CZ20003732A3 - Pomocný prostředek - Google Patents

Abstract

Řešení se zabývá pomocným prostředkem, který obsahuje surfaktant vzorce HO(CH2CH2O)n - A - R a farmaceuticky přijatelné vehikulum. Součástí řešení je také očkovací přípravek, který je složen z pomocného prostředku a antigenu * nebo antigenního přípravku a který je určen k léčbě infekcí, ;·» nádorů nebo alergií u savců.

Description

Oblast techniky

Vynález se zabývá pomocným prostředkem, který obsahuje polyoxyethylenether nebo polyoxyethylenester a farmaceuticky přijatelné vehikulum, a očkovacím přípravkem, který obsahuje tento pomocný prostředek a antigen. Vynález se dále zabývá použitím polyoxyethylenetherů a polyoxyethylenesterů při výrobě pomocných prostředků a očkovacích přípravků a jejich použitím jako léčiv.

Dosavadní stav techniky

Očkování na sliznici, například nosu nebo úst, představuje snadný a mnohem pohodlnější způsob očkování, než je tradiční očkování systémově podanou injekcí. Podání očkovací látky injekční cestou je spojeno s řadou nepříjemných projevů, jako je bolest a podráždění v místě vpichu. Tyto projevy mohou vyvolat „strach z jehly“, který vede ke špatné spolupráci pacienta na očkovacím režimu. Systémová injekce může být také zdrojem infekce v místě vpichu.

Očkování na sliznici se stalo zajímavým od té doby, kdy bylo na zvířatech předvedeno, že podání antigenů na sliznici je ve vyvolání imunitní odezvy na povrchu sliznice, která je branou vstupu mnoha patogenů, mnohem účinnější než systémové podání antigenů injekcí. Předpokládá se, že očkováním na sliznici, například nosu, je možné navodit slizniční imunitu nejen na sliznici nosu, ale i na sliznicích vzdálených, jako je sliznice genitálu (Mestecky, 1987, Journal of Clinical Immunology, 7, 265 • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · ···· · · ··

- 276; McGhee a Kiyono, Infectious Agents and Disease, 1993, 2, 55 73).

Aby mohla imunizace na sliznici nahradit imunizaci injekční, nebo aby se mohla stát její alternativou, musí být možné podáním očkovacího přípravku na sliznici vyvolat systémovou imunitní odezvu přinejmenším stejně účinně jako při injekci. Přestože bylo zaznamenáno, že určité antigeny podané na sliznici jsou schopné navodit systémovou odpověď (Cahill et kol., 1993, FEMS Microbiology Letters, 107, 211 - 216), většina rozpustných antigenů podaných samostatně na nosní sliznici nevyvolá žádnou, nebo jen malou imunitní odpověď.

Mnohými autory byly objeveny účinné pomocné látky, které pomáhají tento problém překonat různými způsoby, jako je zapouzdření antigenů (např. liposomy a mikročástice); přímá interakce s cílovými buňkami s následným uvolněním imunostimulačních cytokinů (např. cholera toxin nebo termolabilní toxin E. coli)', zvýšení absorpce antigenů epitelem (např. cholera toxin).

V této patentové přihlášce jsou předvedeny polyoxyethylenethery a polyoxyethylenestery jako velmi účinné pomocné prostředky pro očkovací přípravky. Pomocné prostředky podle vynálezu jsou bezpečné, snadno se sterilizují a podávají. Výhodou těchto prostředků je, že jsou při podání na sliznici schopny vyvolat dostatečnou systémovou imunitní odezvu, a to přinejmenším stejnou, jako při běžném podání očkovacího přípravku systémovou injekcí.

Polyoxyethylenethery, jako je polyoxyethylenlaurylether, jsou popsány v příručce Merck index (12. vydání, 7717), jejich léčebné použití, které je zde uvedeno, zahrnuje: místní znecitlivění, látky protisvědivé a sklerotizující. Polyoxyethylenethery a nebo polyoxyethylenestery patří do skupiny neionogenních surfaktantů.

Po podání polyoxyethylenetherů a polyoxyethylenesterů na sliznici nosu je popsáno zvýšené vychytávání inzulínu v nosní dutině (Hirai a kol., 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 165 - 172; Hirai a kol., 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 173 - 184).

V očkovacích přípravcích se používají i další neionogenní surfaktanty. Očkovací přípravky obsahující kombinaci polyoxyethylenového ricínového oleje nebo glyceridů kyseliny kaprilové/kaprinové s polyoxyethylenmonoestery sorbitanu a antigenem vyvolávají systémovou imunitní odezvu po místním podání na slizniční membránu (patentová přihláška WO 9417827). V této patentové přihlášce je popsáno, že kombinace TWEEN 20™ (polyoxyethylenmonoester sorbitanu) a Imwitor 742™ (glyceridy kyseliny kaprilové/kaprinové) nebo kombinace TWEEN 20™ a polyoxyethylenový ricínový olej zvyšuje systémovou imunitní odpověď po intranasální imunizaci. Podrobnosti o účinku tohoto přpravku na zvýšení imunitní odpovědi při podání antigenů na sliznici nosu jsou uvedeny také v literatuře (Gizurason a kol., 1996, Vaccine Research, 5, 69 - 75; Aggerbeck a kol., 1997, Vaccine, 15, 307 - 316).

Surfaktanty mohou mít také formu neionogenních surfaktantových vezikul (obecně známých jako neosomy, patentová přihláška WO 95/09651). Tyto vezikuly vytvářejí za přítomnosti cholesterolu vezikuly s lipidovou

Novasomy (patentová přihláška US 5,147,725) jsou paucilamenární vezikulární struktury s obsahem polyoxyethylenetherů a cholesterolu zapouzdřujících antigen, které po systémovém podání zesilují imunitní odezvy na antigen.

• ·

dvojvrstvou, které váží antigen do vnitřní vodní fáze nebo přímo na dvojvrstvu.

Podstata vynálezu

Vynález spočívá v tom, že polyoxyethylenethery nebo polyoxyethylenestery podané spolu s antigeny významným způsobem zesilují systémovou imunitní odezvu. Při použití těchto pomocných prostředků v očkovacích přípravcích podávaných na sliznici vede jejich zesilující účinek ktomu, že imunologická odpověď organizmu na antigen je stejná nebo dokonce vyšší, než při běžném podání antigenu systémovou injekcí. Tyto molekuly představují skupinu pomocných prostředků vhodných pro podávání lidem, a to jednak při běžném systémovém očkování, jednak při nahrazení systémového očkování očkováním na sliznici.

Vynález je silným pomocným prostředkem očkovacích přípravků a na rozdíl od mnoha jiných dostupných pomocných prostředků, které působí pomocí zapouzdření antigenu, má formu nevezikulárního roztoku nebo suspenze. Vynález se tedy zabývá pomocným prostředkem, který obsahuje surfaktant vzorce (I) ve formě roztoku nebo suspenze bez obsahu vezikul. Vynález se dále zabývá pomocným prostředkem očkovacího přípravku, který obsahuje surfaktant vzorce (I) formulovaný bez přítomnosti cholesterolu.

Očkovací přípravky a pomocné prostředky podle vynálezu obsahují molekuly obecného vzorce (I):

HO(CH₂CH₂O)_n-A-R, kde n je číslo 1 až 50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová skupina o 1 až 50 uhlících nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících.

	- 5 -	···*·· · ·· ·· ·· • · · ♦ · · · · » · · ·· · ····· • · · · ······ • · · · ···· ···· · ··· ···· ·· ··
Vynález	se	zabývá	očkovacím	přípravkem obsahujícím

polyoxyethylenether obecného vzorce (I), kde n je číslo mezi 1 a 50, s výhodou mezi 4 a 24, nejlépe 9; složka R je alkylová skupina o 1 až 50 uhlících, s výhodou o 4 až 24 uhlících, nejlépe o 12 uhlících; a A je vazba. Koncentrace polyoxyethylenetheru se pohybuje v rozmezí 0,1 — 20 g/l, s výhodou 0,1 - 10 g/l, nejlépe v rozmezí 0,1-1 g/l. Vhodné polyoxyethylenethery patří do následující skupiny: polyoxyethylen - 9 laurylether, polyoxyethylen - 9 -stearylether, polyoxyethylen - 8 stearylether, polyoxyethylen - 4 - laurylether, polyoxyethylen - 35 laurylether a polyoxyethylen - 23 - laurylether.

Vynález se dále zabývá očkovacím přípravkem obsahujícím polyoxyethylenester obecného vzorce (I), kde n je číslo mezi 1 a 50, s výhodou mezi 4 a 24, nejlépe 9; R je alkylová skupina o 1 až 50 uhlících, s výhodou o 4 až 20 uhlících, nejlépe o 12 uhlících; a A je skupina -C(O)-. Koncentrace polyoxyethylenesteru se pohybuje v rozmezí 0,1 - 20 g/l, s výhodou 0,1 - 10 g/l, nejlépe v rozmezí 0,1-1 g/l. Vhodné polyoxyethylenestery patří do této skupiny: polyoxyethylen 9 - laurylestery, polyoxyethylen - 9 - stearylestery, polyoxyethylen - 8 stearylestery, polyoxyethylen - 4 - laurylestery, polyoxyethylen - 35 laurylestery a polyoxyethylen - 23 - laurylestery.

Vynález se dále zabývá očkovacím přípravkem obsahujícím polyoxyfenylethery obecného vzorce (I), kde n je číslo mezi 1 a 50, s výhodou mezi 4 a 24, nejlépe 9; R je fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících, s výhodou o 4 až 24 uhlících, nejlépe o 12 uhlících; a A je vazba. Koncentrace polyoxyethylenfenyletherů se pohybuje s výhodou mezi 0,1 a 10 g/l, nejlépe v rozmezí 0,25 - 1 g/l.

