CZ2001196A3 - Device for detecting one or several fluorescent components and use of such device - Google Patents

Abstract

Zařízení pro detekci jedné nebo několika fluorescenčních složek, kde uvedené složky jsou obsaženy v médiu, přičemž toto médium je obsaženo ve vedení, např. v kapiláře (14). Zařízení zahrnuje prostředek pro excitování fluorescenčních složek světlem, např. argonový iontový laser (16). Uvedené médium a kapilára (14) tvoří konstrukci, která je transparentní pro excitační a emitované fluorescenční světlo argonového iontového laseru (16), a uvedené zařízení zahrnujejednu nebo několik takových konstrukcí, je zlepšeno ponecháním alespoň části emitovaného fluorescenčního světla, aby bylo vedeno z ozařovací zóny prostřednictvím úplného odrazu (TIR) v uvedené konstrukci a snímáno zjednoho konce této konstrukce, v komoře (18), přes kondenzorovou čočku (19), skleněné dolní propusti (20), do objektivu kamery (21).Device for detecting one or more fluorescent wherein the components are contained in the medium, wherein this medium is contained in the conduit, eg in the capillary (14). The device includes means for exciting fluorescent light components such as an argon ion laser (16). Listed the medium and the capillary (14) form a structure that is transparent for excitation and emitted fluorescent light of argon an ionic laser (16), and said device comprises one or more several such designs are improved by leaving at least a portion of the emitted fluorescent light to be conducted from full reflection (TIR) irradiation zone v said structure and sensed from one end of this the structure, in the chamber (18), through the condenser lens (19), glass low-pass filter (20), into the camera lens (21).

Description

Oblast technikyTechnical field

Předkládaný vynález se týká zlepšení v typu zařízení, která jsou používána pro detekci fluorescenčních složek.The present invention relates to improvements in the type of devices that are used to detect fluorescent components.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Fluorescenční detekce nebo fluorometrie je dobře zavedenou a často používanou metodou v analytické chemii.Fluorescence detection or fluorometry is a well established and frequently used method in analytical chemistry.

Hlavními znaky fluorescenční detekce jsou velká selektivita a vysoká citlivost a tato metoda je často aplikována pro detekci stopových složek ve vzorcích různých typů. Fluorescenční detektory sestávají obecně ze tří hlavních podsystémů: i) excitačního světelného zdroje a přidruženéThe main features of fluorescence detection are high selectivity and high sensitivity, and this method is often applied to detect trace components in samples of various types. Fluorescent detectors generally consist of three main subsystems: i) excitation light source and associated

I optiky, ii) měrné kyvety, a iii) snímací optiky a světelného detektoru. Světelný zdroj generuje světlo, které excituje fluorescenční složky. Nejčastěji používanými světelnými zdroji jsou vysokointenzitní lampy, jako například xenonové výbojky nebo lasery. Excitační optika převádí světlo od iI optics, ii) measuring cells, and iii) scanning optics and light detector. The light source generates light that excites the fluorescent components. The most commonly used light sources are high intensity lamps, such as xenon lamps or lasers. Excitation optics converts light from i

světelného zdroje k ozařovací zóně, kde světlo excituje vzorek. Nejčastěji je používána zaostřovací optika, ale rovněž může být použita například vláknová optika (s optickými vlákny) a další druhy vlnovodů. Když je použít / laserový světelný zdroj, může být zaostřovací optika v některých případech vypuštěna. Vzorek může obsahovat jednu nebo několik fluorescenčních složek. Vzorek je obecně přítomen v médiu, například v kapalném roztoku, které je dále obsaženo v nějakém typu měrné kyvety. Měrnou kyvetou může, například, být komora, do které je vzorek nejprve vložen, potom detekován, přičemž je stacionární, a nakonec je vyjmut.the light source to the radiation zone where the light excites the sample. Focusing optics is most commonly used, but fiber optics (with optical fibers) and other types of waveguides can also be used. When a / laser light source is used, the focusing optics may in some cases be omitted. The sample may contain one or more fluorescent components. The sample is generally present in a medium, for example a liquid solution, which is further contained in some type of measuring cuvette. For example, the measuring cuvette may be a chamber into which a sample is first inserted, then detected, being stationary, and finally removed.

* · • · ** • · • · · • · · · » ···« · ·* • ** ** · • »» »· · ·

Kyvetou může rovněž být část nějakého typu vedení, skrz které je vzorek transportován do a z ozařovací zóny. Snímací optika snímá emitované fluorescenční světlo účinným způsobem a transportuje toto světlo do světelného detektoru. Rovněž pro snímací optiku jsou běžně používány zaostřovací prvky, ale rovněž může být použito například vláknové optiky.·Snímací a rovněž excitační optika může rovněž zahrnovat nějaký typ zařízení, jako je například monochromátor nebo jeden či několik filtrů, pro selekci nebo rozptyl vlnových délek. Excitace je nejčastěji prováděna na jedné vlnové délce nebo několika dobře definovaných vlnových délkách nebo alternativně může být excitační vlnová délka skenována. Detekce může být prováděna na jedné nebo několika diskrétních vlnových délkách nebo intervalech vlnových délek, nebo snímaných či rozptýlených v intervalu vlnových délek, nebo může být detekováno celkové množství emitovaného světla. Selektivní detekce vlnových délek zvyšuje univerzálnost a selektivitu fluorometrie a je nutným předpokladem v aplikacích, jako je například čtyřbarevná sekvenční analýza DNA. Existuje mnoho různých typů světelných detektorů, jako jsou například fotodiody, diodová pole, zařízení CTD (zařízení s přenosem nábojů, včetně zařízení CCD (zařízení s nábojovou vazbou) a zařízení CID (zařízení s injekcí náboje}}, a fotonky s fotonásobičem.The cuvette may also be a portion of some type of conduit through which the sample is transported to and from the radiation zone. The sensing optics senses the emitted fluorescent light efficiently and transports it to the light detector. Focusing elements are also commonly used for sensing optics, but also fiber optics can also be used The sensing as well as excitation optics can also include some type of device, such as a monochromator or one or more filters, for selecting or scattering wavelengths. Excitation is most often performed at a single wavelength or several well-defined wavelengths, or alternatively, the excitation wavelength can be scanned. The detection may be performed at one or more discrete wavelengths or wavelength intervals, or sensed or scattered at a wavelength interval, or the total amount of light emitted may be detected. Selective wavelength detection increases the universality and selectivity of fluorometry and is a prerequisite in applications such as four-color DNA sequence analysis. There are many different types of light detectors, such as photodiodes, diode arrays, CTDs (charge transfer devices), including CCDs (charge coupled devices), and CIDs (charge injection devices}}, and photomultiplier tubes.

Jedním z nejběžnějších a nejdůležitějších využití fluorometrie je detekční metoda ve spojení a analytickými metodami, ve kterých je vzorek obsažen a transportován v určitém typu vedení. Takové analytické metody zahrnují, ale nejsou omezeny na, CE (kapilární elektroforéza), LC (kapalinová chromatografie) a FIA (průtoková analýza seOne of the most common and most important applications of fluorometry is in conjunction with detection methods and analytical methods in which a sample is contained and transported in a particular type of line. Such analytical methods include, but are not limited to, CE (capillary electrophoresis), LC (liquid chromatography) and FIA (flow analysis).

4 4 4 » »·«« • · 44 4 4 4 5 6 »» · «« · · 4

44

4 • 4 4444 vstřikováním). V této souvislosti bude předkládaný vynález převážně diskutován ve spojení s CE, ale aplikace na další analytické metody jsou osobám v oboru znalým zcela zjevné. CE je dobře zavedená separační metoda s možností analýzy velmi malých množství vzorku a poskytující velmi vysokou účinnost separace.4 • 4 4444 injection). In this context, the present invention will be largely discussed in conjunction with CE, but applications to other analytical methods are readily apparent to those skilled in the art. CE is a well established separation method with the possibility of analyzing very small amounts of sample and providing very high separation efficiency.

Fluorescenční detekce, a zejména LIF (laserem indukovaná fluorescence), je bobře zavedenou detekční technikou pro CE. Lasery mají dvě hlavní výhody: i) vysokou intenzitu světla, a ii) schopnost zaměřit laserový paprsek na malý bod uvnitř kapiláry. Je důležité, že velikost světelného paprsku v bodě excitace nepřispívá k rozšíření pásma: šířka CE špíček může vyžadovat průměry paprsků o velikosti 10 pm nebo méně. V nejběžnějším a dobře zavedeném optickém nastavení a ortogonálním nastavení je kapilára ozařována laserem a emitované světlo je snímáno v 90° vzhledem ke směru laserového paprsku. Hlavní snahou je, za účelem maximalizace citlivosti, maximalizovat účinnost snímání světla a minimalizovat množství rušivého světla přiházejícího do světelného detektoru. Vysoká účinnost snímání je obecně dosahována prostřednictvím použití snímací optiky s velkou numerickou aperturou. Termín rušivé světlo je v tomto popisu použit pro označení všech typů nechtěného detekovaného světla. Rušivé světlo může být do určité míry vyloučeno prostřednictvím použití spektrálních a/nebo prostorových filtrů. Elektroforézní kapiláry jsou často chráněny polymerním potahem, například polyimidem, který musí být odstraněn předtím, než může být provedena fluorescenční detekce. Rozptyl primárně laserového světla může nastat, pokud jsou na stěně kapiláry ponechány polymerní nebo jiné • 9Fluorescence detection, and in particular LIF (laser-induced fluorescence), is a well established CE detection technique. Lasers have two main advantages: i) high light intensity, and ii) the ability to aim the laser beam at a small point inside the capillary. It is important that the size of the light beam at the point of excitation does not contribute to the widening of the band: the width of the CE peak may require beam diameters of 10 µm or less. In the most common and well-established optical adjustment and orthogonal adjustment, the capillary is irradiated with laser and the emitted light is sensed at 90 ° relative to the direction of the laser beam. The main aim is to maximize light sensing efficiency and minimize the amount of interfering light entering the light detector to maximize sensitivity. High sensing efficiency is generally achieved through the use of large numerical aperture sensing optics. The term interfering light is used in this specification to refer to all types of unwanted detected light. Spurious light can be eliminated to some extent through the use of spectral and / or spatial filters. Electrophoretic capillaries are often protected by a polymer coating, for example polyimide, which must be removed before fluorescence detection can be performed. Scattering of primarily laser light can occur if polymeric or other are left on the capillary wall

99

9 9 • 9999 99 9 • 9 9 9 9 · >9 částice, pokud je stěna poškrábána, nebo pokud uvnitř stěny nebo média uvnitř kapiláry existují cizorodé prvky. Navíc dochází k rozptylu světla na každém optickém rozhraní podle Fresnelova zákona odrazu. Přesněji tedy válcové sloupce běžně používané v CE představují problém, protože rozptylují světlo rovněž v 90° vzhledem ke směru laserového paprsku. Většina materiálů také rozptyluje světlo pružným (Rayleighovým) Ramanovým molekulárním rozptylem. Rozptýlené primární světlo může často být, ale ne ve všech případech, účinně vyloučeno prostřednictvím spektrální filtrace nebo rozložení vlnových délek. Sekundární světlo s posunutou vlnovou délkou může představovat vážnější problém. Nepružný (Stokesův posunutý) Ramanův rozptyl nebo fluorescenční vyzařování od Částic polymeru nebo nečistot na stěně sloupce, od stěny sloupce samotné, od média, ve kterém je obsažen vzorek, nebo od nečistot v médiu či ve vzorku samotném, nemusí být snadno vyloučitelný spektrální filtrací nebo rozložením vlnových délek. Může být dosaženo prostorové filtrace prostřednictvím, například, snímací optiky a apertur s malou ohniskovou hloubkou. Snímání světla je prostorově soustředěno do oblasti média, zatímco světlo vystupující z jiných oblastí je vyloučeno.9 9 • 9999 99 9 • 9 9 9 9 ·> 9 particles if the wall is scratched or if there are foreign elements inside the wall or medium inside the capillary. In addition, light scattering occurs at each optical interface according to Fresnel's reflection law. More specifically, the cylindrical columns commonly used in CE present a problem because they also scatter light at 90 ° with respect to the direction of the laser beam. Most materials also scatter light by elastic (Rayleigh) Raman molecular scattering. Diffused primary light can often, but not in all cases, be effectively eliminated through spectral filtration or wavelength distribution. Secondary light with shifted wavelength can be a more serious problem. Inelastic (Stokes shifted) Raman scattering or fluorescence emission from polymer particles or pollutants on the column wall, from the column wall itself, from the medium in which the sample is contained, or from impurities in the medium or in the sample itself may not be easily eliminated by spectral filtration or wavelength distribution. Spatial filtration can be achieved by, for example, scanning optics and apertures with a small focal depth. The light sensing is spatially concentrated in the medium region, while light emanating from other regions is excluded.

Pro vysoce účinné separační metody, využívající sloupce s malými průměry a malé vzorky a poskytující velmiFor highly efficient separation methods, using columns with small diameters and small specimens and providing very

5 úzká analytická pásma v detektoru, jako je například mikro LC a zejména CE, je nezbytným požadavkem, aby detekce byla prováděna na sloupci a aby detekční objem byl tak malý, jak je možné. Použití vnější detekční kyvety s průměrem větším než je průměr sloupce povede na rozšíření pásma a vazba na takovou kyvetu obecně způsobí mrtvé objemy, což vede na další • 9 • ·5 narrow analytical bands in a detector, such as micro LC and especially CE, is an essential requirement that the detection be performed on a column and that the detection volume is as small as possible. The use of an outer detection cell with a diameter greater than the column diameter will lead to bandwidth expansion, and binding to such a cell will generally cause dead volumes, leading to further • 9 • ·

99999999

9 • 99 99 • 99 9

999 9 9 9 • « 9 9 9 ·· 9 «9 rozšíření pásma. Maximální přípustný detekční objem pro, například, vysoce účinnou CE separaci na 100 pm sloupci může být řádově nebo méně než 2 ní.999 9 9 9 • «9 9 9 ·· 9« 9 bandwidth extension. The maximum allowable detection volume for, for example, high efficiency CE separation on a 100 µm column may be of the order of or less than 2 µ.

