CZ20001776A3 - Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu - Google Patents
Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20001776A3 CZ20001776A3 CZ20001776A CZ20001776A CZ20001776A3 CZ 20001776 A3 CZ20001776 A3 CZ 20001776A3 CZ 20001776 A CZ20001776 A CZ 20001776A CZ 20001776 A CZ20001776 A CZ 20001776A CZ 20001776 A3 CZ20001776 A3 CZ 20001776A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- molecules
- containers
- thermal
- curve
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Způsob funkční klasifikace proteinu, který je schopen se
během tepelné změny rozvinout. Způsob zahrnuje testování
jedné nebo několika z většího počtu různých molekul na
schopnost posunovat křivku tepelného rozvinutí pro protein,
přičemž posun v křivce tepelného rozvinutí indikuje, že se
molekula váže na protein nebo ovlivňuje měřitelným
způsobem stabilitu, vytvoření spektra aktivity pro protein, kde
spektrum aktivity odráží sadu molekul z většího množství
molekul, které posunují křivku tepelného rozvinutí proteinu, a
jsou tudíž ligandy, které se na protein váží, porovnání spektra
aktivity pro protein sjedním nebo několika funkčními
referenčními seznamy a klasifikací proteinu podle sady
molekul ve větším počtu různých molekul, které posunují
křivku tepelného rozvinutí proteinu.
Description
Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu klasifikace proteinu založeného na schopnosti jednoho nebo více ligandů modifikovat stabilitu, zvláště tepelnou stabilitu, proteinu tak, že tato modifikace označuje interakci mezi ligandem a proteinem.
Dosavadní stav techniky
Přibližně 3 χ 109 párů nukleotidových baží obsažených v lidském genomu kóduje přibližně 60 000 až 100 000 základních proteinů (Alberts, et al., Molecular biology of the cell, 3rd Ed. , Alberts, B.D. et al., Eds. (1994); Rowen, L. et al., Science 278: 605 (1997)). Výzkumníci podílející se na projektu lidského genomu rychle identifikují všechny geny obsažené na 23 párech lidských chromozomů. Produkty těchto genů jsou všeobecně uznávány jako budoucí oblast terapeutických cílů pro vývoj léčiv v následujících dekádách. Zatímco sekvenování lidského genomu bude ukončeno zhruba během několika let, objasnění funkce těchto genů je otázka vzdálené budoucnosti. Pro porozumění funkční organizaci lidského genomu a vytvoření přechodu od „strukturní genomiky (strukturní organizace genomu) neboli od informací o sekvenci k „funkční genomice (funkčnosti genomu) a k .souvislosti s normálními a patologickými fenotypy, hledají se nové technologie (Hieter and Boguski, Science 278: 601 (1997)).
Obtížnost tohoto úkolu jasně ilustruje nedávné zjištění, že ze 4 288 genů v elementárním genomu mikroorganizmu E. coli je funkce asi 40 % proteinů kódovaných těmito geny zcela neznámá (Blattner et al., Science 277: 1453 (1997)).
Z dvanácti jednoduchých organizmů, v případě nichž je dostupná
* informace o celém genomu, z nichž největší je S. cerevisiae s 12,1 megabázemi (6 034 geny), se identifikovalo za použití dosavadní metody počítačového porovnání sekvencí pouze 44 % až 69 % genů (Pennisi, E., Science 277: 1433 (1997)). Spirocheta, která způsobuje syfilis, má 1 014 genů, z nichž 45 % nemá žádnou známou funkci (Fraser et al., Science 281: 375-388 (1998)). Existuje zde tedy mezera ve funkčních informacích, která představuje výzvu tradičním metodám a současně příležitost k objevení nových cílů pro terapeutické zásahy.
Klasifikace proteinů neznámé funkce založená na homologii nukleotidů nebo aminokyselin s proteiny se známou funkcí je však nepřesná a nespolehlivá. Funkce proteinů, které vykazují strukturální homologii, nemusí být stejná. Například lysozym a α-laktalbumin vykazují 40 % sekvenční homologii, ale odlišné funkce. Lysozym je hydroláza a α-laktalbumin je protein vázající vápník, který se podílí na syntéze laktózy při jejím vylučování do mléka během laktace savců (Qasba and Kumar, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 32: 255-306 (1997)).