Očkovací přípravky podle vynálezu se používají k ochraně savců před nákazou nebo k léčení savců již nemocných, a to podáním očkovacího • · · · * · • · · ···· · · · · • · 9 · · · · · • « · 9 9 9 9 9 9 9

9 · · 9 9 9 9 ···· · ··· ···· ·· ·· přípravku na sliznici ústní, bukální, střevní, poševní, rektální nebo nosní. Podávané přípravky mají formu kapek, spreje nebo prášku. Součástí vynálezu jsou také přípravky nebulizované nebo v aerosolu. Přípravky podle vynálezu mají dále formu gastrorezistentních kapslí, granulí pro podávání ústy nebo čípků pro podávání do rekta nebo do pochvy. Přípravky podle vynálezu zvyšují také imunogenicitu antigenů podávaných na kůži ve formě transdermálních nebo transkutánních systémů. Přípravky podle vynálezu se podávají také parenterálně jako nitrosvalová nebo podkožní injekce, kdy jsou tyto přípravky charakteristické tím, že nejsou podávány ve vezikulární formě.

Vynález se zabývá zajména pomocnými prostředky pro očkovací přípravky podávané na sliznici. Takové pomocné prostředky jsou u lidí dobře snášeny a imunitní odezvy jimi vyvolané jsou silné. Pomocné prostředky podle vynálezu mají formu roztoků nebo suspenzí bez přítomnosti vezikul, nejsou tedy zatíženy problémy, které provázejí výrobu pomocných částicových systémů, včetně udržení stability, uniformity a kontroly kvality. Takové přípravky jsou silnými pomocnými prostředky, zároveň vykazují nízkou reaktogenicitu a jsou dobře snášeny pacienty.

Polyoxyethylenethery podle vynálezu mají hemolytické účinky. Hemolytická aktivita polyoxyethylenetherů se měří následující zkouškou in vitro, přičemž hemolytická aktivita je vyjádřena jako nejvyšší koncentrace detergentu, která nezpůsobí lýzu červených krvinek:

1. Čerstvá krev laboratorních morčat se ve stolní centrifuze 3 krát promyje fosfátem pufrovaným nasyceným roztoken chloridu sodného (PBS).

2. Do 800 Dl PBS obsahujících dvojnásobná ředění detergentu se přidá 50 □! této krevní suspenze.

·· 4··· • · · 4 4 4 4 · · · · ·· · 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 ·· 444444

- 7 - 4444 4 444 4444 44 44

3. Hemolýza se stanovuje po 8 hodinách opticky nebo měřením optické hustoty supernatantu. Přítomnost červeně zbarveného supernatantu, který absorbuje světlo při 570 min značí hemolýzu.

4. Výsledky jsou vyjádřeny jako koncentrace prvního ředění detergentu, při kterém se hemolýza již neobjeví.

V rámci experimentální variability těchto biologických zkoušek mají polyoxyethylenethery nebo surfáktanty obecného vzorce (I) podle vynálezu hemolytickou aktivitu mezi 0,5 a 0,0001 g/l, s výhodou mezi 0,05 a 0,0001 g/l, s větší výhodou 0,005 a 0,0001 g /I, nejlépe mezi 0,003 a 0,0004 g/l. V nejlepším případě mají polyoxyethylenethery nebo polyoxyethylenestery hemolytickou aktivitu podobnou (t.j. v rámci desetinásobného rozdílu) jako polyoxyethylen-9-laurylether nebo polyoxyethylen-8-stearylether.

Poměr délky polyoxyethylenové části k délce alkylového řetězce v surfaktantu (tj. poměr n:délka alkylového řetězce) ovlivňuje rozpustnost této skupiny detergentu ve vodním prostředí. Pomocné prostředky podle vynálezu mají formu roztoku nebo tvoří částicové struktury, jako jsou micely. Pomocné prostředky podle vynálezu jsou díky své přirozené struktuře bez vezikul čisté, nejsou zakalené nebo opákní, jsou stabilní, snadno se sterilizují filtrací na membráně s póry o průměru 220 nm a zpracovávají se jednoduchým a kontrolovaným způsobem.

Očkovací přípravky podle vynálezu mají formu nevezikulárního roztoku nebo suspenze polyoxyethylehetheru nebo poíyoxyethylenesteru obecného vzorce (I) ve farmaceuticky přijatelném vehikuiu, jako je PBS nebo voda, s antigenem nebo antigenním přípravkem. Tyto očkovací přípravky se podávají na slizniční povrch savce buď jako primární imunizace nebo jako upomínací dávka. Jinou možností je podávat přípravky podle vynálezu systémově, například transdermálně, podkožně nebo nitrosvalově.

- 8 • ·9 · ·

Dalšími pomocnými prostředky zesilujícími jak slizniční, tak systémovou imunitní odezvu jsou bakteriální enterotoxiny získané zVibrio cholerae (cholera toxin (CT) a Escherichia coli (termolabilní enterotoxin (LT). CT a LT jsou heterodimery sestávající z pentamerového kruhu subunitu, do něhož zapadá toxický A subunit. Strukturu a biologickou aktivitu těchto toxinů popsali ve svých článcích Clements a Finklestein, 1979, Infection and Immunity, 24, 760 - 769; Clements a kol., 1980, Infection and Immunity, 24, 91 - 97. V poslední době byl vyvinut netoxický derivát LT, který postrádá proteolytické místo nezbytné k přeměně netoxické formy LT po jejím uvolnění z buňky na formu toxickou. Díky záměně aminokyseliny argininu za glycin na 192. místě je tato forma LT (označená mLT(R192G)) vůči proteolytickému štěpení nevnímavá. Toxicita této formy je tak výrazně snížena při zachování jejího silného pomocného účinku. mLT(R192G) je proto nazýván mutant proteolytického místa. Způsob výroby mLT(R192G) je podrobně popsán v patentové přihlášce WO 96/06627. Mezi další mutantní formy LT patří mutanty aktivního místa, jako je mLT(A69G), ve kterém je na 69. místě zaměněn glycin za alanin. V patentové přihlášce WO 96/06627 je popsáno použití mLT(R192G) jako očkovacího přípravku na sliznici. Tyto pomocné prostředky je možné kombinovat s neionogenními surfaktanty podle tohoto vynálezu.

Součástí vynálezu jsou kombinace polyoxyethylenetheru nebo polyoxyethylenesteru s dalšími pomocnými prostředky nebo imunostimulačními látkami, včetně cholera toxinu a jeho B subunitu, monofosforyllipidu A a jeho netoxického derivátu 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (popsáno v patentové přihlášce UK číslo GB 2,220,211), saponinů, jako je Quil A (získaný z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina) a jeho frakcí, včetně QS21 a QS17 (US 5,057, 540; Kensil, C.R., 1996, Crit Rev Ther Drug Carríer Syst, 12 (1-2), 1 - 55; EP 0 362 279 B1; Kensil a kol., 1991, J. Immunology, 146, 431 - 437; WO 99/100008) a oligonukleotidového pomocného systému ·· ♦···

·· ·· * · · · • · « · • · · · · • · · · • · · · obsahujícího nemethylovaný CpG dinukleotid (popsáno v patentové přihlášce WO 96/02555). Zvláště výhodná imunostimulační látka používaná v kombinaci s POE je CpG imunostimulační oligonukleotid. Kombinované prostředky s touto látkou mají u větších zvířat silný indukční a upomínací účinek na imunitní odpovědi. Vhodné oligonukleotidy obsahují následující sekvence: všechny internukieotidové vazby těchto sekvencí jsou modifikované fosforothioátem.

OLIGO 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT

OLIGO 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT

OLIGO 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

CpG oligonukleotidy používané v tomto vynálezu se syntetizují jakýmkoli způsobem známým v oboru (například tak, jak je popsáno v patentové přihlášce EP468520). Pohodlným způsobem výroby těchto oligonukleotidů je syntéza na automatickém syntezátoru.

Polyoxyethylenethery a polyoxyethylenestery se kombinují s vehikuly očkovacích přípravků, jako je chitosan nebo jiné polykatiionové polymery, polylaktidové nebo polylaktidoglykolidové částice, částice složené z polysacharidů nebo chemicky upravených polysacharidů, liposomy bez cholesterolu nebo částice na lipidové bázi, emulze typu olej ve vodě (WO 95/17210), částice složené z monoesterů glycerolu a další. Polyoxyethylenethery a polyoxyethylenestery se po smíchání s práškovými vehikuly, jako je laktoza obsahující antigen, podávají ve formě suchého prášku.

Pomocné prostředky podle vynálezu obsahují surfaktanty polyoxyethylenethery nebo polyoxyethylenestery, které nemají formu vezikul. Vynález se tedy zabývá použitím polyoxyethylenetherů a polyoxyethylenesterů obecného vzoece (I) při výrobě pomocných prostředků a očkovacích přípravků, ve kterých surfaktant obecného vzorce (I) není přítomen ve formě vezikul.

·· ···· ··· · · ·♦ ♦ · ·· • · · · · · « · · · » • · · · · · • · · · · ···· · · · ·

Očkovací přípravky podle vynálezu obsahují antigen nebo antigenní přípravek, který vyvolá imunitní odezvu proti lidskému patogenu. Antigen nebo antigenní přípravek je odvozen z HIV - 1 (jako je tat, nef, gp120 nebo gp160), lidských herpes virů (jako je gD nebo jeho deriváty, Immediate Early protein, jako je ICP27 z HSV1 nebo HSV2), cytomegaloviru ((zvláště lidských)(jako je gB nebo jeho deriváty), rotavirů (včetně oslabených virů), viru Epstein - Barrové (jako je gp350 nebo jeho deriváty), varicella zoster viru (jako je gpl, II a IE63) nebo virů hepatitid, jako je virus hepatitidy B (povrchový antigen hepatitidy B nebo jeho derivát), virus hepatitidy A, virus hepatitidy C nebo virus hepatitidy E, nebo z dalších virových patogenů, jako jsou paramyxoviry: respiračně syncytiální virus (proteiny F a G nebo jejich deriváty), virus parainfluenzy, spalničkový virus a virus příušnic, lidské papillomaviry (například HPV6, 11, 16, 18, ...), flaviviry (např. virus žluté zimnice, virus horečky dengue, virus klíšťové encefalitidy, virus japonské encefalitidy) nebo virus influenzy (celý živý nebo inaktivovaný virus, rozštěpený influenza virus, vyrostlý na vejcích, buňkách MDCK nebo buňkách Věro nebo celé chřipkové virosomy (které popsal Gluck R., 1992, Vaccine, 10, 915 - 920) nebo jejich čištěné nebo rekombinantní proteiny, jako je HA, NP, NA nebo M protein nebo jejich kombinace) nebo antigeny a antigenní přípravky odvozené z bakteriálních patogenů, jako je Neisseria spp, včetně N. gonorrhea a N. meningitidis (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, proteiny vážící transferin, proteiny vážící laktoferin, PilC, adheziny); Streptococcus pyogenes (například M proteiny nebo jejich části, proteáza C5A, kyseliny lipoteichové), S. agalactiae, S. mutans', Haemophillus ducrer, Moraxella spp, včetně M. catarrhalis, známá také jako Branhamella catarrhalis (vysoko a nízkomolekulární adheziny a ivaziny); Bordetella spp, včetně B. pertussis (například pertaktin, pertusový toxin nebo jeho deriváty, vláknitý hemaglutinin, adenylátcykláza, fimbrie), B. parapertussis a B. bronchiseptica', Mycobacterium spp, včetně M. tuberculosis (například ESAT6, antigen 85A, B nebo C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M.