Jedním navrženým zařízením pro maximalizaci účinnosti 5 snímání světla a minimalizaci rušivého světla je souohmskový fluorescenční mikroskop [Ju, J. a kol., Anal. Biochem. 1995, 231, 131-40]. Laserový paprsek je odražen dichroickým děličem světla s dolní propustí a zaostřen objektivem mikroskopu na velmi malý bod, řádově o velikosti 10 pm, uvnitř kapiláry.One proposed device for maximizing light sensing efficiency and minimizing interfering light is a Soumoscopic fluorescence microscope [Ju, J. et al., Anal. Biochem. 1995, 231, 131-40]. The laser beam is reflected by a low-pass dichroic light divider and focused by a microscope objective at a very small point, of the order of 10 µm, inside the capillary.

¹⁰ Emitované fluorescenční světlo je snímáno stejným objektivem, ale je přenášeno skrz dělič světla do detekční optiky. Zaostřením snímací optiky přesně dovnitř kapiláry jsou minimalizovány příspěvky rušivého světla způsobené stěnou kapiláry. Umístěním apertury do ohniskového bodu snímaného fluorescenčního světla může být rušivé světlo dále omezeno prostřednictvím prostorové filtrace. Vysoká účinnost snímání světla je dosažena použitím objektivu mikroskopu s velkou numerickou aperturou. Nevýhody tohoto zařízení zahrnují nutnost dodržení velmi přísných mechanických tolerancí a velmi pečlivého optického vyrovnaní, a citlivost na, například, vibrace. Tyto nevýhody jsou důsledkem použité malé ohniskové hloubky. Navíc pro válcové kapiláry vzniká problém se zaostřením světla a snímáním světla ve vnitřku tělesa postrádajícího kruhovou symetrii. ^{10 The} fluorescent light emitted is sensed by the same lens, but is transmitted through the light divider to the detection optics. By focusing the sensing optics precisely inside the capillary, the contribution of interfering light caused by the capillary wall is minimized. By positioning the aperture at the focal point of the sensed fluorescent light, interfering light can be further reduced by spatial filtration. High light sensing efficiency is achieved using a large numerical aperture microscope objective. The disadvantages of this device include the necessity of maintaining very strict mechanical tolerances and very careful optical alignment, and sensitivity to, for example, vibration. These disadvantages are due to the small focal length used. In addition, for cylindrical capillaries, there is a problem with focusing light and sensing light inside the body lacking circular symmetry.

Dalším navrženým zařízením pro optimalizaci citlivosti detekce je plášťová průtoková kyveta [Swerdlow, H.Another proposed sensitivity optimization device is a jacket flow cell [Swerdlow, H.

a kol., Anal. Chem. 1991, 63, 2835-41; Chen, D. Y. a kol·., J.et al., Anal. Chem. 1991, 63, 2835-41; Chen, D. Y. et al., J.

Chromatogr. 1991, 559, 237-46] . Analyzát, který má být detekován je vypuštěn z kapiláry a excitován bezprostředně 30 vně konce kapiláry v toku pufru proudícího skrz vysoce čistou • φ • φ • Φ ·φ·φ • φ * · · φ »·· • · φ φ · ·· φ φφ křemennou kyvetu. Protože analyzát je detekován za kapilárou, příspěvky rušivého světla od stěny kapiláry jsou vyloučeny. Navíc, protože křemenná kyveta může být zkonstruována s plochými optickými povrchy, je vyloučen problém s rozptylem světla, který je spojen se zakřivenými povrchy. Vysoké účinnosti snímání světla je dosaženo prostřednictvím použití snímací optiky s velkou numerickou aperturou. Použití tohoto zařízení vyžaduje velmi pečlivou kontrolu podmínek průtoku a impedancí průtoku, aby se udržela integrita toku analyzátu.Chromatogr. 1991, 559, 237-46]. The analyte to be detected is discharged from the capillary and excited immediately 30 outside the end of the capillary in the flow of buffer flowing through the high purity. Φ · φ · φ · • · φ · · • φ φφ quartz cell. Since the analyte is detected behind the capillary tube, interfering light contributions from the capillary wall are excluded. In addition, since the quartz cuvette can be constructed with flat optical surfaces, the problem of light scattering that is associated with curved surfaces is avoided. High light sensing efficiency is achieved through the use of large optic aperture sensing optics. The use of this equipment requires very careful control of flow conditions and flow impedances in order to maintain the integrity of the analyte flow.

Navíc přítomnost částic, bublinek nebo nečistot v pufru plášťové průtokové kyvety může vést na velká množství rušivého světla.In addition, the presence of particles, bubbles, or impurities in the buffer flow cell buffer can result in large amounts of interfering light.

Aby se zvýšila průchodnost vzorků CE analýzy, jako například pro hromadnou sekvenční analýzu DNA, je žádoucí spouštět CE v mnoha kapilárách současně. Taková multiplexm analýza s sebou přináší vážné dodatečné optické a geometrické problémy, pokud se týká fluorescenční detekce. Nejčastěji je množství kapilár uspořádáno vedle sebe paralelním způsobem, takže pole kapilár tvoří rovinné pole v detekčním bodě.In order to increase the throughput of CE analysis samples, such as for bulk DNA sequence analysis, it is desirable to run CE in many capillaries simultaneously. Such multiplex analysis entails serious additional optical and geometric problems in terms of fluorescence detection. Most often, the plurality of capillaries are arranged side by side in a parallel manner so that the capillary field forms a planar field at the detection point.

Běžné sloupcové ortogonální nastavení může být aplikováno pro detekci pole kapilár [Ueno, K. a kol.,Conventional column orthogonal alignment can be applied to detect the capillary field [Ueno, K. et al.,

Proceedings of the Society of Photo-Optical InstrumentationProceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation

Engineers 1997, 2985, 4-18]. Vznikají zde ale problémy s ozařováním. Pokud je rovinné pole kapilár ozařováno, například, množstvím paralelních laserových paprsků nebo do řádky zaostřeným laserovým paprskem, excitující světlo může tvořit rovinu, která je kolmá k rovině pole kapilár. S touto geometrií zde není ponechán ortogonální směr pro snímání světla. Úhel 90° mezi excitujícím a emitovaným světlem může 30 být získán nakloněním pole kapilár, ale taková konstrukce φφφ φφφ φ • φ φ φφ φφφEngineers 1997, 2985, 4-18]. However, irradiation problems arise. When the planar field of the capillaries is irradiated, for example, by a plurality of parallel laser beams or a line-focused laser beam, the exciting light may form a plane that is perpendicular to the plane of the capillary field. With this geometry, the orthogonal direction for capturing light is not left here. An angle of 90 ° between the exciting and the emitted light 30 can be obtained by tilting the capillary field, but such a construction φφφ φφφ φ •φφφφφφφφφφ

Φ φ φ · φφφ «· φφφφ φ φφφ • · φ φφφφ φ φ φ φφ φ vede na vytvořeni nadměrného rušivého světla a rovněž na problémy s účinnosti snímáni světla. Jako alternativa může být pole kapilár ozařováno jedním jediným laserovým paprskem ve stejné rovině jako je pole, přičemž tento laserový paprsek dopadá na různé kapiláry postupným způsobem [Anazawa, T. a kol., Anal. Chem. 1996, 68, 2699-2704; Yeung, E. S. a kol.,Vede φ · φ φ vede vede vede vede vede vede vede vede vede vede vede φ na vede vede vede vede vede vede na φ na φ vede vede φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ vede Alternatively, the capillary field may be irradiated with a single laser beam in the same plane as the field, the laser beam impinging on the different capillaries in a sequential manner [Anazawa, T. et al., Anal. Chem. 1996, 68, 2699-2704; Yeung, E.S. et al.,

US patent č. 5,741,411, 1998]. S touto konstrukcí může být snímací optika umístěna v 90’ vzhledem k vstupnímu paprsku. Protože ale vstupní paprsek bude dopadat na množství optických rozhraní, bude se vytvářet množství rušivého světla. Navíc, protože určitá energie laseru je ztracena na každém rozhraní, dostupná energie laseru bude rychle klesat, jak laserový paprsek postupuje skrz množství kapilár, což vede snížený fluorescenční signál. Dále, protože laserové paprsky jsou divergentní (rozbíhavé), není možné udržet přesné zaostření paprsku na prodlouženou vzdálenost.U.S. Patent No. 5,741,411, 1998]. With this design, the sensing optics can be positioned 90 'relative to the input beam. However, since the input beam will impinge on a plurality of optical interfaces, an amount of interfering light will be generated. In addition, since some laser energy is lost at each interface, the available laser energy will decrease rapidly as the laser beam progresses through a plurality of capillaries, resulting in a reduced fluorescent signal. Further, since the laser beams are divergent, it is not possible to maintain precise beam focus over an extended distance.

Výsledkem je, že určité kapiláry budou ozářeny ne tak přesně zaostřeným paprskem, což může způsobit rozšíření detekčního pásma a ztrátu separačního rozlišení elektroforézních vrcholů.As a result, certain capillaries will be irradiated with a not so precisely focused beam, which may cause widening of the detection band and loss of separation resolution of the electrophoretic peaks.

Princip souohniskového mikroskopu může být rovněž aplikován pro detekci pole kapilár [Mathies, R.A. a kol., US patent č. 5,274,240, 1993; Kheterpal, I. a kol.,The principle of a co-microscope microscope can also be applied to the detection of capillary fields [Mathies, R.A. et al., U.S. Patent No. 5,274,240, 1993; Kheterpal, I. et al.,

Electrophoresis, 1996, 17, 1852-59]. V tomto případě musí být 2 5 zaostřený laserový paprsek skenován přes pole kapilár (nebo obráceně). Je tedy potřebné použít pohyblivé části v detektoru, což není žádoucí, zejména s ohledem na požadované přísné mechanické tolerance a citlivost na vibrace. Navíc, protože laserová energie je sdílena v čase mezí všemi různými 30 kapilárami, je pracovní cyklus na kapiláru malý, což snižuje • · · * ···· · · · • · · ♦· ···· celkovou účinnost snímání světla na kapiláru. Tyto problémy jsou zvýrazněny zejména tehdy, když jsou použita velká pole kapilár.Electrophoresis, 1996, 17, 1852-59]. In this case, the focused laser beam must be scanned through the capillary field (or vice versa). Therefore, it is necessary to use moving parts in the detector, which is not desirable, especially in view of the required strict mechanical tolerances and sensitivity to vibration. In addition, since laser energy is shared between all the different 30 capillaries, the capillary duty cycle is small, reducing the overall light sensing capillary efficiency. . These problems are particularly pronounced when large capillary fields are used.

Pro detekci pole kapilár může být rovněž aplikována plášťová průtoková kyveta [Takahashi, S. a kol., Anal. Chem. 1994, 66, 1021-26; Dovichi, N. J. a kol., US patent č. 5,741,412, 1998; Takahashi, S. a kol·., US patent č.A sheath flow cell may also be applied to detect the capillary field [Takahashi, S. et al., Anal. Chem. 1994, 66, 1021-26; Dovichi, N.J. et al., U.S. Patent No. 5,741,412, 1998; Takahashi, S. et al., U.S. Pat.

5,759,374, 1998], Jsou s tím ale spojené specifické nevýhody. Opět nemůže být použito jednoduché ortogonální nastavení, jak bylo diskutováno výše. Jednou možností je ozařovat rovinné pole toků analyzátu ortogonálně s rovinou světla (například řádek zaostřeného laserového paprsku), a snímat emitované světlo ve stejné rovině jako je pole kapilár, to jest snímaní na konci vzhledem ke kapilárám. Základní optická omezení ale limitují účinnost snímání světla z rozšířené řady objektů (to jest konců kapilár). Aby se zmenšil nejdelší rozměr pole konců kapilár, je alternativou uspořádat kapiláry v třírozměrném poli, to jest ve svazku, ale potom laserový paprsek bude interagovat se vzorky přes prodlouženou vzdálenost, což může vést na rozbíhání, ztrátu zaostření a rozšíření detekčního pásma. Rovněž těsné uspořádání množství kapilár do svazku může mít za následek rozšíření pásma v důsledku neúčinné disipace Jouleova tepla. Navíc plášťová průtoková detekce ve spojení s poli kapilár přináší extrémní nároky na propracovanost, řízení a tolerance průtokového systému.5,759,374, 1998]. However, there are specific disadvantages associated with this. Again, a simple orthogonal setting cannot be used, as discussed above. One possibility is to irradiate the planar field of the analyte fluxes orthogonally to the plane of light (for example, a focused laser beam line), and to sense the emitted light in the same plane as the capillary field, i.e., the end-to-capillary sensing. However, basic optical constraints limit the efficiency of light sensing from an extended array of objects (i.e., the ends of the capillaries). In order to reduce the longest dimension of the capillary ends, it is an alternative to arrange the capillaries in a three-dimensional array, i.e. in a beam, but then the laser beam will interact with the samples over an extended distance, which can lead to divergence, loss of focus and widen the detection band. Also, the tight arrangement of a plurality of capillaries into a bundle may result in bandwidth due to inefficient dissipation of Joule heat. In addition, jacket flow detection in conjunction with capillary arrays brings extreme demands on the sophistication, control and tolerance of the flow system.

Bylo rovněž navrženo více-kapilárové zařízení pro sekvenční analýzu DNA, založené na příčném ozařování a vedení emitovaného fluorescenčního světla prostřednictvím úplného odrazu (TIR) v kapilárách [Takubo, K., JP patent č. 10019846, • · * • ···· • · • · ·· ···· ·· ·· ·A multi-capillary DNA sequencing device was also designed based on transverse irradiation and conduction of emitted fluorescence light through full reflection (TIR) in capillaries [Takubo, K., JP Patent No. 10019846. · · · · · · · · · ·

1998] . Nebyl ale navržen žádný optický potah na kapilárách, takže TIR podmínky nebudou dodrženy. Protože index lomu (Rl) gelu uvnitř kapilár ve nejpraktičtějších případech bude přibližně stejný jako Rl elektrolytického pufru, do kterého jsou ponořeny konce kapilár, většina světla bude unikat radiálně skrz obvod kapilár a nedosáhne konců kapilár. Rovněž svazkování kapilár bez optického potahu bude způsobovat vznik vážných optických přeslechů mezi kapilárami, což opět zabrání většině světla v dosažení konce kapiláry, ve které bylo emitováno. Navíc, svazkování kapilár celou cestu od injekčního konce k detekčnímu bodu bude způsobovat vznik značného Jouleova tepla, což nepříznivě ovlivní rozlišení elektroforézy.1998]. However, no optical coating on capillaries has been designed, so TIR conditions will not be met. Since the refractive index (R1) of the gel inside the capillaries in most practical cases will be approximately the same as R1 of the electrolyte buffer into which the ends of the capillaries are immersed, most light will escape radially through the perimeter of the capillaries and will not reach the ends of the capillaries. Also, bundling of capillaries without an optical coating will cause serious optical crosstalk between the capillaries, which again prevents most light from reaching the end of the capillary in which it was emitted. In addition, bundling of capillaries all the way from the injection end to the detection point will cause considerable Joule heat, which will adversely affect the electrophoresis resolution.

