-merkaptoetanolu. Po frakcionaci na SDS polyakrylamidové elektroforéze (SDS-PAGE) byly proteinové proužky vizualizovány pomocí barvení Coomassie. MuFc-muLeptin měl zjevnou molekulovou váhu okolo 50 kD podle SDS-PAGE.

Pro purifikaci byly fúzní proteiny navázány na Protein A Sepharosu s následnou eluci sodnofosfátovým pufrem /100 mM NaH₂PO₄. PH 3, a 150 mM NaCl). Eluát byl okamžitě zneutralizován pomocí 0,1 objemu 2 M Tris hydrochloridu.

Příklad 3. Postupy ELISA

ELISA stanovení byla použita k určeni koncentrací proteinových produktů v supernatantech MTX-rezistentních klonů a dalších testovaných vzorků. Množství lidských Fc- a myších Fcobsahujících proteinů byla určena pomocí anti-huFc ELISA a respektive anti-muFc ELISA.

Anti-huFc ELISA je popsána detailněji níže:

A. Potažení destiček.

Destičky ELISA byly potaženy kozi protilátkou ptori lidskému IgG (H+L) AffiniPure (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) v koncentraci 5 ug/ml v PBS a v objemu 100 ul/jamku v 96-jamkových destičkách (Nunc-Immuno plate Maxisorp). Potažené destičky byly přikryty a přes noc inkubovány při teplotě 4°C. Destičky byly poté čtyřikrát promyty 0,05% Tweenem (Tween 20) v PBS a blokovány 1%BSA/1% «31 kozím sérem v PBS, 200 ul/jamku. Po inkubaci š blokovacím pufrem při teplotě 37°C po dobu 2 hodin byly destičky čtyřikrát promyty 0,05% Tweeenm v PBS a vysušeny papírovým ubrouskem.

B. Inkubace s testovanými vzorky a se sekundární protilátkou Testované vzorky byly naředěny na příslušné koncentrace vzorkovým pufrem, který obsahoval 1%BSA/1% kozí sérum/0,05% Tween v PBS. S chimérickou protilátkou (s lidským Fc) , jejíž koncentrace byla známa, byla připravena standardní křivka. K přípravě standardní křivky byla provedena sériová ředění vzorkovým pufrem, aby vznikla standardní křivka v rozmezí 125 ng/ml až 3,9 ng/ml. K destičce byly přidány naředěné vzorky a standardy v objemu 100 ul/jamku a destička byla inkubována při teplotě 37°C po dobu 2 hodin. Po inkubaci byla destička osmkrát promyta 0,05% Tweenem v PBS. Ke každé jamce bylo poté přidáno 100 ul sekundární protilátky, křenové peroxidázy konjugované s protilátkou proti lidskému IgG (Jackson Immuno Research), naředěné okolo 1:120000 vzorkovým pufrem. Přesné ředění sekundární protilátky musí být určeno pro každou šarži křenové peroxidázy konjugované s protilátkou .proti lidskému IgG. Po inkubaci při teplotě 37°C po dobu 2 hodin byla destička osmkrát promyta 0,05% Tweenem v PBS.

C. Vyvinutí

K destičce byl přidán roztok substrátu v objemu 100 ul/jamku. Roztok substrátu byl připraven rozpuštěním 30 mg OPD (ofenylendiamin dihydrochlorid, 1 tableta) v 15 ml 0,025 M kyselině citrónové/0,05 M Na2HPO₄ pufru, pH 5, který obsahoval 0,03% čerstvě přidaný peroxid vodíku.Barva byla vyvíjena po dobu 30 minut při pokojové teplotě a ve tmě. Vyvíjecí čas může být změněn v závislosti na mezišaržové variabilitě potažených destiček, sekundární protilátky, atd. Pozorujte vyvíjení barvy standardní křivky, abyste určili, kdy zastavit reakci. Reakce byla zastavena přidáním 4a H2SO4, 100 ul/jamku. Destička byla odečtena čtecím zařízením, které bylo nastaveno na 490 i 650 nm a naprogramováno, aby odečetlo optickou denzitu pozadí při 650 nm od optické denzity při 490 nm.