···· ♦» 4 >

«4 4 4444 4*4*

4 4*444

4 * 4 4 4 4 · · F

4 44 4 4 · · . II . 4444 4 444 4444 44 ·4 paratuberculosis, M. smegmatis', Legionella spp, včetně L. pneumophila', Escherichia spp, včetně enterotoxické E. coli (například kolonizační faktory, termolabilní toxin nebo jeho deriváty, termostabilní toxin nebo jeho deriváty), enterohemoragická E. coli, enteropatogenní E. coli (například shiga - like toxin nebo jeho deriváty); Vibrio spp, včetně V. cholerae (například cholera toxin nebo jeho deriváty); Shigella spp, včetně S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerr, Yersinia spp, včetně Y. enterocolitica (například Yop protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis', Campylobacter spp, včetně C. jejuni (například toxiny, adheziny a invaziny) a C. co//; Salmonella spp, včetně S. typhi, S. paratyphi, S choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp, včetně L. monocytogenes; Helicobacter spp, včetně H. pylori (například ureáza, kataláza, vakuolizační toxin); Pseudomonas spp, včetně P. aeruginosa; Staphylococcus spp, včetně S. aureus, S. epidermidis·, Enterococcus spp, včetně E. faecalis, E. faeciunr, Clostridium spp, včetně C. tetani (například tetanový toxin a jeho deriváty), C. botulinum (například botulotoxin a jeho deriváty), C. difficile (například klostridiové toxiny A, B a jejich deriváty); Bacillus spp, včetně B. anthracis; Corynebacterium spp, včetně C. diphteríae (například difterický toxin a jeho deriváty); Borrelia spp, včetně B. burgdorferi (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB) B. andersonii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp, včetně E. equi a agens způsobujícího lidskou granulocytovou ehrlichiozu; Rickettsia spp, včetně R. rickettsii; Chlamydia spp, včetně C. trachomatis (například MOMP, proteiny vážící heparin), C. pneumoniae (například MOMP, heparin vážící proteiny), C. psittaci·, Leptospira spp, včetně L. interrogans; Treponema spp, včetně T. pallidum (například vzácné proteiny vnější membrány), T. denticola, T. hyodysenteriae·, nebo antigeny nebo antigenové přípravky odvozené od parazitů, jako je Plasmodium spp, včetně P. falciparum; Toxoplasma spp, včetně T. gondii (například SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp, včeně E. histolytica·, Babesia spp, včetně B. microti; Trypanosoma spp, včetně T. cruzi; Giardia spp, včetně G. lamblia; Leishmania spp, včetně L. major, Pneumocystis spp, včetně P. carinii;

·· ···· · ·· ·· ·· ·· · ·Φ · · · « · · • · · · · · · · • · · · ♦ ··*·* • · · ♦ · · · · ···· · ··· ··*· ·· ·♦

Trichomonas spp, včetně 7. vaginalis; Schistosoma spp, včetně S. mansoni, nebo antigen a antigenní přípravky odvozené z kvasinek, jako je Candida spp, včetně C. albicans; Cryptococcus spp, včetně C. neoformans.

Výhodné antibakteriální očkovací přípravky obsahují antigeny odvozené od Streptococcus spp, včetně S. pneumoniae (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, PsaA, PspA, streptolyzin, cholin vážící proteiny a proteinový antigen pneumolyzin (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins a kol., Microbial Pathogenesis, 25, 337 - 342) a jejich mutantní detoxifikované deriváty (WO 90/06951; WO 99/03884). Další výhodné očkovací přípravky obsahují antigeny odvozené od Haemophillus spp, včetně H. influenzae typ B (například PRP a jeho konjugáty), netypovatelný H. influenzae (například OMP26, vysokomolekulární adheziny, P5, P6, D protein a D lipoprotein, fimbrin a peptidy od fimbrinu odvozené (US 5,843,464) nebo varianty mnohočetných kopií nebo jejich fúzní proteiny). Další výhodné antibakteriální očkovací přípravky obsahují antigeny odvozené od Moraxella catarrhalis (včetně jejích vezikul vnější membrány a OMP106 (WO 97/41731)) a od Neisseria meningitidis B (včetně jejích vezikul vnější membrány a NspA (WO 96/29412)).

Deriváty povrchového antigenu hepatitidy B jsou v oboru dobře známy a patří mezi ně kromě jiných také S antigeny PreS1 a PreS2 popsané v evropských patentových přihláškách EP - A - 414 374; EP - A - 0304 578 a EP 198 - 474. Jeden z výhodných očkovacích přípravků podle vynálezu obsahuje antigen gp120 z HIV - 1, zejména, pokud je exprimován v CHO buňkách. Očkovací přípravek podle vynálezu obsahuje také gD2t popsaný v tomto textu výše.

Očkovací přípravky podle vynálezu obsahující nárokovaný pomocný prostředek obsahují také antigen odvozený z lidského papilomaviru

- 13 • ·

• · (HPV), který způsobuje bradavice na genitáliích (HPV 6, HPV 11 a další) a rakovinu děložního čípku (HPV 16, HPV 18 a další).

Vhodný profylaktický nebo léčebný očkovací přípravek proti bradavicím na genitálu obsahuje částice L1 nebo kapsomery a fúzní proteiny s jedním nebo více antigeny - proteiny E6, E7, L1 a L2 z HPV 6 a HPV 11.

K nejvhodnějším formám fůzních proteinů patří L2E7 popsaný v patentové přihlášce WO 96/26277 a protein D(1/3) — E7 popsaný v patentové přihlášce GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).

Očkovací přípravek k profylaxi a léčbě cervikální infekce nebo rakoviny způsobené HPV obsahuje antigeny HPV 16 nebo 18. Jedná se o antigeny L1 nebo L2 ve formě monomerů, nebo antigeny L1 a L2 dohromady ve viru podobné částici (VLP) nebo antigen L1 samostatně ve VLP nebo v kapsomeru. Tyto antigeny, viru podobné částice a kapsomer jsou známy a jsou popsány například v patentových přihláškách W094/00152, WO94/20137, WO94/05792 a WO93/02184.

Součástí těchto očkovacích přípravků jsou také časné proteiny, například E7, E2 nebo E5, a to samostatně nebo ve formě fůzních proteinů. Nejvhodnější formou je VLP obsahující fúzní proteiny L1E7 (WO96/11272).

Vhodnými antigeny HPV 16 jsou časné proteiny E6 nebo E7 ve fúzi s nosičem D proteinu, které tak tvoří fúze D protein - E6 nebo E7, nebo jejich kombinace; nebo kombinace časných proteinů E6 nebo E7 s antigenem L2 (WO96/26277).

• ·

Časné proteiny E6 nebo E7 z HPV 16 nebo 18 jsou přítomny také samostatně, s výhodou ve fúzi D protein - E6/E7. Takové očkovací přípravky obsahují volitelně jeden nebo oba časné proteiny z HPV 18, s výhodou ve formě fúze D protein - E6 nebo D protein - E7 nebo D protein - E6/E7.

Očkovací přípravky podle vynálezu navíc obsahují antigeny z dalších HPV kmenů, s výhodou z kmenů HPV 6, 11, 31, 33 nebo 45.

Očkovací přípravky podle vynálezu obsahují také antigeny z parazitů způsobujících malárii. Vhodnými antigeny například z Plasmodium falciparum jsou RTS,S a TRAP. RTS je hybridní protein obsahující celou C - terminální část proteinu z circumsporozoitu P. falciparum spojenou čtyřmi aminokyselinami z preS2 části povrchového(S) antigenů hepatitidy B s povrchovým antigenem viru hepatitidy B. Úplná struktura tohoto antigenů je popsána v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/EP92/02591, zveřejněné pod číslem WO 93/10152, která nárokuje priority z patentové přihlášky UK č. 9124390.7. Na kvasinkách je RTS exprimován jako lipoproteinová částice, při současné expresi s S antigenem z HBV vzniká smíšená částice známá jako RTS,S. Antigeny TRAP jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB89/00895, publikované jako W090/01496. Očkovací přípravek proti malárii podle vynálezu obsahuje antigenní přípravek obsahující kombinaci antigenů RTS,S a TRAP. Další antigeny z plasmodií, které jsou vhodné do vícestupňového očkovacího přípravku proti malárii, jsou MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, Pfs27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 z Plasmodium falciparum a jejich analogy z Plasmodium spp.