Některé proteiny mají podobnou funkci a přitom nevykazují sekvenční homologii. Například serinové proteázy trypsin a subtilisin mají podobnou funkci, aniž vykazují sekvenční nebo strukturální homologii (Tong et al., Nátuře Structural Biology 9: 819-826 (1998)) . Cyklické proteinové kinázy závislé na AMP a D-Ala:D-Ala ligázy z rodiny kináz „ATP Grasp nemají žádnou sekvenční homologii, a přitom sdílejí společné strukturální elementy pro rozeznávání ATP a jsou to oba enzymy závislé na ATP (Denessiouk et al., Protein Science 7: 1768-1771 (1998)). Některé proteiny nevykazují žádnou sekvenční homologii, vykazují určitou strukturální homologii a přitom mají rozdílné funkce. Příklady takových proteinů je protein nesoucí rezistenci na bleomycin, bifenyl 1,2-dioxygenáza a lidská glyoxaláza (Bergdoll et al., Protein Science 7: 1661-1670 (1998) ) .
·· ·· ·· ·· • ··· ···· • · ···· · ·· · ··· ·· ··· ·· · ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ·· ··
Proto je zde potřeba přesné, spolehlivé technologie, která umožňuje rychlou klasifikaci proteinů s neznámou funkcí s vysokou prostupností.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje metody funkční klasifikace proteinu. Tyto metody se vzzahují ke schopnosti molekul v množství různých molekul modifikovat stabilitu proteinu a tak se vázat na protein. Tři z uvedených metod nezahrnují stanovení, zda molekuly, které se váží na protein, posouvají křivku teplotního rozvinutí proteinu. Tři alternativní a rozdílné metody zahrnují stanovení, zda molekuly, které se váží na protein, posouvají křivku teplotního rozvinutí proteinu.
A. Metody, které nezahrnují stanovení, zda molekuly, které se váží na protein, posouvají křivku termálního rozvinutí proteinu.
Vynález popisuje způsob funkční klasifikace proteinu, zahrnující testování jedné nebo několika z většího množství různých molekul na schopnost modifikovat stabilitu proteinu, přičemž modifikace stability proteinu indikuje, že se molekula váže na protein; vytvoření spektra aktivity testovaného proteinu, kde spektrum aktivity odráží podsoubor molekul z většího množství různých molekul, které modifikují stabilitu proteinu a proto jsou ligandy, které se váží na protein; porovnání spektra aktivity proteinu s jedním nebo více seznamy referenčních funkčních spekter a klasifikaci proteinu podle souboru molekul ve větším množství různých molekul, které modifikují stabilitu proteinu.
Vynález dále popisuje způsob funkční klasifikace proteinu, zahrnující testování jedné nebo více z většího množství různých molekul, o nichž se ví, že se vážou na určitou třídu proteinů, na schopnost modifikace stability ···· ·· ·· ·· ·· ·· ··· ··· · ·· · ·· · · · · ·· · · · · ·· · · · · · · · · ·· · • ·· · · ·· · · · · · •· ·· ·· ·· ·· ·· proteinu. Modifikace stability proteinu indikuje, že molekula se váže na protein; vytvoření spektra aktivity proteinu, kde spektrum aktivity odráží sub-sadu molekul z více různých molekul, které modifikují stabilitu proteinu a proto jsou ligandy, který se váží na protein; porovnání spektra aktivity proteinu s jedním nebo více seznamů referenčních funkčních spekter a klasifikaci proteinu podle sady molekul ve velkém množství molekul, které modifikují stabilitu proteinu.
Vynález také popisuje způsob funkční klasifikace proteinu. Tento způsob zahrnuje klasifikaci proteinu podle sady molekul ve velkém množství různých molekul, které modifikují stabilitu proteinu.
B. Alternativní a odlišné metody, které zahrnují stanovení, zda molekuly, které se váží na protein posouvají křivku termálního rozvinutí proteinu.
Vynález popisuje způsob funkční klasifikace proteinu, který je schopen se rozvinout na základě změny teploty. Tento způsob zahrnuje testování schopnosti jedné nebo více molekul z velkého množství různých molekul posunout, křivku termálního rozvinutí proteinu, kde posun na křivce termálního rozvinutí proteinu indikuje, že se molekula váže na protein; na základě testování se vytvoří spektrum aktivity proteinu , kde spektrum aktivity odráží sub-sadu molekul velkého množství různých molekul, které posouvají křivku termálního rozvinutí proteinu a proto tvoří ligandy, které se vážou na protein; porovnání spektra aktivity proteinu s jedním nebo více seznamů referenčního funkčního spektra a klasifikace proteinu vzhledem k sadě molekul ve velkém množství různých molekul, které posouvají křivku termálního rozvinutí proteinu.