Postup ELISA stanovení s protilátkou . anti-muFc byl podobný, s výjimkou, že ELISA destička byla potažena kozí protilátkou

···· ·· ·· ·· * ·♦·· ··· proti myšímu IgG (H+L) AffiniPure (Jackson Immuno Research) v koncentraci 5 ug/ml v PBS a v objemu 100 ul/jamku; a sekundární protilátkou byla s křenovou peroxidázou konjugovaná kozí protilátka anti-mulgG (Souther Biotechnology Assoc., Birmingham, AL), použitá v ředění 1 ku 5000.

Příklad 4. Exprese huFc-huLeptinu

Human Fat Cell Quick-Clone cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) byla použita jako templát pro PCR ke klonování a adaptování cDNA lidského leptinu pro expresi jako huFc-huLeptinového fúzního proteinu. Dopředný primer byl 5'C CCG GGT AAA GTG CCC ATC CAA AAA GTC CA (SEQ ID NO: 11), kde sekvence C CCG GGT AAA GTG CCC

ATC CAA AAA GTC CA (SEQ ID NO: 12) kóduje karboxy terminus imunoglobulinového těžkého řetězce s následnou sekvencí (tučně) kódující zralý N-terminus leptinu. Sekvence C CCG GG je Xmal restrikční místo vložené němou mutací (Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495). Reverzní primer byl 5' CTC GAG TCA GCA CCC AGG GCT GAG GTC (SEQ ID NO: 13), který kóduje antikomplenetární sekvenci karboxylového terminu leptinu s jeho translačním STOP kodónem (antikodón. TCA) a ten bylo následován Xhol místem (CTCGAG). Výsledný PCR produkt o 450 bázích byl klonován a sekvenován. Sekvenční analýza potvrdila, že produkt kóduje lidský leptin přizpůsobený pro expresi, tj . s Xmal místem na 5' konci a Xhol místem na jeho 3' konci.

Expresní vektor pdCs-huFc-huLeptin byl zkonstruován následujícím způsobem. Xmal-Xhol restrikční fragment obsahující lidskou leptinovou cDNA byl poté ligován k XmalXhol fragmentu pdCs-huFc vektoru podle Lo et al. (Protein Engineering (1998) 11:495). huFc fragment je lidský Fc fragment lidského imunoglobulinu γΐ. Výsledný vektor, pdCshuFc-huLeptin byl použit k transfekci savčích buněk pro expresi huFc-muLeptinu.

Příklad 5. Konstrukce expresních vektorů pro muLeptin-muFc a muLeptin-Gly-Ser-spoj ovaci část-muFc

Myší leptinová cDNA byla adaptována pro expresi jako muLeptinmuFc fúzní protein pomocí PCR. Dopředný primer, 5'C TTA AG C

GTG CCT ATC CAG AAA GTC CA (SEQ ID NO: 14) vložil AfIII

(CTTAAG) místo pro ligaci sekvence cDNA kódující zralý Nterminus myšího leptinu (sekvence tučně) do DNA kódující signální peptid. Reverzní primer, 5'GAT ATC GCA TTC AGG GCT AAC ATC (SEQ ID NO: 15), vložil EcoRV místo těsně pod sekvenci kódující karboxy terminus myšího leptinu bez STOP kodónu (antikomplementární sekvence tučně). EcoRV místo sloužilo jako spojovací adaptér pro konstrukční fúzi myšího leptinu k myšímu Fc, jak je diskutováno níže. Výsledný PCR produkt o 450 párech bází byl klonován a kompletně sekvenován. AfIII-EcoRV fragment kódující zralý myší leptin byl poté použit pro konstrukci pdCs-muLeptin-muFc expresního vektoru.

Ligační produkt AfIII-EcoRV fragmentu kódujícího zralý myší leptin a Xbal-AflII fragment kódující signální peptid imunoglobulinového lehkého řetězce (Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495) byl subklonován. Výsledný Xbal-EcoRV fragment kóduje signální peptid následovaný zralým leptinem bez STOP kodónu.

K adaptování EcoRV místa k 5'konci muFc DNA byly do EcoRI-Xhol klonovacího vektoru subklonovány ligační produkt AfIII-Xhol fragmentu kódujícího myší Fc (Lo et al. (1998) Protein Engineering 11:495) a následující spojovací adaptér.