Prostředky podle vynálezu obsahují také protinádorový antigen a používají se v imunoterapii nádorů. Pomocný prostředek podle vynálezu « · · · • 9 9·· ···· • · 9 9 9 9 9 • 9 9 999999

9 · · 9 9 · · 9 9 9 · · · · · · · obsahuje například antigeny odhojení nádoru z rakoviny prostaty, prsu, tlustého střeva a konečníku, plic, slinivky břišní, ledvin nebo z melanomu. Příkladem jsou antigeny MÁGE 1, MÁGE 3 nebo další antigeny MÁGE pro léčbu melanomu, dále PRÁME, BAGE nebo GAGE (Robbins a Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology, 8, 628 - 636; Van den Eynde a kol., 1997, International Journal of Clinical and Laboratory Research; Correale a kol., 1997, Journal of the National Cancer Institute,

89, 293). Tyto antigeny jsou exprimovány mnoha různými tumory, jako je melanom, karcinom plic, karcinom močového měchýře a sarkom močového měchýře. Spolu s pomocným prostředkem podle vynálezu se používají i další specifické nádorové antigeny, jako je specifický antigen prostaty (PSA) nebo Her - 2/neu, KSA (GA733), MUC — 1, karcinoembryonální antigen (CEA) a jiné. Součástí vynálezu je tedy očkovací přípravek obsahující pomocný prostředek podle vynálezu a antigen odhojení nádoru.

Antigenem v očkovacím přípravku podle vynálezu používaným k léčbě mnoha nádorů nebo k imunokastraci je také tělu vlastní peptidový hormon, jako je celý gonadotropin uvolňující hormon (GnRH, WO 95/20600), krátký peptid o 10 aminokyselinách.

Pomocné prostředky podle vynálezu jsou vhodné pro přípravu očkovacího přípravku s antigenem odvozeným z Borrelia spp. Takovým antigenem je kyselina nukleová, antigeny nebo antigenní přípravky odvozené od patogenu, rekombinantně vyrobené proteiny nebo peptidy a chimérické fúzní proteiny. Antigenem je například OspA. OspA je plně zralý protein v lipidované formě získané od hostitelské buňky (E. coli) nazvaný lipo - OspA nebo jeho nelipidovaný derivát. Mezi nelipidované deriváty patří nelipidovaný fúzní protein NS1 - OspA, který obsahuje prvních 81 aminokyselin s N - koncem z nestrukturálního proteinu (NS1) z influenza viru a celý protein OspA, a dále MDP - OspA, což je nelipidovaná forma OspA nesoucí navíc tři aminokyseliny s N - koncem.

4 4 • · 4444 44·· • · 4 4*444 • · · 444444

Očkovací přípravky podle vynálezu se používají k profylaxi a léčbě alergie. Tyto očkovací přípravky obsahují antigeny specifické na alergen (například Der p1) a antigeny nespecifické na alergen (například peptidy odvozené od lidského IgE, stanworth dekapeptid (patentová přihláška EP 0 477 231 B1) a další).

Množství proteinu v očkovací dávce je určeno jako množství, které navodí imunoprotektivní odpověď bez významných vedlejších účinků. Toto množství se liší podle specifického imunogenu, způsobu jeho zpracování a formy, ve které je přítomen. Obecně se předpokládá, že každá dávka bude obsahovat 1 - 1000Dg proteinu, s výhodou 1 500Dg, s větší výhodou 1 - 100dg, nejlépe 1 - 50Dg. Optimální množství proteinu v příslušném očkovacím přípravku se stanoví na základě výsledků standardních studií imunitních reakcí subjektu. Po úvodní očkovací dávce může následovat jedna nebo více dávek upomínacích ve vhodných intervalech.

Pomocné prostředky podle vynálezu jsou součástí očkovacích přípravků obsahujících antigeny z mnoha různých zdrojů. Mezi tyto antigeny patří lidské, bakteriální nebo virové kyseliny nukleové, antigeny nebo antigenní přípravky odvozené od patogenu, antigeny nebo antigenní přípravky odvozené od nádoru, antigeny odvozené od hostitele, včetně peptidů GnRH a IgE, rekombinantně vyrobené proteiny nebo peptidy a chimérické fúzní proteiny.

Očkovací přípravky podle vynálezu se podávají ústy. Farmaceuticky přijatelným vehikulem těchto očkovacích přípravků jsou, mimo jiné, alkalické pufry, střevní kapsle nebo mikrogranule. Očkovací přípravky podle vynálezu se podávají vaginálně. Farmaceuticky přijatelným vehikulem těchto očkovacích přípravků jsou, mimo jiné, látky emulgační, polymery, jako je CARBOPOL R, a další známé stabilizátory vaginálních • · • · · · · · · « 9 · · • · · ···*· • · · · ······ . 17 - ·· ·· ···· ^L‘ ···· · ··· ···· ·· ·· krémů a čípků. Očkovací přípravky podle vynálezu se podávají rektálně.

Vehikulem těchto očkovacích přípravků jsou vosky a polymery používané k výrobě rektálních čípků známé v oboru.

Pomocné prostředky podle vynálezu se používají jak k profylaxi, tak i k léčbě. Vynález se zabývá způsobem léčby savců ohrožených nebo trpících infekčním onemocněním, nádorovým onemocněním, alergií nebo autoimunitním onemocněním. Součástí vynálezu je očkovací přípravek pro medicínské účely zde popsaný. Obecný způsob výroby očkovacího přípravku je popsán Vollerem a kol., 1978, New Trends and Development in Vaccines, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A.

Vynález se zabývá použitím polyoxyethyletherů a polyoxyethylenesterů obecného vzorce (I) ve výrobě pomocného prostředku obsahujícího surfaktant vzorce (I) a farmaceuticky přijatelné vehikulum. Vynález se zabývá použitím polyoxyethylenetherů a polyoxyethylenesterů obecného vzorce (I) ve výrobě očkovacího přípravku obsahujícího surfaktant vzorce (I), farmaceuticky přijatelné vehikulum a antigen. Vynález se zabývá použitím polyoxyethylenetherů a polyoxyethylenesterů obecného vzorce (I) ve výrobě pomocného prostředku nebo očkovacího přípravku popsaných výše, přičemž pomocný prostředek neobsahuje cholesterol. Vynález se zabývá použitím polyoxyethylenetherů a polyoxyethylenesterů obecného vzorce (I) ve výrobě pomocného prostředku nebo očkovacího přípravku popsaných výše, přičemž pomocný prostředek má formu nevezikulárního roztoku nebo suspenze.

Mezi farmaceuticky přijatelná vehikula patří voda, nasycený roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem a izotonický pufrový roztok.

• · • · · ·

Alternativní označení polyoxyethylenlauryletheru je zaneseno v CAS registru. Registrační číslo polyoxyethylenlauryletheru je CAS REGISTRY NUMBER: 9002- 92- 0.

Vynález je předveden na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Techniky měření protilátkových (Ab) odpovědí na specifický antigen

Měření OspA specifických sérových protilátek IgG - ELISA

Imunodestičky Maxisorp Nunc se přes noc při 4°C potáhnou antigenem OspA (v koncentraci 1 pg/ml, 50 μΙ do jamky) nebo čištěnou kozí protilátkou proti myšímu Ig (Boerhinger, v koncentraci 5 pg/ml, 50 μΙ do jamky) v PBS, řada A. Volná místa na destičce se 1 hodinu blokují při 37°C saturačním pufrem (PBS obsahující BSA v koncentraci 1g/l, polyoxyethylenmonolaureát sorbitan (TWEEN 20) v koncentraci 0,1 g/l a normální bovinní sérum (NBS, v koncentraci 4g/l). Potom se přidá série dvojnásobných ředění (v saturačním pufru, 50 μΙ do jamky) směsi izotypových IgG ředěných v saturačním pufru (50 μΙ v jamce) jako standardní křivka (směs myších monoklonálních protilátek lgG1, lgG2a a lgG2b (Sigma), začínajících na koncentraci 200 ng/ml, řada A ) a sérové vzorky (začínající na ředění 1:100, řady B až H) se 1 hodinu 30 minut inkubují při 37°C. Destičky se potom třikrát promyjí vymývacím pufrem (PBS, polyoxyethylenmonolureát sorbitan (TWEEN 20) v koncentraci 0,1 g/l). Biotinylované kozí protilátky proti myšímu IgG (Amersham) ředěné 1:5000 v saturačním pufru se inkubují (50DI v jamce) 1 hodinu 30 minut při 37°C. Po třech promytích a následném přidání konjugátu streptavidinu s křenovou peroxidázou (Amersham) se destičky pětkrát promyjí a 20 minut inkubují při teplotě místnosti s revelačním pufrem (50 μί na jamku, OPDA v koncentraci 0,4 mg/ml (Sigma) a peroxid vodíku v koncentraci 0,03g/l v 50mM citrátovém pufru o pH 4,5). Revelace je ukončena přidáním 50 μί 2N kyseliny sírové do každé jamky. Imunočtěčkou Biorad 3550 se při 492 a 630 nm měří optická hustota. Titr protilátek se vypočítá 4 parametrovou matematickou metodou za použití softwaru SoftMaxPro.

Titry IgG protilátek anti - TT, anti - FHA a anti - influenza se měří stejnou technikou s tím že, antigen OspA se nahradí antigenem TT, FHA nebo celým influenza antigenem. Antigen TT je dodáván z komerčně dostupného zdroje (Behring). Antigen FHA se vyrábí a čistí způsobem popsaným v patentové přihlášce EP 0 427 462 B. Celý influenza virus inaktivovaný β - propiolaktonem (BPL) se získá od SSD GmBH (Drážďany, Německo).