Vláknová optika může být rovněž použita pro přenos excitačního světla a snímání emitovaného světla [Quesada, M. A. a kol., Elektroforéza, 1996, 17, 1841-51]. Vyrovnání velkého počtu jednotlivých vláken a kapilár ale s sebou přináší obrovské množství práce. Navíc lze očekávat, Že množství rušivého světla překročí množství takového světla u souohniskového snímacího zařízení nebo u plášťové průtokové kyvety.Fiber optics can also be used to transmit excitation light and sense emitted light [Quesada, M. A. et al., Electrophoresis, 1996, 17, 1841-51]. However, balancing a large number of individual fibers and capillaries brings a huge amount of work. In addition, it is expected that the amount of interfering light exceeds the amount of such light in a co-ordinate sensing device or a casing flow cell.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Předkládaný vynález je založen na myšlence, že zařízení pro detekci jedné nebo několika fluorescenčních složek, kde uvedené složky jsou obsaženy v médiu, přičemž toto médium je obsaženo ve vedení, uvedené zařízení zahrnuje prostředek pro excitování fluorescenčních složek světlem, uvedené médium a vedení tvoří konstrukci, která je transparentní pro excitační a emitované fluorescenční světlo, *· «The present invention is based on the idea that an apparatus for detecting one or more fluorescent components, wherein said components are contained in a medium, said medium comprising a conduit, said device comprising means for exciting the fluorescent components with light, said medium and conduit forming a structure, which is transparent to excitatory and emitted fluorescent light, * · «

«*· * · · · · · · • · · · · · ··« ♦ · · · · · ·· ··«· · a uvedené zařízení zahrnuje jednu nebo několik takových konstrukcí, může být zlepšeno ponecháním alespoň části emitovaného fluorescenčního světla, aby bylo vedeno z ozařovací zóny prostřednictvím úplného odrazu (TIR) v uvedené konstrukci a snímáno z jednoho konce této konstrukce.And said device comprises one or more such constructions, may be improved by leaving at least a portion of the fluorescent emitted. light to be guided from the radiation zone by total reflection (TIR) in said structure and sensed from one end of said structure.

Takové zařízení nabízí jednoduchost a robustnost, pokud se týká mechaniky, optiky a manipulace s kapalinami, a rovněž vysokou účinnost snímání světla, nízké množství rušivého světla a snadnou upravitelnost pro detekci pole , · i ' kapilar.Such a device offers simplicity and robustness in terms of mechanics, optics and fluid handling, as well as high light sensing efficiency, low levels of interfering light, and easy adaptability to field, capillary detection.

Pro světlo postupující v materiálu s indexem lomu a dopadající na povrch materiálu s indexem lomu n₂ pod úhlem a vzhledem k normále k povrchu, dochází k TIR (úplnému odrazu} pokud:For light passing through a material with a refractive index and impinging on the surface of a material with a refractive index n ₂ at an angle and relative to the surface normal, TIR (full reflection) occurs if:

n₁.sina > n₂ n ₁ .sina> n ₂

To znamená, že n, musí být vetší než n₂. Za podmínek TIR je všechno světlo v principu odraženo zpět do prvního materiálu. Pro odraz pod úhly menšími než a je nějaké světlo odraženo a nějaké přeneseno.That is, n must be greater than n ₂ . Under TIR conditions, in principle all light is reflected back into the first material. For reflection at angles less than a, some light is reflected and some transmitted.

V jednom aspektu tedy předkládaný vynález navrhuje zařízení, jehož podstata spočívá v tom, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a koncem pro snímání světla uvedené konstrukce je dostatečně velká pro umožnění světelným 25 paprskům vystupujícím z ozařovací zóny, které nesplňují podmínky TIR, aby byly účinně odvedeny ze světlo vodící části uvedené konstrukce před dosažením konce pro snímání světla. Takové zařízení zajišťuje, že pouze světlo vedené prostřednictvím TIR skrz konstrukci bude snímáno a detekováno na konci konstrukce. Prostřednictvím použití vhodnéhoThus, in one aspect, the present invention provides a device, wherein the distance between the irradiation zone and the light sensing end of said structure is sufficiently large to allow light rays exiting the irradiation zone that do not meet the TIR conditions to be effectively removed from the irradiation zone. a light guiding portion of said structure before reaching the light sensing end. Such a device ensures that only light transmitted through the TIR through the structure will be sensed and detected at the end of the structure. Through the use of appropriate

Η 4 » « <Η 5 »« <

uspořádání většina z excitačního, primárního světla a část z rušivého (rozptýleného) světla může být přinucena, aby nesplnila podmínky pro TIR a aby byla přenesena ze světlo vodící konstrukce před dosažením konce pro snímání světla.The arrangement of most of the excitation, primary light and part of the interfering light can be forced not to fulfill the conditions for TIR and to be transferred from the light guide structure before reaching the light sensing end.

V dalším aspektu předkládaný vynález navrhuje zařízení, jehož podstata spočívá v tom, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a koncem pro snímání světla uvedené konstrukce je alespoň čtyřnásobně, nebo výhodně alespoň osminásobně, nebo obzvláště výhodně alespoň šestnáctinásobně, větší než největší průřezový rozměr světlo vodící části uvedené konstrukce. Pokud je uvedená vzdálenost čtyřikrát větší, většina ze světla, které dosáhne konce pro snímání světla, bude vystavena alespoň jednomu jevu odrazu. Protože ale vyloučení světla, které není podroben TIR, je mnohem účinnější při vícenásobných jevech odrazu, jsou mnohem výhodnější hodnoty osminásobku nebo šestnáctinásobku.In another aspect, the present invention provides a device, wherein the distance between the radiation zone and the light sensing end of said structure is at least four times, or preferably at least eight times, or particularly preferably at least 16 times, greater than the largest cross-sectional dimension of the light guiding portion. construction. If the distance is four times greater, most of the light that reaches the light sensing end will be exposed to at least one reflection effect. However, since exclusion of light not subjected to TIR is much more effective at multiple reflection phenomena, values of eight or sixteen times are more preferred.

Navíc, pokud ozařování probíhá v bezprostřední blízkosti konce pro snímání světla, rozptyl a ohyb primárního excitačního světla může v důsledku hranových jevů způsobit zvýšené úrovně rušivého světla. Dokonce, například, dobře zaostřený laserový paprsek má konečný rozsah a takové jevy mohou nastat v blízkosti ostrých hran. Předkládaný vynález poskytuje prostředek pro vyloučení takovýchto jevů.In addition, if the irradiation takes place in the immediate vicinity of the light sensing end, the scattering and bending of the primary excitation light may cause increased levels of interfering light due to edge effects. Even, for example, a well focused laser beam has a finite range, and such phenomena can occur near sharp edges. The present invention provides a means for eliminating such phenomena.

Výraz složky je použit pro označení jakékoliv fluorescenční entity, jako jsou molekuly, ionty, supramolekulární seskupení, micely, částice, nebo celé buňky nebo části buněk. Výraz médium je použít pro označení kapaliny s vysokou nebo nízkou viskozitou, polotuhého gelu, nebo tuhého materiálu. Výraz vedení je použit pro označení jakékoliv podlouhlé entity fyzicky obsahující uvedené médium, • · · · 4 4 * 4 · · • ♦ · · · ♦ 4444 4 · « φ • 4 4 4 4 4 4 « · ·· 4444 44 # 44 ·« ve které mohou být přenášeny uvedené složky, jako je například bez jakéhokoliv omezení, trubice, kapilára, sloupec, nebo kanálek vytvořený, například rovněž bez omezení, ve skle, křemenu, křemíku nebo organickém polymeru.The term component is used to refer to any fluorescent entity, such as molecules, ions, supramolecular assemblies, micelles, particles, or whole cells or parts of cells. The term medium is used to denote a high or low viscosity liquid, a semi-solid gel, or a solid material. The term conduit is used to denote any elongate entity physically containing the medium, 4444 44 # 4444 44 # 44 Wherein said components may be carried, such as, without limitation, a tube, capillary, column, or channel formed, for example, also without limitation, in glass, quartz, silicon, or organic polymer.

V jednom určitém případě je vedením separační sloupec pro CE nebo LC. Uvedené médium může nebo nemusí být transportováno uvnitř uvedeného vedení. Excitační světlo může být v ultrafialovém, viditelném, téměř infračerveném nebo infračerveném rozsahu. Výraz konstrukce je použit pro označení jakékoliv entity zahrnující a fyzicky definující uvedené vedení a uvedené médium. Termín světlo vedoucí část konstrukce označuje tu část konstrukce, která skutečně vede světlo a může označovat médium, vedení, nebo médium a vedení. Výraz transparentní znamená, že materiál musí být schopen přenášet světlo s nízkými ztrátami, to jest neabsorbuje mnoho a nerozptyluje mnoho na relevantních vlnových délkách. Výraz konec pro snímání světla konstrukce označuje ten konec konstrukce, kde vedené světelné paprsky opouštějí konstrukci a mohou být snímány a detekovány optickými prostředky. Tento režim snímání světla vylučuje odpojení světla od konstrukce prostřednictvím jakéhokoliv vnějšího optického odváděče před dosažením konce konstrukce. Příkladem takového odváděče může být optické vlákno připojené na konstrukci. V jednom určitém případě je koncem pro snímání světla jeden konec separačního sloupce pro CE nebo LC. Termín ozařovací zóna označuje místo, ve kterém excitační, primární světlo interaguje s konstrukcí a excituje fluorescenční složky.In one particular case, the line is a separation column for CE or LC. Said medium may or may not be transported within said conduit. The excitation light may be in the ultraviolet, visible, near infrared or infrared range. The term construction is used to refer to any entity comprising and physically defining said conduit and said medium. The term light-guiding portion of a structure refers to that portion of the structure that actually guides the light and may refer to a medium, a conduit, or a medium and a conduit. The term transparent means that the material must be able to transmit light with low losses, i.e. it does not absorb much and does not scatter much at the relevant wavelengths. The term light sensing end of the structure refers to that end of the structure where the guided light rays leave the structure and can be sensed and detected by optical means. This light sensing mode avoids detaching the light from the structure via any external optical trap before reaching the end of the structure. An example of such a trap is an optical fiber attached to the structure. In one particular case, the light sensing end is one end of the CE or LC separation column. The term irradiation zone refers to the site at which the excitation, primary light interacts with the construction and excites the fluorescent components.

Výhody předkládaného vynálezu budou zřejmější z následující diskuze výhodného ovlivňování různých aspektů a provedení vynálezu. Vysvětlující příklady budou převážně The advantages of the present invention will become more apparent from the following discussion of advantageously influencing various aspects and embodiments of the invention. The explanatory examples will be predominantly

• 9 *• 9 *

99

9*9 • 9 9 • 9999 * 9 • 9 9 • 999

9 ·9 ·

9« 9999 •99 9 999· 9 9 odkazovat na detekci ve spojení s CE, jak ale bude zcela zřejmé osobám v oboru znalým, předkládaný vynález není omezen pouze na tuto detekci.9 to 9999 • 99 9 999 · 9 9 to refer to detection in connection with CE, but as will be apparent to those skilled in the art, the present invention is not limited to this detection.

Následující popis příkladných provedení bude učiněn ve spojení s odkazy na připojené výkresy.The following description of exemplary embodiments will be made with reference to the accompanying drawings.

Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Obr.l znázorňuje schematický náčrtek světlo vedoucí konstrukce, ve které RI (index lomu) vedení je větší než RI média;Fig. 1 shows a schematic sketch of a light guide structure in which the RI (refractive index) of the conduit is greater than the RI of the medium;

Obr. 2 znázorňuje schematický náčrtek světlo vedoucí konstrukce, ve které RI vedení je menší než RI média;Giant. 2 shows a schematic sketch of a light guide structure in which the RI line is smaller than the RI of the medium;

Obr. 3 znázorňuje schematický náčrtek spektrálního rozkladu světla snímaného z kapilár;Giant. 3 is a schematic diagram of the spectral decomposition of light sensed from capillaries;

Obr. 4 znázorňuje diagram postupu paprsků pro světlo vystupující z různých míst ve světlo vedoucí konstrukci;Giant. 4 illustrates a beam flow diagram for light emitting from various locations in a light guiding structure;

Obr.5 znázorňuje schematický náčrtek excitačního světla zaostřeného před dosažením kapiláry;Fig. 5 shows a schematic sketch of excitation light focused before reaching the capillary;

Obr. 6 znázorňuje schematický náčrtek množství kapilár uspořádaných ve formě rovinného pole;Giant. 6 is a schematic diagram of a plurality of capillaries arranged in the form of a planar field;

Obr. 7 znázorňuje schematický náčrtek světla, které je částečně rozptýleno před dosažením rovinného pole kapilár;Giant. 7 shows a schematic sketch of light that is partially scattered before reaching a planar field of capillaries;

Obr. 8 znázorňuje schematický náčrtek rovinného pole kapilár, které jsou uspořádány do čtvercového pole na koncích pro snímání světla;Giant. 8 is a schematic diagram of a planar array of capillaries that are arranged in a square array at the light sensing ends;

• · · • » ♦ • · ♦ ·· ··· • · · · ϊ 4 · • * · * * ··«« • · · · · · • · ·· »· Ϊ ϊ ϊ ϊ 4 • * * * ϊ · ϊ · · · · · · · ·

Obr. 9 znázorňuje schematický náčrtek hustě uspořádaného pole kapilár, zobrazeného na světelném detektoru;Giant. 9 is a schematic diagram of a densely arranged array of capillaries shown on a light detector;

Obr.10 znázorňuje schematický náčrtek řídce uspořádaného pole kapilár, zobrazeného na světelném detektoru;Figure 10 is a schematic diagram of a sparsely arranged array of capillaries shown on a light detector;

Obr.11 je schematické znázornění zařízení použitého v příkladech;Fig. 11 is a schematic representation of the apparatus used in the examples;