Vynález také popisuje způsob funkční klasifikace proteinu, který je schopný se rozvinout na základě změny teploty. Uvedený způsob zahrnuje testování schopnosti jedné nebo více molekul z velkého množství různých molekul, které jsou známy, • · · · • · · « • · · ( » 9 9 I • · 99 že vážou určitou třídu proteinů, posunout křivku termálního rozvinutí proteinu, kde uvedený posun indikuje, že se molekula váže na protein; na základě testování se vytvoří spektrum aktivity proteinu, kde spektrum aktivity odráží sub-sadu molekul velkého množství různých molekul, které posouvají křivku termálního rozvinutí proteinu a proto tvoří ligandy, které se vážou na protein; a klasifikace proteinu jako člena třídy proteinů, jestliže jedna nebo více molekul z velkého množství různých molekul posouvá křivku termálního rozvinutí proteinu.
Vynález také popisuje způsob funkční klasifikace proteinu, který je schopný se rozvinout na základě změny teploty. Uvedený způsob zahrnuje klasifikaci proteinu vzhledem k sadě molekul ve velkém množství různých molekul, které posouvají křivku termálního rozvinutí proteinu.
Vynález přináší několik výhod způsobů podle vynálezu při procesu výzkumu léků, zvláště s ohledem na funkční organizaci genomu. Například metody podle vynálezu umožňují široké využití, protože jsou založeny na termodynamických vlastnostech, které jsou běžné pro všechny komplexy 1igand/receptor. Dále metody podle vynálezu umožňují řídit hodnocení proteinových cílů získaných ze studií genomu, protože není nutná znalost funkce specifického cíle.
Dále je výhodné, že metody podle vynálezu se mohou aplikovat univerzálně v případě libovolného receptoru, který je cílem pro léky. Když se testuje nový receptor, není nutné pokaždé vyvíjet nový test. Testování knihoven látek začíná ihned po přípravě cíle proteinu.· Když studovaný receptor je enzym, je možné stanovit pořadí rozmezí stupňů afinity sérií látek rychleji a jednodušeji ve srovnání s běžnými kinetickými metodami. Navíc je možné stanovit navázání ligandu na enzym bez ohledu na to, zda dojde k navázání na aktivní místo, na vazebné místo alosterického ko-faktoru nebo na rozhraní pod • · ·
• · · · « · · · • · · · · · « · · · ··· · β ··· · · · jednotky receptorů. Vynález je aplikovatelný v případě receptorů, které nejsou enzymatické.
Vynález dále popisuje způsoby, které minimalizují objemy testů (například 1 až 5 μί), což umožňuje použití testu na mikrotitračních destičkách s vysokou hustotou prohlubní v uspořádání 16 x 24 (384 prohlubní) , 32 x 48 (1 536 prohlubní) nebo dále ve speciálním uspořádání. Do prohlubně je nutné dát pouze přibližně 5 až 40 pikomolů proteinu (0,1 μς až 1,0 μρ proteinu o molekulové hmotnosti 25 000), přičemž konečná koncentrace proteinu je přibližně 1 až 4 μΜ. 1,0 mg proteinu se používá k provedení 103 až IO4 testů v miniaturním provedení.
Vynález dále popisuje metody umožňující testování knihoven látek s ultra vysokou prostupností (to například znamená knihovna funkčních sond). Takovou metodou je možné testovat 10 000 až 30 000 látek na jednom přístroji za den. Při této rychlosti je možné testovat 2,5 až 6 proteinů za den na jednom zařízení proti funkčních knihovně sond obsahující 4 000 látek. Za jeden rok je možné na jednom zařízení testovat alespoň 500 až 1 200 terapeutických cílů proti funkčních knihovně sond obsahující 4 000 látek. Během pěti let je možné testovat na jednom zařízení 3 až 7,5 % proteinů kódovaných lidským genomem.
Vynález dále popisuje metody, kterými je možné testovat široké dynamické rozmezí vazebných· afinit, které' se mohou testovat v testu v jediné prohlubni a které pokrývají rozsah hodnot dvanácti řádů (to je femtomolární (ΙΟ-15 M) až milimolární (10~3M) afinit.