Měření myších sérových protilátek IgG specifických na polysacharidv (PS14 a PS19) S. pneumoniae - ELISA

Imunodestičky Maxisorp Nunc se na 2 hodiny při 37°C potáhnou antigenem PS14 (v koncentraci 5 μΙ/ml, 100 μΙ na jamku) nebo antigenem PS19 (v koncentraci 20 μΙ/ml, 100 μΙ na jamku) ředěným v PBS. Destičky se potom třikrát promyjí vymývacím pufrem (PBS, polyoxyethylenmonolaureát sorbitan (TWEEN 20) v koncentraci 0,1 g/l). Potom se přidá série dvojnásobných ředění (v PBS, TWEENu 20, 100 μί na jamku) monoklonálních protilátek (mAb) lgG1 specifických na PS14 nebo PS19 jako standardní křivka (začíná se na koncentraci PS14 785 ng/ml, PS19 2040 ng/ml, řada A) a sérové vzorky (začínající na ředění 1:20, řady B až H) se za stálého třepání 30 minut inkubují při 20°C. Aby se předešlo nespecifickým reakcím, tak se před přidáním a ředěním na destičce obě standardní mAb a sérové vzorky 1 hodinu inkubují při 37°C • · · · • ·

- 20 s běžným polysacharidem (CPS). Destičky se potom třikrát promyjí vymývacím pufrem (PBS, TWEEN 20). Potom se za stálého třepání 30 minut inkubují kozí protimyší IgG konjugované s peroxidázou (Jackson) ředěné v poměru 1:5000 v PBS s TWEENem 20. Po třech promytích se destičky 15 minut inkubují při teplotě místnosti s revelačním pufrem (100 μΙ na jamku, OPDA v koncentraci 0,4 mg/ml (Sigma) a peroxid vodíku v koncentraci 0,03 g/l v 50mM citrátovém pufru o pH 4,5). Revelace je ukončena přidáním 1N HCI (50 μΙ do každé jamky). Imunočtečkou Biorad 3550 se při 492 a 630 nm stanovuje optická hustota. Titr protilátek se vypočítá 4 parametrovou matematickou metodou za použití softwaru SoftMaxPro.

Měření OspA specifických sérových Ig u opic - ELISA

Imunodestičky Maxisorp Nunc se přes noc při 4°C potáhnou antigenem OspA (v koncentraci 1 pg/ml, 50 μΙ do jamky) ředěným v PBS. Volná místa na destičce se 1 hodinu blokují při 37°C saturačním pufrem (PBS obsahující BSA v koncentraci 1g/l, polyoxyethylenmonolaureát sorbitan (TWEEN 20) v koncentraci 0,1g/l). Potom se přidá série dvojnásobných ředění (v saturačním pufru, 50 μΙ do jamky) referenčního séra jako standardní křivka (sérum má střední titr 60000 jednotek ELISA/ml,začíná na 12 EU/ml, řada A) a sérové vzorky (začínající na ředění 1:100, řady B až H) se 1 hodinu 30 minut inkubují při 37°C. Destičky se potom třikrát promyjí vymývacím pufrem (PBS, polyoxyethylenmonolureát sorbitan (TWEEN 20) v koncentraci 0,1 g/l). Biotinylované kozí protilátky proti lidskému Ig (Amersham) ředěné v poměru 1:3000 v saturačním pufru se inkubují (50 μΙ v jamce) 1 hodinu 30 minut při 37°C. Po třech promytích a následném přidání konjugátu streptavidinu s křenovou peroxidázou (Amersham) se destičky pětkrát promyjí a 20 minut inkubují při teplotě místnosti s revelačním pufrem (50 μΙ na jamku, OPDA v koncentraci 0,4 mg/ml (Sigma) a peroxid vodíku v koncentraci 0,03g/l v 50mM citrátovém pufru o pH 4,5). Revelace je ukončena přidáním 50 μΙ 2N

- 21 - · · · ·

4 4 4 « 4444444 kyseliny sírové do každé jamky. Imunočtěčkou Biorad 3550 se při 492 a

630 nm měří optická hustota. Titr protilátek se vypočítá 4 parametrovou matematickou metodou za použití softwaru SoftMaxPro.

Titry anti - influenza protilátek se měří podobnou technikou s tím že, antigen OspA se nahradí celým influenza antigenem inaktivovaným β propiolaktonem (BPL) získaným od SSD GmBH (Drážďany, Německo).

Měření OspA specifických opičích nosních IgA protilátek - ELISA

Imunodestičky Maxisorp Nunc se přes noc při 4°C potáhnou antigenem OspA (v koncentraci 1 pg/ml, 50 μΙ do jamky) ředěným v PBS (řady B až H). Volná místa na destičce se 1 hodinu blokují při 37°C saturačním pufrem (PBS obsahující BSA v koncentraci 1g/l, polyoxyethylenmonolaureát sorbitan (TWEEN 20) v koncentraci 0,1 g/l a normální bovinní sérum (NBS) v koncentraci 4 g/l). Potom se přidá série dvojnásobných ředění (v saturačním pufru, 50 μΙ do jamky) referenční sekrece jako standardní křivka (sekrece má střední titr 3000 jednotek ELISA/ml, začíná na 30 EU/ml, řada A ) a nosní výtěry (začínající na ředění 1:5, řady B až H) se 2 hodiny inkubují při 22°C. Destičky se potom třikrát promyjí vymývacím pufrem (PBS, polyoxyethylenmonolureát sorbitan (TWEEN 20) v koncentraci 0,1 g/l). Biotinylované kozí protilátky proti lidskému IgA (ICN, v koncentraci 0,2 μΙ/ml) v saturačním pufru se inkubují (50 μΙ v jamce) 1 hodinu 30 minut při 37°C. Po třech promytích a následném přidání konjugátu streptavidinu s křenovou peroxidázou (Amersham) se destičky pětkrát promyjí a 10 minut inkubují při teplotě místnosti s revelačním pufrem (50 μΙ na jamku, TMB, Biorad) Revelace je ukončena přidáním 50 μΙ 0,4N kyseliny sírové do každé jamky. Imunočtěčkou Biorad 3550 se při 450 a 630 nm měří optická hustota. Titr protilátek se vypočítá 4 parametrovou matematickou metodou za použití

9 · 9 · 1

- ZZ ” · · · · •··· · ·«*···· softwaru SoftMaxPro. Vzorky se považují za pozitivní, pokud titr IgA přesáhne konec zkoušky (0,3 EU/ml).

Měření titrů sérových LA2 - like protilátek na antigen lípo - OspA inhibiční zkouška

Titry protilátek v očkovacích přípravcích jsou studovány s ohledem na jejich LA2 - like specificitu. LA2 je myší monoklonální protilátka, která rozezná konformační epitop OspA na povrchu bakterie a která je schopná zabíjet B. burgdorferi in vitro a chránit myši při setkání s laboratorně vypěstovanými spirochetami (Schaible UE a kol., 1990, Proč Nati Acad Sci USA, 87, 3768 - 3772). Monoklonální protilátka LA-2 navíc koreluje s baktericidními protilátkami. Při studiích s lidskými séry korelují titry LA-2 s celkovými titry protilátek anti - OspA IgG (měřeno ELISOU).

Imunodestičky Maxisorp Nunc se přes noc při 4°C potáhnou antigenem lípo OspA (v koncentraci 0,5 pg/ml, 50 μΙ do jamky) ředěným v PBS. Volná místa se 1 hodinu blokují při 37°C saturačním pufrem (PBS, BSA v koncentraci 1 g/l, TWEEN 20 v koncentraci 0,1g/l, NBS v koncentraci 4 g/l). Série dvojnásobných ředění monoklonální protilátky (mAb) LA2 (začínajících na 4Dg/ml) se ředí v saturačním pufru (50 μΙ do jamky) za vzniku standardní křivky. Ředění sérových vzorků z očkovacích přípravků (začíná se na ředění 1:10) se přidá také a destičky se inkubují 2 hodiny při 37°C. Po inkubaci se destičky třikrát promyjí vymývacím pufrem (PBS, TWEEN 20 v koncentraci 0,1 g/l).Do každé jamky se přidá 50 μΙ konjugátu peroxidázy s monoklonální protilátkou LA2 (1:10.000) ředěných v saturačním pufru a inkubuje se 1 hodinu při 37°C. Po pěti promytích se destičky 20 minut inkubují při teplotě místnosti (ve tmě) s revelačním pufrem (50 μΙ na jamku, OPDA v koncentraci 0,4 mg/ml (Sigma) a peroxid vodíku v koncentraci 0,03g/l v 50mM citrátovém pufru o pH 4,5). Reakce a zabarvování je ukončeno přidáním 2N kyseliny sírové. Imunočtěčkou Biorad 3550 se při 492 a 630 nm měří optická

- 23 • · · 4· · 4

494 4 9 94 4 • 9 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4

4 9 9 4 4

9444944 44 44 hustota. Titry LA2 - like protilátek se vypočítají 4 parametrovou matematickou metodou za použití softwaru SoftMaxPro. Titry LA2 - like protilátek se určí porovnáním se standardní křivkou.

Příklad 2

Intranasální stimulace myší OspA antigenem

- týdenní samice kmene Balb/c (skupiny po 8 zvířatech) se imunizují nitrosvalovou injekcí 1 pg antigenů lípo - OspA na 50 pg kamence. Po třech měsících dostanou myši v celkové anestezii intranasálně upomínací dávku - 10 pl roztoku (5 pl do jedné nosní dírky pipetou po kapkách) s obsahem A: 5 pg antigenů lípo - OspA; B: 5 pg antigenů lípo - OspA v tweeenu 20 v koncentraci 36 g/l, Imwitor 742 v koncentraci 10 g/l; C: 5 pg antigenů lípo - OspA v tweenu 20 v koncentraci 36 g/l; D: 5 pg antigenů lípo OspA v polyoxyethylen - 9 -lauryletheruD v koncentraci 18 g/i.

dní po podání upomínací dávky se v sérech zjišťují IgG protilátky proti antigenů lípo - OspA a protilátky LA2 proti antigenů OspA ELISOU (viz příklad 1). Výsledky (obrázek 1) ukazují, že intranasálně podaný antigen lípo - OspA je schopen vyvolat systémové zvýšení titru protilátek IgG specifických na antigen lípo - OspA. Toto zvýšení je ale jen nepatrné za přítomnosti tweenu 20 a Imwitoru 742 nebo tweenu 20 samostatně. Zvýšení titru protilátek je ale velmi významné za přítommnosti polyoxyethylen - 9 - lauryletheru. Obdobná situace nastává při odpovědi protilátek LA2 (viz obrázek 2).