IQ Obr.12 znázorňuje stopu fluorescenčního signálu, zaznamenaného během čerpání roztoku fluoresceinu skrz kapiláru;Fig. 12 shows a trace of the fluorescent signal recorded during pumping of the fluorescein solution through the capillary;

Obr.13 znázorňuje obrazy konce pro snímání světla kapiláry během čerpání vody respektive fluoresceinu;Fig. 13 shows images of the capillary light sensing end during pumping of water and fluorescein, respectively;

Obr.14 znázorňuje elektroferogram injekce fluoresceinu; a14 shows an electropherogram of a fluorescein injection; and

Obr.15 znázorňuje DNA sekvenci získanou se zařízením „„ podle obr. 11.Figure 15 shows the DNA sequence obtained with the device of Figure 11.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

V jednom provedení vynálezu index lomu (Rl) média, obsahujícího fluorescenční složky, je nižší než Rl vedení, obsahujícího toto médium. Navíc Rl vedení je větší než Rl materiálu obklopujícího vedení. To může být ilustrováno prostřednictvím, například, velmi běžného případu vodného roztoku v kapiláře z taveného křemenu, kde tato kapilára je obklopena, například, vzduchem nebo polymerem s nízkým Rl. V tomto případě TIR nebude probíhat na hranicí mezi médiem a vedením, ale na hranici mezi vedením a obklopujícím • · · ···* · · *· • · · · · · ···· * · · · ··· · · · » » » ·· ···· ·♦ · ·· »·« materiálem (a do určité míry na hranici mezi vedením a médiem). Absorbance obklopujícího materiálu nemusí být příliš velká a odrazový povrch obklopujícího materiálu nemusí být příliš rozptylující, protože to ovlivní nepříznivě účinnostIn one embodiment of the invention, the refractive index (R1) of the medium containing the fluorescent components is lower than the R1 conduction containing the medium. Moreover, the R1 conduit is larger than the R1 conduit material surrounding the conduit. This can be illustrated by, for example, a very common case of an aqueous solution in a fused silica capillary, where the capillary is surrounded, for example, by air or a low R1 polymer. In this case, the TIR will not take place at the boundary between the medium and the conduit, but at the boundary between the conduit and the surrounding one. · · ··· * · · ···· · · ···· · · ♦ materiál materiál materiál «« «((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( The absorbance of the surrounding material may not be too high and the reflecting surface of the surrounding material may not be too distracting, as this will adversely affect efficiency

TIR. Světlo bude vedeno jak v médiu tak i ve vedení. Příklad takového provedení je znázorněn na obr. 1, kde fluorescenční světlo, emitované z ozařovací zóny 3, je vedeno skrz vedení X a médium 2 do konce A pro snímání světla.TIR. The light will be guided both in the medium and in the leadership. An example of such an embodiment is shown in Fig. 1, where the fluorescent light emitted from the radiation zone 3 is passed through line X and the medium 2 to the light sensing end A.

Ve výhodné variantě tohoto provedení je vedení vyrobeno ze skla, taveného křemenu, křemenu nebo organického polymeru. To jsou velmi běžné a praktické konstrukční materiály pro vedení a z optického hlediska umožňují použití velkého rozsahu různých médií, včetně vody a mnoha organických rozpouštědel.In a preferred variant of this embodiment, the conduit is made of glass, fused silica, quartz or an organic polymer. These are very common and practical construction materials for conducting and, from an optical point of view, allow the use of a wide range of different media, including water and many organic solvents.

V jednom aspektu této varianty má vedení potah z organického polymeru. Potah, například, CE kapilár zajišťuje dostatečnou robustnost vedení pro většinu praktických manipulací a chrání vedení před znečištěních a poškrábáním. Navíc může tento polymerický potah vytvořit dobře definovanýIn one aspect of this variant, the conduit has an organic polymer coating. The cover, for example, CE capillaries ensures sufficient line robustness for most practical handling and protects the line from dirt and scratches. In addition, the polymeric coating may be well defined

0 optický povrch s vysokou kvalitou. Výhodně je vedení vyrobeno z taveného křemenu a potahem je fluoropolymer. Použití kapilár z taveného křemenu je dobře zavedeno v praxi CE a vysoce čistý tavený křemen je vynikajícím optickým materiálem. Fluoropolymery obecně mají nízký index lomu, což umožňuje velkou účinnost snímání světla.0 optical surface with high quality. Preferably, the conduit is made of fused quartz and the coating is a fluoropolymer. The use of fused silica capillaries is well established in CE practice and high purity fused silica is an excellent optical material. Fluoropolymers generally have a low refractive index, allowing high light sensing efficiency.

Použitím transparentního polymerického potahu s vysokou optickou kvalitou není nutné odstraňovat tento potah v ozařovací zóně. Excitační světlo může být jednoduše vedeno skrz potah a na vedení. Použitý potah nesmí být vysoce fluorescenční na použitých vlnových délkách. Nejběžnějším • · · · •··♦· · · • · *· ·«·· • · ·· ·· · potahovým materiálem pro kapiláry v CE je polyimid. Tento materiál je fluorescenční a není transparentní a musí být odstraněn před excitováním. Odstraňování potahu představuje speciální, komplikovaný krok celého procesu. Po odstranění potahu jsou kapiláry mechanicky velmi křehké a povrch kapilár je citlivý na nečistoty a poškrábání. Malé, zbývající polyimidové částice mohou způsobovat nárůst velkých hodnot rozptylu světla a fluorescence pozadí.By using a transparent polymeric coating of high optical quality, it is not necessary to remove the coating in the radiation zone. The excitation light can be simply guided through the coating and onto the guide. The coating used must not be highly fluorescent at the wavelengths used. The most common capillary coating material in CE is polyimide, the most common capillary coating material in CE. This material is fluorescent and non-transparent and must be removed before exciting. Removing the coating is a special, complicated step in the process. After removal of the coating, the capillaries are mechanically very brittle and the capillary surface is sensitive to dirt and scratches. Small, remaining polyimide particles can cause large values of light scattering and background fluorescence to increase.

V dalším aspektu předkládané varianty vynálezu vedení ¹⁰ nemá potah, ale je obklopeno kapalinou nebo plynem. Tímto způsobem může být krok potahování zcela vypuštěn. V CE kapalina může nebo nemusí být jedním z elektrolytických roztoků. Vedením může být, například, nepotažený konec potažené kapiláry. Použitím plynu je dosaženo nejnižší možné 15 hodnoty Rl okolního materiálu. To umožňuje nejúčinnější snímání světla prostřednictvím TIR a použití nej širšího rozsahu materiálů pro vedení.In another aspect of the present invention, the conduit ¹⁰ is not coated but is surrounded by a liquid or gas. In this way, the coating step can be omitted completely. In CE, the liquid may or may not be one of the electrolytic solutions. The conduit may be, for example, the uncoated end of the coated capillary. By using gas, the lowest possible Rl of the surrounding material is achieved. This allows the most efficient light sensing through TIR and the use of the widest range of guide materials.

V dalším provedení předkládaného vynálezu je Rl uvedeného média větší než Rl vedení, takže TIR probíhá na hranici mezi médiem a vedením. Tato hranice musí mít dobrou optickou kvalitu. Navíc TIR může nebo nemusí probíhat na hranici mezi vedením a materiálem obklopujícím vedení. První případ je analogický výše popisovanému provedení. V druhém případě by obklopující materiál měl být absorpční a/nebo by 25 měl mít vyšší Rl než vedení. Toto provedení umožňuje použití dalších kombinací materiálů pro vedení a médium. Příklad tohoto provedení je znázorněn na obr. 2, kde fluorescenční světlo emitované z ozařovací zóny 3 je vedeno skrz médium 2.In another embodiment of the present invention, the R1 of said medium is greater than the R1 of the conduit so that the TIR runs at the boundary between the medium and the conduit. This boundary must be of good optical quality. In addition, the TIR may or may not run at the boundary between the conduit and the material surrounding the conduit. The first case is analogous to the embodiment described above. In the latter case, the surrounding material should be absorbent and / or 25 should have a higher R1 than the conduit. This embodiment allows the use of other combinations of material for the conduit and the medium. An example of this embodiment is shown in Fig. 2, where the fluorescent light emitted from the radiation zone 3 is passed through the medium 2.

ke konci 4 pro snímání světla.to the light sensing end 4.

¹⁹ · 9 9 9 9 9 1 ’ · * 9 9 9 9999 · · « ¹ · 9 9 9 9 · < ¹⁹ · 9 9 9 9 9 1 '* 9 9 9 9999 · · « ¹ · 9 9 9 9 · <

·· ·»·9 99 9 99·· · »· 99 99 99

V jedné variantě tohoto provedení je hlavní složkou média voda a vedení je vyrobeno z organického polymeru, výhodně fluoropolymeru nebo silikonpolymeru. Tato varianta umožňuje použití jednoduchého, levného polymerického trubkoví. Protože vedení v tomto případě nevede světlo, vnější tvar a rozměry vedení nejsou v centru pozornosti. Vedením může být, například, kanálek v kusu polymerického materiálu.In one variation of this embodiment, the major component of the medium is water and the conduit is made of an organic polymer, preferably a fluoropolymer or silicone polymer. This variant allows the use of a simple, inexpensive polymeric tube. Since the guide in this case does not conduct light, the external shape and dimensions of the guide are not the focus. The conduit may be, for example, a channel in a piece of polymeric material.

V další variantě tohoto provedení je hlavní složkou média organická kapalina a vedení je vyrobeno z anorganického materiálu, výhodně ze skla, taveného křemenu, nebo křemenu. Tato varianta umožňuje použití velkého rozsahu různých médií pouze s tím omezením, že RI je větší než RI vedení. Jednou takovou myslitelnou kombinací je dimetylsulfoxid v kapiláře z taveného křemenu.In another variation of this embodiment, the main component of the medium is an organic liquid and the conduit is made of an inorganic material, preferably glass, fused quartz, or quartz. This variant allows the use of a wide range of different media only with the restriction that the RI is larger than the RI line. One such conceivable combination is dimethylsulfoxide in a fused silica capillary.

V jednom provedení vynálezu má vedení tvar dutého válce. Tento tvar je výhodný pro účinný přenos světla prostřednictvím TIR. Analogicky jako u optických vláken může být světlo přenášeno na dlouhé vzdálenosti ve válcových světelných vedeních. Válcové uspořádání je velmi běžným případem; vedením může být, například, kruhová CE kapilára,In one embodiment of the invention, the guide is in the form of a hollow cylinder. This shape is advantageous for efficient transmission of light by TIR. Analogous to optical fibers, light can be transmitted over long distances in cylindrical light guides. A cylindrical arrangement is a very common case; the lead may be, for example, a circular CE capillary,

LC sloupec, nebo kus LC nebo FIA trubkoví. Navíc je v praxi jednoduché zkonstruovat systémy s válcovými světelnými vedeními.LC column, or piece of LC or FIA tubing. Moreover, in practice it is easy to design systems with cylindrical light guides.

Pro toto provedení je možné přímo vypočítat účinnost snímání světla zařízení. Rovnice pro numerickou aperturu (N.A.) optických vláken je:For this embodiment, it is possible to directly calculate the light sensing efficiency of the device. The equation for numerical aperture (N.A.) of optical fibers is:

2, 0,5 ,n„ _ ^z v ^coating '2, 0.5, n '_ ^z v ^ coating'

N.A.ON.

• · · • «««· • » • ♦ • ♦ ► ·*·«· • ♦ ♦ ♦ · · · · ·

Tak lze například zjistit, že jiné hodnoty N.A. mohou být získány pro jiné kombinace materiálů, kde například pro světelné vedení s Rl jádra o hodnotě 1,36 (například pufr nebo hydrogel na bázi vody) a Rl potahu o hodnotě 1,31 (například fluoropolymer) je N.A. 0,37, což odpovídá optickému vláknu s velkou N.A. Zjevně může tedy zařízení podle vynálezu poskytovat odpovídající účinnost snímání světla. Navíc taková hodnota N.A. je kompatibilní s běžnou snímací optikou, jako například kondenzátorovými čočkami.For example, other N.A. can be obtained for other material combinations wherein, for example, for a light conduit with an R1 core of 1.36 (e.g., a water-based buffer or hydrogel) and an R1 coating of 1.31 (e.g., a fluoropolymer) is N.A. 0.37, which corresponds to a large N.A. Obviously, the device according to the invention can therefore provide adequate light sensing efficiency. In addition, such a N.A. is compatible with conventional sensing optics, such as capacitor lenses.

Snímací optika se stejnou nebo větší N.A. byla uváděna v některých ortogonálních a souohniskových nastaveních. Světlo, opouštějící válcovou křemíkovou kapiláru skrz válcový vnější povrch, se ale bude značně rozbíhat při průchodu rozhraní křemík/vzduch, takže skutečná účinnost snímání světla u takových systémů může být podstatně nižší.Sensing optics with equal or larger N.A. was reported in some orthogonal and co-focus settings. However, the light leaving the cylindrical silicon capillary through the cylindrical outer surface will diverge considerably as it passes through the silicon / air interface so that the actual light sensing efficiency of such systems may be considerably lower.

Ve výhodné variantě tohoto provedení je vnitřní průměr válce menší než nebo roven 500 pm, nebo je obzvláště výhodně menší než nebo roven 100 pm. To je případ, například, kapilárních sloupců a kapilárního trubkoví pro mikro-LC a proIn a preferred variant of this embodiment, the inner diameter of the cylinder is less than or equal to 500 µm, or particularly preferably less than or equal to 100 µm. This is the case, for example, of capillary columns and capillary tubing for micro-LC and pro

CE. Předkládaný vynález poskytuje tedy prostředek pro účinné snímání, vedení a detekci světla dokonce i pro trubkoví s velmi úzkým vrtáním.CE. Thus, the present invention provides a means for efficiently sensing, guiding and detecting light even for very narrow bore tubes.

V jednom provedení vynálezu je světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, spektrálně rozloženo.In one embodiment of the invention, the light that is sensed from the end of said structure is spectrally distributed.