EcoRI přiléhající konec

5' AATTC GAT ATC (SEQ ID NO: 16)

3' G CTA TAG AATT (SEQ ID NO: 17)

AfIII přiléhající konec

Uvedený spojovací adaptér obsahuje EcoRI a AfIII přiléhající konce a také obsahuje EcoRV místo (GATATC). Po subklonování byl izolován EcoRV-Xhol fragment kódující muFc fragment se STOP kodónem. Fragment byl poté ligován s Xbal-EcoRV fragmentem kódujícím signální peptid a zralý myší leptin (popsaný výše) a Xbal-Xhol natrávený pdCs vektorový fragment. Výsledný expresní plazmid označený pdCs-muLeptin-muFc byl použit k transfekci savčích buněk.

4 · · · · · · * ·· · • · · · ♦ ♦ t « v· ·· · 4 4 4 4· • · · ·· • · · ·4

44 4

Pro linearizována pdCs-muLeptin-muFc byla vložena místě a konstrukci pdCs-muLeptin-Gly-Ser-spojovací část-muFc byla specifickém EcoRV nefosforylováná spoj ovaci ligací část:

DNA ve následuj ící

5'GGC GCA

3'CCG CGT

GGA GGT

TCT GGC

GGA TCC

CCT CCA

AGA CCG

CCT AGG

3'

5' . (SEQ ID (SEQ ID byla vložena správná spojovací sekvence ve Výsledný vektor, pdCs-muLeptin-Gly-Serbyl použit pro transfekci savčích buněk.

potvrzena sekvenací

DNA, aby bylo sekvence

Příklad 6. Snížená spojovací část-muFc

Protože C-terminální cysteinové reziduum se intramolekulové disulfidové vazby s cysteinem 117, představovat problém pro sbalení proteinu a následnou pokud je leptin K otestování, zdali expresní spoj ovací konstrukt serinová exprese muLeptin-muFc a muLeptin-Gly-Serúčastní může to sekreci, protein.

vytvořen jako leptin-Fc fúzní k tomu opravdu dochází byly zkonstruovány a muLeptin-Gly-Serv Příkladu 5. Druhý glycinová a je umožněna správně se analyzována pro muLeptin-muFc jak je vektory část-muFc, jak je popsáno kóduje pružnou spojovací část rezidua vložená mezi leptin a větší volnost tvořit disulfidovou vazbu a v buňkách 293 byla a analýzou Western blot za (s křenovou peroxidázou proti mulgG, Jackson anti-muLeptin (biotinylovaná myšímu leptinu, RD Systems, každého konstruktu byla buněčných muLeptinStabilní

Přechodná exprese anti-muFc ELISA stanovení protilátek kozí bohatou na

Fc, takže leptinu sbalit. pomocí použití konj ugovaná

ImmunoResearch) i polyklonální protilátka

Minneapolis, MN).

detekována velmi lyzátů ukázala, Gly-Ser-spojovací část-muFc zůstala

NS/0 klony byly také izolovány. Exprese muLeptin-muFc (s nebo bez spojovací části) byla nanejvýš 10% exprese muFc-muLeptinu.

anti-muFc protilátka protilátky proti

V supernatantech nízká exprese, že většina protinů část-muFc

Analýza celých muLeptin-muFc a uvnitř buněk.

·· ···· ·· ·· · ·· • · · · · · ····· ·· · 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 · 9 9 9 9 9 9· · ·· 9 · · 9 · ·· 4 4

Následné studie dále naznačily, že Leptin-Fc fúzní protein nebyl tak aktivní in vivo jako Fc-Leptinový fúzní protein (viz Obrázek 6) . Pokud byl ob/ob myším intraperitoneálně aplikován Leptin-Fc v dávce 0,25 mg/kg/den, nebyl pozorován žádný významný úbytek váhy. Je překvapivé, že Fc-leptin byl účinnější než Leptin-Fc, protože tyto fúzní proteiny obsahují stejné části a liší se pouze pořadím skupin v každém polypetidovém řetězci.

Příklad 7. Léčba ob/ob myši intraperitoneální (ip.) injekci muFc-muLeptinu

Pět až šest týdnů staré myši C57BL/6J ob/obIJ, které byly homozygotní pro mutaci genu obezity (ob/ob myši), byly zakoupeny z Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Dvě myši v každé skupině byly léčeny buďto muFc-muLeptinem nebo pouze PBS. MuFc-Leptin byl rozpuštěn v PBS a podáván denně (denně po dobu prvních 12 dnů a poté pouze od pondělí do pátku) intraperitoneálně. Množství aplikovaného leptinu bylo normalizováno na 0,25 mg leptinu na kg tělesné váhy myši. Kontrolní skupině byl podáván pouze PBS. Všechny myši měly neomezený přístup k potravě a vodě a tělesná hmotnost byla měřena denně před aplikací.

