CZ2000860A3 - Gonadotropins obtained by expression in Dictyostelium - Google Patents

Abstract

Gonadotropiny exprimované v Dictyostelium, kteréjsou secemovány v biologicky aktivní formě. Exprese gonadotropinů v Dictyostelimje snadnýmzpůsobempro selekci mutantních gonadotropinů.Gonadotropins expressed in Dictyostelium that are secreted in biologically active form. Expression gonadotrophins in Dictyostelim is easy selection of mutant gonadotropins.

Description

Oblast technikyTechnical field

Předkládaný vynález se týká gonadotropinů nebo jejich mutantů exprimovaných v Dictyostelium, farmaceutických prostředků obsahujících takové gonadotropiny, způsobu přípravy gonadotropinů a způsobů selekce mutantních gonadotropinů se superagonistickými nebo antagonistickými vlastnostmi.The present invention relates to gonadotropins or mutants thereof expressed in Dictyostelium, pharmaceutical compositions containing such gonadotropins, a process for preparing gonadotropins and methods for selecting mutant gonadotropins with superagonistic or antagonistic properties.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Gonadotropiny tvoří rodinu strukturálně příbuzných glykoproteinových hormonů. Typickými členy této rodiny jsou choriový gonadtropin (CG), folikuly-stimulující hormon (FSH), luteinizační hormon (LH) a thyroidální stimulační hormon (TSH). FSH, LH a TSH jsou přítomné u většiny obratlovců a jsou syntetizovány a secernovány hypofýzou. CG byl doposud objeven pouze u primátů, včetně lidí, a u koní a je syntetizován tkání placenty.Gonadotropins are a family of structurally related glycoprotein hormones. Typical members of this family are chorionic gonadtropin (CG), follicle-stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), and thyroid stimulating hormone (TSH). FSH, LH and TSH are present in most vertebrates and are synthesized and secreted by the pituitary. CG has so far been found only in primates, including humans, and in horses, and is synthesized by placental tissue.

Hormony jsou heterodimerní proteiny velikosti přibližně 30 kD, kde tyto heterodimery jsou tvořeny nekovalentní vazbou společné a-podjednotky a hormon-specifické β-podjednotky.Hormones are heterodimeric proteins of approximately 30 kD, wherein these heterodimers are formed by the non-covalent binding of the common α-subunit and the hormone-specific β-subunit.

U jednoho druhu je a-podjednotka v podstatě identická pro každý člen gonadotropinové rodiny; je také vysoce konzervovaná mezi druhy, β-podjednotky jsou odlišné pro každý člen, t.j. CG, FSH, TSH a LH, ale existují významné homologie v jejich struktuře. Dále, β-podjednotky jsou také vysoce konzervované mezi druhy. U lidí se a-podjednotka skládá z 92 aminokyselin, zatímco β-podjednotka má pro každý hormon jinou velikost: 111 zbytků pro hFSH, 121 zbytků pro hLH, 118 zbytků pro hTSH a 145 zbytků pro hCG (Combarnous, 'i. (.1992), Endocrine Eevisws, 13: 670-691;In one species, the α-subunit is substantially identical for each member of the gonadotropin family; is also highly conserved between species, β-subunits are different for each member, i.e. CG, FSH, TSH and LH, but there are significant homologies in their structure. Furthermore, β-subunits are also highly conserved between species. In humans, the α-subunit is composed of 92 amino acids, while the β-subunit has a different size for each hormone: 111 residues for hFSH, 121 residues for hLH, 118 residues for hTSH, and 145 residues for hCG (Combarnous, i. Endocrine Eevisws, 13: 670-691;

Lustbader, J.W. et al., (1993), Endocrine Reviewa, 14: 291-311).Lustbader, J.W. et al., (1993), Endocrine Review, 14: 291-311).

;3-pod jednotka hCG je významně větší než ostatní 8-pcd j ednotky, protože obsahuje dalších 34 aminokyselin na C-konci, které jsou označovány jako karboxy-koncový peptid (CTP). Tento CTP obsahuje yřThe 3-subunit hCG unit is significantly larger than the other 8-pcd units because it contains an additional 34 amino acids at the C-terminus, referred to as the carboxy-terminal peptide (CTP). This CTP contains yr

Gonadotropiny mají různé účinky na různé tělesné funkce, včetně metabolismu, regulace teploty a reprodukčních procesů. Například, hypoíyzární FSH má zásadní úlohu ve stimulaci vývoje a zrání íolikulu, zatímco LH indukuje ovulaci (Sharp, E.M. (1990), Clin. Endocrine!. 33: 787-807; Dorrington and Armstrong (1979),Gonadotropins have different effects on various body functions, including metabolism, temperature regulation and reproductive processes. For example, hypohysial FSH plays a critical role in stimulating the development and maturation of the follicle, while LH induces ovulation (Sharp, E.M. (1990), Clin. Endocrine! 33: 787-807; Dorrington and Armstrong (1979),

Eecent Prcg. Hormon. Pes ;5 : 301-342) .Eecent Prcg. Hormone. Dog; 5: 301-342).

současnosti je FSH kombinaci s LH, pro aplikován klinicky, buď samostatně nebo ovariální stimulaci, t.j. pro ovariální hyperstimulaci pro fertilizaci in vitro (IVF) a pro indukci ovulace in vivo u neplodných žen nemajících ovulaci (Insler, V. (1988), Int. J. Fertility 33: 85-97; Navot and Rosenwaks (1988), J. Vitro Fert Embryo Transfer, 5: 3-13), stejné jako v léčbě mužského· hypogenadismu. Lidský choriogonadotropin (HCG) se účastní udržování těhotenství v časných stadiích po· početí a má také významné terapeutické aplikace.currently, FSH is combined with LH, for administration clinically, either alone or ovarian stimulation, ie for ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization (IVF) and for the induction of in vivo ovulation in infertile non-ovarian women (Insler, V. (1988), Int. J. Fertility 33: 85-97, Navot and Rosenwaks (1988), J. Vitro Fert Embryo Transfer, 5: 3-13), as in the treatment of male hypogenadism. Human chorionic gonadotropin (HCG) is involved in the maintenance of pregnancy in the early stages of conception and also has significant therapeutic applications.

Dvě pod jednotky heterodimeru mají mnoho· konzervovaných intra-podjednotkových disulfidových vazeb: pět disulíidových vazeb v d-podjednotce a šest disulfidových vazeb v β-podjednotce.Two subunits of the heterodimer have many conserved intra-subunit disulfide bonds: five disulfide bonds in the d-subunit and six disulfide bonds in the β-subunit.

i. í i-O X 'U.Ol líz* cystěinové zbytky jsou plně konzervované mezi všemi členy gonadotropinové rodiny. Nedávno získaná rentgenová struktura hCG ukázala, že tyto disulíidevé vazby se účastní typické trojrozměrné struktuře, která se nazývá disulfidová smyčka.The cystein residues are fully conserved among all members of the gonadotropin family. The recently obtained x-ray structure of hCG has shown that these disulfide bonds are involved in a typical three-dimensional structure called a disulfide loop.

Gonadotropiny obsahují tři nebo čtyři asparaginové zbytky, • · · · které mohou být N-glykosylované a které mají významný vliv na jejich konformaci a biologickou aktivitu. Kromě C-koncového peptidu (CTP) hCG může být hCG glykosylován na čtyřech serinových pozicích. Hlavní úlohou glykosylováného CTP se zdá být prodloužení cirkulačního poločasu hCG.Gonadotropins contain three or four asparagine residues, which may be N-glycosylated and have a significant effect on their conformation and biological activity. In addition to the C-terminal peptide (CTP) of hCG, hCG can be glycosylated at four serine positions. The main role of glycosylated CTP seems to be to increase the circulating half-life of hCG.

Biosyntéza glykoproteinových hormonů je vysoce komplexní proces. V poslední dekádě bylo zjištěno, že skládání, sestavení a sekrece gonadotropinů je usnadněna pomocí velké sady chaperonů a skládacích enzymů, které jsou lokalizovány v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Protože a- a β-podjednotky obsahují takzvanou disulfidovou smyčku, může se předpokládat, že protein-disulfid izomerasa má klíčovou úlohu při skládání proteinu. Dále bylo zjištěno, že N-vázané oligosacharidové vedlejší řetězce jsou nutné pro správné skládání, tvorbu disulfidových vazeb a sekreci hCG (Feng, W. et al., (1995), J.Biosynthesis of glycoprotein hormones is a highly complex process. In the last decade, it has been found that folding, assembly and secretion of gonadotropins is facilitated by a large set of chaperones and folding enzymes that are located in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Since α- and β-subunits contain a so-called disulfide loop, it can be assumed that protein disulfide isomerase plays a key role in protein folding. Furthermore, N-linked oligosaccharide side chains have been found to be necessary for proper folding, disulfide bond formation, and hCG secretion (Feng, W. et al., (1995), J.

Biol. Chem. 270, 11851-11859). Úspěšné sestavení dvou podjednotek do dimeru je nezbytným předpokladem pro biologickou aktivitu dimeru.Biol. Chem. 270, 11851-11859. Successful assembly of two subunits into a dimer is a prerequisite for the biological activity of the dimer.

Hodnocení funkčních determinant heterodimerních glykoproteinových hormonů je často narušeno nežádoucími sekundárními účinky mutací na sestavení podjednotek. Pro zlepšení studií analyzujících strukturu/funkci byly připraveny mutanty, ve kterých jsou kódující regiony β-podjednotky hCG a společné α-podjednotky spojeny prostřednictvím peptidových vmezeřených sekvencí nebo interpodjednotkových disulfidových vazeb. Bylo zjištěno, že tyto kovalentně vázané α-podjednotky a β-podjednotky hCG se mohou skládat do biologicky aktivních konformaci.Assessment of functional determinants of heterodimeric glycoprotein hormones is often hampered by undesired secondary effects of mutations on subunit assembly. Mutants in which the coding regions of the hCG β-subunit and the common α-subunits are linked via peptide spacer sequences or intersubunit disulfide bonds have been prepared to improve structure / function studies. It has been found that these covalently linked α-subunits and β-subunits of hCG can fold into biologically active conformations.

Gonadotropiny byly exprimována v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) a jejich rekombinantní deriváty měly biologické aktivity srovnatelné s přirozenými hormony (Olijve, W. et al., (1996), Mol. Hum. Reprod. 2: 371-382). Tato skutečnost naznačuje, že tyto hostitelské buňky obsahují všechny chaperony a skládací enzymy nezbytné pro sestavení α-podjednotky a S-podjednotky hCG a pro provedení všech posttranslačních modifikací nutných pro plnou biologickou aktivitu. Dále, použití CHO buněk v kombinaci s místně-cílenou mutagenesí bylo potvrzeno jako hodnotný nástroj pro hodnocení funkčních determinant v glykoproteinových hormonech (Puett, D. et al., H.(1994), v Glycoprotein Hormones (Lustbader, J.W., Puett, D. and Ruddon, R.W., ed.), str. 59-82,Gonadotropins were expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells and their recombinant derivatives had biological activities comparable to natural hormones (Olijve, W. et al., (1996), Mol. Hum. Reprod. 2: 371-382). This suggests that these host cells contain all the chaperones and folding enzymes necessary to assemble the α-subunit and the S-subunit of hCG and to perform all post-translational modifications necessary for full biological activity. Furthermore, the use of CHO cells in combination with site-directed mutagenesis has been confirmed as a valuable tool for evaluating functional determinants in glycoprotein hormones (Puett, D. et al., H. (1994), in Glycoprotein Hormones (Lustbader, JW, Puett, D). and Ruddon, RW, eds., pp. 59-82,

Springer-Verlag, New Zork) a pro vývoj nových terapeutických analogů těchto hormonů (Fares, F.A. et al., (1992), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4304-4308).Springer-Verlag, New Zork) and for the development of new therapeutic analogues of these hormones (Fares, F. A. et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4304-4308).