Spektrální rozložení zlepšuje univerzálnost a selektivitu zařízení. Výhodně je spektrální rozložení provedeno prostřednictvím jednoho nebo několika hranolů, mřížek nebo optických filtrů. Může být výhodné nejprve snímat a kolimovat světlo opouštějící světlo vedoucí konstrukci prostřednictvím 30 zaostřovací optiky. Primární světlo může být odblokováno, • · · · · » · • · · · »«*·· • · · * · · • ♦ • · » • · · ·· ·*« například, interferenčními filtry nebo dolními propustmi. Příklad takového provedení je znázorněn na obr. 3, kde světlo, vystupující z kapiláry 5., je snímáno čočkou 6 a spektrálně rozloženo hranolem Ί_ před zaostřením druhou čočkouSpectral distribution improves versatility and selectivity of the device. Preferably, the spectral distribution is performed by means of one or more prisms, gratings or optical filters. It may be advantageous to first sense and collimate the light exiting the light guiding the structure through the focusing optics. The primary light may be unblocked, for example, by interference filters or low pass filters. An example of such an embodiment is shown in Fig. 3 where the light coming out of the capillary 5 is sensed by the lens 6 and spectrally distributed by the prism 7 before focusing by the second lens

6 na světelný detektor 8L6 for a light detector 8L

V jednom provedení vynálezu světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, je detekováno prostřednictvím detektoru obrazu světla, výhodně CTD nebo pole fotodiod.In one embodiment of the invention, light that is sensed from the end of said structure is detected by a light image detector, preferably a CTD or a photodiode array.

Tento obrazový detektor sestává z několika obrazových prvků detektoru a je schopen poskytnout obraz geometrického rozložení světla. Použitím takového detektoru může být získán obraz světla opouštějícího světlo vedoucí konstrukci v různých polohách a úhlech. To může být výhodné v některých případech, například, pro vyloučení rušivého světla nebo při 15 použití množství světlo vedoucích konstrukcí.The image detector consists of several image elements of the detector and is capable of providing an image of geometric light distribution. By using such a detector, an image of light leaving the light guiding the structure at different positions and angles can be obtained. This may be advantageous in some cases, for example, to avoid interfering light or when using a plurality of light guiding structures.

V jednom provedení vynálezu je světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, prostorově rozloženo, výhodně prostřednictvím použití apertury nebo prostřednictvím vyloučení části detekovaného obrazu. Apertura je běžně používána při fotografování nebo v mikroskopii pro provádění prostorově rozložené detekce světla. Obrazový detektor může provádět stejnou úlohu: pouze ty obrazové prvky, které obsahují požadovanou informaci, jsou čteny nebo ukládány do paměti, zatímco signál z ostatních obrazových prvků je 25 vyloučen. Samozřejmě, že prostorové rozlišení může být rovněž prováděno prostřednictvím selekce vhodné velikosti a umístění ne-obrazového detektoru (jako je například jedna fotodioda), ale to může být často shledáno nepraktickým.In one embodiment of the invention, the light that is sensed from the end of said structure is spatially distributed, preferably by using an aperture or by eliminating part of the detected image. Aperture is commonly used in photography or microscopy to perform spatially distributed light detection. An image detector can perform the same task: only those image elements that contain the desired information are read or stored, while the signal from the other image elements is excluded. Of course, spatial resolution can also be done by selecting the appropriate size and location of the non-image detector (such as a single photodiode), but this can often be found impractical.

3Q Příklad výhodného ovlivňování tohoto provedení je ilustrován prostřednictvím výpočtu postupu paprsků, který je • · • ♦ · • · · ·· ·»»· • · · « i ’ϊ • ··«« φφφ φ • ♦ · · φ ♦ ·· ·· znázorněn diagramem na obr. 4. Výpočet je proveden pro válcové vedení s vnějším průměrem 375 pm, vnitřním průměrem 100 pm, RI 1,46, které je naplněno médiem s RI 1,36 ve vnitřním kanálku, a které je obklopeno vzduchem. Na obr. 4a je znázorněn diagram výpočtu postupu paprsků, provedeného pro množství světelných paprsků vystupujících ze středu konstrukce, což je případ emitování fluorescenčního světla ve vnitřním kanálku. Tento obrázek, ilustrující průřez kapiláry, znázorňuje rozložení dovnitř odražených světelných paprsků uvnitř kapiláry v určité vzdálenosti od ozařovací zóny.An example of an advantageous effect of this embodiment is illustrated by calculating the beam progression, which is φ · φ · φ · · φ · i · φ · · ·· shown in the diagram in Fig. 4. The calculation is performed for a cylindrical guide with an outer diameter of 375 pm, an inner diameter of 100 pm, RI 1.46, which is filled with medium with RI 1.36 in the inner channel and surrounded by air . FIG. 4a is a diagram of the calculation of the beam path performed for a plurality of light beams extending from the center of the structure, as is the case for emitting fluorescent light in the inner channel. This illustration, illustrating the cross-section of the capillary, shows the distribution of the reflected light rays within the capillary at a distance from the radiation zone.

Paprsky postupují převážně v blízkosti středu kapiláry a intenzita světla je zejména vysoká uvnitř gelem naplněného, vnitřního kanálku. Obr. 4b znázorňuje diagram stejného výpočtu pro množství paprsků vystupujících z místa v blízkosti vnějšího povrchu konstrukce, což případ rušivého (rozptýleného) primárního světla dopadajícího na vnější povrch. Paprsky postupují převážně v blízkosti obvodu kapiláry. Zobrazením konce konstrukce na obrazovém detektoru a selekcí pouze těch obrazových prvků, které pokrývají středovou oblast, může být rozptýlené rušivé světlo do značné míry vyloučeno, zatímco současně se velmi účinně snímá fluorescenční světlo. Zjevně tedy předkládaný vynález poskytuje prostředek pro účinné oddělení rušivého světla, vystupujícího z oblastí vně média, od fluorescenčního světla, vystupujícího z vnitřku média, prostřednictvím prostorového rozlišení s použitím nastavení uvedeného v příkladu nebo jednoho z množství jiných nastavení.The rays progress predominantly near the center of the capillary, and the intensity of light is particularly high inside the gel-filled, internal channel. Giant. 4b shows a diagram of the same calculation for a plurality of beams emanating from a location near the outer surface of the structure, which is the case of interfering primary light incident on the outer surface. The rays proceed mainly near the perimeter of the capillary. By displaying the end of the structure on the image detector and selecting only those pixels that cover the central region, diffused interfering light can be largely avoided, while at the same time fluorescent light is captured very effectively. Obviously, the present invention provides a means for effectively separating interfering light emitted from areas outside the medium from fluorescent light emitted from the interior of the medium through spatial resolution using the settings shown in the example or one of a number of other settings.

V jednom provedení vynálezu je excitačním světlem světlo z laseru. Lasery mají tu výhodu, že mají vysokou intenzitu světla a zároveň dobře definované excitační vlnové • » • 4 4In one embodiment of the invention, the excitation light is laser light. Lasers have the advantage that they have a high light intensity and at the same time a well-defined excitation wave • »• 4 4

944 94 4945 94 4

4 44 4

44 «· *44 «· *

• ·• ·

4949 délky. Navíc může být laserové světlo snadno zaostřeno na velmi malé rozměry, což je výhodné ve spojení s úzkými kapilárami. Pro účely předkládaného vynálezu poskytuje vysoce kolimované světlo z laseru ještě speciální výhodu: geometrie ozařování může být snadno řízena a množství primárního světla ve vazbě se světelným vedením prostřednictvím TIR může být udržováno velmi malé.4949 lengths. In addition, laser light can be easily focused to very small dimensions, which is advantageous in conjunction with narrow capillaries. For the purposes of the present invention, highly collimated laser light provides a special advantage: the geometry of the irradiation can be easily controlled and the amount of primary light in association with the TIR light guide can be kept very small.

V jednom provedení vynálezu je excitační světlo zaostřeno ve směru paralelním se směrem vedení emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené světlo vedoucí konstrukce. Výhodně by šířka excitačního paprsku (v uvedeném směru) měla být menší než 500 pm a zvláště výhodně by měla být menší než 200 pm. Například pro diskrétní kapiláru je světlo zaostřeno v axiálním směru, což je stejný směr, kterým 15 je světlo vedeno. Ve většině případů tento směr splývá se směrem přenosu vzorku ve vedení. Je důležitá malá axiální excitační délka a malý excitační objem, například v CE, kde účinnost separace je vysoká a analytická pásma jsou velmi úzká. Navíc excitační světlo může nebo nemusí být zaostřenoIn one embodiment of the invention, the excitation light is focused in a direction parallel to the direction of conduction of the emitted fluorescent light along said light-guiding structure. Preferably, the width of the excitation beam (in said direction) should be less than 500 µm and particularly preferably it should be less than 200 µm. For example, for a discrete capillary, the light is focused in the axial direction, which is the same direction in which the light is guided. In most cases, this direction coincides with the direction of sample transfer in the conduit. A small axial excitation length and a small excitation volume are important, for example in CE, where the separation efficiency is high and the analytical bands are very narrow. In addition, the excitation light may or may not be in focus

0 ve dvou směrech prostřednictvím běžné, kruhové čočky. Pro množství kapilár a jiných konstrukcí může být světlo zaostřeno pouze v jednom směru (řádkové zaostření) prostřednictvím válcové čočky. Příklad tohoto provedení je znázorněn na obr. 5, kde je excitační světlo zaostřeno 25 prostřednictvím čočky 9 před dosažením kapiláry 5. Obousměrná šipka znázorňuje směr, ve kterém je světlo vedeno v kapiláře.0 in two directions through a conventional, circular lens. For a number of capillaries and other constructions, light can be focused in only one direction (line focus) by means of a cylindrical lens. An example of this embodiment is shown in Fig. 5 where the excitation light is focused 25 through the lens 9 before reaching the capillary 5. The two-way arrow shows the direction in which the light is guided in the capillary.

V jednom provedení vynálezu je úhel mezi směrem šíření excitačního světla a směrem vedení emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené světlo vedoucí ³⁰ konstrukce dostatečně velký, výhodně ortogonální nebo téměř • · · 9 9 • · 999« 9 9 • 9 • 9 •· ·*·· ortogonální, pro zabránění tomu, aby jakákoliv ne-rozptýlená složka excitačního světla byla opticky spřažena do směru vedení světlo vedoucí konstrukce prostřednictvím úplného odrazu. Aby se udržela úroveň rušivého rozptýleného světla nízká, mělo by být množství primárního, excitačního světla spřaženého do světelného vedení prostřednictvím TIR udržováno tak nízko, jak jen je možné. Zjevnou cestou pro dosažení tohoto úkolu je udržení úhlu a pro excitační světlo na tak malé hodnotě, jak jen je možné, což odpovídá ortogonálnímu nebo téměř ortogonálnímu ozařování. Pro dobře kolimovaný paprsek a nízký úhel a je možné (při ignorování rozptylu světla) udržet množství primárního světla spřaženého prostřednictvím TIR na extrémně nízké hodnotě.In one embodiment of the invention, the angle between the direction of propagation of the excitation light and the direction of conduction of the emitted fluorescent light along said light-guiding structure ³⁰ is sufficiently large, preferably orthogonal or nearly 999 · 9 · 9 · 9 · 9 · 9 · 9 Orthogonal, to prevent any non-scattered component of the excitation light from being optically coupled to the direction of the light guiding structure by complete reflection. In order to keep the level of distracting scattered light low, the amount of primary excitation light coupled to the light guide by the TIR should be kept as low as possible. The obvious way to accomplish this is to keep the angle and for excitatory light as low as possible, which corresponds to orthogonal or near orthogonal irradiation. For a well collimated beam and low angle α, it is possible (while ignoring light scattering) to keep the amount of primary light coupled by TIR at an extremely low value.

V jednom provedení vynálezu je množství uvedených konstrukcí uspořádáno ve formě pole, výhodně rovinného nebo téměř rovinného pole, v ozařovací zóně. To může být případ, například multiplexované CE. Protože světlo je vedeno prostřednictvím TIR uvnitř každé samostatné konstrukce, je předkládaný vynález velmi vhodný pro detekci pole.In one embodiment of the invention, a plurality of said structures are arranged in the form of a field, preferably a planar or near planar field, in the irradiation zone. This may be the case, for example, multiplexed CE. Since light is guided by TIR within each separate structure, the present invention is very suitable for field detection.

00

Předkládaný vynález má několik výhod, pokud se týká takové multiplexované detekce, jak ostatně bude diskutováno níže. Příklad takového provedení lze nalézt na obr. 6, kde je množství kapilár £ uspořádáno ve formě rovinného pole, jak je znázorněno v různých pohledech.The present invention has several advantages with respect to such multiplexed detection, as moreover will be discussed below. An example of such an embodiment can be found in Fig. 6, where a plurality of capillaries 6 are arranged in the form of a planar field, as shown in different views.

V jedné variantě tohoto provedení je excitační světlo prostorově rozloženo přes uvedené pole. Tato varianta je obzvláště výhodná ve spojení s rovinnými poli. Směr excitačního světla je ortogonální nebo téměř ortogonální vzhledem k rovinnému poli. Světlo je geometricky rozloženo ³⁰ přes pole, výhodně prostřednictvím jedné nebo několika čoček, • φ ·· φφφφ ·· · • · · φ φ φ • · · φφφφ » φ φ • · φ φ φ ·· · φφ rozšiřovače paprsku nebo ohybového tvarovače paprsku. Světlo může nebo nemusí být zaostřeno ve směru ortogonálním vzhledem ke směru rozložení, například prostřednictvím válcové čočky. Tato geometrie ozařování poskytuje velmi jednoduché a čisté ozáření: excitační světlo prochází skrz velmi málo optických povrchů, což má za následek malé množství rozptylového nebo rušivého světla. Naproti tomu excitační světlo, postupující v rovině rovinného pole, bude dopadat na množství konstrukcí postupným způsobem a bude procházet mnoha optickými povrchy, což způsobuje nárůst velkého množství rozptylového čí rušivého světla. Navíc, přestože laserové paprsky mohou být úzce zaostřeny, laserové paprsky jsou rozbíhavé. Čím úžeji je laserový paprsek zaostřen, tím rozbíhavějším se stává. Aby se udržela axiální excitační délka nebo excitační objem malý, je podstatné udržet interakční délku mezi paprskem a množstvím konstrukcí malou. To je dosaženo, když je excitační délka ortogonální nebo téměř ortogonální vzhledem k rovinnému poli, ale ne když paprsek dopadá na množství konstrukcí postupným způsobem. Příklad této varianty je znázorněn na obr. 7, kde světlo z laseru 10 je prostorově rozloženo do dvou rozměrů prostřednictvím rozšiřovače 11 paprsku a zaostřeno do jednoho rozměru prostřednictvím válcové čočky 12 před dosažením rovinného pole kapilár 5.. Vyšrafované oblasti znázorňují přibližný rozsah laserového paprsku z různých pohledů.In one variation of this embodiment, the excitation light is spatially distributed over said field. This variant is particularly advantageous in connection with planar fields. The direction of excitation light is orthogonal or almost orthogonal to the planar field. The light is geometrically distributed ³⁰ across the array, preferably through one or more lenses. beam. The light may or may not be focused in an orthogonal direction to the direction of distribution, for example by means of a cylindrical lens. This irradiation geometry provides very simple and clean irradiation: excitatory light passes through very few optical surfaces, resulting in a small amount of diffuse or interfering light. In contrast, excitation light traveling in the plane of a planar field will impinge on a plurality of constructions in a sequential manner and will pass through many optical surfaces, causing an increase in a large amount of diffuse or interfering light. In addition, although the laser beams can be narrowly focused, the laser beams are divergent. The more closely the laser beam is focused, the more divergent it becomes. In order to keep the axial excitation length or excitation volume small, it is essential to keep the interaction length between the beam and the plurality of constructions small. This is achieved when the excitation length is orthogonal or nearly orthogonal to the planar field, but not when the beam impinges on a plurality of constructions in a sequential manner. An example of this variation is shown in Fig. 7, where the laser light 10 is spatially distributed to two dimensions by a beam expander 11 and focused to one dimension by a cylindrical lens 12 before reaching the plane field of the capillaries 5. The shaded areas show the approximate laser beam of different views.