Za 4 měsíce došlo u kontrolní skupiny (čtverečky na Obrázku 3) ke stabilnímu zvýšení tělesné váhy o 40% (od 50 g do 70 g) . U skupiny léčených denní intraperitoneální injekcí muFcmuLeptinu došlo za první měsíc ke 45% snížení tělesné hmotnosti (od 50,5 g do 28 g) a poté se tělesná hmotnost stabilizovala na zhruba 27-31 g (kosočtverce na Obrázku 3) . Protože myši nebyly léčeny o víkendech, jejich tělesné hmotnosti se zvýšily na více než 30g do každého pondělí, ale denní léčba způsobila stabilní snížení tělesné hmotnosti na zhruba 27-28 g do každého pátku. Jak je uvedeno na Obrázku 3, bylo pro muFc-muLeptin prokázáno, že je účinný po dobu 4 měsíců.

Všimněte si, že během prvních dvou týdnů léčby byl příjem potravy pod mezí detekce. Po 3 až 4 týdnech, když se tělesné hmotnosti snížily na zhruba 30 g a došlo ke zjevnému úbytku

4 · · 4 4 ·· ··4 4 4 • 4 4 4 · 4 44*44

4 4444 444

4 444 44 444 44

4444 4444 444 ♦* 44 ·4 4»444 tukové tkáně, konzumovaly myši v průměru okolo 3 g potravy denně na 1 zvíře. To je ve shodě s výsledky Mounziha et al. (Mounzih et al. (1997) Endocrinology 138:1190), které prokázaly, že spotřeba potravy u ob/ob myší léčených leptinem v dávce 20 mg/kg se znovu obnovila na přibližně 2,6-3,2 g 45. den.

Příklad 8. Léčba ob/ob myší subkutánní (sc.) injekcí muFc-. muLeptinu

Bylo zjištěno, že subkutánní injekce muFc-muLeptinu jsou stejně účinné na snížení tělesné váhy u ob/ob myší jako intraperitoneální injekce. Pět až šest týdnů staré myši ob/ob byly denně léčeny muFc-muLeptinem (pouze pondělí až pátek) sukutánní injekcí. Množství injekčně aplikovaného leptinu bylo normalizováno na 0,25 nebo 0,1 mg leptinu na kg tělesné hmotnosti myši. Všechny myši měly neomezený přístup k potravě a vodě a tělesná hmotnost byla měřena denně před aplikací. Po 17 dnech došlo u myší léčených dávkou 0,1 a 0,25 mg leptinu/kg ke 14%, respektive 22% snížení tělesné váhy, zatímco u kontrolní skupiny, které byl aplikován PBS, došlo k .15% zvýšení hmotnosti. Snížení příjmu potravy u myší léčených sc. injekcemi je podobné jako u myší léčených ip. injekcemi ekvivalentních dávek.

Příklad 9. Léčba ob/ob myší intravenózní (iv.) injekcí muFcmuLeptinu

Bylo zjištěno, že intravenózní injekce. muFc-muLeptinu jsou u ob/ob myší stejně účinné na snížení na skupinu) byly léčeny muFc-muLeptinu v dávce 0,25 Všechny myši měly neomezený hmotnost byla měřena denně před aplikací, po (2 myši injekcemi nebo PBS. a tělesná tělesné denními nebo 1 mg přístup k zastavena denně i poté. 0,25 mg a (trojúhelníky po dobu naznačuj í, dnech, ale tělesná hmotnost byla Jak je uvedeno na Obrázku mg/kg leptinu ve respektive kolečka) ke a respektive 72 váhy. Myši ob/ob intravenózními leptinu na kg, potravě a vodě Léčba byla zaznamenávána 4, vedla léčba dávkou formě muFc-muLeptinu snížení tělesné váhy hodin. Tyto výsledky a

dalších že muFc-muLeptin má mnohem delší cirkulační poločas než myší leptin, a to na základě vysokých, častých dávek leptinu potřebných na snížení tělesné hmotnosti.