Naneštěstí má použití savčích buněk jako jsou CHO buňky pro expresi lidských gonadotropinů několik nevýhod. Není mošno generovat vysoký počet transformantů, který je nutný pro studie využívající náhodnou mutagenesí proteinových domén. Náhodná mutagenese vybraných domén v proteinech je hodnotným nástrojem pro identifikaci strukturálních determinant vazby na receptor a biologické aktivity. Dále, použití CHO buněk je nákladné a pracné. Proto existuje potřeba exprese gonadotropinů v méně robustním expresním hostiteli.Unfortunately, the use of mammalian cells such as CHO cells for the expression of human gonadotropins has several drawbacks. It is not possible to generate the high number of transformants required for studies using random mutagenesis of protein domains. Random mutagenesis of selected domains in proteins is a valuable tool for identifying structural determinants of receptor binding and biological activities. Furthermore, the use of CHO cells is expensive and laborious. Therefore, there is a need for expression of gonadotropins in a less robust expression host.

Hostitelské buňky z nižších organismů mohou splňovat výše uvedené požadavky, ale předpokládá se, že komplexní skládání gonadotropinů znemožní správnou expresi a sekreci takových komplexních rekombinantních proteinů.Host cells from lower organisms may meet the above requirements, but it is believed that complex gonadotropin folding will prevent proper expression and secretion of such complex recombinant proteins.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že organismus Dictyostelum je schopen produkce vysoce komplexních glykoproteinových hormonů.It has now been unexpectedly found that Dictyostelum is capable of producing highly complex glycoprotein hormones.

Půdní améba Dictiostielum discoideum je organismem, který umožňuje provedení atraktivní alternativy pro heterologní expresi lidských glykoproteinových hormonů. Tento organismus může být kultivován a transformován stejně snadno jako kvasinka Saccharomyces a zároveň má některé komplexní vlastnosti podobné jako savčí buňky, jako je glykosylace a chemotaxe. Dále bylo nedávno ujištěno, že Dictiosteilum je vhodným systémem pro přístupy využívající náhodné mutagenese.The soil amoeba Dictiostielum discoideum is an organism that makes it possible to make an attractive alternative for heterologous expression of human glycoprotein hormones. This organism can be cultivated and transformed as easily as the yeast Saccharomyces and at the same time has some complex properties similar to mammalian cells, such as glycosylation and chemotaxis. Furthermore, it has recently been assured that Dictiosteilum is a suitable system for random mutagenesis approaches.

Nicméně, bylo zjištěno několik odlišností v glykosylaci mezi proteiny produkovanými v Dictyostelium a materiálem produkovaným v CHO buňkách. Je známo, že glykosylace má významný vliv na funkcí hormonu a u většiny glykosylaci provedených vHowever, several differences in glycosylation have been found between proteins produced in Dictyostelium and material produced in CHO cells. It is known that glycosylation has a significant effect on hormone function and in most glycosylations performed in

Dictyostelium nejsou galaktosa, N-acetylgalaktosaamin nebo kyselina sialová navázány na oligosacharidové vedlejší řetězce (Slade, M. et al., (1997), Biotech. Genet. Eng. Rev. 14: 1-35). Bylo zjištěno, že ačkoliv není post-translační modifikace identická s modifikací u vyšších eukaryotických organismů, jsou gonadotropiny produkované v Dictyostelium také biologicky aktivní. Bylo zjištěno, že protein je schopen vazby na svůj receptor a stimulace produkce cAMP v buňkách exprímujících lidský LH/CG receptor.Dictyostelium is not galactose, N-acetylgalactosamine or sialic acid bound to oligosaccharide side chains (Slade, M. et al., (1997), Biotech. Genet. Eng. Rev. 14: 1-35). It has been found that although the post-translational modification is not identical to that of higher eukaryotic organisms, the gonadotropins produced in Dictyostelium are also biologically active. The protein has been found to be capable of binding to its receptor and stimulating cAMP production in cells expressing the human LH / CG receptor.

Heterogenita exprimovaných glykoproteinů je značně snížena, což vede k produkci homogenějších přípravků isohormonů. Proto jsou gonadotropiny produkované v Dictyostelium chemicky lépe definovány než komplexnější gonadotropiny produkované v CHO. Toto je hlavní výhodou udržování a analytické hodnocení složení jednotlivých šarží. Protože glykosylace je velmi významnou determinantou pro poločas gonadotropinů in vivo poskytuje produkce gonadotropinů v Dictyostelium prostředek pro produkci nemutovaných gonadotropinů s dobře definovanými poločasy in vivo. Dále, úprava exprese gonadotropinů v Dictyostelium pomocí genového inženýrství umožňuje vývoj konkrétních gonadotropinů pro některé klinické aplikace.The heterogeneity of the expressed glycoproteins is greatly reduced, leading to the production of more homogeneous isohormone preparations. Therefore, gonadotropins produced in Dictyostelium are chemically better defined than the more complex gonadotropins produced in CHO. This is the main advantage of maintaining and analyzing the composition of individual batches. Since glycosylation is a very important determinant of the in vivo half-life of gonadotropins, the production of gonadotropins in Dictyostelium provides a means for producing unmutated gonadotropins with well-defined half-lives in vivo. Furthermore, genetic engineering of the expression of gonadotropins in Dictyostelium allows the development of particular gonadotropins for some clinical applications.

« * • · · · • » · · • · · * • · · · • · · ·* * * * * * * * * *

Vzhledem ke komplexu inter- a intramolekulového skládání dvou podjednotek, velkému počtu disulfidových můstků, disulfidovým smyčkám a post-translačním modifikacím je překvapivé, že aktivní gonadotropiny mohou být exprimovány v Dictyostelium a že správně složené molekuly mohou být připraveny způsobem podle předkládaného vynálezu. Správná tvorba disulfidových vazeb je zásadním dějem ve skládání a zrání funkčních gonadotropinů. Zásadní je zejména tvorba disulfidových vazeb v β-podjednotce: pro účinné kombinování a složení jsou nutné všechny disulfidové vazby. Podrobné studie skládání hCG ukázaly, že skládání molekuly neprobíhá jednoduchou sekvenční dráhou, ale že probíhá nezávisle v různých doménách molekuly. Proto se předpokládalo, že buňky nižších organismů nejsou schopny sekrece správně složených gonadotropinů.Given the complex of inter- and intramolecular folding of the two subunits, the large number of disulfide bridges, disulfide loops and post-translational modifications, it is surprising that active gonadotropins can be expressed in Dictyostelium and that correctly folded molecules can be prepared by the method of the present invention. Proper disulfide bond formation is an essential event in the folding and maturation of functional gonadotropins. In particular, the formation of disulfide bonds in the β-subunit is essential: all disulfide bonds are required for efficient combination and composition. Detailed hCG folding studies have shown that the folding of the molecule does not follow a simple sequence pathway, but that it takes place independently in different domains of the molecule. Therefore, it was assumed that lower organism cells were unable to secrete correctly folded gonadotropins.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Předkládaný vynález poskytuje gonadotropiny exprimované v Dictyostelium.The present invention provides gonadotropins expressed in Dictyostelium.

Použití Dictyostelium discoideum má tu výhodu, že se jedná o dobře prostudovaný organismus. Vegetativní amébu lze snadno a levně kultivovat buď v axenické kultuře, nebo na Gram-negativních bakteriích. Kromě toho, bylo popsáno několk transformačních vektorů, které mohou být použity pro řízení exprese cizorodých proteinů.The use of Dictyostelium discoideum has the advantage of being a well-studied organism. Vegetative amoebae can be easily and cheaply cultivated either in axenic culture or on Gram-negative bacteria. In addition, several transformation vectors have been described which can be used to control the expression of foreign proteins.

Gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být dimerické, t.j. složené ze dvou nekovalentně navázaných podjednotek. Výhodně je gonadotropinem hCG nebo FSH. Nicméně, gonadotropiny mohou obsahovat obecně přijímané modifikace.The gonadotropins of the present invention may be dimeric, i.e. composed of two non-covalently linked subunits. Preferably, the gonadotropin is hCG or FSH. However, gonadotropins may contain generally accepted modifications.

V jedné takové výhodné modifikaci gonadotropinů podle • · · · • · · · předkládaného vynálezu je C-konec aminokyselinové sekvence jedné podjednotky navázán - volitelně prostřednictvím spojovací skupiny - na N-konec aminokyselinové sekvence druhé podjednotky. Výhodně je spojovací skupinou kompletní nebo částečná CTP jednotka nebo její varianta, nebo repetitivní oligopeptid, například 5-krát opakující se Ser-Gly peptid.In one such preferred modification of the gonadotropins according to the present invention, the C-terminus of the amino acid sequence of one subunit is linked - optionally via a linker group - to the N-terminus of the amino acid sequence of the other subunit. Preferably, the linker is a complete or partial CTP unit or variant thereof, or a repetitive oligopeptide, for example a 5-fold Ser-Gly peptide.

Jinou modifikací gonadotropinů podle předkládaného vynálezu může být rozšíření a-podjednotky a/nebo β-podjednotky na jejich N- nebo C-koncích o kompletní nebo částečnou CTP jednotku nebo její variantu. Rozšíření může obsahovat příslušné CTP jednotky v jednoduché nebo mnohotné formě. Alternativně může být kompletní CTP jednotka nebo částečná CTP jednotka nebo její mnohotné formy insertována v N- nebo C-konci uvedených podjednotek. Ještě jinou modifikací je vložení jedné nebo více dalších disulfidových vazeb.Another modification of the gonadotropins of the present invention may be the extension of the α-subunit and / or the β-subunit at their N- or C-termini by a complete or partial CTP unit or a variant thereof. The extension may include the appropriate CTP units in a single or multiple form. Alternatively, a complete CTP unit or a partial CTP unit or multiple forms thereof may be inserted at the N- or C-terminus of said subunits. Yet another modification is the insertion of one or more additional disulfide bonds.

Dále, gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být buď glykosylovane, nebo částečně glykosylováné. Částečně glykosylované gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být získány místně cílenou mutagenesí, při které je odstraněno jedno nebo více míst pro glykosylaci v gonadotropinů.Further, the gonadotropins of the present invention may be either glycosylated or partially glycosylated. The partially glycosylated gonadotropins of the present invention may be obtained by site-directed mutagenesis in which one or more glycosylation sites in the gonadotropins are removed.

Alternativně může být charakter glykosylace gonadotropinů podle předkládaného vynálezu modifikován vložením dalších glykosylačních míst a volitelně odstraněním jednoho nebo více glykosylačních míst, což vede k modifikované glykosylaci uvedených gonadotropinů. Glykosylační místa, jak je zde tento termín použit, se skládají z aminokyselinové sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X může být jakákoliv aminokyselina.Alternatively, the glycosylation pattern of the gonadotropins of the present invention may be modified by inserting additional glycosylation sites and optionally removing one or more glycosylation sites, resulting in modified glycosylation of said gonadotropins. Glycosylation sites, as used herein, consist of the amino acid sequence Asn-X-Ser / Thr, where X can be any amino acid.

Termíny a-podjednotka a β-podjednotka CG, FSH, LH a TSH, stejně jako heterodimerické formy, jsou použity v běžném významu a označují proteiny mající aminokyselinovou sekvenci známou v • 999 oboru, nebo jejich alelické varianty, bez ohledu na charekter glykosylace.The terms α-subunit and β-subunit CG, FSH, LH, and TSH, as well as heterodimeric forms, are used in the ordinary sense and refer to proteins having the amino acid sequence known in the art, or allelic variants thereof, regardless of glycosylation pattern.

Přirozené formy těchto proteinů jsou ty proteiny, které mají aminokyselinovou sekvenci izolovanou z příslušné tkáně obratlovce a jsou tvořeny těmito sekvencemi jako takovými nebo jejich alelickými variantami.The natural forms of these proteins are those proteins having an amino acid sequence isolated from the respective vertebrate tissue and consisting of these sequences as such or allelic variants thereof.