Dále. vynález popisuje způsob vazebných interakcí, které se mohou monitorovat prostřednictvím aditivity volné energie navázání ligandu v případě jednotlivých ligand.
Metody podle vynálezu poskytují informace, které jsou přesnější a spolehlivější, než informace získané klasickými metodami sekvenční homologie, jak se popisují v publikacích ··«· φφ ·· φ φ ·· φφ • « · · φ ♦ φφφφ φφ φ φ ·φφφ φ · · · φφ φφφ φφ φφφ φφ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ Φ· φφ φφ
Tatusov, R. L. et al., Science 278: 631-637 (1997) a Heiter, P. and M. Boguski, Science 278: 601-602 (1997).
Navíc je možné identifikovat a rozlišit různé třídy enzymů na základě schopnosti vázat se na různé sady analogů přechodného stavu. Například se zjistilo, že deriváty kyseliny benzenborité (BBA) se vratně vážou na různé serinové proteázy, jako jsou subtilisiny z bakteriálních zdrojů a a-chymotrypsin z eukaryontních zdrojů (Nakatani, H., et al., J. Biochem. (Tokyo) 77: 905-8 (1975)). Zjistilo se, že boroargininové analogy v přechodném stavu, které mají argininovou skupinu rpo tato syntetická peptidomimetika v poloze Pl, jsou specifičtějšími inhibitory serinových proteáz, trombinu, trypsinu a plazminu (Tapparelli et al., J. Biol. Chem. 268: 4734-41 (1993)) s pozorovanou specifitou: Kd přibližně 10 nM (trombin), Kd přibližně 1 000 nM (trypsin), Kd přibližně 10 000 nM (plazmin). To ukazuje důležitou výhodu, kterou poskytují metody podle vynálezu, pokud jde o klasifikaci proteinů porovnáním sekvencí: posun ÁTm očekávaný při navázání analogu kyseliny borité v přechodném stavu by měl být mnohem charakterističtější pro serinovou proteázu (bez ohledu na skutečnost, zda pochází z bakteriálního nebo eukaryontního zdroje) ve srovnání s informací, kterou poskytuje samotné porovnání sekvencí. Serinové proteázy z bakteriálních a eukaryontních zdrojů jsou učebnicové příklady konvergentního vývoje a proto vykazují velmi malou sekvenční homologii navzdory skutečnosti, že sdílí katalytickou funkci.
Vynález popisuje metody funkční klasifikace proteinu, který je schopen se rozvinout, podle sady molekul ve větším množství různých molekul, které modifikují stabilitu proteinu. Rozvinutí proteinu může být vyvoláno ošetřením denaturačním činidlem (jako je močovina, guanidinhydrochlorid, guanidinthiosukcinát • · »
φφφφ ·· · · φφ • · · φ · φ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φφ φ φ φφ φφ φφ φφ · φ φφ atd.), působením detergentů, aplikací tlaku, zahřáním proteinu atd. .
Vynález popisuje způsoby funkční klasifikace proteinu, které zahrnují stanovení, zda dojde k posunu křivky teplotního rozvinutí proreinu. Za ligandy, které se vážou na protein se považují pouze molekuly, které způsobují posun křivky termálního rozvinutí proteinu. Je výhodné, aby se pro stanovení posunu křivky teplotního rozvinutí proteinu použil test teplotního posunu na mikrotitračních destičkách. Test teplotního posunu na mikrotitračních destičkách zahrnuje stanovení, zda testované vázající se molekuly způsobují posun křivky termálního rozvinutí. Test termálního posunu na mikrotitračních destičkách se popisuje v mezinárodní patentové přihlášce 901,/11397/08154 (uveřejněné 13. listopadu 1997 jako dokument č. WO 97/42500), přihlášce US patentu č. 08/853,464 podané 9. kvěrna 1997 a v přihlášce US patentu č. 08/853,459 podané 9. kvěrna 1997.
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob klasifikace cílového proteinu, který je schopný se rozvinout na základě změny teploty. V jednom provedení vynálezu přijde cílový protein do kontaktu s jednou molekulou velkého množství různých molekul v každém z velkého počtu kontejnerů. Kontejnery se pak v intervalech zahřívají za hranice rozmezí teplot. Upřednostňuje se, aby se kontejnery zahřívaly současně. Po každém intervalu zahřívání se měří fyzikální změna spojená s termálním rozvinutím cílové molekuly. V jiném provedení této metody se vynáší do grafu křivka termálního rozvinutí v případě cílové molekuly v každém kontejneru jako funkce teploty. Pro každou křivku termálního rozvinutí se stanovuje teplota středu Tm a pak se porovnává s hodnotou Tm křivky termálního rozvinutí získané v případě cílové molekuly, kdy v kontejnerech nejsou přítomny žádné molekuly. V jiném případě se celá křivka termálního rozvinutí porovnává s jinou • · « ·
4
4444
4 4 44 4 4 44 4
44 44 44 44 44 celou křivkou termálního rozvinutí za použití počítačové analýzy.