Přiklad 10. Léčba ob/ob myší muFc-muLeptinem třikrát týdně nebo jedenkrát za čtyři dny

Na Obrázku 5 je uveden efekt různých dávkovačích schémat na. tělesnou hmotnost myší ob/ob. Skupina 3 myší ob/ob (plné kosočtverce) byla léčena specificky myším leptinem ve formě muFc-muLeptinu subkutánními injekcemi v dávce 0,25 mg/kg denně od pondělí do pátku až do bodu A; od bodu A do bodu B byla častost injekcí snížena na třikrát týdně (pondělí, středa a pátek). Jiná skupina, také obsahující 3 myši ob/ob (čtverečky byla léčena myším leptinem ve formě muFc-muLeptinu subkutánními injekcemi v dávce 0,1 mg/kg denně od pondělí do pátku až do bodu C; od bodu C do bodu D byla častost injekcí snížena na třikrát týdně (pondělí, středa a pátek), avšak od bodu D se dávka zvýšila na 1 mg/kg jedenkrát za 4 dny. Kontrolní skupině 3 myší ob/ob (trojúhleníky) byl aplikován denně PBS, od pondělí do pátku. Všechny myši měly neomezený přístup k potravě a vodě a tělesná hmotnost byla měřena denně před aplikací.

Jak je uvedeno na Obrázku 5, byla dávka 0,25 mg/kg muFcmuLeptinu aplikovaného sc. injekcí třikrát týdně (pondělí, středa a pátek) účinná na stabilizaci tělesné hmotnosti okolo 36 až 39 gramů po dobu 9 týdnů. Dávka 1 mg/kg aplikovaná sc. injekcí každé 4 dny vedla ke snížení z 51 g na 34 g za 4 týdny, po kterých se tělesná váha stabilizovala mezi 30 až 33 g. Dávkovači schéma 0,1 mg/kg třikrát týdně bylo na snížení tělesné váhy neúčinné. Tyto výsledky naznačují, že denní injekce muFc-muLeptinu nejsou nezbytné při jeho dlouhotrvajícím účinku při injekci příslušné dávky.

Příklad 11. Léčba štíhlých myší a myší db/db muFc-muLeptinem Pro srovnání s myšmi ob/ob byla léčeny normální C57BL/6J,

C57BL/KS a Balb/C (všechny zakoupeny denními (pondělí myši a diabetické C57BL/KS db/db myši z Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me) až pátek) intraperitoneálními nebo sukutánními injekcemi muFc-muLeptinu v PBS. Množství injekčně ·· *· 00·· ♦

Φ Φ * Φ φ φ · · *Φ ♦

ΦΦ Φ Φφφφ ·ΦΦ

ΦΦ ♦········· • · · · φ 0 Φ · φ·Φ φ · Φ · 00 · · φ · 000 aplikovaného leptinu bylo normalizováno na 0,25 mg nebo 1 mg leptinu na kg tělesné váhy myši. Jak je uvedeno v Tabulce 1, neměl muFc-muLeptin v žádné z dávek účinek na db/db myši, které postrádají receptor pro leptin. U normálních C57BL/6J, C57BL/KS a Balb/C myší měla nízká dávka velmi mírný efekt. Vysoká dávka však vedla za 19 dnů k významnému snížení tělesné hmotnosti (Tabulka 1) bez. závislosti na věku myší.

Tabulka 1 Procentuální změna tělesné hmotnosti myší (3 myši na skupinu) léčených muFc-muLeptinem v dávce 0, 0,25 nebo 1 mg/kg (pondělí až pátek) intraperitoneálními (ip.) nebo subkutánními (sc.) injekcemi po dobu 19 dnů.

	Cesta	Věk	Vehikulum	0,25 mg/kg	1 mg/kg
ob/ob	IP	2 m	+ 14,7	-23,3	-17,4“
db/db	SC	2 m	+ 7,21	+ 6, 78	+ 5,01
db/db	IP	5 m	+ 1,82	+ 5,66	+ 5,28
C57BL/6J	IP	5 m	+ 1, 03	-1,69	-13, 9
C57BL/KS	IP	5 m	+ 0, 22	-0,13	16, 9
Balb/C	IP	2 m	+ 9,18	-5,4	-9, 19

Léčba myší ob/ob v dávce 1 mg/kg byl zastavena po 5 dnech protože nižší dávka 0,25 mg/kg byla stejně účinná.