Termín varianty označuje ty proteiny, které obsahují alterace aminokyselinové sekvence vzhledem k přirozeným proteinům. Alteracemi mohou být jednotlivé nebo mnohotné delece, inserce, substituce a jejich kombinace, a mohou být připraveny, například, místně specifickou mutagenesí.The term variant refers to those proteins that contain alterations of the amino acid sequence to natural proteins. Alterations may be single or multiple deletions, insertions, substitutions, and combinations thereof, and may be prepared, for example, by site-specific mutagenesis.

Termín CTP jednotka, jak je zde použit, označuje aminokyselinovou sekvenci, která se nachází na karboxylovém konci β-podjednotky hCG v rozsahu od 112-118 zbytku do zbytku 145 na C-konci, nebo její část. Kompletní CTP jednotka obsahuje 28-34 aminokyselin, v závislosti na N-konci CTP. Částečná CTP jednotka je aminokyselinová sekvence, která se nachází mezi pozicemi 112-118 až 145 včetně, ale která má alespoň jednu aminokyselinu deletovanou vzhledem k nejkratší možné kompletní CTP jednotce (aminokyseliny 118-145). Mnohotné CTP jednotky jsou tandemová seskupení kompletních CTP jednotek nebo částečných CTP jednotek nebo jejich kombinace.The term CTP unit, as used herein, refers to an amino acid sequence that is located at the carboxyl terminus of the β-subunit of hCG in the range of 112-118 residue to residue 145 at the C-terminus, or a portion thereof. The complete CTP unit contains 28-34 amino acids, depending on the N-terminus of the CTP. A partial CTP unit is an amino acid sequence that lies between positions 112-118 to 145 inclusive, but which has at least one amino acid deleted relative to the shortest possible complete CTP unit (amino acids 118-145). Many CTP units are tandem groupings of complete CTP units or partial CTP units or combinations thereof.

Způsoby konstrukce gonadotropinových genů podle předkládaného vynálezu jsou v oboru dobře známé (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, poslední vydání). Techniky pro místně cílenou mutagenesi, ligaci dalších sekvencí, PCR a konstrukci vhodných expresních systémů jsou také všechny dobře známé v oboru. Části nebo celá DNA kódující požadovaný protein může být • · · konstruovány synteticky za použití standardních technik syntézy na pevné fázi, výhodně tak, aby obsahovala restrikční místa pro snadné provedení ligací. DNA kódující sekvence může obsahovat vhodné kontrolní elementy pro transkripci a translaci.Methods of constructing the gonadotropin genes of the present invention are well known in the art (Sambrook et al., Molecular Cloning: and Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, latest edition). Techniques for site-directed mutagenesis, ligation of additional sequences, PCR, and construction of suitable expression systems are also well known in the art. Portions or all of the DNA encoding the protein of interest may be constructed synthetically using standard solid phase synthesis techniques, preferably to contain restriction sites for ease of ligation. The DNA coding sequence may contain suitable control elements for transcription and translation.

Vynález dále obsahuje způsob pro expresi gonadotropinů nebo jejich mutantů v Dictyostelium. Uvedený způsob podle předkládaného vynálezu obsahuje kroky:The invention further provides a method for expressing gonadotropins or mutants thereof in Dictyostelium. Said method according to the present invention comprises the steps of:

- transformaci kmene Dictyostelium rekombinantním plasmidovým vektorem obsahujícím DNA sekvenci kódující geny nebo mutované geny pro gonadotropiny pod kontrolou Dictyostelium regulačních sekvencí;transforming the Dictyostelium strain with a recombinant plasmid vector containing a DNA sequence encoding genes or mutated gonadotropin genes under the control of Dictyostelium regulatory sequences;

- kultivaci rekombinantního kmene za podmínek umožňujících expresi uvedené DNA sekvence; aculturing the recombinant strain under conditions allowing expression of said DNA sequence; and

- izolaci exprimovaného proteinu.isolating the expressed protein.

Výhodně je exprimovaným proteinem jednořetězcový protein, tzn., že podjednotky jsou kovalentně vázané pomocí spojovací molekuly. Ještě lépe je gonadotropinem jednořetězcový hCG.Preferably, the expressed protein is a single chain protein, i.e., the subunits are covalently linked by means of a linker molecule. More preferably, the gonadotropin is a single-chain hCG.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob pro skríning mutovaných gonadotropinů. Uvedený způsob obsahuje:Another aspect of the present invention is a method for screening mutated gonadotropins. Said method comprises:

- náhodnou mutagenesi genů pro gonadotropiny;- random mutagenesis of gonadotropin genes;

- inserci mutovaných genů do plasmidového vektoru proinsertion of the mutated genes into the plasmid vector

Dictyostelium;Dictyostelium;

- transformaci kmene Dictyostelium uvedeným rekombinantním plasmidovým vektorem;transforming the Dictyostelium strain with said recombinant plasmid vector;

- kultivaci klonů za podmínek umožňujících expresi DNA sekvence;culturing the clones under conditions allowing expression of the DNA sequence;

- určení poměru vazba na receptor/přenos signálu; adetermining the receptor binding / signal transduction ratio; and

- izolaci klonů s poměrem, který se liší od poměru určeného pro přirozené gonadotropiny.- isolation of clones with a ratio different from that intended for natural gonadotropins.

Výhodně mají mutované gonadotropiny vazbu na receptor, která • · · · • · se rovná vazbě přirozeného gonadotropinu na jeho receptor. Lépe je afinita mutovaného proteinu k jeho receptoru vyšší než afinita jeho přirozeného protějšku. Přenos signálu by měl být alespoň dvakrát vyšší nebo nižší ve srovnání s přirozeným proteinem. Výhodně je rozdíl v přenosu signálu 10-násobný.Preferably, the mutated gonadotropins have a receptor binding that is equivalent to the binding of natural gonadotropin to its receptor. More preferably, the affinity of the mutated protein to its receptor is higher than that of its natural counterpart. The signal transmission should be at least twice as high or lower as the native protein. Preferably, the difference in signal transmission is 10-fold.

Proteiny mající vysoký poměr jsou použitelné jako antagonisté, zatímco proteiny s nízkým poměrem mohou být použity jako superagonisté.High ratio proteins are useful as antagonists, while low ratio proteins can be used as superagonists.

Způsoby pro stanovení vazby na receptor, stejně jako in vitro a in vivo testy pro stanovení biologické aktivity gonadotropinů j sou v oboru dobře známé.Methods for determining receptor binding as well as in vitro and in vivo assays for determining the biological activity of gonadotropins are well known in the art.

Náhodná mutagenese nemusí být provedena na kompletním gonadotropinovém genu, ale může být provedena na genu pro jednu podjednotku nebo na dobře definovaném regionu, jako je například determinantní smyčka.Random mutagenesis need not be performed on the complete gonadotropin gene, but can be performed on a single subunit gene or on a well-defined region, such as a determinant loop.

Pro vložení náhodných bodových mutací do genu pro gonadotropin může být použita amplifikace vybraného regionu za použití Taq DNA polymerasy. Protože Taq DNA polymerasa postrádá 3'->5' exonukleolytickou editační aktivitu, je tento enzym DNA polymerasou vnášející chyby do sekvence, se změřenou chybovostí 10~⁵ až 10^_4 chyb na syntetizovaný nukleotid. Proto může být PCR s Taq DNA polymerasou za v podstatě standardních podmínek reakce použita pro zavádění mutací (Zhou, Z. et al., (1991),Amplification of a selected region using Taq DNA polymerase can be used to insert random point mutations into the gonadotropin gene. Because Taq DNA polymerase lacks 3 '->5' exonucleolytic editing activity, this enzyme is a DNA polymerase that introduces errors into the sequence, with a measured error rate of 10 ^-5 to 10 ^-4 errors per synthesized nucleotide. Therefore, PCR with Taq DNA polymerase under substantially standard reaction conditions can be used to introduce mutations (Zhou, Z. et al., (1991),

Nucl. Acids Res. 19: 52). Nicméně, frekvecne mutací získaná za použití této techniky je adekvátní pro mutagenesi relativně velkých sekvencí, ale ne pro mutagenesi malých DNA fragmentů (<500 bp) . Nespolehlivost Taq DNA polymerasy může být zvýšena přidáním Mn²* a použitím relativně vysokých koncentrací dNTP a Mg²' (Leungh, D.W. et al., (1989), Technique 1: 1-15).Nucl. Acids Res. 19: 52). However, the frequency mutation obtained using this technique is adequate for the mutagenesis of relatively large sequences, but not for the mutagenesis of small DNA fragments (<500 bp). The unreliability of Taq DNA polymerase can be increased by the addition of Mn ² * and the use of relatively high concentrations of dNTP and Mg ² '(Leungh, DW et al., (1989), Technique 1: 1-15).

• · • · · ·• • •

Alternativním způsobem pro úpravu frekvence mutací, kterou je také možno ovlivnit typ mutací, je použití dITP v kombinaci s omezenými množstvími čtyř dNTP (Spee, J.H. et al., (1993), Nucl.An alternative method for adjusting the frequency of mutations, which can also affect the type of mutations, is to use dITP in combination with limited amounts of four dNTPs (Spee, J. H. et al., (1993), Nucl.

Acids Res. 21: 777-778) . Pro mutagenesi krátké cílové DNA (< 50 bp) je metodou volby použití degenerovaných oligonukleotidů (Kirchhoff, F. and Desrosiers, R.C. (1996), Meth. Molec. Biol.Acids Res. 21: 777-778). For mutagenesis of short target DNA (<50 bp), the method of choice is the use of degenerate oligonucleotides (Kirchhoff, F. and Desrosiers, R.C. (1996), Meth. Molec. Biol.

57: 323-333). Obvykle se skládají tyto způsoby ze čtyř kroků. V prvním kroku je vybraný region amplifikován (modifikovanou) PCR. Ve druhém kroku je amplifikované DNA trávena párem restrikčních endonukleas, které tráví každý konec vybrané DNA sekvence. Ve třetím kroku je DNA fragment obsahující vybranou DNA sekvenci ligován s vektorovou DNA trávenou restrikčními endonukleasami. Ve čtvrtém kroku jsou výsledné rekombinantní DNA molekuly vloženy do buněk transformací nebo elektroporací.57: 323-333). Usually these methods consist of four steps. In the first step, the selected region is amplified by (modified) PCR. In the second step, the amplified DNA is digested by a pair of restriction endonucleases that spend each end of the selected DNA sequence. In a third step, the DNA fragment containing the selected DNA sequence is ligated with the vector DNA digested with restriction endonucleases. In a fourth step, the resulting recombinant DNA molecules are introduced into cells by transformation or electroporation.

DNA vektory kódující jakýkoliv gonadotropin podle předkládaného vynálezu také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. DNA vektory podle předkládaného vynálezu mohou být získány operativní vazbou DNA kódující přirozené gonačotropiny nebo jejich varianty s DNA obsahující Dictyostelium regulační sekvence. Volitelně mohou tyto vektory také obsahovat regiony, které obsahují sekvence rozpoznávající počátek replikace a/nebo sekvence kódující polypeptid usnadňující extrachromosomální replikaci. Takové vektory mají tu výhodu, že se mohou replikovat v Dictyostelium hostitelských buňkách extrachromosomálně.DNA vectors encoding any gonadotropin of the present invention are also within the scope of the present invention. The DNA vectors of the present invention can be obtained by operably linking DNA encoding natural gonacotropins or variants thereof to DNA containing Dictyostelium regulatory sequences. Optionally, the vectors may also comprise regions that contain origin of replication and / or polypeptide-encoding sequences facilitating extrachromosomal replication. Such vectors have the advantage that they can replicate in Dictyostelium host cells extrachromosomally.