Způsoby podle vynálezu, které zahrnují stanovení, zda molekuly posunou křivku termálního rozvinutí proteinu se liší od metod, které nezahrnují toto stanovení. Takové testy jsou například test náchylnosti k proteolýze, povrchové navázání na protein, navázání protilátek na protein, diferenciální navázání na imobilizovaný ligand a agregace proteinu a jsou dobře známy v oboru. Například se popisují v dokumentu US patent č. 5,585,.277 a US patent č. 5,679,582. Tyto přístupy popsané v dokumentu US patent č. 5,585,277 a 5,679,582 zahrnují porovnání rozsahu, svinutí a/nebo rozvinutí proteinu v přítomnosti a v nepřítomnosti testované navázané molekuly. Tyto přístupy nezahrnují stanovení, zda libovolné molekuly, které se vážou na protein způsobují posun křivky teplotního rozbalení proteinu.
Termín „funkční klasifikace proteinů znamená klasifikaci proteinu podle biologické, biochemické, fyzikální nebo chemické funkce, jako je schopnost hydrolyzovat fosfátové části (fosfatáza), přidat fosfátové části (kináza) atd.. Proteiny se mohou klasifikovat podle jedné nebo více z řady různých funkcí a metody podle vynálezu se neomezují na klasifikaci proteinů, jako jsou fosfatázy, kinázy nebo jiné typy enzymů.
Termíny „velké množství molekul, „velké množství látek nebo „velké množství kontejnerů znamená alespoň dvě molekuly, dvě látky nebo dva kontejnery.
Termín „sub-sada molekul ve velkém množství různých molekul znamená sadu molekul zahrnující menší počet molekul než velké množství různých molekul.
Termín „multi-variabilní znamená více než jedna experimentální proměnná.
Termín „testování znamená testování schopností velkého množství molekul nebo látek vázat se na cílovou molekulu, • 999
9 9 9 9 9
9 9 9 9 999
9 9 9 9 9 9
99 99 99
99 ♦ 9
9
9
9 99 která je schopna se, když se zahřeje, rozvinout. Postup testování je opakovaný nebo iterativní postup, ve kterém se u molekul testuje schopnost vázat se na protein v testu rozvinutí a zvláště v testu teplotního posunu. Jestliže se například sub-sada molekul v knihovně funkčních sond, u které se testuje schopnost vázat se na protein, neváže, pak se testování opakuje s jinou sub-sadou molekul. Jestliže knihovna vůbec neobsahuje molekuly, které vážou protein, pak se testování opakuje za použití molekul z jiné knihovny funkčních sond.
Termín „testování funkčních sond představuje stanovení (například test) schopnosti většího množství molekul v knihovně funkčních sond vázat cílový protein a modifikovat stabilitu cílového proteinu.
Termín „knihovna funkčních sond se vztahuje na jednu nebo více různých molekul, u kterých se testuje schopnost vázat se na cílový protein a modifikovat stabilitu, zvláště pak teplotní stabilitu proteinu jako odezvu na rozvinutí proteinu (například teplotní rozvinutí). Při provádění testu stability, s výhodou s použitím testovací technologie teplotního posunu na mikrotitračních destičkách, s proteinem v přítomnosti každého člena knihovny funkčních sond, mohou se sloučeniny inkubovat s cílovým proteinem individuálně a/nebo ve skupinách za účelem stanovení, které ligandy se individuálně nebo v kombinaci váží těsně a specificky na cílový protein.
Knihovnou funkčních sond může být libovolný druh knihovny molekul, zahrnující knihovnu proteinů, knihovnu proteinových podjednotek, knihovnu peptidů, knihovnu vitaminů a ko-faktorů, knihovnu inhibitorů enzymů, knihovnu nukleových kyselin, knihovnu generických léků, knihovnu přirozených produktů nebo kombinační knihovnu. Pro molekuly v knihovně, které se vážou na cílový protein, se může stanovit biologický účinek testem in vitro a in vivo.
toto·· <· • · to * to · • to • · to to • ·· to· « ·· ·· » ·· < • · to·
Jestliže funkční testovaná knihovna je kombinační knihovna, pak je to s výhodou kombinační knihovna připravená za použití systému DirectedDiversity®. Systém
DirectedDiversity® se popisuje v US patentu č. 5,463,564.