Příklad 12 Léčba ob/ob myší intraperitoneální (ip.) injekcí huFc-huLeptinu

HuFc-huLeptin byl podáván ip. místo sc. cestou, aby se snížila imunogenita u myší. Jedna myš ob/ob byla léčena dávkou 0,1 mg/kg lidského leptinu ve formě huFc-huLeptinu denní ip. injekcí (po dobu prvních 17 dnů a poté pouze od pondělí do pátku). Další myš ob/ob byla léčena vyšší dávkou 0,5 mg/kg denně (po dobu prvních 17. dnů a poté pouze od pondělí do pátku) až do 33. dne a poté byla frekvence injekcí snížena na 3 injekce týdně (pondělí, středa a pátek). Kontrolní myši ob/ob byl podáván pouze denně PBS (po dobu prvních 17 dnů a poté pouze od pondělí do pátku) . Všechny myši měly neomezený přístup k potravě a vodě a tělesná hmotnost byla měřena denně před aplikací.

• 9 9 9 9 9 »· 9 ··· 9 • 9 * 9 · · 9 9 ·· 9

9 9 »··· · ··

9 999 · · 9 · 9 ·9 • ••9 · · 9 9 · ··

9« 9 · ·· · 9 · ·· · 9

Obrázek 6 ukazuje, že huFc-huLeptin byl stejně účinný jako muFc-muLeptin, co se týká snížení tělesné hmotnosti u ob/ob myší. Další skupina dvou starších myší ob/ob byla léčena střední dávkou 0,25 mg/kg denně (po dobu prvních 10 dnů a poté pouze od pondělí do pátku). Jejich tělesná hmotnost se snížila z 65 g na 31 g (-51,4% za 23 dnů, po kterých jejich tělesná hmotnost kolísala mezi zhruba 31 g každé pondělí do zhruba 26 g každý patek (data nejsou uvedena). Stojí za zmínku, že po téměř dvou měsících léčby si udržel huFc-huLeptin svou účinnost a nezdál se být nepříznivě ovlivněn imunologickou odpovědí, která by se mohla vyvinout proti lidskému proteinu.

Tento experiment byl zopakován na větších skupinách myší (n=8)Navíc byly myši léčeny 15 měsíců Fc Leptinem s výsledkem, který ukázal, že hmotnost myší se udržela v rozmezí 20-30 gramů. Po tuto dobu se u myší neobjevily žádné zjevné nežádoucí účinky. Další experimenty také ukázaly, že denní podání Fc-Leptinu intraperitoneální injekcí, subkutánní injekcí a intravenózní injekcí vedlo k podobným výsledkům. Proto injekční cesta se nezdá být důležitá pro kvantifikaci in vivo aktivity u myší ob/ob..

Příklad 13. Léčba infertility myší ob/ob intraperitoneální (ip) injekcí muFc-muLeptinu

Samci ob/ob a samice ob/ob byly léčeny muFc-muLeptinem denními intraperitoneálními injekcemi 0,25 mg/kg. Každý samec ob/ob byl úvodně umístěn s jednou samicí ob/ob a s jednou normální samicí C57BL/6J. Když došlo k rychlému nárůstu tělesné hmotnosti ukazující na zabřeznutí, byla březí myš izolována. Po zhruba 2 až 4 týdnech léčby se u všech šesti samců ob/ob zlepšil jejich defekt infertility a byly schopni oplodnit normální a/nebo ob/ob samice. Všechny normální C57BL/6j zabřezlé samice normálně porodily a krmily svá mláďata. Ze šesti březích samic ob/ob pouze čtyři normálně porodily homozygotní mláďata ob/ob. Avšak žádné ze čtyř mláďat přežilo první den, protože matky ob/ob neměly laktaci.

Příklad 14. Farmakokinetika

Minneapolis,MN). Myším ob/ob (6 myší na injekční aplikace do ocasní žíly.

aplikovaného leptinu bylo normalizováno tělesné váhy myši.

krvácením okamžitě po

4, 8, a 48 hodinách po do zkumavek obsahujících heparin, aby se Buňky byly odstraněny centrifugací ve mikrocentrifúze Eppendorf po dobu 4 minut, myšího leptinu v plazmě byla měřena za použití Minneapolis, Cirkulující poločasy muFc-muLeptinu a myšího leptinu byly respektive 18 minut.

skupinu)

Množství na 1 mg odebrána

Krev byla injekci (0 minut) a v injekci. Krevní vzorky aby

Byla porovnána farmakokinetika muFc-muLeptinu a myšího leptinu (RD Systems, byla provedena inj ekčně leptinu na kg retroorbitálním

0,1, 0,5, 1, 2, byly odebírány zabránilo srážení krve.

vysokootáčkové mikrocentrifúze Eppendorf po dobu Koncentrace myšího leptinu v plazmě byla měřena imunoanalyzačního kitu na myší leptin (RD Systém, MN) .

určeny na 8,8 hodiny a

Podobně bylo zjištěno, že huFc-huLeptin má u myší cirkulační poločas přes 10 hodin.