Jak bylo uvedeno výše, variantní gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být agonisté nebo antagonisté, v závislosti na místě mutace. Místo mutace může způsobit jemné změny v konformaci molekuly. Pokud je místo mutace vybráno například v částech proteinu, které jsou asociovány s vazbou na receptor a/nebo přenosem signálu, tak může mít secernovaný protein podle předkládaného vynálezu částečnou nebo úplnou ztrátu signální aktivity. Takové změněné gonadotropiny, které mají zachovanou vazbu na receptor, mohou být použity jako antagonisté. Také mohou být připraveny gonadotropiny se zlepšenou vazbou a lepším přenosem signálu.As mentioned above, the variant gonadotropins of the present invention may be agonists or antagonists, depending on the site of mutation. The mutation site can cause subtle changes in the conformation of the molecule. When the mutation site is selected, for example, in portions of a protein that are associated with receptor binding and / or signal transduction, the secreted protein of the present invention may have a partial or total loss of signaling activity. Such altered gonadotropins that have retained receptor binding can be used as antagonists. Also, gonadotropins with improved binding and better signal transduction can be prepared.

Agonistické gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro stejné klinické aplikace jako přirozené gonadotropiny. Kromě proteinů mohou být použity jako diagnostické prostředky pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek k přirozeným proteinům v biologickém vzorku. Mohou být také použity jako kontrolní činidla v testech pro hodnocení koncentrací gonadotropinových hormonů v různých vzorcích. Antagonisté mohou být použity například v léčbě nádorů závislých na gonadotropinech; LH/hCG antagonisté mohou být použity pro prevenci kolísání LH během kontrolované ovariální hyperstimulace a FSH antagonisté mohou být použity pro mužskou antikoncepci.The agonist gonadotropins of the present invention can be used for the same clinical applications as natural gonadotropins. In addition to proteins, they can be used as diagnostic means for detecting the presence or absence of antibodies to natural proteins in a biological sample. They can also be used as control reagents in assays to evaluate gonadotropin hormone concentrations in various samples. Antagonists can be used, for example, in the treatment of gonadotropin-dependent tumors; LH / hCG antagonists can be used to prevent LH fluctuations during controlled ovarian hyperstimulation and FSH antagonists can be used for male contraception.

Vhodné farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují jeden nebo více gonadotropinů podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.Suitable pharmaceutical compositions of the present invention comprise one or more of the gonadotropins of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou v oboru dobře známé a zahrnují, například, sterilní fyziologický roztok, laktosu, sacharosu, fosforečnan vápenatý, želatinu, dextrin, agar, pektin, podzemnicový olej, olivový olej, sesamový olej a vodu.Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art and include, for example, sterile saline, lactose, sucrose, calcium phosphate, gelatin, dextrin, agar, pectin, peanut oil, olive oil, sesame oil and water.

Dále mohou farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahovat jedno nebo více stabilizačních činidel, jako jsou například uhlovodany, včetně sorbitolu, manitolu, škrobu, sacharodextrinu a glukosy, proteiny, jako je albumin nebo kasein a pufry jako jsou například alkalické fosfáty.Further, the pharmaceutical compositions of the present invention may contain one or more stabilizing agents, such as carbohydrates, including sorbitol, mannitol, starch, saccharodextrin and glucose, proteins such as albumin or casein, and buffers such as alkaline phosphates.

Vhodnými způsoby podání jsou intramuskulární injekce, podkožní • · · 9Suitable routes of administration are intramuscular injection, subcutaneous injection

• · · · injekce, intravenosní injekce nebo intraperitoneální injekce, orální a intranasální podání.Injection, intravenous injection or intraperitoneal injection, oral and intranasal administration.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález a nijak neomezují jeho rozsah.The following examples illustrate the present invention and do not limit its scope in any way.

Popis obrázků na připojených výkresechDescription of the figures in the attached drawings

Obr. l: Plasmidy a strategie klonování. (1A) Mapy plasmidů MB12n a MB12n/PsA. Oba plasmidy se skládají ze čtyř hlavních fragmentů, obsahujících E. coli udržovací sekvenci (bluescript), gen pro resistenci na blasticidin pod kontrolou Dd promotoru (BSR), klonovací kazetu s Dd promotorem (actl5) a terminátor (2H3) a sekvence pro extrachromosomální expresi v Dictyostelium (G4/D5, G5/D6). MB12n/PsA obsahuje PsA vazebnou sekvenci (tabulka 1) insertovanou do jedinečného BglII místa MB12n. (1B) - diagram klonování JV158. Použité oligonukleotidy jsou označeny horizontálními šipkami, xxx v oligonukleotidu b20aarev ukazuje, že v sekvenci mohou být provedeny substituce pro optimalizaci sekvence pro preferenční kodony Dictyostelium. (lc) - diagram klonování JV10PSA. Všechny oligonukleotidové sekvence jsou uvedeny v tabulce 1.Giant. l: Plasmids and cloning strategies. (1A) Maps of plasmids MB12n and MB12n / PsA. Both plasmids consist of four major fragments containing the E. coli maintenance sequence (bluescript), the blasticidin resistance gene under the control of the Dd promoter (BSR), the Dd promoter cloning cassette (act15), and the terminator (2H3) and the extrachromosomal expression sequence. in Dictyostelium (G4 / D5, G5 / D6). MB12n / PsA contains a PsA binding sequence (Table 1) inserted into the unique BglII site of MB12n. (1B) - JV158 cloning diagram. The oligonucleotides used are indicated by horizontal arrows, xxx in oligonucleotide b20aarev shows that sequence substitutions can be made to optimize the sequence for the Dictyostelium preference codons. (lc) - JV10PSA cloning diagram. All oligonucleotide sequences are listed in Table 1.

Obr. 2: Vazebná aktivita přirozených hLH, hCG a jednořetězcového hCG (schCG) produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd) k membránám CHO buněk stabilně exprimujícím lidský LH/CG receptor. Membrány byly inkubovány se ¹²⁵1-značeným hCG za nepřítomnosti nebo za přítomnosti různých koncentrací neznačeného přirozeného hLH, hCG nebo jednořetězcového hCG. Křivky vytěsnění z vazby jsou uvedeny jako procento maximální vazby při každé dávce neznačeného hormonu.Giant. 2: Binding activity of natural hLH, hCG and single-chain hCG (schCG) produced in Chinese hamster ovary (CHO) or Dictyostelium discoideum (Dd) cells to CHO cell membranes stably expressing the human LH / CG receptor. Membranes were incubated with ¹²⁵ 1-labeled hCG in the absence or presence of various concentrations of unlabeled native hLH, hCG or single-chain hCG. Binding displacement curves are shown as a percentage of maximum binding at each dose of unlabeled hormone.

• · • · · ·• • •

Obr. 3: In vitro biologická aktivita přirozeného hLH, hCG a jednořetězcového hCG (schCG) produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd). Extracelulární cAMP byl stanoven specifickou RIA po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský LH/CG receptor.Giant. 3: In vitro biological activity of native hLH, hCG and single-chain hCG (schCG) produced in Chinese hamster ovary (CHO) or Dictyostelium discoideum (Dd) cells. Extracellular cAMP was determined by specific RIA after stimulation of CHO cells stably expressing the human LH / CG receptor.

Obr. 4: In vitro biologická aktivita přirozeného hCG produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd). Produkce luciferasy byla měřena po 4 hodinové inkubaci při 37 °C a po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský LH/CG receptor a reporterový konstrukt.Giant. 4: In vitro biological activity of natural hCG produced in Chinese hamster ovary (CHO) or Dictyostelium discoideum (Dd) cells. Luciferase production was measured after 4 hours incubation at 37 ° C and after stimulation of CHO cells stably expressing the human LH / CG receptor and reporter construct.

Obr. 5: In vitro biologická aktivita přirozeného FSH produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd). Produkce luciferasy byla měřena po 4 hodinové inkubaci při 37 °C a po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský FSH receptor a reporterový konstrukt.Giant. 5: In vitro biological activity of native FSH produced in Chinese hamster ovary (CHO) or Dictyostelium discoideum (Dd) cells. Luciferase production was measured after 4 hours incubation at 37 ° C and after stimulation of CHO cells stably expressing the human FSH receptor and reporter construct.

Obr. 6: In vitro biologická aktivita přirozeného hCG a vybraných mutantních hCG produkovaných v Dictyostelium discoideum (Dd). Produkce luciferasy byla měřena po 4 hodinové inkubaci při 37 °C a po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský LH/CG receptor a reporterový konstrukt.Giant. 6: In vitro biological activity of native hCG and selected mutant hCG produced in Dictyostelium discoideum (Dd). Luciferase production was measured after 4 hours incubation at 37 ° C and after stimulation of CHO cells stably expressing the human LH / CG receptor and reporter construct.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1: Vývoj expresních konstruktůExample 1: Development of expression constructs

Pro expresi v Dictyostelium byl vybrán mutantní gonadotropin skládající se ze zcela intaktní a-podjednotky navázané přes dekamerní peptid obsahující pět Ser-Gly repetitivních sekvencí na β-řetězec bez jeho C-koncového peptidu.For expression in Dictyostelium, a mutant gonadotropin consisting of a completely intact α-subunit linked via a decameric peptide containing five Ser-Gly repeat sequences to the β-chain without its C-terminal peptide was selected.

Byly připraveny dva konstrukty, které se lišily ve vedoucí sekvenci. První z nich obsahoval přirozenou vedoucí sekvenci β-podjednotky hCG. Pro omezení možných problémů při translaci mRNA způsobených přítomností významného množství (přibližně 40% v β-podjednotce hCG) řídce používaných kodonů bylo prvních 30 baží kódující sekvence změněno na preferenční kodony pro Dictyostelium. Při konstrukci druhého konstruktu se předpokládalo, že proteiny účastnící se na sekreci v savčích buňkách v ER a Golgiho aparátu nemusí být mezi druhy konzervované. Pro usnadnění transportu v Dictyostelium byl vedoucí peptid lidské β-podjednotky zaměněn za vedoucí peptid Dictyostelium glykoproteinu, Prespore proteinu A (PsA), který je transportován přes plasmatickou membránu. Tato vedoucí sekvence byla již dříve použita pro expresi secernovaných heterologních proteinů (Dittrich, W. et al., (1994), Bio/Technology 12:Two constructs were prepared that differed in the leader sequence. The first contained the natural leader sequence of the hCG β-subunit. To reduce the potential for mRNA translation problems caused by the presence of significant amounts (approximately 40% in the β-subunit of hCG) of the rarely used codons, the first 30 bases of the coding sequence were changed to Dictyostelium preference codons. In the construction of the second construct, it was believed that proteins involved in secretion in mammalian cells in the ER and Golgi apparatus need not be conserved between species. To facilitate transport in Dictyostelium, the leader peptide of the human β-subunit was replaced with the leader peptide of Dictyostelium glycoprotein, Prespore Protein A (PsA), which is transported across the plasma membrane. This leader sequence has previously been used to express secreted heterologous proteins (Dittrich, W. et al., (1994), Bio / Technology 12:

614-618).614-618).

Expresní plasmidy byly označeny JV158 (adaptované kodony s vedoucím peptidem β-podjednotky) a JVlOPsA (s vedoucím peptidem PsA) a byly získány z MB12n.The expression plasmids were designated JV158 (adapted codons with a β-subunit leader peptide) and JV1OPsA (with a PsA leader peptide) and were obtained from MB12n.