Termín „spektrum aktivity se zde vztahuje na seznam látek (tj. ligandú), které se váží na cílový protein a modifikují stabilitu cílového proteinu (například teplotní stabilitu) a příslušné afinity ligandú vůči cílovému proteinu. Termíny „profil navázání funkční sondy a „spektrum aktivity jsou Pokles Tm naznačuje, že látka nebo molekula blokuje synonyma navázání by stabilizovala protein.
jiné molekuly, která Jestliže se například sníží Tm působením kovového chelátoru, naznačuje to, že se protein váže na kov (například interakcí mezi vápníkem a a-laktalbuminem). Jestliže se působením redukčního činidla, pak to naznačuje, protein obsahuje jednu nebo více disulfidických vazeb.
Termín „seznam funkčních referenčních spekter se zde vztahuje na seznam tříd cílových proteinů (včetně odkazů na příslušné elektronické databáze), souvisejících ligandu a odpovídajících vazebných konstant, které se mohou použít k funkční klasifikaci cílového proteinu. V jiném případě může seznam funkčních referenčních spekter tvořit sada jednoho nebo více spekter aktivit pro jeden nebo více známých proteinů. Tak může spektrum aktivity daného proteinu sloužit jako „fingerprint pro uvedený protein a pro funkční třídů proteinů, do které protein patří.
Termín „funkční referenční seznam znamená seznam proteinů, které sdílejí jeden nebo více společných rysů, jako je vázání určitého ligandu nebo vykazování společné aktivity.
Termín „komparátor spektra aktivity označuje počítačové nebo grafické zařízení, kterým je možné porovnat spektrum aktivity, odvozené z pozorování účinků knihovny funkčních sond na cílový protein, se seznamem funkčních referenčních spekter.
Tm sníží že tento • ftftft · · · * ftft ftft ftft ft·· · · · · · · · ftft · ft ftftftft · ftft · • ft ftftft ftft ftftft ftft · • ftftft ft··· ftftftft ·· ·♦ ·· ·· ·· ··
Komparátorem spektra aktivity může být například tabulkový procesor, snadno dostupný běžným odborníkům. Může se použít například Microsoft Excel (Microsoft Inc., Redmond, WA) .
V mnoha případech může být genu pokusně přisouzena funkce prostřednictvím homologie se sekvencemi se známou funkcí („funkční hypotéza získaná ze sekvenční homologie). Test teplotního posunu se může použít k ověření takové funkční hypotézy nebo k identifikaci správné funkce ze seznamu možných funkcí implikovaných sekvenční homologii. Existují například proteiny, které hydrolyzují ATP a převádějí energii hydrolýzy na mechanickou energii, známé jako „molekulové motory. Tyto proteiny zahrnují .DNA a RNA helikázy, kinesiny, šaperoniny pro opětné svinování proteinů a proteinové komplexy v bázi bakteriálního bičíku. Tyto proteiny všechny sdílí sekvenční homologii v ATP-hydrolyzující oblasti, zatímco jejich další funkce se liší. Při jedné aplikaci metod podle vynálezu se může použít známá sekvenční homologie části cílového proteinu (například oblast ATPázy) pro navržení testu na tepelný posun za použití specifické knihovny funkčních sond řízené na různé možné funkce cílového proteinu (například knihovny obsahující molekuly pro testování speciálních aktivit šaperoninů, helikáz, kinesinů a jiných molekulových motorů). V jiném případě se může cílový protein identifikovat prostřednictvím sekvenční homologie jako tyrosinová kináza a vynález je pak možné použít k testování tohoto cíle proti peptidové knihovně, obsahující řadu možných substrátových fosforylačních míst. Tyto příklady ukazují, že vynález je vysoce komplementární s procesem stanovujícím funkci za použití sekvenční homologie, protože se může použít pro potvrzení, odmítnutí nebo vypracování hypotetických funkcí indikovaných sekvenční homologii.