Příklad 3

Intranasální stimulace myší amtigenem OspA ·· ···♦

- 24 Skupiny myší se primárně imunizují tak, jak je popsáno v příkladu 2, a to 5 pg antigenu lípo - OspA samostatně (skupina A a C) nebo v přítomnosti B: kyseliny taurocholové v koncentraci 1g/l; D: dodecylmaltosidu v koncentraci 1g/l; E: tweenu 20 v koncentraci 36 g/l nebo F: polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v koncentraci 18 g/l. Protože zkouška se skupinami A a B probíhá v jinou dobu než zkouška se skupinami C, D, E a F, jsou na obrázcích odděleny (viz obrázek 3). Taurocholát sodný v koncentraci 1 g/l významně nezvyšuje odpověď na upomínací dávku. Dodecylmaltosid v koncentraci 1 g/l a tween 20 v koncentraci 36 g/l mají pouze slabý zesilující účinek, ale polyoxyethylen - 9 - laurylether zesiluje odezvu IgG protilátek velmi významně. Podobný účinek je pozorován při odpovědi protilátek LA2 (viz obrázek 4).

Příklad 4

Intranasální stimulace myší - studie rozsahu dávek

Ke stanovení koncentrace polyoxyethylen - 9 -lauryletheru potřebné k dosažení pomocného účinku pozorovaného v předešlých příkladech je provedena zkouška dávkového rozmezí. Protože pomocné účinky mají i ostatní polyoxyethylenethery, je zkouška provedena také s polyoxyethylen - 23 - lauryletherem. Myším primárně imunizovaným stejně jako v příkladu 1 je intranasálně podáno 10 μΙ upomínací dávky obsahující 5 μg antigenu lipo - OspA v A: PBS; B: polyoxyethylen - 9 lauryletheru v koncentraci 1g/l; C: polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v kocentraci 2 g/l; D: polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v koncentraci 5 g/l; E: polyoxyethylen - 23 - lauryletheru v koncentraci 1 g/l; F: polyoxyethylen - 23 -lauryletheru v koncentraci 10 g/l. 14 dní po podání upomínací dávky se séra analyzují stejným způsobem jako v příkladu 2.

- 25 *·*· 9 99 9 9 99 ·· · ♦ · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 · · · 9 · • *··*··· 99 99

Z obrázků 5 a 6 uvedených níže vyplývá, že i tak nízká koncentrace polyoxyethylen - 9 - lauryletheru, jako je 1 g/l způsobí velmi významné zesílení imunitní odpovědi. Stejně tak i polyoxyethylen - 23 - laurylether významně zvyšuje imunitní odpověď na intranasálně podanou upomínací dávku.

Příklad 5

Kombinovaný očkovací přípravek - intranasální upomínací dávka

V této zkoušce se ověřuje schopnost polyoxyehylenetherů zesílit systémovou imunitní odpověď po jejich intranasálním podání. Samice myšího kmene balb/c sa primárně imunizují nitrosvalovou injekcí komerčního očkovacího přípravku DTPa (difterie, tetanus, nebuněčná pertusová vakcína: INFARIX ™ Smith Kline Beecham, Belgie). Myši se imunizují jednou dvěma 50 μΙ nítrosvalovými injekcemi, které odpovídají 20% dávky u lidí. Po třech měsících myši dostanou intranasálně upomínací dávku (jako v příkladu 2) s tetanovým toxoidem (TT: 5 pg) nebo s vláknitým hemaglutininem (FHA: 5dg) v A: PBS; B: polyoxyethylen - 9 -lauryletheru v koncentraci 1 g/l; nebo C: jen nitrosvalovou injekci očkovací látky DTPa (dvakrát 50 μΙ). Po 14 dnech se v séru stanovují TT a FHA specifické IgG. Titry protilátek jsou zobrazeny na obrázcích 7 a 8.

Protein TT sám o sobě významné zesílení imunitní odezvy nevyvolá, ale polyoxyethylen - 9 - laurylether je schopen imunitní odpověď výrazně zesílit. Překvapivé je, že zesílení imunitní odpovědi po intranasálním podání antigenu v přítomnosti této pomocné látky je větší, než zesílení po nitrosvalovém podání imunizace. Podání FHA vyvolá imunitní odezvu samo o sobě, přidáním pomocného prostředku polyoxyethylen - 9 lauryletheru je tato odezva ještě více zesílena.

Příklad 6 • ·

9 9 • · ·

9 9 • 9 9

- 26 Intranasální stimulace u opic AGMs

Mnoho pomocných prostředků je účinných u malých hlodavců, ale u větších zvířat nemá jejich podávání žádný účinek. V tomto příkladu je předvedena schopnost polyoxyethylenetherů účinně zesilovat imunitní odpověď po intranasálním podání u větších zvířat. Opice kmene kočkodan zelený (AGM) se rozdělí do skupin po čtyřech a primárně imunizují nitrosvalovou injekcí 10 pg antigenu lipo - OspA na 500 pg kamence. Za 10 měsíců se zvířatům v celkové anestezii dvojdávkovým sprejovým zařízením od firmy Pfeiffer GmBH, Německo, podá intranasálně upomínací 200 μΙ (100 μΙ do jedné nosní dírky) dávka, která obsahuje 60 pg antigenu lipo - OspA v A: PBS; nebo B: polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v koncentraci 1 g/l. Po 14 dnech se v séru měří titry imunoglobulinu anti - OspA a LA2. Geometrické střední titry pro každou skupinu jsou znázorněny na obrázcích 9 a 10. U skupiny C, kterou tvoří 10 opic a která dostala primární i upomínací dávku antigenu lipo - OspA na kamenci v nitrosvalové injekci, se zjišťují titry anti - OspA imunoglobulinu (geometrické střední titry jsou ukázány jen pro titry LA2, viz obrázek 10).

Antigen lipo - OspA je při intranasálním podání opicím schopen imunitní odpověď zesilovat, ale toto zesílení je významně větší při současném podání polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v koncentraci 1 g/l. Titry protilátek zjištěné po intranasální upomínací dávce při současném podání polyoxyethylen - 9 -lauryletheru jsou opět vyšší, než titry zjištěné po nitrosvalové injekci (skupina C).

Příklad 7

Primární a upomínací intranasální imunizace AGMs ·· 444« • ·· ·· ·· • · · · · ·· >

4 9 4 4 4 «9 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4444444 44 44

V předcházejících příkladech je předvedeno, že polyoxyethylenethery pomáhají při intranasálním podání upomínací dávky zesílit systémovou imunitní odpověď. V tomto příkladu je ověřována možnost podávat primární i upomínací imunizaci zvířatům intranasálně, aby byla navozena dostatečná systémová imunitní odezva. V rámci zkoumání možnosti podávat tento pomocný prostředek větším zvířatům je zkouška provedena na opicích kmene kočkodan zelený (AGMs).

Opicím kmene kočkodan zelený (AGM) (skupiny po třech zvířatech) je intranasálně podána primární i upomínací imunizační dávka 200 μΙ (100 μί do jedné nosní dírky, podáno dvojdávkovým sprejovým zařízením od firmy Pfeiffer GmBH, Německo) obsahující 60 μρ antigenu lípo - OspA v A: PBS; nebo B: polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v koncentraci 1 g/l. Po 14 dnech se v séru měří OspA specifický imunoglobulin. Na obrázku 11 je patrné, že po intranasálním podání primární i upomínací imunizační dávky antigenu bez pomocného prostředku nenastává žádná systémová imunitní odpověď. Po podání antigenu s polyoxyethylen - 9 íauryletherem, coby pomocným prostředkem, jsou na diagramu zaznamenány významné titry anti - OspA protilátek.

Příklad 8

Pomocný účinek CpG v intranasálně podané očkovací látce na indukci systémové a nosní humorální imunitní odpovědi na antigen lípo - OspA u primátů

Na tomto modelu je ověřen pomocný účinek polyoxyethylen - 9 lauryletheru (POE-9LE) bez a ve spojení s jinými imunostimulačními látkami při primární a upomínací imunizaci primátů. Stanovují se sérové i nosní imunoglobuliny. Imunostimulační látka zde použitá je CpG 1001 popsaný v příkladu 9.

- 28 • 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 *9

999* 99 99

Metodika

Opicím kmene kočkodan zelený se intranasálně podá primární a upomínací imunizační dávka v den 0 (pl a den 14 (pil). Očkovací přípravek je podán dvojdávkovým sprejovým zařízením od firmy Pfeiffer (100 μΙ do každé nosní dírky, v celkové anestezii). Zkoušenými přípravky jsou:

skupina	antigen	pomocný prostředek	n=	podání
1	lipoOspA (60 pg)	Žádný	2	i.n.
2	lipoOspA (60pg)	CpG (100 μ9)	3	i.n.
3	lipoOspA (60 pg)	CpG (100 μ9), POE - 9 LE (0,25 g/l)	3	i.n.
4	lipoOspA (60 pg)	POE - 9 LE (0,25 g/l)	4	i.n.
5	lipoOspA (60 pg)	POE - 9 LE (0,25 g/l)	4	i.n.

14. den po pil se odeberou sérové vzorky a stanovují se titry lipo - OspA protilátek. Nosní IgA specifické na antigen se měří velmi citlivou ELISOU na nosních výtěrech odebraných ve stejné době. Zvířata se považují za pozitivní, pokud titry jejich IgA dosáhnou stanovené hladiny, která je významně výše než hladina základní.

Výsledky ·· ·*·»

Sérový OspA specifický imunoglobulin

Sérové hladiny imunoglobulinů anti - lipo - OspA měřené 14. den po pil jsou ukázány na obrázku 12. Antigen lipo - OspA podaný samostatně jako primární i upomínací imunizace nevyvolá žádné zachytitelné zvýšení sérových imunoglobulinů. V přítomnosti CpG je situace stejná. Současné podání POE - 9LE v koncentraci 0,25 g/l nebo 0,5 g/l vyvolá větší imunitní odezvu než podání CpG, přičemž nejúčinnější je koncentrace POE - 9 LE 0,5 g/l. Při podání jak CpG, tak POE - 9 LE v koncentraci 0,25 g/l je protilátková odpověď podobná jako při podání POE - 9 LE v koncentraci 0,5 g/l. To svědčí o synergii mezi složkami CpG a POE.