MB12n je 8,25 kb extrachromosomální plasmid v Dictyostelium discoideum (Dd), který obsahuje jedinečné restrikční místo mezi Dd promotorem a terminátorem. MBl2n se skládá z 2,9 kb (Clal-HincII částečného tráveného fragmentu) z pl55dl (Hughes, J.E. et al., (1994), Mol. Cell Biol. 14: 6117-6124) obsahujícíhoMB12n is an 8.25 kb extrachromosomal plasmid in Dictyostelium discoideum (Dd), which contains a unique restriction site between the Dd promoter and terminator. MB12n consists of a 2.9 kb (Clal-HincII partial digested fragment) p155dl (Hughes, J. E. et al., (1994), Mol. Cell Biol. 14: 6117-6124) containing

Dd sekvenci rozpoznávající počátek replikace a dva Dd geny nutné pro replikaci (G4/D5 a G5/D6), 2,95 kb fragmentu z pBluescript (Stratagene) pro propagaci v E. coli, 1,3 kb fragmentu obsahujícího gen pro resistenci na blasticidin mezi Dd Actine 15 promotorem a Dd Actin 8 terminátorem (z pBSR2, Sutoh, K. (1993), Plasmid 30: 150-154) a 1,05 kb klonovací kazety obsahující Dd Actin 15 promotor, jedinečné BglII restrikční místo a Dd 2H3Dd sequence recognizing origin of replication and two Dd genes required for replication (G4 / D5 and G5 / D6), a 2.95 kb fragment from pBluescript (Stratagene) for propagation in E. coli, a 1.3 kb fragment containing the blasticidin resistance gene between the Dd Actine 15 promoter and the Dd Actin 8 terminator (from pBSR2, Sutoh, K. (1993), Plasmid 30: 150-154) and a 1.05 kb cloning cassette containing the Dd Actin 15 promoter, a unique BglII restriction site and Dd 2H3

terminátor (z BS18.2H3, Kumagai, A. et al., (1989), Cell 57:terminator (from BS18.2H3, Kumagai, A. et al., (1989), Cell 57:

265-275) . BglII místo v genu pro resistenci na blasticidin bylo odstraněno mutagenesi. Obr. 1A ukazuje relativní pozice těchto složek v MB12n. Plasmid MB12n/PsA obsahuje spojovací sekvenci kódující 19 aminokyselinový PsA vedoucí peptid (Early, E.A. et al., (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 3458-3466; Dittrich, W. et al., (1994), Bio/Technology 12: 614-618) klonovaný do jedinečného BglII místa. Plasmid má jedinečné Ndel místo v 3' části PsA sekvence a jedinečné BglII místo 5' k 2H3 terminátoru, pro usnadnění klonování ve čtecím rámci. BglII místo sousedící s Dd Actin 15 promotorem bylo eliminováno během klonování (viz tabulka 1) .265-275). The BglII site in the blasticidin resistance gene was removed by mutagenesis. Giant. 1A shows the relative positions of these components in MB12n. Plasmid MB12n / PsA contains a linker encoding a 19 amino acid PsA leader peptide (Early, EA et al., (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 3458-3466; Dittrich, W. et al., (1994), Bio / Technology 12: 614-618) cloned into a unique BglII site. The plasmid has a unique NdeI site in the 3 'part of the PsA sequence and a unique BglII site 5' to the 2H3 terminator, to facilitate cloning in the reading frame. The BglII site flanking the Dd Actin 15 promoter was eliminated during cloning (see Table 1).

Za použití primerů b20aarev a alphater (tabulka 1) byl jednořetězcový hCG amplifikován PCR z plasmidu obsahujícího hCG mutant 1 [β-(1-111)-(Ser-Gly)_s-a-(1-92)] (Heikoop, J.C. et al., (1997), Eur. J. Biochem. 245: 656-662). Výsledný fragment byl klonován v MB12n po trávení BglII. Primer b20aarev je navržen pro optimalizaci prvních 10 aminokyselin β-řetězce pro preferenční kodony v Dictyostelium. Stejný templát byl amplifikován s primery bmature (tabulka 1) a alphater za zisku produktu, který byl, po trávení Ndel a BglII, klonován do MB12n/PsA. Výsledné plasmidy byly označeny JSV158 a JV10PSA, v příslušném pořadí (viz obr. 1B a 1C). PCR byla provedena za použití Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim) systému, za použití následujících parametrů cyklu: denaturace po dobu 3 minut při 94 °C, potom 25 cyklů o 30 sekundách při 94 °C, 30 sekundách při 37 °C a 60 sekundách při 72 °C. PCR produkty byly separovány gelovou elektroforesou, byly excidovány z gelu a byly přečištěny za použití Qiaex II (qiagen) před restrikčním trávením a klonováním. Všechny DNA sekvence byly analyzovány a potvrzeny dideoxy-sekvenováním.Using primers b20aarev and alphater (Table 1), single stranded hCG was amplified by PCR from a plasmid containing hCG mutant 1 [β- (1-111) - (Ser-Gly) _s -a- (1-92)] (Heikoop, JC et. al., (1997) Eur. J. Biochem. 245: 656-662). The resulting fragment was cloned in MB12n after digestion with BglII. Primer b20aarev is designed to optimize the first 10 amino acids of the β-chain for preferential codons in Dictyostelium. The same template was amplified with bmature primers (Table 1) and alphater to yield a product that was cloned into MB12n / PsA after digestion with NdeI and BglII. The resulting plasmids were designated JSV158 and JV10PSA, respectively (see Figures 1B and 1C). PCR was performed using the Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim) system, using the following cycle parameters: denaturation for 3 minutes at 94 ° C, then 25 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 37 ° C and 60 seconds at 72 ° C. The PCR products were separated by gel electrophoresis, excised from the gel, and purified using Qiaex II (qiagen) before restriction digestion and cloning. All DNA sequences were analyzed and confirmed by dideoxy sequencing.

Tabulka 1: DNA sekvence pro oligonukleotidy a PsA spojovací sekvenci. PsA sekvence také ukazuje sekvenci PsA vedoucí sekvence, stejně jako jedinečná restrikční místa Bglll a Ndel.Table 1: DNA sequence for oligonucleotides and PsA linker sequence. The PsA sequence also shows the PsA leader sequence as well as the unique BglII and NdeI restriction sites.

Oligo ID: SekvenceOligo ID: Sequence

PsA: (Bglll) Ndel Bglll agatcatgaa attccaacat acatttattg catíattatc actattaaca tatgcaaatg cagaíctPsA: (Bglll) Ndel Bglll agatcatgaa attccaacat acatttattg catatattatc actattaaca tatgcaaatg cagaíct

MK FQ HT FIALLS LLT YANA b20aarev: gcagatctat ggagatgttc caaggtctcc tccttttatt actcctcagc atgggtggta catgggcatc caag alphater: ccagatctaa acatttaaga tttgtg bmature: gctatcgaca tatgcaaatg catccaagga gccgcttcgMK FQ HT FIALLS LLT YANA b20aarev: gcagatctat ggagatgttc caggtctcc tccttttatt actcctcagc atgggtggta catgggcatc caag alphater: ccagatctaa acatttaaga tttgtg bmature: gctatcgaca

Příklad 2: Exprese jednořetězcového hCG v DictyosteliumExample 2: Expression of single-chain hCG in Dictyostelium

Dictyostelium kmen AX3 byl kultivován do hustoty 2 x 10^e buněk na ml v axenickém mediu před elektroporací. Podmínky elektroporace byly v podstatě stejné, jak byly popsány (Mann, S.K.O. et al., (1994), v: Cell Biology: a Laboratory Handbook,Dictyostelium strain AX3 was cultured to a density of 2 x 10 ^e cells per ml in axenic medium before electroporation. The electroporation conditions were essentially the same as described (Mann, SKO et al., (1994), in: Cell Biology: a Laboratory Handbook,

J.E. Celíš ed., Academie Press, svazek 1, str. 412-452), za použití 1 μg plasmidové DNA pro elektroporací 10⁷ buněk.JE Celis ed., Academic Press, Vol. 1, pp. 412-452), using 1 µg plasmid DNA for electroporation of 10 ⁷ cells.

Plasmidy JV158 a JV10PSA byly transformovány do Dictyostelium, stejně jako MB12n kontrolní plasmid. Po elektroporací byly buňky z jedné kyvety umístěny na 10 cm plotnu. 12 hodin po elektroporací byl přidán blasticidin v konečné koncentraci 5 ^g/ml. 24hodin po elektroporací bylo medium obsahující mrtvé buňky aspirováno, buňky byly re suspendovány pipetováním ve mediu obsahujícím blasticidin a byly rozděleny do 24 jamek v 96-jamkové » 0 • * • · • · · · « · mikrotitrační plotně. 24 jamek bylo ředěno sériově 10-, 100- a 1000-krát. Medium obsahující blasticidin bylo vyměňováno každé 3 dny. Pozitivní jamky byly identifikovány 5-9 dnů po umístění na plotnu a transformační účinnost byla hodnocena ze sériového ředění. Obvykle bylo získáno mezi 1 x 10⁴ a 6 x 10⁴ kolonií na ptg DNA. Jednotlivé jamky byly potom vybrány pro další pokusy. Jedna jamka obsahovala 200 μΐ media, což je dostatečné množství pro DELFIA^r hLH test, který má 100% zkříženou reaktivitu s hCG. Test je založen na přímé sandwichové technice, ve které jsou monoklonální protilátky zaměřené proti specifickému antigenu na β-podjednotce imobilizovány. Po vazbě intaktního (jednořetězcového) hCG na protilátku na pevné fázi se navážou a kvantifikují europiem značené protilátky proti specifickému antigennímu místu na α-podjednotce. Test se provede podle návodu výrobce (Wallac Oy, Turku, Finland).The plasmids JV158 and JV10PSA were transformed into Dictyostelium as well as the MB12n control plasmid. After electroporation, cells from one cuvette were placed on a 10 cm plate. 12 hours after electroporation, blasticidin was added at a final concentration of 5 µg / ml. 24 hours after electroporation, the cell containing the dead cells was aspirated, the cells were resuspended by pipetting in the blasticidin-containing medium and distributed into 24 wells in a 96-well microtiter plate. 24 wells were serially diluted 10-, 100- and 1000-fold. Medium containing blasticidin was replaced every 3 days. Positive wells were identified 5-9 days after plating and transformation efficiency was evaluated from serial dilutions. Usually between 1 x 10 ⁴ and 6 x 10 ⁴ colonies per ptg DNA were obtained. Individual wells were then selected for further experiments. One well contained 200 μΐ medium, which is sufficient for the DELFIA ^r hLH test, which has 100% cross-reactivity with hCG. The assay is based on a direct sandwich technique in which monoclonal antibodies directed against a specific antigen on the β-subunit are immobilized. Following binding of intact (single chain) hCG to the solid phase antibody, europium-labeled antibodies against the specific antigenic site on the α-subunit are bound and quantified. The test is performed according to the manufacturer's instructions (Wallac Oy, Turku, Finland).

Výsledky jasně ukazují, že imunologicky aktivní jednořetězcový hCG je produkován z obou expresních konstruktů a nikoliv z kontrolního plasmidu. Kromě toho, množství jednořetězcového hCG produkované z JV158 (267 mU/ml) se zdá být významně vyšší než množství produkované z JV10PSA (4,9 mU/ml), což naznačuje, že v tomto případě je lidský S-hCG vedoucí peptid účinější než Dictyostelium vedoucí peptid z PsA.The results clearly show that the immunologically active single chain hCG is produced from both expression constructs and not from the control plasmid. In addition, the amount of single chain hCG produced from JV158 (267 mU / ml) appears to be significantly higher than the amount produced from JV10PSA (4.9 mU / ml), suggesting that in this case the human S-hCG leader peptide is more effective than Dictyostelium leading peptide from PsA.

Kinetiky produkce jednořetězcového hCG byly studovány pro buňky transformované JV158. Různé hustoty transformovaných buněk byly umístěny na plotny v axenickém mediu, byly kultivovány do konfluence a takto byly udržovány po dobu několika dnů, bez jakékoliv výměny media. Alikvoty media byly odebírány každých 24 hodin a byly provedena jejich analýza na přítomnost jednořetězcového hCG. Úroveň exprese dosáhla maxima 4 až 5 dnů poté, co buňky dosáhly konfluence (data nejsou uvedena). Protože buňky se začínají odlučovat od plotny přibližně 6-7 dnů po • b dosažení konfluence, je medium sklízeno v den 5 po dosažení konfluence.Kinetics of single chain hCG production were studied for JV158 transformed cells. Different densities of transformed cells were plated in axenic media, cultured to confluence and thus maintained for several days, without any medium change. Aliquots of the media were taken every 24 hours and analyzed for the presence of single-chain hCG. The expression level reached a maximum of 4-5 days after the cells reached confluence (data not shown). Since cells begin to separate from the plate approximately 6-7 days after confluence is reached, the medium is harvested on day 5 after confluence.