Vynález dále popisuje způsob funkční klasifikace proteinu, zahrnující a) testování schopnosti jedné nebo více molekul z velkého počtu molekul, o kterých se ví, že se vážou
« · · 4
44 ·· ·· • · · 4
9 4 · • 4 4 4 na určitou třídu proteinů, modifikovat stabilitu uvedeného proteinu, kde modifikace stability proteinu indikuje, že molekula váže protein, b) vytvoření spektra aktivity proteinu na základě testování, kde spektrum aktivity odráží sub-sadu molekul z většího množství různých molekul, které modifikují stabilitu uvedeného proteinu, a c) klasifikování proteinu jako člena uvedené třídy proteinů, jestliže, jedna nebo více z většího množství různých molekul modifikuje stabilitu proteinu.
Je nutné poznamenat, že shora uvedený proces pro stanovení nebo specifikaci funkce proteinu za použití testů teplotního posunu se může také aplikovat na funkční hypotézy vytvořené za použití jiných metod pro stanovení funkce proteinu (například trojrozměrné struktury proteinů a nukleových kyselin, profily buněčné exprese mRNA nebo proteinu kódovaného cílovým genem, a fenotypické účinky obměn cílového genu tak, že se mění jeho funkce na úrovni organizmu).
Dále za použití metod podle vynálezu je možné stanovit navázání více jak jednoho ligandů na více než jedno místo na proteinu a klasifikovat protein podle sub-sady molekul, které se vážou na protein. Například protein s neznámou funkcí, o kterém se zjistí, že se váže na DNA a adenosintrifosfát (ATP) , se může klasifikovat jako protein, který ovlivňuje strukturu DNA. Za použití informace týkající se navázání více ligandů je možno velký počet proteinových klasifikací zúžit pouze na několik pravděpodobných klasifikací.
Za použití metod podle vynálezu je také možné testovat u proteinu se známou funkcí další funkci dříve neznámou. S výhodou se používá test tepelného posunu na mikrodestičkách pro testování knihovny funkčních sond molekul proti proteinům.
Termín „funkce se týká biologické funkce proteinu, peptidu nebo polypeptidů. Například kináza je protein, jehož funkcí je katalyzovat kovalentní adici fosfátové skupiny na jiný protein.
Termín „molekula znamená látku, u které se testuje vazební afinita vůči cílové molekule. Tento termín zahrnuje chemické látky libovolné struktury, které zahrnují, ale nejsou omezeny na nukleové kyseliny, jako je DNA a RNA, a peptidy.
Termín „molekula znamená fiatky v knihovně látek nebo • ΦΦΦ *· • · · φ φ φ φ · · · ·· φφ > φ φ φ φ φ φφφ • Φ 4
Φ Φ 4
ΦΦ ΦΦ » φ Φ <
» Φ Φ « » φ Φ 4 > Φ Φ <
• Φ ΦΦ v kombinované knihovně. Termíny „molekula a „ligand jsou synonyma.
Termín „přijít do kontaktu s cílovým proteinem znamená umístit cílový protein do roztoku s molekulou, u které se testuje schopnost vázat se. Termín „přijít do kontaktu znamená otáčet a míchat roztok cílového proteinu a molekuly, u které se testuje schopnost vázat se na protein. Termín „přijít do kontaktu znamená smíchat cílový protein s molekulou, u které se testuje schopnost vázat se na protein. Míchání se například provádí opakovaným průchodem roztoku špičkou pipe-ČM, Termín „přijít do kontaktu s výhodou znamená rovnováhu navázání mezi cílovým proteinem .a molekulou, u které se testuje navázání. Ke kontaktu může dojít v kontejneru nebo dříve než se cílový protein a testovaná molekul umístí do kontejneru.
Termín „kontejner znamená libovolnou nádobu nebo komůrku, do které se umístí receptor a molekula, u které se testuje schopnost navázání. Termín „kontejner znamená reakční zkumavky (například testovací zkumavky, mikrozkumavky, ampule atd.). Termín „kontejner znamená prohlubeň na mikrotitračních destičkách nebo mikrodestičky s velkým množství® prohlubní.
Termín „vzorek znamená obsahy kontejneru.