55

V další variantě tohoto provedení je excitační světlo skenováno přes uvedené pole. Opět může být směr excitačního světla ortogonální nebo téměř ortogonální vzhledem k rovinnému poli. Tímto způsobem je excitační světlo síleno mezi různými konstrukcemi v čase spíše než aby bylo sdíleno v prostoru. Světlo je výhodně zaostřeno ve dvou směrech φ φ • · · * φ φ •Φ φφφφ • φ φ φ • φ φφφφ • φ φ φφ · • · φ • φ φ • · φ ·· φφφ prostřednictvím jedné nebo několika běžných, kruhových čoček. Bud' může být skenován světelný paprsek, nebo může být skenováno pole. Jednou alternativou je umístit množství konstrukcí v kruhovém poli a otáčet optiku uvnitř tohoto pole. Tato varianta má stejné výhody jako předcházející varianta. Je rovněž možné použít kombinace těchto dvou variant, například skenovací systém v kombinaci s ohybovým děličem paprsku.In another variation of this embodiment, the excitation light is scanned through said field. Again, the direction of excitation light may be orthogonal or nearly orthogonal to the planar field. In this way, excitation light is amplified between different constructions over time rather than being shared in space. The light is preferably focused in two directions by means of one or more conventional, circular lenses. . Either the light beam can be scanned or the field can be scanned. One alternative is to place a number of structures in a circular array and rotate the optics within that array. This variant has the same advantages as the previous variant. It is also possible to use combinations of these two variants, for example a scanning system in combination with a bending beam splitter.

V jednom provedení vynálezu konce pro snímání světla θ uvedeného pole, výhodně rovinného nebo téměř rovinného, konstrukcí jsou geometricky přeuspořádány tím způsobem, že je to výhodné pro účinné snímání světla, výhodně ve formě dvojrozměrného pole. Základní optická omezení limitují účinné snímání světla z rozšířeného rovinného pole, například, konců ,In one embodiment of the invention, the light sensing ends θ of said field, preferably planar or almost planar, of the structures are geometrically rearranged in such a way that it is advantageous for efficient light sensing, preferably in the form of a two-dimensional field. Basic optical constraints limit the effective sensing of light from an extended planar field, for example,

kapilár. Čočky s vysokou numerickou aperturou snímají vysoce účinně z lokalizované oblasti; čočky s nízkou numerickou aperturou mají menší účinnost snímání, ale širší záběr pohledu. Prostřednictvím přeuspořádání konců konstrukcí, například kapilár, do mnohem kompaktnější formy, například θ čtvercového, obdélníkového, nebo jiného mnohostranného pole, se stává možným snímat světlo z většího počtu konstrukcí s vysokou účinností. Jako příklad může být uvedeno, že hustě uspořádané rovinné pole se 100 CE kapilárami s vnějším průměrem 0,5 mm je široké 50 mm a způsobuje potíže, pokud se týká snímání světla. Na druhou stranu, pokud jsou konce kapilár přeuspořádány do hustě uspořádaného čtvercového pole, jeho největší rozměr bude potom pouze 5 mm, což usnadňuje podstatně účinné snímání světla. Prostřednictvím využití principů pro vedení světla podle předkládaného vynálezu je θ možné přeuspořádat geometrické nastavení množství konstrukcí • » · • ···· • · · ·· · ·· ··· • * • · * • 9 ·♦·· mezi ozařovací zónou a konci pro snímání světla. Množství kapilár, například z taveného křemene, může být snadno přeuspořádáno z rovinného pole na čtvercové pole na vzdálenosti několika centimetrů prostřednictvím mírného ohnutí kapilár. Takové mírné ohnutí podstatně neovlivní schopnost kapilár vést světlo. Uspořádání množství konstrukcí do dvojrozměrného pole již v ozařovací zóně způsobí problémy, pokud se týká zaostření laserových paprsků na prodloužené vzdálenosti a pokud se týká rozptylu světla, způsobeného excitačním světlem dopadajícím na mnoho optických povrchu, jak bylo diskutováno výše. Příklad tohoto provedení je znázorněn na obr. 8, kde je množství kapilár 5. uspořádáno v rovinném poli v ozařovací zóně 3., ale přeuspořádáno do čtvercového pole na koncích 4, pro snímání světla.capillaries. Lenses with high numerical aperture pick up highly efficiently from the localized area; Lenses with a low numerical aperture have less scanning efficiency, but a wider viewing range. By rearranging the ends of structures, such as capillaries, into a much more compact form, such as θ of square, rectangular, or other multifaceted field, it becomes possible to sense light from multiple structures with high efficiency. By way of example, a densely arranged planar array with 100 CE capillaries with an outer diameter of 0.5 mm is 50 mm wide and causes problems in terms of light sensing. On the other hand, if the ends of the capillaries are rearranged into a densely arranged square array, its largest dimension will then be only 5 mm, which facilitates substantially efficient light capture. By utilizing the light guiding principles of the present invention, it is possible to rearrange the geometrical adjustment of the plurality of structures between the irradiation zone. and a light sensing end. A plurality of capillaries, for example, fused quartz, can easily be rearranged from a planar field to a square field over a distance of a few centimeters by slightly bending the capillaries. Such a slight bending will not substantially affect the ability of the capillaries to conduct light. Arranging a plurality of structures in a two-dimensional field already in the radiation zone will cause problems with regard to focusing the laser beams over extended distances and with respect to light scattering caused by excitatory light incident on many optical surfaces, as discussed above. An example of this embodiment is shown in Fig. 8, where a plurality of capillaries 5 are arranged in a planar field in the radiation zone 3, but rearranged in a square field at the ends 4, for sensing light.

Je možné uvést, že husté uspořádání mnoha kapilar obecně způsobuje rozšíření pásma v důsledku neúčinné disipace Jouleova tepla spojeného se separacemi v CE. V předkládaném případě jsou ale kapiláry hustě uspořádány pouze za místem excitace, takže Jouleovo teplo neovlivní účinnost měřené separace.It can be noted that the dense arrangement of many capillaries generally causes bandwidth expansion due to inefficient dissipation of Joule heat associated with the CE separations. In the present case, however, the capillaries are densely arranged only beyond the excitation site, so that the Joule heat does not affect the efficiency of the measured separation.

V jedné variantě tohoto provedení je uvedené dvojrozměrné pole hustě uspořádáno a snímané světlo je spektrálně rozloženo prostřednictvím jednoho nebo několika optických filtrů. Pokud je hustě uspořádané dvojrozměrné pole zobrazeno na povrch obrazového detektoru, může obraz zaujímat značnou kontinuální plochu na povrchu a nemusí zde zůstat dostatek prostoru na povrchu pro disperzí vlnových délek jednotlivých konstrukcí v jednom rozměru prostřednictvím, například hranolu nebo mřížky. V tomto případě můře být spektrální rozložení získáno prostřednictvím jednoho neboIn one variation of this embodiment, said two-dimensional field is densely arranged and the sensed light is spectrally distributed by one or more optical filters. When a densely ordered two-dimensional array is displayed on the surface of an image detector, the image may occupy a considerable continuous surface area and there may not be enough surface space to disperse the wavelengths of the individual structures in one dimension by, for example, a prism or grid. In this case, the spectral distribution can be obtained by means of one or two

44

4444 ·4444 ·

• 4 · i · Í Í • · 4444 44 · • · 4 4 4 ·· 4 44• 4444 44 • 4 4 4

444 několika filtrů, například jedné nebo několika horních či dolních propustí nebo interferenčních filtrů. Filtry mohou být uspořádány, například jako sled filtrů [Kheterpal, I. a kol., Electrophoresis, 1996, 17, 1852-59] nebo na otáčejícím se filtračním kole. Příklad této varianty je znázorněn na obr. 9. Obr. 9a ilustruje množství kapilár 5, které jsou hustě uspořádány. Obr. 9b ilustruje světlo z kapilár 5, snímané čočkou 6, a vedené skrz filtr 13 na otočném filtračním kole před zobrazením na detektoru 8., Obr. 9c znázorňuje obraz pole kapilár na detektoru v jednom definovaném okamžiku.444 several filters, for example one or more high or low pass filters or interference filters. The filters may be arranged, for example, as a sequence of filters [Kheterpal, I. et al., Electrophoresis, 1996, 17, 1852-59] or on a rotating filter wheel. An example of this variant is shown in Fig. 9. 9a illustrates a plurality of capillaries 5 that are densely arranged. Giant. 9b illustrates the light from the capillaries 5 sensed by the lens 6 and passed through the filter 13 on the rotary filter wheel before being displayed on the detector 8. FIG. 9c shows an image of a capillary array on a detector at a defined time.

V další variantě tohoto provedení je uvedené dvojrozměrné pole dostatečně řídké pro umožnění, aby snímané světlo bylo spektrálně rozloženo na povrchu obrazového detektoru prostřednictvím jednoho nebo několika hranolů nebo 15 mřížek. Obraz na povrchu obrazového detektoru se stava dostatečně řídkým, takže je zde prostor v obrazu jednotlivých konstrukcí pro spektrální rozlišení v jednom směru. Příklad této varianty je znázorněn na obr. 10. Obr. 10a ilustruje množství kapilár 5., které jsou řídce uspořádány. Obr. 10bIn another variation of this embodiment, said two-dimensional field is sufficiently thin to allow the sensed light to be spectrally distributed on the surface of the image detector by means of one or more prisms or 15 gratings. The image on the surface of the image detector becomes thin enough so that there is space in the image of the individual structures for spectral resolution in one direction. An example of this variant is shown in Fig. 10. 10a illustrates a plurality of capillaries 5 that are sparsely arranged. Giant. 10b

0 znázorňuje světlo z kapilár, snímané čočkou 6. a vedene skrz hranol 1 před zobrazením na detektoru 8.. Obr. 10c ilustruje spektrálně rozložený obraz pole kapilár na detektoru. Kruhové obrazy jednotlivých kapilár jsou roztaženy v důsledku zobrazení různých barev na různých místech na detektoru.0 shows the light from the capillaries sensed by the lens 6 and guided through the prism 1 before being displayed on the detector 8. FIG. 10c illustrates a spectrally spaced image of a capillary array on a detector. The circular images of the individual capillaries are stretched due to the display of different colors at different locations on the detector.

²⁵²⁵

V jednom provedení vynálezu, využívajícím množství uvedených konstrukcí, mohou být jednotlivé konstrukce identifikovány spřažením světla prostřednictvím úplného odrazu do konstrukcí v nějakém bodě jiném, než je konec pro snímání světla, a snímáním světla z konců pro snímání světla 30 uvedených konstrukcí. Pokud například je velké množství CE • · • · • · ·· *In one embodiment of the invention, utilizing a plurality of said structures, the individual structures may be identified by coupling the light by fully reflecting into the structures at a point other than the light sensing end and sensing light from the light sensing ends 30 of said structures. For example, if there is a large number of CEs

···♦ «·· kapilár uspořádáno dohromady do svazku a zobrazeno na konci pro snímání světla, může být obtížné identifikovat, který injekční konec přísluší ke specifickému zobrazenému konci pro snímání světla. Prostřednictvím nasvícení světla, například ze svítící diody (LED), na každou kapiláru v určitém okamžiku na injekčním konci, ponechání tohoto světla, aby bylo vedeno ke konci pro snímání světla prostřednictvím TIR, a monitorování obrazu na detektoru může být tento problém vyřešen. Stává se tedy možným uspořádat do svazku velký počet kapilár dohromady ne-systematickým a náhodným způsobem a identifikovat jednotlivé kapiláry následně potom.Arranged in a bundle and displayed at the light sensing end, it may be difficult to identify which injection end belongs to the specific light sensing end shown. By illuminating a light, for example from a light emitting diode (LED), to each capillary at some point at the injection end, leaving that light to be led to the light sensing end via TIR, and monitoring the image on the detector can solve this problem. Thus, it becomes possible to arrange a large number of capillaries together in a non-systematic and random manner and identify the individual capillaries subsequently.

Navíc k tomu, co bylo vysvětleno výše, je zcela zřejmé, že zařízení podle předkládaného vynálezu ve srovnání s sloupcovým ortogonálním optickým nastavením poskytuje jednoduchý a účinný prostředek pro dosažení vysoké účinnosti snímání světla a pro separaci primárního světla a rušivého rozptylového světla od emitovaného fluorescenčního světla, zejména ve spojení s multiplexovanou detekcí. Ve srovnání se souohniskovým mikroskopem není ohnisková vzdálenost kritickáIn addition to what has been explained above, it is clear that the device of the present invention provides a simple and efficient means for achieving high light sensing efficiency and separating primary light and interfering scattering light from emitted fluorescent light compared to the column orthogonal optical adjustment, especially in conjunction with multiplexed detection. The focal length is not critical compared to a co-focus microscope

0 a tak je podstatně vyšší robustnost s ohledem na mechanické tolerance, optické vyrovnání a, například, vibrace. Pro multiplexovanou detekci nejsou potřebné žádné pohybující se části pro předkládaný vynález. Ve srovnání s plášťovou průtokovou kyvetou předkládaný vynález neukládá tak vysoké požadavky na propracovanost řešeni, řízení a tolerance průtokového systému, a tak nabízí podstatně vyšší stupeň robustnosti. Navíc toto zařízení podle předkládaného vynálezu nabízí jednoduché řešení problému ozařování množství kapilár.Thus, the robustness is considerably higher with respect to mechanical tolerances, optical alignment and, for example, vibration. No moving parts for the present invention are required for multiplexed detection. Compared to a casing flow cell, the present invention does not impose such high demands on the sophistication of the solution, control and tolerance of the flow system, and thus offers a significantly higher degree of robustness. Moreover, the device of the present invention offers a simple solution to the problem of irradiating a plurality of capillaries.