Nosní OspA specifické IgA

Očkovací přípravky obsahující antigen lipo - OspA samostatně nebo v kombinaci s CpG nevyvolávají žádné zvýšení zachytitelných protilátek IgA v nose (obrázek 13 souhrnně ukazuje všechny protilátkové odpovědi v nose). Při podání kombinace antigenů lipo - OspA s polyoxyethylenlauryletherem v koncentraci 0,25 g/l je pouze 25% zvířat pozitivních na „nosní IgA“ (na rozdíl od 50% pozitivních zvířat při současném podání POE - 9 LE v koncentraci 0,5 g/l). Pokud se kombinace antigenů lipo - OspA a POE - 9 LE v koncentraci 0,25 g/l doplní o CpG, pak 100% zvířat vyvine IgA protilátkovou odpověď. Z toho je zřejmé, že CpG a polyoxyethylenlaurylether jsou synergické také při indukci slizničních protilátek.

CpG a polyoxyethylenlaurylether tedy vykazují synergii při indukci antigen specifických sérových imunoglobulinů a nosních IgA u opic.

Příklad 9 •φ φφφφ φφφ φφφφ φφφφ φφφφ φ φ φφφφ φ φ φφφφφφ φ φ φφφφ

ΦΦΦΦΦΦ· ·· ··

Pomocný účinek intranasálně podaného CpG na zesílení systémové humorální odpovědi na antigen lipo - OspA

V tomto příkladu je předveden účinek dalších imunostimulačních látek přidaných k pomocnému prostředku polyoxyethylenetheru (POE - 9 LE) u myší. CpG je známý imunomodulační oligonukleotid popsaný v patentové přihlášce PCT WO 96/02555. Imunitní odpovědi zesílené očkovacími přípravky s CpG jsou přinejmenším stejně vysoké, jako imunitní odpovědi vyvolané konvenčním nitrosvalových upomínacím očkováním. Tyto přípravky jsou dále srovnávány se známým intranasálním pomocným prostředkem, termolabilním enterotoxinem z E. coli (mLT).

V této zkoušce jsou použity sekvence CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT) a CpG 1002 (TCT CCC AGC GTG CGC CAT) a negativní kontrolní sekvence neimunostimulačního CpG 1005 (TCC ATG AGC TTC CTG AGC TT).

Metodika

Myši kmene balb/c se v den 0 primárně imunizují nitrosvalovým podáním 100 pl očkovacího přípravku obsahujícího 1 pg antigenu lipo - OspA adsorbovaného na 50 pg hydroxidu hlinitého. V den 107 je zvířatům v celkové anestezii podána intranasální upomínací imunizace 10 pl (5 pl do jedné nosní dírky) nosních kapek mikropipetou. Skupiny po 6 myších dostanou upomínací dávku následujících očkovacích přípravků intranasálně (i.n) nebo nitrosvalově (i.m.):

·· ···· ·« «· ·· * · < *· · · 9 9 9 9 • 9 β ···«· * » · * ···»«· • · · · · · 9 9

9999 9 999 9999 99 99

Skupina	antigen	pomocný prostředek	Podáni
1	lipoOspa (5pg)	AIOH3 (50pig)	i.m.
2	lipoOspa (5pg)	CpG 1005(20pg), POE -9 LE(1g/l)	i.n.
3	lipoOspa (δμρ)	CpG 1002(2Όμα), POE - 9 LE(1g/I)	i.n.
4	lipoOspa (5pg)	CpG 1001(20μρ), POE - 9 LE(1 g/l)	i.n.
5	lipoOspa ^g)	CpG 1005^ig)	i.n.
6	lipoOspa (5μ$)	CpG 1002^ig)	i.n.
7	íipoOspa (5μ^)	CpG 1001^g)	i.n.
8	lipoOspa (5pg)	POE-9 LE(1g/l)	i.n.
9	lipoOspa ^g)	mLT (5^mg)	i.n.
10	lipoOspa ^g)	Žádný	i.n.
11	neimunizováno

Odběry krve jsou provedeny v den podání upomínací dávky a 14 dní poté (pil). V jednotlivých sérech se ELISOU stanovují titry OspA specifických protilátek IgG a protilátek LA2.

Výsledky

Z obrázku 14 (OspA specifické sérové IgG stanovované antigen specifickou ELISOU) a 15 (baktericidní titry LA2 v séru) vyplývá, že podání CpG samostatně nezlepšuje sérovou protilátkovou odpověď na antigen OspA. Očkovací přípravek obsahující OspA s

- 32 ·· ··*· · ·« «· ·· ·· · ·· · · *··· ·· · ····· • · « · ······ • · ·· ···« ·»·· · «*· «··· ·Φ ·· polyoxyethylenleuryletherem zvyšuje výsledné titry IgG a LA2. Nejlepších odpovědí je dosaženo, když je antigen lipo - OspA podán současně jak s polyoxyethylenlauryletherem, tak i s CpG.

Příklad 10

Dávková studie

V příkladu 4 je popsáno, že i tak malé koncentrace polyxyethylen - 9 lauryletheru, jako je 1 g/l, velmi významně zvyšují imunitní odpověď. V tomto příkladu je předvedena zkouška dávkového rozsahu s nižšími koncentracemi pomocného prostředku tak, aby byla stanovena koncentrace polyoxyethylen - 9 - lauryletheru potřebná k dosažení účinnosti této látky jako pomocného prostředku v očkovacích přípravcích na nosní sliznici.

Myši kmene balb/c se primárně imunizují tak, jak je popsáno v příkladu 2. Upomínací dávka 10 μΙ je zvířatům podána intranasálně. Dávka obsahuje 5 pg antigenu lipo - OspA v A: PBS; B: polyoxyethylen - 9 -laurylether v koncentraci 1 g/l; C: polyoxyethylen - 9 -laurylether v koncentraci 0,5 g/l; D: polyoxyethylen - 9 -laurylether v koncentraci 0,25 g/l nebo je upomínací dávka podána nitrosvalově injekcí E; 1 μg antigenu lipo OspA adsorbovaného na 50 pg kamence. 14 dní po podání upomínací dávky se v sérech stanovují titry protilátek tak, jak je popsáno v příkladu

1.

Výsledky

Z obrázků 16 a 17 je zřejmé, že polyoxyethylen - 9 -laurylether v koncentraci 0,25 g/l významně zvyšuje imunitní odpověď. Tento pomocný prostředek dosahuje již v nízké koncentraci podobné protilátkové • · · · « · • ·

odpovědi, jaká je dosažena při parenterálním podání očkovacího přípravku.

Příklad 11

Očkování opic proti chřipce

V příkladu 11 bylo ukázáno, že polyoxyethylen - 9 -laurylether zvyšuje u myší imunogennost viru chřipky. V tomto příkladu je ověřováno, zda má tento surfaktant podobný pomocný účinek také u větších druhů. Opice druhu kočkodan zelený (AGMs, 2 zvířata ve skupině, odběry krve u 2 zvířat za den) se imunizují primární a upomínací intranasálně podanou (jako v příkladu 6) dávkou 50 pg ekvivalentu HA z inaktivovaného celého viru A/Beijing/262/95 ve 200 μΙ A: PBS; B: polyoxyethylen - 9 lauryletheru v koncentraci 0,5 g/l. V den 2, 7 a 14 po podání upomínací dávky se v sérech zvířat stanovují imunoglobuliny specifické na A/Beijing/262/95 virus. Na obrázku je jasně ukázáno, že pokud je polyoxyethylen - 9 - laurylether použit jako pomocný prostředek, je imunitní odpověď na influenza antigen lepší.

Příklad 13

Očkování proti polysacharidovým antigenům

V předcházejících příkladech je ukázána schopnost polyoxyethylen - 9 lauryletheru zvyšovat imunitní odpověď na proteinový antigen. V tomto příkladu je zkoušena schopnost tohoto pomocného prostředku zvyšovat imunitní odpověď na intranasálně podanou upomínací dávku polysacharidového antigenu po předchozí parenterální primární imunizaci u myší. Myši se primárně imunizují jednorázovou podkožní 100 μΙ injekcí obsahující polysacharidy PS14 a PS19 (1 pg každého z nich) ze • · · · · ·

Streptococcus pneumoniae konjugované s nosičem D proteinu. Po dvou měsících dostanou myši v celkové anestezii intranasálně upomínací dávku 40 μΙ roztoku (v čase 0 10 μΙ do každé nosní dírky, o 30 minut později opět 10 μΙ do každé nosní dírky, podané pipetou po kapkách) pbsahujícího 1 pg konjugátu PS14 a 1 Dg konjugátu PS19 v A: 150 mM NaCI o pH 6,1; B; polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v koncentraci 1 g/l. 14 dnů po podání upomínací dávky se v séru stanovují protilátky IgG specifické na PS14 a PS19.

Výsledky

Z obrázků 20 a 21 je patrno, že samostatné podání PS14 a PS19 vyvolá imunitní odpověď, která je ještě více zesílena podáním polyoxyethylen 9 - lauryletheru jako pomocného prostředku.

Příklad 14

Polyoxyethylen - 8 - stearylether

V tomto příkladu je ukázáno, že pomocný účinek na imunitní odezvu mají i jiné polyoxyethylenethery, například polyoxyethylen - 8 - stearylether.

Myším kmene balb/c primárně imunizovaným stejně jako v příkladu 2 je intranasálně podána upomínací dávka 10 μΙ obsahující 5 pg antigenu lípo - OspA v A: PBS; B; polyoxyethylen - 9 - lauryletheru v koncentraci 1 g/l; C; polyoxyethylen - 8 - stearyletheru v koncentraci 1 g/l; nebo dávka D: nitrosvalová injekce 1 pg antigenu lípo - OspA adsorbovaného na 50 pg kamence. 14 dní po podání upomínací dávky se séra anlyzují stejným způsobem jako v příkladu 1.

9

- 35 Výsledky

Z obrázků 22 a 23 vyplývá, že polyoxyethylen - 8 - stearylether zesiluje imunitní odpověď na antigen stejně významně jako polyoxyethylen - 9 laurylether. Po podání obou polyoxyethylenetherů se titry protilátek zvyšují stejně, jako po podání očkovacího přípravku parenterálně.