Příklad 15. Konstrukce huFc (n-Q mutace)-huLeptin

Abychom otestovali, zdali N-vázaná glykosylace Fc oblasti imunoglobulinu ovlivňuje sérový poločas huFc-huLeptinu, byl připraven rekombinantní huFc-huLeptin mutant, kde bylo zmutováno asparaginové reziduum v glykosylačním místě Fc oblasti za glutamin. Stručně řečeno bylo pomocí PCR za použití dopředného primeru 5' GAG CAG TAC CAA AGT ACG TAC CGT GTG GTC AGC (SEQ ID NO: 16) a reverzního primeru 5'ACG GTA CGT ACT TTG GTA CTG CTC CTC CCG CG (SEQ ID NO: 17) zmutováno pouze Nglykosylační místo (Asn-Ser-Thr) kódované v DNA huFchuLeptinu. Primery kódovaly změnu z Asn-Ser-Thr n Gin (CAA)Ser-Thr, který již není místem N-glykosylace. Navíc primery vložily němou mutací SnaBI místo (TACGTA), aby usnadnily vyhledávání mutace Asn na Gin (N na Q) . Po mutagenezi pomocí PCR byl sekvenací DNA potvrzen SacII-Smal fragment obsahující substituci N na Q, který byl poté použit k náhradě odpovídajícího fragmentu v pdCs-huFc-huLeptinu, aby vznikl pdCs-huFc (n-Q)-huLeptin.

ΦΦ φφφφ ·· φφ φφ φφ φ φφφφ φ · φ φ φ φ φφφφ * « φ φ φφφ φφ φφφ φ

Expresní plazmid pdCs-huFc (N-Q)-huLpetin byl transfektován do lidských buněk, jak je popsáno v Příkladu 2. Purifikovaný huFc(N-Q)-huLeptinový protein byl poté použit pro farmakokinetické studie, jak je popsáno v Příkladu 14. Pro přímé srovnání byla myším paralelně aplikována stejná množství huFc-huLeptinu (1 mg leptinu/kg) nebo huFc(N-Q)-huLeptinu (1 mg leptinu/kg).' Koncentrace huFc(N-Q-huLeptinu a huFchuLeptinu v myším séru byly měřeny anti-huFc ELISA stanovením, jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky uvedené na Obrázku 7 ukazují, že huFc-huLeptin (kosočtverce) má delší cirkulační poločas než huFc(N-Q)-huLeptin (čtverečky).

Ekvivalenty

Vynález může být vyjádřen i jinými specifickými formami bez odchýlení od jeho duchu nebo nezbytných charakteristik. Uvedené formy vynálezu by měly být proto považovány ve všech ohledech za ilustrativní spíše než omezující vynález zde popsaný. Rozsah vynálezu je tedy indikován připojenými patentovými nároky spiše než uvedeným popisem a všechny změny, které přicházejí ve smyslu a ekvivalenci patentových nároků jsou proto zamýšleny jako zahrnuté do vynálezu.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Nukleová kyselina kódující fúzní protein obsahující:

   a) signální sekvenci;

   b) imunoglobulinovou Fc oblast; a

   c) sekvenci cílového proteinu zahrnující leptin.

   Nukleová kyselina podle patentového nároku 1, kde řečená signální sekvence, řečená imunoglobulinová Fc oblast a řečená sekvence cílového proteinu jsou kódovány sériově v 5' do 3' směru.

   Nukleová kyselina podle patentového nároku 1, kde řečená signální sekvence, řečená sekvence cílového proteinu a řečená imunoglobulinová Fc oblast jsou kódovány sériově v 5' do 3' směru.

   Nukleová kyselina podle patentového nároku 1, kde řečená imunoglobulinová Fc oblast obsahuje imunoglobulinovou pantovou oblast.

   Nukleová kyselina podle patentového nároku 1, kde řečená imunoglobulinová Fc oblast obsahuje imunoglobulinovou pantovou oblast a imunoglobulinovou doménu pro konstantní těžký řetězec.