Úplně odražené světlo může být v principu odpojeno od konstrukce skrz její obvod prostřednictvím vnějšího optického • 9 *· 9999The fully reflected light can in principle be disconnected from the structure through its perimeter by means of an external optical • 9 * · 9999

999 • · · * * 9 • · 9 9999 <9 φ • 9 · 9 9 ·· 9 .· odváděče a snímáno před dosažením konce konstrukce. Takovým odváděčem může být například optické vlákno připojené na konstrukci. Takové odpojení nebo odvedení má ale několik nevýhod. Konstrukce nesmí být potažena nebo potah musí být odstraněn v místě odvádění. RI média nesmí být vyšší, než je RI vedení. Optické odvedení neposkytuje jakýkoliv prostředek pro vyloučení rušivého rozptýleného světla, podobně jako například plášťová průtoková kyveta a souohniskový mikroskop. Protože prostorová informace je ztraceno při odvedení, je vyloučení rušivého rozptylového světla nemožné prostřednictvím prostorového rozlišení. Navíc, protože rušivé rozptylové světlo může postupovat převážně v blízkosti obvodu konstrukce a fluorescenční světlo převážně v blízkosti středu, může odvádění skrz obvod konstrukce vést na zvýšení množství rušivého rozptylového světla. Navíc také optické vyrovnání velkého počtu odváděčů s množství konstrukcí s sebou přináší obrovské množství práce a odváděče mohou zabírat značné množství prostoru, což způsobuje, že oto uspořádání je méně vhodné pro multiplexovanou detekci.999 • · * * 9 • · 9 9999 <9 φ • 9 · 9 9 ·· 9. · Trap and sensed before reaching the end of the structure. Such a trap may be, for example, an optical fiber attached to the structure. However, such a disconnection or removal has several disadvantages. The structure must not be coated or the coating must be removed at the drainage point. The media RI must not be higher than the line RI. Optical evacuation does not provide any means to eliminate interfering scattered light, such as a jacketed flow cell and co-microscope. Since spatial information is lost when being discharged, the elimination of interfering scattering light is impossible through spatial resolution. In addition, since the interfering scattering light can proceed predominantly near the periphery of the structure and the fluorescent light predominantly near the center, discharging through the periphery of the structure can lead to an increase in the amount of interfering diffuse light. In addition, the optical alignment of a large number of traps with a number of designs entails a huge amount of work and the traps can occupy a considerable amount of space, making the arrangement less suitable for multiplexed detection.

00

Existuje několik aplikací zařízení podle předkládaného vynálezu. Bude uvedeno pár příkladů, ale využitelnost není omezena pouze na tyto příklady a další aplikace budou zcela zřejmé pro osoby v oboru znalé. Zařízení může být použito pro detekci složek s přirozenou fluorescencí 2 5 a rovněž složek označených jedním nebo několika fluorofory. Přirozená fluorescence v UV oblasti je vykazována, například, aminokyselinami tryptofan a tyrosin. Označování se dvěma fluorofory může odkazovat například na použití fluoroforů s přenosem energie, s jedním dárcovským a jedním přijímacím fluoforem [Ju, J. a kol., Nátuře Medicíně 1996, 2, 246-49].There are several applications of the device of the present invention. A few examples will be given, but utility is not limited to these examples, and other applications will be apparent to those skilled in the art. The device can be used to detect components with natural fluorescence 25 as well as components labeled with one or more fluorophores. Natural fluorescence in the UV region is exhibited, for example, by the amino acids tryptophan and tyrosine. Labeling with two fluorophores may refer, for example, to the use of energy transfer fluorophores, with one donor and one receiving fluorophore [Ju, J. et al., Nature Medicine 1996, 2, 246-49].

• 4• 4

Zařízení může být použito pro detekci ve spojení s jakoukoliv metodou zahrnující přenos uvedených složek přes ozařovací zónu uvnitř uvedeného vedení. Takové metody jsou zcela běžné při chemické a biochemické analýze. Vzorek může být, například, přenášen uvnitř délky kapilárního trubkoví prostřednictvím tlaku, elektroosmotického proudění, nebo migrace v elektrickém poli. Zařízení může být, například, použito pro detekci ve spojení s kapilární elektroforézou, včetně kapilární zónové elektroforézy, kapilární gelové elektroforézy, micelární elektrokinetické kapilární chromatografie a kapilárního izoelektrického zaostřování, kapilární elektrochromatografie, kapalné chromatografie, nebo průtokové injekční analýzy. Zařízení může být použito pro detekci ve spojení s analýzou nukleových kyselin, například ve spojení se sekvenční analýzou DNA. Jednou obzvláště zajímavou aplikací je vysokokapacitní sekvenční analýza DNA prostřednictvím CE v polích kapilár.The device may be used for detection in conjunction with any method comprising transferring said components through an irradiation zone within said conduit. Such methods are quite common in chemical and biochemical analysis. For example, the sample may be transferred within the length of the capillary tube by pressure, electroosmotic flow, or migration in an electric field. For example, the device may be used for detection in conjunction with capillary electrophoresis, including capillary zone electrophoresis, capillary gel electrophoresis, micellar electrokinetic capillary chromatography and capillary isoelectric focusing, capillary electrochromatography, liquid chromatography, or flow injection analysis. The device may be used for detection in conjunction with nucleic acid analysis, for example in conjunction with DNA sequence analysis. One particularly interesting application is high-capacity DNA sequencing analysis by CE in capillary fields.

Způsob podle vynálezu bude v následujícím popisu ilustrován prostřednictvím neomezujících příkladů.The process of the invention will be illustrated in the following description by way of non-limiting examples.

PŘÍKLADYEXAMPLES

Zařízení, použité v příkladech, je znázorněno na obr. 11. Ve všech příkladech byly použity fluoropolymerem potažené válcové kapiláry 14 z taveného křemenu s vnitřním průměrem 100 pm a s vnějším průměrem 375 pm (TSU100375, Polymicro, Phoenix, Arizona, USA). Injekční konec kapiláry byl uložen do kapalinou naplněné komory 15. Světlo z argonového iontového laseru 16 (2013-150ML, Uniphase, San Jose, California, USA) , vyzařujícím převážně na 488 a 514 nm, bylo zaostřeno Čočkou 17 a ozařovalo kapiláru pod úhlem 90°. Energie laseru, dopadající na kapiláru, byla odhadnuta na přibližně 3 mW.The apparatus used in the examples is shown in FIG. 11. In all examples, fluoropolymer coated cylindrical capillaries 14 of fused quartz having an inside diameter of 100 µm and an outside diameter of 375 µm were used (TSU100375, Polymicro, Phoenix, Arizona, USA). The injection end of the capillary was placed in a liquid-filled chamber 15. Argon ion laser light 16 (2013-150ML, Uniphase, San Jose, California, USA), emitting predominantly at 488 and 514 nm, was focused by Lens 17 and illuminated the capillary at 90 degrees °. The laser energy incident on the capillary was estimated to be approximately 3 mW.

Polymerický potah nebyl odstraněn v ozařovací zóně. Axiální ozařovací délka laseru v kapiláře byla odhadnuta na 25 pm a detekční objem byl tedy odhadnut na 0,2 nl. Světlo bylo vedeno přibližně 5 cm ke konci kapiláry, který byl umístěn do kapalinou naplněné komory 18. Světlo vystupující z konce kapiláry bylo snímáno na konci prostřednictvím kondenzátorové čočky 19 (063098, Spindler & Hoyer, Gottingen, Germany). Primární světlo bylo odfiltrováno jednou nebo dvěma skleněnými dolními propustmi 20 (OG 530, Schott Glaswerke, Mainz, Germany). Světlo bylo snímáno prostřednictvím 50mm objektivu 21 kamery (Series E 1/1.8, Nikon, Tokyo, Japan) na povrch CCD 22 (TE/CCD-1024-TKB/1, Princeton Instruments, Trenton, New Jersey, USA). V některých experimentech byl mezi skleněný filtr (dolní propust) a objektiv kamery (fotografického přístroje) vložen hranol 23 (336675, Spindler & Hoyer) pro dosažení spektrálního rozložení. Snímané obrazy byly ukládány a vyhodnocovány prostřednictvím softwaru WinView (Princeton Instruments) a PC kompatibilním s IBM.The polymer coating was not removed in the radiation zone. The axial irradiation length of the capillary laser was estimated to be 25 µm and the detection volume was therefore estimated to be 0.2 µl. Light was guided approximately 5 cm to the end of the capillary, which was placed in the liquid-filled chamber 18. Light exiting the end of the capillary was sensed at the end through a capacitor lens 19 (063098, Spindler & Hoyer, Gottingen, Germany). The primary light was filtered with one or two 20 glass low pass filters (OG 530, Schott Glaswerke, Mainz, Germany). Light was captured through a 50mm lens of a 21 camera (Series E 1 / 1.8, Nikon, Tokyo, Japan) onto a CCD 22 surface (TE / CCD-1024-TKB / 1, Princeton Instruments, Trenton, New Jersey, USA). In some experiments, a prism 23 (336675, Spindler & Hoyer) was inserted between the glass filter (low pass) and the camera lens (camera) to achieve spectral distribution. The scanned images were saved and evaluated using WinView software (Princeton Instruments) and a PC compatible with IBM.

Příklad 1Example 1

V tomto příkladu byl z optického nastavení vypuštěn hranol 23 a snímané světlo nebylo spektrálně rozloženo. Nejprve byla voda čerpána kontinuálně skrz kapiláru po dobu několika minut prostřednictvím tlakovaného vzduchu. Potom 0,7 nM roztok fluoresceinu (16630-8, Aldrich, St. Louis,In this example, the prism 23 was omitted from the optical adjustment and the sensed light was not spectrally distributed. First, the water was pumped continuously through the capillary for several minutes through pressurized air. Then a 0.7 nM fluorescein solution (16630-8, Aldrich, St. Louis,

Missouri, USA) ve vodě byl čerpán stejným způsobem. Doba expozice fotografického přístroje (kamery) byla 1 s. Zaznamenaná stopa je znázorněna na obr. 12. Získaný signál byl vypočítán jako rozdíl mezi počtem pulzů, sečtených na množství obrazových prvků, pro fluorescein a vodu. Šum byl vypočítán jako standardní odchylka cd vodního základu.Missouri, USA) in the water was pumped the same way. The exposure time of the camera was 1 s. The recorded track is shown in Fig. 12. The obtained signal was calculated as the difference between the number of pulses added to the number of pixels for fluorescein and water. Noise was calculated as the standard deviation cd of the water base.

φφ

Detekční limit koncentrace (braný jako 3x šumu) byl 2,7 pM a detekční limit hmoty byl 550 ymolů. Příklad ilustruje účinné snímání a detekci fluorescenčního světla a demonstruje vynikající detekční limit získaný se zařízením.The detection limit of concentration (taken as 3x noise) was 2.7 pM and the mass detection limit was 550 µmol. The example illustrates the efficient detection and detection of fluorescent light and demonstrates the excellent detection limit obtained with the device.

Na obr. 13 jsou znázorněny obrazy konce kapiláry.Fig. 13 shows images of the end of the capillary.

Obr. 13a znázorňuje obraz pro čistou vodu. Hlavním znakem je kruh světla v blízkosti obvodu sloupce v důsledku rozptylu světla na vnějším povrchu. Obr. 13b znázorňuje obraz pro fluorescein. Hlavním znakem je přibližně Gaussův vrchol v průběhu světla ve středu sloupce v důsledku emise fluorescenčního světla. Tento vrchol je superponován na pozadí ve tvaru kruhu. Zjevně je, pouze čtením obrazových bodů v blízkosti středu možné, vyloučit rušivé rozptylové světlo prostřednictvím prostorové filtrace.Giant. 13a shows an image for pure water. The main feature is a circle of light near the perimeter of the column due to light scattering on the outer surface. Giant. 13b shows an image for fluorescein. The main feature is approximately the Gaussian peak during light in the center of the column due to the emission of fluorescent light. This peak is superimposed on a circle-shaped background. Obviously, only by reading pixels near the center, it is possible to eliminate distracting diffuse light through spatial filtration.

Příklad 2Example 2

V tomto příkladu byl použit hranol 23. Sloupec byl naplněně hydrogelem (póly(dimetylakrylamid), 7% T, 4% C) s křížovou vazbou. Délka kapiláry od injekčního konce k ozařovací zóně byla přibližně 30 cm. Kapalinové komory byly naplněny pufrem sestávajícím z o,l M Tris, 0,1 M boritanu, 2 mM EDTA, a 7 M močoviny. 0,084 nM roztok fluoresceinu (F-1130, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) ve vodě bylo elektrokineticky injektováno při 4 kV p dobu 20 sekund a podrobeno elektroforéze při 5 kV. Doba expozice byla 0,6 s. Obr. 14 znázorňuje část elektroferogramu. Detekční limit koncentrace pro vrchol fluoresceinu byl 70 fM. Tento příklad opět demonstruje vynikající schopnost detekce zařízení.A prism 23 was used in this example. The column was packed with hydrogel (poly (dimethylacrylamide), 7% T, 4% C) with cross-linking. The length of the capillary from the injection end to the radiation zone was approximately 30 cm. The liquid chambers were filled with a buffer consisting of 0.1 M Tris, 0.1 M borate, 2 mM EDTA, and 7 M urea. A 0.084 nM fluorescein solution (F-1130, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) in water was electrokinetic injected at 4 kV p for 20 seconds and electrophoresed at 5 kV. The exposure time was 0.6 s. 14 shows a portion of an electropherogram. The concentration detection limit for the fluorescein peak was 70 fM. Again, this example demonstrates excellent device detection capability.