Claims (41)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Pomocný prostředek, vyznačující se surfaktant vzorce (I) ΗΟ(ΟΗ₂ΟΗ₂Ο)_η - A - R,

   50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících; a farmaceuticky přijatelné vehikulum, přičemž surfaktant vzorce (I) je ve formě vodného roztoku nebo micel.
2. 2. Pomocný prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I) HO(CH₂CH2O)_n - A - R, kde n je číslo od 1 do 50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkyiová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhiících; a farmaceuticky přijatelné vehikulum, přičemž surfaktant vzorce (I) není ve formě vezikul a pomocný prostředek neobsahuje polymer kyseliny akrylové.
3. 3. Pomocný prostředek podie nároku 1 nebo vyznačující se tím, že neobsahuje emulzi typu olej ve vodě nebo voda v oleji.
4. 4. Pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že surfaktant vzorce (I) má hemolytické účinky.
5. 5. Pomocný prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I) HO(CH₂CH₂O)_n - A - R, kde n je číslo od 1 do 50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících; a farmaceuticky přijatelné vehikulum, přičemž surfaktant vzorce (I) není ve formě vezikul a stupeň hemolytické aktivity se při zkoušce krevní hemolýzy u morčete pohybuje v rozmezí 0,05 - 0,0001%.

   • · · ·

   - 37
6. 6. Pomocný prostředek podle nároků 4 nebo 5 vyznačující se tím, že hemolytická aktivita surfaktantu vzorce (I) se při zkoušce krevní hemolýzy u morčete neliší více než desetkrát od hemolytické aktivity polyoxyethylen - 9 - lauryletheru a polyoxyethylen - 8 stearyletheru.
7. 7. Pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I), kde n je číslo od 4 do 24.
8. 8. Pomocný prostředek podle nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I), kde R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 8 až 20 uhlících.
9. 9. Pomocný prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I) HO(CH₂CH2O)_n - A - R, kde n je číslo 9, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících; a farmaceuticky přijatelné vehikulum, přičemž surfaktant vzorce (I) není ve formě vezikul.
10. 10. Pomocný prostředek podle nároku 8 nebo 9 vyznačující se tím, že R je alkylová skupina o 12 uhlících.
11. 11. Pomocný prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I) HO(CH2CH₂O)_n - A - R, kde n je číslo 8, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících; a farmaceuticky přijatelné vehikulum, přičemž surfaktant vzorce (I) není ve formě vezikul.

    • · · · • · · · • · · · • · · · • · · ·

    - 38
12. 12. Pomocný prostředek podle nároku vyznačující se tím, že R je alkylová skupina o 18 uhlících.
13. 13. Pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I), kde A je vazba a tím je vytvořen ether.
14. 14. Pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že obsahuje surfaktant vzorce (I), kde A je skupina -C(O)- a tím je vytvořen ester.
15. 15. Pomocný prostředek podle nároku vyznačující se tím, že poiyoxyethylenether nebo polyoxyethylenester vzorce (I) patří do následující skupiny: polyoxyethylen - 9 - laurylether, polyoxyethylen

    - 9 - laurylester, polyoxyethylen - 9 - stearylether, polyoxyethylen 8 - stearylether, polyoxyethylen - 4 - laurylether, polyoxyethylen - 35

    - laurylether, polyoxyethylen - 23 - laurylether.
16. 16. Pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až vyznačující se tím, že koncentrace surfaktantu se pohybuje v rozmezí 0,1-10 g/l.
17. 17. Pomocný prostředek podle nároku 16 vyznačující se tím, ž e koncentrace surfaktantu se pohybuje v rozmezí 0,25 - 1 g/l.
18. 18. Kombinace pomocných prostředků, vyznačující se tím, že se skládá z pomocného prostředku obsahujícího surfaktant vzorce (I) HO(CH₂CH₂O)_n - A - R, kde n je číslo od 1 do 50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících a farmaceuticky přijatelné vehikulum, přičemž

    - 39 • · · w » · · 4 » · · 1 * · · « » · · « • · · · surfaktant vzorce (I) není ve formě vezikuí; a z ještě alespoň jedné imunostimulační látky ze skupiny: LT, CT, 3D - MPL, CpG a QS21.
19. 19. Kombinace pomocných vyznačující se tím, že obsahuje pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 17 v kombinaci s alespoň jednou imunostimulační látkou.
20. 20. Kombinace pomocných prostředků podle nároku 19 vyznačující se tím, že alespoň jedna imunostimulační látka patří do skupiny: LT, CT, 3D - MPL, CpG a QS21.
21. 21. Pomocný prostředek podle nároku vyznačující se tím, že imunostimulační látka CpG obsahuje tyto sekvence: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO. 1).
22. 22. Kombinace pomocných vyznačující se tím, že se skládá z polyoxyethylenetheru, a to buď polyoxyethylen - 9 lauryletheru nebo polyoxyethylen - 8 - stearyletheru, a z 3D - MPL.
23. 23. Pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až vyznačující se tím, že dále obsahuje vehikulum patřící do skupiny: chitosan a další polykatiionové polymery, polylaktidové a polylaktidoglykolidové částice, částice složené z polysacharidů nebo z chemicky upravených polysacharidů nebo částice složené z monoesterů glycerolu.
24. 24. Pomocný prostředek vyznačující se tím, že obsahuje polyoxyethylen - 9 - laurylether.

    - 40
25. 25. Očkovací přípravek vyznačující se tím, že obsahuje pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 24 a dále antigen nebo antigenní přípravek.

    • · ····
26. 26. Očkovací přípravek podle nároku v y z n a č u j í c í se tím, že antigen nebo antigenní přípravek je odvozen od těchto patogenů: virus lidské imunodeficience, varicella zoster virus, herpes simplex virus typ 1, herpes simplex virus typ 2, lidský cytomegalovirus, virus horečky dengue, viry hepatitid A, B, C nebo E, respiračně syncitiální virus, lidský papilloma virus, infíuenza virus, Hib, virus meningitidy, salmonela, neisserie, borrelie, chlamydie, bordetela, streptokokus, mykoplazma, mykobakterium, hemofilus, plasmodium nebo toxoplazma, IgE peptidy, jako je stanworth dekapeptid; nebo od antigenů spojených s nádorovým bujením (TMA): MÁGE, BAGE, GAGE, MUC - 1, Her - 2 - neu, LnRH, CEA, PSA, KSA nebo PRÁME.
27. 27. Očkovací přípravek vyznačující se tím, že obsahuje polyoxyethylen - 9 - laurylether a infíuenza virus antigen.
28. 28. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků 25 až 27 vyznačující se tím, že je ve formě aerosolu nebo spreje.
29. 29. Použití surfaktantu obecného vzorce (I) HO(CH2CH₂O)_n - A - R, kde n je číslo od 1 do 50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících, přičemž surfaktant vzorce (I) není ve formě vezikul, ve výrobě léčiva k aplikaci na slizniční povrch nebo na kůži pacienta.
30. 30. Použití pomocného prostředku podle kteréhokoli z nároků 1 až 24 ve výrobě léčiva k aplikaci na slizniční povrch nebo na kůži pacienta.

    ···· “ H1 - · · · · ···· ···· 9 999 9999 99 99
31. 31. Použití surfaktantu obecného vzorce (I) podle nároku 29 vyznačující se tím, že léčivo neobsahuje polymer kyseliny akrylové.
32. 32. Použití surfaktantu obecného vzorce (I) podle nároku vyznačující se tím, že léčivo neobsahuje emulzi typu olej ve vodě nebo voda v oleji.
33. 33. Použití polyoxyethylen - 9 - lauryletheru nebo polyoxyethylen - 8 - stearyletheru ve výrobě očkovacího přípravku k aplikaci na slizniční povrch nebo na kůži pacienta.
34. 34. Sprejové zařízení, zvláště dvojdávkové sprejové zařízení, s očkovacím vyznačující se tím, že očkovací přípravek obsahuje (a) surfaktant obecného vzorce (I) HO(CH2CH2O)_n - A - R, kde n je číslo od 1 do 50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících; (b) farmaceuticky přijatelné vehikulum; a (c) antigen nebo antigenní přípravek.
35. 35. Použití očkovacího přípravku podle kteréhokoli z nároků 25 až 28* ve výrobě očkovacího přípravku pro léčbu virových, bakteriálních a parazitárních infekcí, alergií nebo nádorů.
36. 36. Způsob léčby savců ohrožených nebo již nemocných infekcí, nádorem nebo alergií vyznačující se tím, že je savcům podáváno bezpečné a účinné množství očkovacího přípravku podle kteréhokoli z nároků 25 až 28.

    ·· ·♦·· · 4>· ·· ·« ·· · ··»· ··· · ·· · ···>·

    ΊΊ · · « · ·····«

    - τ·2 ~ · · · · ··*·

    9999 9 999 9999 ·· ··
37. 37. Způsob léčby savců ohrožených nebo již nemocných infekcí, nádorem nebo alergií vyznačující se tím, že je savcům podáváno na sliznici bezpečné a účinné množství očkovacího přípravku podle kteréhokoli z nároků 25 až 28.
38. 38. Způsob léčby savců ohrožených nebo již nemocných infekcí, nádorem nebo alergií vyznačující se tím, že je savcům intranasálně podáváno bezpečné a účinné množství očkovacího přípravku podle kteréhokoli z nároků 25 až 28.
39. 39. Způsob výroby očkovacího přípravku podle kteréhokoli z nároků 25 až 28 v y z n a č u j í c í se tím, že se smíchá (a) pomocný prostředek podle nároků 1 až 24, (b) farmaceuticky přijatelné vehikulum a (c) antigen nebo antigenní přípravek.
40. 40. Očkovací přípravek nebo pomocný prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 28 vyznačující se tím, že je používán jako léčivo.
41. 41. Očkovací přípravek složený z pomocného prostředku, farmaceuticky přijatelného vehikula a antigenu nebo antigenního přípravku vyznačující se tím, že pomocný prostředek je surfaktant vzorce (I) HO(CH₂CH₂O)_n - A - R, kde n je číslo od 1 do 50, A je vazba nebo skupina -C(O)-, R je alkylová nebo fenylalkylová skupina o 1 až 50 uhlících.