Příklad 3: Aktivita jednořetězcového hCG exprimovaného v DictyosteliumExample 3: Activity of single-chain hCG expressed in Dictyostelium

Schopnost vazby jednořetězcového hCG z Dictyostelium na lidský LH/CG receptor byla stanovena testem kompetitivní vazby s heterodimerním hCG. CHO buňky exprimující lidský LH/CG receptor (Jia, X.-C. et al. (1991), Mol. Endocrinol. 5: 759-768) byly simultáně inkubovány se ^12sI-hCG a přečištěným materiálem ze supernatantu buněčné kultury Dictyostelium.The ability to bind single chain hCG from Dictyostelium to the human LH / CG receptor was determined by competitive binding assay with heterodimeric hCG. CHO cells expressing the human LH / CG receptor (Jia, X.-C. et al. (1991), Mol. Endocrinol. 5: 759-768) were co-incubated with ^12s I-hCG and purified material from Dictyostelium cell culture supernatant.

Vazebná aktivita k receptoru pro přečištěný jednořetězcový hCG byla kvantifikována testem vytěsnění radioaktivně značeného ligandu z receptoru na membránových frakcích izolovaných z exponenciálně rostoucích buněk. V celkovém objemu 0,5 ml pufru (konečné složení 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 0,1% hovězí sérový albumin, pH 7,4) bylo fixní množství membránového proteinu indukováno se ^:L2sI-hCG (20000 cpm, přibližně 12 pM) a stoupajícím množstvím kompetičního proteinu po dobu 18 hodin při teplotě okolí. ¹²⁵I-značený hCG (NEX-106) byl získán od DuPont de Nemours. Specifická vazba byla 10-12% celkové přidané radioaktivity. Po inkubaci byly navázané a volné hormony separovány centrifugováním. Vysoce přečištěné rekombinantní gonadotropiny byly použity jako standardy.Receptor binding activity for purified single chain hCG was quantified by assay for displacement of radiolabeled ligand from receptor on membrane fractions isolated from exponentially growing cells. In a total volume of 0.5 ml of buffer (final composition 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl ₂ , 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4), a fixed amount of membrane protein was induced with ^{: L2s} I-hCG (20000 cpm) , about 12 pM) and an increasing amount of competition protein for 18 hours at ambient temperature. ¹²⁵ I-labeled hCG (NEX-106) was obtained from DuPont de Nemours. Specific binding was 10-12% of the total radioactivity added. After incubation, bound and free hormones were separated by centrifugation. Highly purified recombinant gonadotropins were used as standards.

Pro přečištění hCG z buněčné kultury Dictyostelium bylo z velkých (22x22 cm) kultivačních ploten odebráno medium.Medium was removed from large (22x22 cm) culture plates to purify hCG from Dictyostelium cell culture.

Přečištění bylo provedeno za použití programovatelného FPLC systému (Pharmacia, Roosendaal, The Netherlands) za použití kontrolního a chromatografického supervizního systému UNICORN (Pharmacia, Roosendaal, The Netherlands). Přečištění • · • * · « · · jednořetězcového hCG bylo provedeno za použití kombinace hydrofobní interakce a imunochromatografie s monoklonálními protilátkami specifickými pro LH/CG β-podjednotku. Pro tento účel bylo připraveno 150 ml media s koncentrací jednořetězcového hCG 0,372 jednotek/ml podle DELFIA^R. Za použití tohoto media byly získány přibližně 3 jednotky přečištěného jednořetězcového hCG (přibližně 5% výtěžek). Všechny postupy byly provedeny při 4 °C.Purification was performed using a programmable FPLC system (Pharmacia, Roosendaal, The Netherlands) using a UNICORN control and chromatographic supervisory system (Pharmacia, Roosendaal, The Netherlands). Single-chain hCG purification was performed using a combination of hydrophobic interaction and immunochromatography with monoclonal antibodies specific for the LH / CG β-subunit. 150 ml medium with a single-chain hCG concentration of 0.372 units / ml according to DELFIA ^R was prepared for this purpose. Using this medium, approximately 3 units of purified single chain hCG were obtained (approximately 5% yield). All procedures were performed at 4 ° C.

Současná inkubace s různými koncentracemi přirozeného hCG, přirozeného hLG nebo jednořetězcového hCG vytěsňovala ^12sI-hCG z vazby způsobem závislým na dávce (obr. 2). Křivky ukazují, že materiál produkovaný v Dictyostelium je schopen vazby na lidský LH/CG receptor. Afinita pro receptor je srovnatelná s afinitou jednořetězcového hCG produkovaného v CHO buňkách, o kterém bylo prokázáno, že je významně méně účinný ve vytěsnění ¹²⁵I-hCG z vazby než heterodimer hCG. Proto se zdá, že neexistují významné rozdíly ve vazebné kapacitě mezi jednořetězcovým hCG produkovaným v Dictyostelium ve srovnání s jednořetězcovým hCG produkovaným v CHO buňkách.Co-incubation with various concentrations of wild-type hCG, wild-type hLG or single-chain hCG displaced ^{12s of} I-hCG from binding in a dose-dependent manner (Fig. 2). The curves show that the material produced in Dictyostelium is capable of binding to the human LH / CG receptor. The affinity for the receptor is comparable to that of single chain hCG produced in CHO cells, which has been shown to be significantly less effective in displacing ¹²⁵ I-hCG from binding than the hCG heterodimer. Therefore, there appear to be no significant differences in binding capacity between single-chain hCG produced in Dictyostelium compared to single-chain hCG produced in CHO cells.

Biologická aktivita jednořetězcového hCG z Dictyostelium byla analyzována stanovením jeho schopnosti stimulovat produkci cAMP v CHO buňkách exprimujících lidský LH/CG receptor. Buňky byly inkubovány po dobu 4 hodin se stoupajícími koncentracemi hormonu za přítomnosti 0,1 mM 3-isobutyl-l-methylxantinu. Extracelulární cAMP byl stanoven RIA (Immunotech).The biological activity of single chain hCG from Dictyostelium was analyzed by determining its ability to stimulate cAMP production in CHO cells expressing the human LH / CG receptor. Cells were incubated for 4 hours with increasing hormone concentrations in the presence of 0.1 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine. Extracellular cAMP was determined by RIA (Immunotech).

Výsledky ukazují, že jednořetězcový hCG produkovaný v Dictyostelium je schopen aktivace lidského LH/CG receptoru, což vede k produkci cAMP. Byl zjištěn pouze malý rozdíl v účinnosti mezi jednořetězcovým hCG produkovaným v Dictyostelium a materiálem produkovaným v CHO buňkách (IC hodnota přibližně 5-krát nižší).The results show that the single-chain hCG produced in Dictyostelium is capable of activating the human LH / CG receptor, resulting in cAMP production. Only a small difference in efficacy was found between single-chain hCG produced in Dictyostelium and material produced in CHO cells (IC value approximately 5-fold lower).

•I *·»• I *

Příklad 4: Exprese a biologická aktivita heterodimerního hCG v DictyosteliumExample 4: Expression and biological activity of heterodimeric hCG in Dictyostelium

Pokusili jsme se o expresi heterodimerního hCG v Dictyostelium. Pro expresi a- a β-podjednotky byly vytvořeny dva plasmidy. Jejich struktura a celková organisace jsou v podstatě stejné se strukturou a organisací MB12n, který byl popsán v příkladu 1. Pro usnadnění exprese dvou nezávislých plasmidů v Dd jsme nahradily kazetu resistence na blasticidin v MBl2n 2,4 kb KpnI-Xbal fragmentem z pl55dl (Hughes, J.E. et al., (1994), Mol.We attempted to express heterodimeric hCG in Dictyostelium. Two plasmids were generated for expression of the α- and β-subunits. Their structure and overall organization are essentially the same as that of MB12n described in Example 1. To facilitate expression of two independent plasmids in Dd, we replaced the blasticidin resistance cassette in MBl2n with a 2.4 kb KpnI-XbaI fragment from p1555dl (Hughes , JE et al., (1994) Mol.

Cell Biol. 14: 6117-6124), který obsahuje neomycinovou kazetu, čímž jsme získali MB12neo. Pro konstrukci expresního vektoru pro a-podjednotku byla její přirozená cDNA sekvence produkovaná pomocí PCR za použití primerů, které vkládají BglII restrikční místo jak na 5'-konec, tak na 3 '-konec fragmentu, takže tento fragment může být klonován do MB12neo. Pro konstrukci expresního vektoru pro β-podjednotku hCG byl MB12n modifikován tak, aby obsahoval jiné jedinečné restrikční místo (Sphl) 3' v BglII klonovacím místu (viz příklad 1) . cDNA pro β-podj ednotku hCG byla amplifikována za použití 5'-primeru, což vedlo k alteraci prvních 30 baží kódující sekvence tak, že byly tvořeny preferenčními kodony pro Dictyostelium (viz příklad 1). Primery také vkládaly vhodná restrikční místa jak na 5' konec (BglII), tak na 3' konec (Sphl) fragmentu, což usnadnilo přímé klonování.Cell Biol. 14: 6117-6124), which contains a neomycin cassette to obtain MB12neo. To construct the expression vector for the α-subunit, its native cDNA sequence was produced by PCR using primers that insert a BglII restriction site at both the 5'-end and the 3'-end of the fragment so that this fragment can be cloned into MB12neo. To construct the expression vector for the β-subunit of hCG, MB12n was modified to contain another unique restriction site (SphI) 3 'in the BglII cloning site (see Example 1). The cDNA for the β-subunit of hCG was amplified using the 5'-primer, resulting in alteration of the first 30 bases of the coding sequence so that they were formed by preferential codons for Dictyostelium (see Example 1). The primers also inserted suitable restriction sites at both the 5 'end (BglII) and the 3' end (SphI) of the fragment, which facilitated direct cloning.

Dva expresní plasmidy byly transformovány simultáně do Dictyostelium. Po transformaci byly buňky umístěny na plotny pro klonální ředění. Klonální transformanty byly potom selektovány a byly dále kultivovány pro analýzu. Množství hCG secernovaného Dictyostelium bylo stanoveno podle návodu výrobce Delfia^R hLH testu (Wallac Oy, Turku, Finland), který má 100% zkříženou reaktivitu s hCG. Výsledky jasně ukazují, že imunologicky aktivní hCG je produkován v Dictyostelium.Two expression plasmids were transformed simultaneously into Dictyostelium. After transformation, cells were plated on clonal dilution plates. Clonal transformants were then selected and further cultured for analysis. The amount of hCG secreted by Dictyostelium was determined according to the manufacturer's instructions for the Delfia ^R hLH assay (Wallac Oy, Turku, Finland), which has 100% cross-reactivity with hCG. The results clearly show that immunologically active hCG is produced in Dictyostelium.

• ···· ·» *• ···· · »

·· • · ···· • · ··

A · «A · «

Φ • βΦ • β

ΦΦΦ· ·»ΦΦΦ · · »

Ačkoliv byla přítomnost heterodimerního hCG demonstrována v mediu pomocí detekce epitopů, byly nutné další pokusy pro stanovení toho, zda je hCG produkovaný v Dictyostelium biologicky aktivní. Kvantifikace byla založena na imunoreaktivitě.Although the presence of heterodimeric hCG was demonstrated in the medium by epitope detection, further attempts were necessary to determine whether hCG produced in Dictyostelium was biologically active. Quantification was based on immunoreactivity.