Příklad 3 • · · · · · · » · • · · · · · ·»»· · « · • · · ··· « · ·· ···· ·· · *» »· ·Example 3 · · · »·» »·« · 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 * *

Bylo použito stejné optické nastavení, sloupce a podmínek elektroforézy, jako v předcházejícím příkladu. Vzorkem byl vzorek DNA pro cyklickou sekvenční analýzu, vysrážený v etanolu a rozpuštěný ve vodě. Příměry byly označeny čtyřmi různými fluorofory (FAM, JOE, TAMRA, ROX) (Genpak, Brighton, UK) a drženy pohromadě před analýzou. Jednotlivé obrazové prvky CCD-čipu byly sloučeny dohromady do větších obrazových prvků. Spektrum každého datového bodu bylo zaznamenáváno jako spektrum deseti těchto větších obrazových bodů v přibližné oblasti 520 až 670 nm. Kalibrace vlnových délek byla prováděna nasvícením světla ze svítících diod (LED) se známou vlnovou délkou na injekční konec a zaznamenáním získaného spektra. Sekvence byla vyhodnocena prostřednictvím identifikace počtu čistých vrcholů každé báze od známé sekvence a použitím spektra těchto vrcholů jako reprezentativního spektra čistých bází. Potom bylo vypočítáno bázová skladba zbytku elektroferogramu prostřednictvím matematického přepočtu těchto kalibračních spekter na každý z datových bodů. Obr. 15 znázorňuje takto získanou bázovou sekvenci. Přesnost řazení bází je odhadnuta na 96 až 98 % v oblasti 40 až 450 bází. Příklad ilustruje vynikající schopnost detekce, zanedbatelné přispění k rozšíření detekčního pásma, a schopnost rozlišení vlnových délek zařízení podle vynálezu, a zjevně demonstruje použitelnost pro sekvenční analýzu DNA.The same optical alignment, column, and electrophoresis conditions were used as in the previous example. The sample was a DNA sample for cyclic sequence analysis, precipitated in ethanol and dissolved in water. The primers were labeled with four different fluorophores (FAM, JOE, TAMRA, ROX) (Genpak, Brighton, UK) and held together prior to analysis. The individual pixels of the CCD chip were merged together into larger pixels. The spectrum of each data point was recorded as the spectrum of ten of these larger pixels in the approximate range of 520 to 670 nm. Calibration of the wavelengths was performed by illuminating light from LEDs of known wavelength at the injection end and recording the obtained spectrum. The sequence was evaluated by identifying the number of pure peaks of each base from the known sequence and using the spectrum of these peaks as a representative spectrum of pure bases. The base composition of the remainder of the electropherogram was then calculated by mathematically converting these calibration spectra to each of the data points. Giant. 15 shows the base sequence thus obtained. Baseline shifting accuracy is estimated to be 96 to 98% in the 40 to 450 base region. The example illustrates excellent detection capability, negligible contribution to detection bandwidth, and wavelength resolution of the device of the invention, and clearly demonstrates usability for DNA sequence analysis.

Předkládaný vynález samozřejmě není omezen na aspekty, provedení a varianty specificky popsané výše, nebo na specifické příklady, ale aniž by byl opuštěn obecný vynálezecký koncept, který je definován připojenými nároky, lze provést množství změn a modifikací vynálezu.Of course, the present invention is not limited to the aspects, embodiments and variants specifically described above, or to specific examples, but without departing from the general inventive concept as defined by the appended claims, numerous changes and modifications may be made to the invention.

Claims (9)

1. Zařízení pro detekci jedné nebo několika fluorescenčních složek, kde uvedené složky jsou obsaženy v médiu, přičemž toto médium je obsaženo ve vedení, uvedené zařízení zahrnuje prostředek pro excitování fluorescenčních složek světlem v ozařovací zóně a prostředek pro snímání a detekcí fluorescenčního světla emitovaného uvedenými fluorescenčními složkami, uvedené médium a vedení tvoří konstrukci, která je transparentní pro excitační a fluorescenční světlo emitované uvedenými fluorescenčními složkami, a uvedené zařízení zahrnuje několik takových konstrukcí, vyznačující se tím, že uvedené vedení je vyrobeno z taveného křemene, křemene nebo organického polymeru, přičemž toto vedení má vnější potah z organického polymeru, který má index lomu menší, než je index lomu taveného křemene, křemene nebo organického polymeru, a tento potah je transparentní pro excitační světlo, takže alespoň část emitovaného fluorescenčního světla je vedena od ozařovací zóny prostřednictvím úplného odrazu v uvedených konstrukcích a snímána z jednoho konce uvedených konstrukcí.An apparatus for detecting one or more fluorescent components, wherein said components are contained in a medium, said medium being contained in a conduit, said apparatus comprising means for exciting fluorescent components with light in the radiation zone and means for sensing and detecting fluorescent light emitted by said fluorescent said medium and conduit forming a structure that is transparent to excitation and fluorescent light emitted by said fluorescent components, and said apparatus comprising a plurality of such structures, characterized in that said conduit is made of fused quartz, quartz or organic polymer, the conduit has an organic polymer outer coating having a refractive index less than the refractive index of fused quartz, quartz or organic polymer, and the coating is transparent to excitatory light, so that at least Part of the emitted fluorescent light is guided from the irradiation zone by means of total reflection in the above constructions and scanned from one end of said structure. 2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené vedení je vyrobeno z taveného křemene a má potah z fluoropolymeru.Device according to claim 1, characterized in that said guide is made of fused quartz and has a fluoropolymer coating. 3. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že hlavním komponentem uvedeného média je voda a že uvedené vedení je vyrobeno z organického polymeru.3. The apparatus of claim 1, wherein the main component of said medium is water and said conduit is made of an organic polymer. 4. Zařízení podle nároku 3, vyznačující se tím, že organickým polymerem je fluoropolymer nebo silikonpolymer.4. The apparatus of claim 3, wherein the organic polymer is a fluoropolymer or a silicone polymer. • * » · 4 4 4 4 4 • · 44 4*44*44 4 4 • 4 4*4 444 • 4 4444 44 4 44 44• * »· 4 4 4 4 4 • 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 5. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že hlavním komponentem uvedeného média je organická kapalina, a uvedené vedení je vyrobena ze skla, taveného křemene nebo křemene.The apparatus of claim 1, wherein the main component of said medium is an organic liquid, and said conduit is made of glass, fused silica or quartz. 6. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že 5 množství uvedených konstrukcí je uspořádáno ve formě rovinného pole v ozařovací zóně.Device according to claim 1, characterized in that 5 a plurality of said structures are arranged in the form of a planar field in the irradiation zone. 7. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, že excitační světlo je prostorově rozloženo přes uvedené pole ^0 prostřednictvím jedné nebo několika čoček, rozšiřovače paprsku, nebo ohybového tvarovače paprsku.The apparatus of claim 6, wherein the excitation light is spatially distributed over said field 40 by one or more lenses, a beam expander, or a diffracting beam former. 8. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, že excitační světlo je skenováno přes uvedené pole.The apparatus of claim 6, wherein the excitation light is scanned through said field. . _c 9. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, že konce 15 pro snímání světla uvedeného pole jsou geometricky přeuspořádány ve formě dvojrozměrného pole.. _C. 9. The device according to claim 6, characterized in that the end 15 of the light sensing array are geometrically rearranged in the form of two-dimensional array. 10. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, je detekovánoThe apparatus of claim 1, wherein the light that is sensed from the end of said structure is detected 20 prostřednictvím obrazového detektoru světla.20 by means of an image light detector. 11. Zařízení podle nároku 10, vyznačující se tím, že obrazovým detektorem světla je zařízení s přenosem nábojů nebo pole fotodiod.Device according to claim 10, characterized in that the image light detector is a charge transfer device or a photodiode array. 25 12. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje prostředek pro spektrální rozlišení světla, které je snímáno z konce uvedené konstrukce.The apparatus of claim 1, further comprising means for spectrally resolving light that is sensed from the end of said structure. 13. Zařízení podle nároku 12, vyznačující se tím, že prostředkem pro spektrální rozlišení je jeden nebo několik hranolů, mřížek nebo optických filtrů.13. The apparatus of claim 12, wherein the spectral resolution means is one or more prisms, gratings, or optical filters. φ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ • φ φφ ·♦·· φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ • 14. Zařízeni podle nároku 9, vyznačující se tím, že snímané světlo je spektrálně rozloženo prostřednictvím jednoho nebo několika optických filtrů.Apparatus according to claim 9, characterized in that the sensed light is spectrally distributed by means of one or more optical filters. 15. Zařízení podle nároku 9, vyznačující se tím, že uvedené dvojrozměrné pole je dostatečně řídce uspořádané pro umožnění snímanému světlu, aby bylo spektrálně rozloženo na povrchu obrazového detektoru prostřednictvím jednoho nebo několika hranolů nebo mřížek.The apparatus of claim 9, wherein said two-dimensional array is sufficiently sparsely arranged to allow the sensed light to be spectrally distributed on the surface of the image detector through one or more prisms or gratings. 16. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje prostředek pro prostorové rozlišení světla, které je snímáno z konce uvedené konstrukce.16. The apparatus of claim 1, further comprising means for spatially resolving light that is sensed from the end of said structure. 17. Zařízení podle nároku 16, vyznačující se tím, že světlo je prostorově rozloženo prostřednictvím použití apertury nebo 15 prostřednictvím vyloučeni části detekovaného obrazu.The apparatus of claim 16, wherein the light is spatially distributed by using an aperture or 15 by excluding part of the detected image. 18. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že excitační světlo je zaostřeno ve směru paralelním ke směru vedení emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené18. The apparatus of claim 1, wherein the excitation light is focused in a direction parallel to the direction of conduction of the emitted fluorescent light along said 2Q světlo vedoucí konstrukce.2Q light guide design. 19. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že excitační světlo je světlo z laseru.19. The apparatus of claim 1, wherein the excitation light is laser light. 20. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že úhel mezi směrem šíření excitačního světla a směrem vedení 25 emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené světlo vedoucí konstrukce je ortogonální pro zabránění jakékoliv ne-rozpýlené ne-rušivé složce excitačního světla, aby byla opticky spřažena do směru vedení světlo vedoucí konstrukce prostřednictvím úplného odrazu.20. The apparatus of claim 1, wherein the angle between the direction of excitation light propagation and the direction 25 of the emitted fluorescent light along said light guiding structure is orthogonal to prevent any non-spreading non-interfering component of the excitation light from being optically coupled to The direction of guidance of the light-guiding structure through complete reflection. • 9 9 9999 9 9 9 *9 999* 9999 9 9 · 9• 9 9 9999 9 9 9 * 9 999 * 9999 9 9 · 9 999 · · · <99999 · · · <99 99 999« 99 9 99 9999 999 «99 99 99 99 21. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a koncem pro snímání světla uvedené konstrukce je dostatečně velká pro umožnění světelným paprskům, vystupujícím z ozařovací zóny, které nesplňují21. The apparatus of claim 1, wherein the distance between the radiation zone and the light sensing end of said structure is sufficiently large to allow light beams exiting the radiation zone that do not meet 5 podmínky úplného odrazu, aby byly účinně přeneseny mimo světlo vedoucí část uvedené konstrukce před dosažením konce pro snímání světla.5 fully reflecting conditions so as to be effectively transmitted outside the light-guiding part of said structure before reaching the light sensing end. 22. Zařízení podle nároku 21, vyznačující se tím, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a konce pro snímání světla uvedené konstrukce je alespoň čtyřikrát, alespoň osmkrát, nebo alespoň šestnáctkrát, větší než největší průřezový rozměr světlo vedoucí části uvedené konstrukce.22. The apparatus of claim 21, wherein the distance between the radiation zone and the light sensing ends of said structure is at least four times, at least eight times, or at least sixteen times greater than the largest cross-sectional dimension of the light guiding portion of said structure. 23. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené23. The apparatus of claim 1, wherein said 5 vedení má tvar dutého válce.5 of the guide has the shape of a hollow cylinder. 24. Zařízení podle nároku 23, vyznačující se tím, že vnitřní průměr válce je menší než nebo roven 500 pm, nebo menší než nebo roven 100 pm.The apparatus of claim 23, wherein the inner diameter of the cylinder is less than or equal to 500 µm, or less than or equal to 100 µm. 25. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje prostředek pro identifikací jednotlivých konstrukcí prostřednictvím spřažení světla prostřednictvím úplného odrazu do konstrukcí v určitém místě jiném, než je konec pro snímání světla, a prostřednictvím snímání uvedeného světla z konců pro snímání světla uvedených konstrukcí.25. The apparatus of claim 1, comprising means for identifying individual structures by coupling the light by fully reflecting into the structures at a location other than the light sensing end and by sensing said light from the light sensing ends of said structures. . 26. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci složek s přirozenou fluorescencí nebo složek označených jedním nebo několika fluorofory.Use of the device according to claim 1 for the detection of components with natural fluorescence or components labeled with one or more fluorophores. • 9 9 · » » W * - V• 9 9 W »- V 9 9 9 «9 99·«··« 9 99 9 9 «9 99 ·« ·· «9 9 DT 999 999 99« □ i «9 9999 9· 9 99 99DT 999 999 99 «9 9999 9 · 9 99 99 27. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení s jakoukoliv metodou zahrnující přenos uvedených složek skrz ozařovací zónu uvnitř uvedeného vedení.The use of the device of claim 1 for detection in conjunction with any method comprising transferring said components through an irradiation zone within said conduit. 28. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení 5 s kapilární elektroforézou, včetně kapilární zónové elektroforézy, kapilární gelové elektroforézy, micelární elektrokinetické kapilární chromatografie a kapilárního izoelektrického zaostřování, kapilární elektrochromatografie, kapalné chromatografie, nebo průtokové injekční analýzy.Use of the device of claim 1 for detection in conjunction with capillary electrophoresis, including capillary zone electrophoresis, capillary gel electrophoresis, micellar electrokinetic capillary chromatography and capillary isoelectric focusing, capillary electrochromatography, liquid chromatography, or flow injection analysis. 29. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení s analýzou nukleových kyselin.Use of the device of claim 1 for detection in conjunction with nucleic acid analysis. 30. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení se sekvenční analýzou DNA.Use of the device of claim 1 for detection in conjunction with DNA sequence analysis.