   Nukleová kyselina podle patentového nároku 1, kde řečená imunoglobulinová Fc oblast obsahuje pantovou oblast a CH3 doménu.

   Nukleová kyselina podle patentového nároku 1, kde řečená imunoglobulinová Fc oblast postrádá alespoň CH1 doménu.

   Nukleová kyselina podle patentového nároku 1, kde řečená imunoglobulinová Fc oblast kóduje alespoň část imunoglobulinu γ.

   Replikovatelný expresní vektor pro transfekci savčí buňky, řečený vektor obsahující nukleovou kyselinu podle patentového nároku 1.

   .Savčí buňka obsahující nukleovou kyselinu podle patentového nároku 1.

   .Fúzní protein obsahující imunoglobulinovou Fc oblast a cílový protein obsahující leptin, kde fúzní protein, pokud je podán v dávce okolo 0,25 mg/kg/den po dobu 5 dnů myši ob/ob mající úvodní tělesnou hmotnost alespoň 50 gramů, indukuje 10% nebo 5 gramový úbytek tělesné hmotnosti.

   .Fúzni protein podle patentového nároku 11, protein, pokud je podán v dávce okolo 0,1 kde fúzni mg/kg/den, indukuje 10% nebo 5 gramový úbytek tělesné hmotnosti.

   Fúzni protein podle patentového nároku 11, kde cílový protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo 4.

   Fúzni protein podle patentového nároku 11, kde leptinový řečený cílový protein obsahuje alespoň dvě leptinové molekuly, kde řečené dvě leptinové molekuly spojovacím peptidem.

   .Fúzni protein podle cílový protein imunoglobulinové

   Fúzni protein cílový protein imunoglobulinové j sou spoj eny patentového nároku 11, je připojen k N-terminálnímu Fc oblasti.

   podle patentového nároku 11, kde je připojen k C-terminálnímu konci Fc oblasti.

   kde konci řečený řečené řečený řečené

   Fúzni protein podle patentového nároku 11 dále obsahující spojovací peptid spojující řečenou imunoglobulinovou Fc oblast k řečenému cílovému proteinu.

   Multimerický protein obsahující alespoň dva fúzni proteiny podle patentového nároku 11 připojené kovalentní vazbou.

   Protein podle patentového nároku 18, kde kovalentní vazbou je vazba disulfidová.

   Multimerický protein obsahující alespoň dva fúzni proteiny podle patentového nároku 11 připojené kovalentní vazbou.

   Protein podle patentového nároku 20, kde kovalentní vazbou je vazba disulfidová.

   Fúzni protein podle patentového nároku 11, kde řečená imunoglobulinové Fc oblast je glykosylovaná v alespoň jednom glykosylačním místě.

   Způsob produkce fúzního proteinu zahrnující kroky

   a) poskytnutí savčí buňky podle patentového nároku 10; a

   b) kultivace savčí buňky k produkci řečeného fúzního proteinu.

   Způsob podle patentového nároku 23 zahrnující dodatečný krok odebrání řečeného fúzního proteinu.

   Způsob podle patentového nároku 23 zahrnující dodatečný krok purifikace řečeného fúzního proteinu.

   ·« ··«· • 9 ♦ • * · • ♦ · * ·· • · ·

   26. Způsob podle patentového nároku 23 zahrnující dodatečný krok odštěpení řečené imunoglobulinové Fc oblasti od řečeného cílového proteinu.

   27. Způsob podle patentového nároku 26 zahrnující dodatečný krok odštěpení řečeného cílového proteinu v místě vnitřního štěpení pomocí proteolytického enzymu, který je v savčí buňce endogenního původu.

   28. Způsob léčby stavu zmírňovaného podáním leptinu zahrnující podání nukleové kyseliny podle patentového nároku 1 savci trpícímu řečeným stavem.

   29. Způsob léčby stavu zmírňovaného podáním leptinu zahrnující podání vektoru podle patentového nároku 9 savci trpícímu řečeným stavem.

   30. Způsob léčby stavu zmírňovaného podáním leptinu zahrnující podání fúzního proteinu podle patentového nároku 11 savci trpícímu řečeným stavem.

   31. Způsob léčby stavu zmírňovaného. podáním leptinu zahrnující podání multimerického proteinu podle patentového nároku 18 savci trpícímu řečeným stavem.