Biologická aktivita heterodimerního hCG z Dictyostelium byla analyzována vyšetřením jeho schopnosti aktivovat lidský LH/CG receptor v luciferasovém testu. Výsledky ukazují, že heterodimerní hCG produkovaný v Dictyostelium je schopen aktivovat lidský LH/CG receptor (obr. 4). Kromě toho, jeho biologická aktivita je srovnatelná (hodnota IC_so přibližně dvakrát vyšší) s biologickou aktivitou přirozeného hCG produkovaného v CHO buňkách.The biological activity of heterodimeric hCG from Dictyostelium was analyzed by examining its ability to activate the human LH / CG receptor in a luciferase assay. The results show that the heterodimeric hCG produced in Dictyostelium is able to activate the human LH / CG receptor (Fig. 4). In addition, its biological activity is comparable (IC ₅₀ value approximately twice as high) to that of native hCG produced in CHO cells.

Příklad 5: Exprese a biologická aktivita heterodimerního FSH v DictyosteliumExample 5: Expression and biological activity of heterodimeric FSH in Dictyostelium

Pro výzkum toho, zda je Dictyostelium také schopno produkovat jiné komplexní glykoproteinové hormony, jsme studovali produkci FSH v tomto organismu. Stejným způsobem jako pro hCG (příklad 4) jsme připravili dva expresní plasmidy. Pro konstrukci expresního vektoru pro β-podjednotku FSH byla cDNA amplifikována za použití 5'-primeru, což vedlo k alteraci prvních 27 baží kódující sekvence tak, že byly vytvořeny preferenčními kodony pro Dictyostelium a klonování bylo potom provedeno způsobem popsaným pro β-podjednotku hCG. Po transformaci Dictyostelium byly buňky umístěny na plotny pro klonální ředění. Klonální transformanty byly potom selektovány a byly dále kultivovány pro analýzu.To investigate whether Dictyostelium is also capable of producing other complex glycoprotein hormones, we have studied FSH production in this organism. In the same manner as for hCG (Example 4), we prepared two expression plasmids. To construct the expression vector for the β-subunit of FSH, the cDNA was amplified using the 5'-primer, resulting in alteration of the first 27 bases of the coding sequence so that they were generated by preferential codons for Dictyostelium and cloning was then performed as described for the β-subunit of hCG. After Dictyostelium transformation, cells were plated for clonal dilution plates. Clonal transformants were then selected and further cultured for analysis.

Množství FSH secernované Dictyostelium bylo stanoveno sandwichovým imunotestem (SS-artikel). Výsledky ukazují, že v Dictyostelium je produkován imunologicky aktivní FSH. Kromě toho, heterodimerní FSH produkovaný v Dictyostelium je také schopný aktivovat lidský FSH receptor (obr. 5).The amount of FSH secreted by Dictyostelium was determined by a sandwich immunoassay (SS-article). The results show that immunologically active FSH is produced in Dictyostelium. In addition, heterodimeric FSH produced in Dictyostelium is also capable of activating the human FSH receptor (Fig. 5).

• · · · • · • · ···· ·· ·· ··· ·· ··• · · · · · · · · · · · · · · ·

Příklad 6: Náhodná mutagenese vybraného regionu hCG v DictyosteliumExample 6: Random mutagenesis of a selected region of hCG in Dictyostelium

Protože jsme ukázali, že Dictyostelium je schopno produkovat biologicky aktivní gonadotropiny, bylo naším dalším cílem vyvinout postup pro náhodnou mutagenesi. Pro tento účel jsme vybrali dvě aminokyseliny v determinantní smyčce hCG, o kterých bylo prokázáno, že se účastní vazby na receptor a přenosu signálu.Since we have shown that Dictyostelium is capable of producing biologically active gonadotropins, our next goal was to develop a procedure for random mutagenesis. For this purpose, we selected two amino acids in the hCG determinant loop, which were shown to be involved in receptor binding and signal transduction.

Specifické substituce baží byly vloženy místně cílenou mutagenesi a kombinování PCR fragmentů s překrývajícími se sekvencemi, za standardních podmínek PCR. Primery byly navrženy tak, aby měnily aminokyseliny 94 a 95 v β-podjednotce hCG. První dva nukleotidy obou kodonů byly měněny zcela náhodně (A, C, T nebo G) , zatímco třetí baze byla omezena na G nebo T pro minimalizaci procenta vložených stop-kodonů. PCR fragmenty byly separovány a byly subklonovány v pCR^R2.1 (Invitrogen), Leek, The Netherlands). Primery byly vybrány tak, že subklonované PCR fragmenty obsahovaly BglII místo na 5'-konci a Sphl místo na 3'-konci. Po PCR a klonování byl soubor pCR^R2.1 konstruktů transformován do E. coli. Potom byla ze souboru 200 transformantů izolována DNA a po restrikčním trávení BglII/Sphl byly mutované fragmenty subklonovány do MB12n, který obsahoval BglII a Sphl místo. Po umístění E. coli transformovaných plasmidy MB12 obsahujícími náhodně mutované fragmenty na plotny bylo získáno 400 kolonií a byla připravena DNA.Specific base substitutions were introduced by site-directed mutagenesis and combining PCR fragments with overlapping sequences, under standard PCR conditions. The primers were designed to change amino acids 94 and 95 in the β-subunit of hCG. The first two nucleotides of both codons were changed quite randomly (A, C, T or G), while the third base was limited to G or T to minimize the percentage of inserted stop codons. The PCR fragments were separated and were subcloned in pCR ^R 2.1 (Invitrogen), Leek, The Netherlands). Primers were selected such that the subcloned PCR fragments contained a BglII site at the 5'-end and an SphI site at the 3'-end. After PCR and cloning, a set of pCR ^R 2.1 constructs was transformed into E. coli. DNA was then isolated from a pool of 200 transformants, and after restriction digestion with BglII / SphI, the mutated fragments were subcloned into MB12n containing the BglII and SphI site. After placement of E. coli transformed with plasmids MB12 containing randomly mutated fragments on the plates, 400 colonies were obtained and DNA was prepared.

Dictyostelium byly transformovány simultáně expresním pro α-podjednotku pomocí elektroporace. Selekce blasticidinem (10 ^g/ml) byla provedena 5 hodin po elektroporaci. Další den byly buňky klonálně ředěny v 96-jamkových plotnách za použití 4-násobných ředění a byla zahájena selekce neomycinem (10 /xg/ml) .Dictyostelium was transformed simultaneously by expression for α-subunit by electroporation. Selection with blasticidin (10 µg / ml) was performed 5 hours after electroporation. The next day, cells were clonally diluted in 96-well plates using 4-fold dilutions and neomycin selection (10 µg / ml) was initiated.

• ·• ·

Medium bylo vyměňováno každé 3-4 dny za zachování selekčních podmínek. Pozitivní jamky byly identifikovány 11-14 dní po elektroporaci a účinnost transformace byla stanovena ze sériových ředění. Obvykle bylo získáno 500 transformantů při elektroporaci 10⁷ buněk 1 μ<3 jak hCGa, tak hCGS vektorů. Jedna jamka obsahovala 200 μΐ media. Větší množství media pro přečištění bylo získáno z větších (22 x 22 cm)kultivačních ploten.Medium was changed every 3-4 days while maintaining selection conditions. Positive wells were identified 11-14 days after electroporation and transformation efficiency was determined from serial dilutions. Usually, 500 transformants were obtained by electroporation of 10 ⁷ cells with 1 μ <3 of both hCGα and hCGS vectors. Each well contained 200 μΐ of medium. Larger amounts of purification medium were obtained from larger (22 x 22 cm) culture plates.

Supernatanty 85 klonů Dictyostelium byly analyzovány na přítomnost imunoaktivity a biologické aktivity. Pro kontrolu bylo na 96-jamkové plotně přítomno několik klonů produkujících přirozený hCG a několik netransformovaných Dictyostelium klonů. Koncentrace přirozeného a mutantního hCG byly stanoveny za použití DELFIE^R hLH testu (Wallac Oy, Turku, Finland), který má 100% zkříženou reaktivitu s hCG. Potom byla stanovena in vitro biologická aktivita na lidském LH/CG receptoru. Polovina z 85 analyzovaných mutantů měla B/I poměry od 0,35 do 1,05. Při započítání variací 2 samostatných analýz může být považována aktivita těchto mutantů za srovnatelnou s aktivitou přirozeného hCG. Přibližně 40% těchto mutantů mělo snížený poměr B/I. Toto bylo předpokládáno, protože bylo prokázáno, že mutované aminokyseliny 94 a 95 se účastní vazby na receptor a jeho aktivace. Skutečnost, že 11 klonů nevykazovalo žádnou produkci hCG je pravděpodobně způsobena interferencí alterovaných aminokyselin se správným skládáním mutovaného β-polypeptidu a/nebo interferencí s asociací s α-podjednotkou nebo skutečností, že ne všechny klony obsahuj i expresní konstrukty pro a- i β-podjednotku. Dvanáct klonů s různými poměry B/I bylo vybráno pro podrobnou analýzu.Supernatants of 85 Dictyostelium clones were analyzed for the presence of immunoactivity and biological activity. For control, several clones producing native hCG and several untransformed Dictyostelium clones were present in a 96-well plate. Natural and mutant hCG concentrations were determined using the DELFIE ^R hLH assay (Wallac Oy, Turku, Finland), which has 100% cross-reactivity with hCG. The in vitro biological activity at the human LH / CG receptor was then determined. Half of the 85 mutants analyzed had B / I ratios ranging from 0.35 to 1.05. Including variations of 2 separate assays, the activity of these mutants can be considered to be comparable to that of natural hCG. Approximately 40% of these mutants had a reduced B / I ratio. This was believed because mutated amino acids 94 and 95 were shown to be involved in receptor binding and activation. The fact that 11 clones showed no hCG production is probably due to the interference of the altered amino acids with proper folding of the mutated β-polypeptide and / or interference with α-subunit association, or the fact that not all clones contain both α- and β-subunit expression constructs. . Twelve clones with different B / I ratios were selected for detailed analysis.

Vybrané klony byly dále kultivovány na 6-jamkových plotnách do dosažení konfluence a supernatanty buněčných kultur byly odebírány po dalších 4 dnech, 4 z 20 klonů neprodukovaly žádný • · • · detekovatelný hCG. Toto odpovídá výsledkům získaným pro tyto klony v počátečním skríningu. V dalších klonech se množství produkovaného hCG významně lišilo (116-2118 mU/ml). Supernatanty buněčných kultur byly analyzovány na přítomnost in vitro biologické aktivity hCG při různých koncentracích. Všechny mutanty, které vykazovaly B/I poměry v rozmezí poměrů pro přirozený hCG v počátečním vyšetření vykazovaly také biologickou aktivitu přirozeného hCG při podrobnějším vyšetření. 4 supernatanty, které nevykazovaly žádnou imunologickou aktivitu, nebyly také schopny aktivovat LH/CG receptor. Proto jsme usoudili, že tyto klony neprodukují žádný hCG. Dále, všechny mutanty se sníženým poměrem B/I v počátečním vyšetření měly také sníženou hodnotu IC . Jejich poměry B/I se pohybovaly v rozsahu od 2-krát až > 100-krát nižších hodnot než pro přirozený hCG produkovaný v Dictyostelium. Křivky dávka/odpověď pro osm mutantů jsou uvedeny na obr. 6.Selected clones were further cultured on 6-well plates until confluency was achieved and cell culture supernatants were harvested after an additional 4 days, 4 of the 20 clones produced no detectable hCG. This corresponds to the results obtained for these clones in the initial screening. In other clones, the amount of hCG produced varied significantly (116-2118 mU / ml). Cell culture supernatants were analyzed for the presence of in vitro biological activity of hCG at various concentrations. All mutants that exhibited B / I ratios in the range of ratios for wild-type hCG at baseline also showed biological activity of wild-type hCG at more detailed screening. The 4 supernatants that showed no immunological activity were also unable to activate the LH / CG receptor. We therefore concluded that these clones did not produce any hCG. Furthermore, all mutants with a reduced B / I ratio at baseline also had a reduced IC value. Their B / I ratios ranged from 2 to 100 times lower than for natural hCG produced in Dictyostelium. The dose / response curves for the eight mutants are shown in Figure 6.

Pro korelaci pozorovaných biologických aktivit s mutacemi přítomnými v β-podjednotce byly mutované expresní vektory sekvenovány. Izolovali jsme celkovou DNA z vybraných Dictyostelium klonů a transformovali jsme jí do E. coli. Pro každý Dictyostelium klon bylo mnoho transformantů analyzováno PCR pro kolonie na přítomnost plasmidů pro α-podjednotku nebo plasmidů pro β-podjednotku. Potom byla DNA izolována z několika transformantů obsahujících plasmid pro β-podjednotku a byla provedena analýza sekvence mutovaných regionů za použití automatizovaného sekvenátoru (Pharmacia) .To correlate observed biological activities with mutations present in the β-subunit, mutated expression vectors were sequenced. We isolated total DNA from selected Dictyostelium clones and transformed it into E. coli. For each Dictyostelium clone, many transformants were analyzed by colony PCR for the presence of α-subunit plasmids or β-subunit plasmids. The DNA was then isolated from several transformants containing the β-subunit plasmid and sequence analysis of the mutated regions was performed using an automated sequencer (Pharmacia).

Bylo zjištěno, že většina Dictyostelium klonů obsahuje pouze jeden typ mutace v hCGfi expresním vektoru. Tyto klony produkovaly jeden typ mutantu. Kromě toho jsme zjistili, že většina analyzovaných klonů Dictyostelium obsahuje nepříbuzné sekvence v pozicích 64 a 95 β-pod jednotky, což ukazuje na to, že mutagenese • · ··· · · ‘ ···· ···· · ♦ · · · · • * ··· · ··· ·· · ····· ····· ···· ·· ·· ··· ·· ·· byla náhodná.Most Dictyostelium clones were found to contain only one type of mutation in the hCGfi expression vector. These clones produced one type of mutant. In addition, we found that most of the analyzed Dictyostelium clones contained unrelated sequences at positions 64 and 95 of the β-subunit, suggesting that mutagenesis resulted in mutagenesis. · · · * ··· · ··· ········································································· ··· ··· ··· ···

Příklad 7: Hmotnostní spektrometrická analýza rechCG z Dictyostelium discoideumExample 7: Mass spectrometric analysis of rechCG from Dictyostelium discoideum

Rekombinantní hCG, produkovaný v Dictyostelium, byl izolován ze supernatantu kultur pomocí postupného provedení chromatografie využívající hydrofobní interakce a imunochromatografie s MoAb 119A, které reaguje s epitopem společným pro LH a hCG. Protilátka byla imobilizována na NHS-Sepharose. Kyselinou eluovaný, přečištěný rec hCG byl dialyzován proti 50% acetonitrilu a byl dialyzován. Protein byl rozpuštěn v 0,1% TFA a hmotnostní spektrální analýza byla provedena MALDI-TOF využívající superDHB jako matrici. Čistý rec hCG produkovaný CHO buňkami a izolovaným stejným způsobem přečištění byl použit jako standard.Recombinant hCG, produced in Dictyostelium, was isolated from culture supernatant by sequential chromatography using hydrophobic interaction and immunochromatography with MoAb 119A, which reacts with an epitope common to LH and hCG. The antibody was immobilized on NHS-Sepharose. The acid eluted, purified rec hCG was dialyzed against 50% acetonitrile and was dialyzed. The protein was dissolved in 0.1% TFA and mass spectral analysis was performed by MALDI-TOF using superDHB as a matrix. Pure rec hCG produced by CHO cells and isolated by the same purification method was used as standard.

Jak o?-, tak β-podj ednotky v materiálu z Dictyostelium měly nižší molekulovou hmotnost než příslušné podjednotky z CHO buněk, s mediány píků 11578 a 17351 D pro podjednotky produkované v Dictyostelium a 14013 a 23284 D pro polypeptidy produkované v CHO buňkách. Tato skutečnost naznačuje, že hormon produkovaný v Dictyostelium obsahuje méně a/nebo kratší karbohydratové řetězce. Kromě toho, šířka píků příslušných podjednotek se významně lišila, t.j. 11110-12452 D (1342 D) pro Dictyostelium a- vs. 12959-15591 D (2632 D) pro CHO a- řetězec a 17006-18104 D (1098 D) pro Dictyostelium β vs. 20674-25208 D (4534 D) pro CHO β-řetězec. Tyto skutečnost naznačuje, že glykosylace materiálu produkovaného v Dictyostelium je mnohem méně komplexní.Both the α- and β-subunits in the Dictyostelium material had a lower molecular weight than the respective subunits from CHO cells, with medians of peaks 11578 and 17351 D for the subunits produced in Dictyostelium and 14013 and 23284 D for polypeptides produced in CHO cells. This suggests that the hormone produced in Dictyostelium contains fewer and / or shorter carbohydrate chains. In addition, the peak widths of the respective subunits varied significantly, i.e., 11110-12452 D (1342 D) for Dictyostelium α- vs. 12959-15591 D (2632 D) for CHO α-chain and 17006-18104 D (1098 D) for Dictyostelium β vs. 20674-25208 D (4534 D) for CHO β-chain. These facts suggest that the glycosylation of the material produced in Dictyostelium is much less complex.

• · ··· · · ' ···· ···· · · · ·· · * · ·• · ··· · · '···········

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:List of sequences (1) General information:

(i) Přihlašovatel:(i) Applicant:

(A) Jméno: Akzo Nobel N.V.(A) Name: Akzo Nobel N.V.

(B) Ulice: Velperweg 76 (C) Město: Arnhem (E) Stát: Nizozemí (F) Poštovní kod (ZIP): 6824 BM (G) Telefon: 0412 666379 (H) Telefax: 0412 650592 (ii) Název vynálezu: Gonadotropiny získané expresí v Dictyostelium (iii) Počet sekvencí: 5 (v) Počítačová čtecí forma:(B) Street: Velperweg 76 (C) City: Arnhem (E) Country: Netherlands (F) Zip Code: 6824 BM (G) Telephone: 0412 666379 (H) Telefax: 0412 650592 (ii) Gonadotropins obtained by expression in Dictyostelium (iii) Number of sequences: 5 (v) Computer reading form:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPO) (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:(A) Media Type: Floppy Disk (B) Computer: IBM PC Compatible (C) Operating System: PC-DOS / MS-DOS (D) Software: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (2) Information for SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:(i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 67 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:(A) Length: 67 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) String: single (D) Topology: linear (ii) Molecule type: cDNA (ix) Properties:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 6...62 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:(A) Name / Key: CDS (B) Location: 6 ... 62 (xi) Sequence Description: SEQ ID NO: 1:

AGATC ATG AAA TTC CAA CAT ACA TTT ATT GCA TTA TTA TCA CTA TTA Met Lys Phe Gin His Thr Phe Ile Ala Leu Leu Ser Leu LeuAGATC ATG AAA TTC CAA CAT ACA TTT ATT GCA TTA TTA CCA TTA Met Lys Phe Gin His Thr Phe Ile Ala Leu Leu Leu Leu Leu

5 105 10

ACA TAT GCA AAT GCA GATCTACA GAT GCA AAT GCA GATCT

Thr Tyr Ala Asn Ala • · (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:Thr Tyr Ala Asn Ala (2) Information for SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:(i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 19 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:(A) Length: 19 amino acids (B) Type: amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecule type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 2:

Met Lys Phe Gin His Thr Phe Ile Ala Leu. Leu Ser Leu Leu Thr Tyr ¹ 5 10 15Met Lys, Phe Gin, His Thr Phe, Ile Ala Leu. Leu Ser Leu Ler Thr Tyr ¹ 5 10 15

Ala Asn Ala (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:Ala Asn Ala (2) Information for SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:(i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 74 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:(A) Length: 74 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) String: single (D) Topology: linear (ii) Molecule type: cDNA (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 3:

GCAGATCTAT GGAGATGTTC CAAGGTCTCC TCCTTTTATT ACTCCTCAGC ATGGGTGGTA 60GCAGATCTAT GGAGATGTTC CAAGGTCTCC TCCTTTTATT ACTCCTCAGC ATGGGTGGTA 60

CATGGGCATC CAAG ⁷⁴ (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:CATGGGCATC CAAG ⁷⁴ (2) Information for SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:(i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 26 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • · ·· ·· ·· · · · · « · · · · * ·*·· ···· · · · · · · * · · • · ··· · ··· ► · · (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:(A) Length: 26 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) String: single (D) Topology: linear (ii) Molecule type: cDNA · · ·· ·· ·· · · · · · · · · · (Xi) Sequence description: SEQ ID NO: 4:

CCAGATCTAA ACATTTAAGA TTTGTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:CCAGATCTAA ACATTTAAGA TTTGTG (2) Information for SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:(i) Sequence characteristics:

(A) Délka: 39 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:(A) Length: 39 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) String: single (D) Topology: linear (ii) Molecule type: cDNA (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 5:

GCTATCGACA TATGCAAATG CATCCAAGGA GCCGCTTCGGCTATCGACA TATGCAAATG CATCCAAGGA GCCGCTTCG

Claims (7)

I? a. t θ η t θ ν θ η a :r ο A yAND? a. t θ y t θ ν θ a: r ο A y 1. Gonadotropin nebo jeho mutant získaný heterologní expresí v Dictyostelium hostiteli.Gonadotropin or a mutant thereof obtained by heterologous expression in a Dictyostelium host. 2. Mutantní gonadotropin podle nároku 1, jehož podjednotky jsou kovalentně navázané.The mutant gonadotropin of claim 1, wherein the subunits are covalently linked. 3. Gonadotropin podle nároku l nebo 2 pro terapeutické použití.Gonadotropin according to claim 1 or 2 for therapeutic use. 4. Gonadotropin podle jakéhokoliv z nároků 1-3, kde uvedeným gonadotropinem je hCG nebo FSH.The gonadotropin according to any one of claims 1-3, wherein said gonadotropin is hCG or FSH. 5. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje gonadotropin podle nároku 1 nebo 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.5. A pharmaceutical composition comprising gonadotropin according to claim 1 or 2 and a pharmaceutically acceptable carrier. 6. Způsob přípravy gonadotropinu nebo jeho mutantu vyznačující se tím, že obsahuje kroky:6. A process for the preparation of gonadotropin or a mutant thereof, comprising the steps of: - transformaci kmene Dictyostelium rekombinantním plasmidovým vektorem obsahujícím DNA sekvenci kódující geny nebo mutované geny pro gonadotropiny pod kontrolou Dictyostelium regulačních sekvencí;transforming the Dictyostelium strain with a recombinant plasmid vector containing a DNA sequence encoding genes or mutated gonadotropin genes under the control of Dictyostelium regulatory sequences; - kultivaci rekombinantního kmene za podmínek umožňujících expresi uvedené DNA sekvence; aculturing the recombinant strain under conditions allowing expression of said DNA sequence; and - izolaci exprimovaného proteinu.isolating the expressed protein. 7. Způsob selekce mutantních gonadotropinů se superagonistickou nebo antagonistickou aktivitou vyznačující se tím, že obsahuje kroky:7. A method for selecting mutant gonadotropins having superagonistic or antagonistic activity, comprising the steps of: - náhodnou mutagenesi genů pro gonadotropiny;- random mutagenesis of gonadotropin genes; - inserci mutovaných genů do plasmidového vektoru proinsertion of the mutated genes into the plasmid vector Dictyostelium;Dictyostelium; • ·• · - transformaci kmene Dictyostelium uvedeným rekombinantním plasmidovým vektorem;transforming the Dictyostelium strain with said recombinant plasmid vector; - kultivaci klonů za podmínek umožňujících expresi DNA sekvence;culturing the clones under conditions allowing expression of the DNA sequence; - určení poměru vazba na receptor/přenos signálu pro exprimovaný protein; adetermining the receptor binding / signal transduction ratio for the expressed protein; and - izolaci klonů s poměrem, který se liší od poměru určeného pro přirozené gonadotropiny.- isolation of clones with a ratio different from that intended for natural gonadotropins.