Termíny „spektrální emise, „teplotní změny a „fyzikální změny znamená uvolnění energie ve formě světla nebo tepla, absorpci energie ve formě světla nebo tepla, změny v turbiditě a změny polárních vlastnostech světla. Termíny zvláště znamenají fluorescenční emisi, přenos fluorescenční energie, absorpci ultrafialového nebo viditelného záření, změny v polarizaci světla, změny v polarizaci fluorescenční emise, • · • •00 ·« • · • 0 • 00· » · · 4 »·
0 00 změny v rychlosti změny fluorescence v čase (to znamená poločas rozpadu fluorescence), změny ve fluorescenční anízotropii, změny v přenosu fluorescenční rezonanční energie, změny v turbiditě a změny enzymatické aktivity. S výhodou se termíny vztahují k fluorescenci a k fluorescenční emisi. Fluorescenční emise může být způsobena proteinem nebo může být způsobena fluorescenční reportní molekulou. Použití technik fluorescence při monitorování rozbalování proteinu je dobře známo v oboru. Popisuje se například v publikaci Eftink, M. R., Biophysical. J. 66: 482-501 (1994).
Termín „rozvinutí znamená ztrátu struktury, jako je krystalické uspořádání aminokyselinových bočních řetězců, sekundární, terciární nebo kvartérní proteinová struktura.
Termíny „svinutí, „opětné svinutí a „renaturace znamen&ú /χ řbi/u i' správného uspořádání aminokyselinových bočních řetězců, sekundární, terciáiní nebo kvartérní struktury proteinu, které umožňuje plnou chemickou a biologickou funkci biomolekuly.
Termín „denaturované proteiny znamená proteiny, které se ošetřily tak, že se odstranilo přirozené uspořádání aminokyselinových bočních řetězců, sekundární, terciární nebo kvartérní struktury. Termín „přirozený protein znamená protein, který vykazuje uspořádání aminokyselinových bočních řetězců, sekundární, terciární nebo kvartérní strukturu poskytující protein s plnou chemickou nebo biologickou funkcí. Přirozený protein je ten, který se nezahřál a neošetřil se činidlem nebo chemikálií způsobující rozvinutí, jako je močovina.
Termíny „protein a „polypeptid jsou synonyma.
„křivka rozvinutí je spojených s rozvinutím proteinu, denaturačního činidla, graf fyzikálních změn jako funkcí teploty, tlaku atd..
koncentrace ,Jženaturační křivka je graf fyzikálních změn spojených
ΦΦΦΦ ΦΦ »5 ·· ΦΦ ΦΦ • · · ΦΦΦ 4 19 4
ΦΦΦ 9 4 449 4 4 4 4
4 4 4 4 · · Φ Φ · Φ Φ ♦
-l r 4444 4444 4444
JL Ό ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ 44 s denaturací proteinu nebo nukleové kyseliny jako funkce teploty, koncentrace denaturačního činidla, tlaku atd..
Termín „křivka termálního rozvinutí je graf fyzikálních změn spojených s rozvinutím proteinu nebo nukleové kyseliny jako funkce teploty. Termín „křivka termální denaturace je graf fyzikálních změn spojených s denaturací proteinu nebo nukleové kyseliny jako funkce teploty (popisuje se například v publikaci Davidson et al., Nátuře Structure Biology 2: 859 (1995) a Clegg, R. M. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2994-2998 (1993)).
Termín „posun v křivce termálního rozvinutí znamená posun v křivce termálního rozvinutí v případě proteinu, který se váže na ligand, vztahující se ke křivce termálního rozvinutí proteinu v nepřítomnosti ligandu.
Termín „modifikace stability znamená změnu výšky tlaku, množství tepla, koncentrace detergentů nebo koncentrace denaturačního činidla, které je nutné, aby způsobilo daný stupeň fyzikální změny cílového proteinu, na který se váže jeden nebo více ligandů vztahující se k výšce tlaku, množství tepla, koncentraci detergentů nebo koncentraci denaturačního činidla, které je nutné, aby došlo ke stejnému stupni fyzikální změny v cílovém proteinu, kde není přítomen žádný ligand. Modifikace stability se může vykazovat jako zvýšení nebo snížení stability. Modifikace stability proteinu ligandem indikuje, že se ligand váže na protein. Modifikace stability proteinu více jak jedním ligandem ukazuje, že ligandy vážou protein.
Termín „modifikace teplotní stability znamená změnu v množství tepelné energie, která je nutná, aby došlo k danému stupni fyzikální změny cílového proteinu, na který se váže p z jeden nebo více ligandyh vztahující se k množství tepelne energie, která je nutná, aby způsobila stejný stupeň fyzikální změny cílového proteinu, přičemž není přítomen žádný ligand.
Modifikace teplotní stability se může vykazovat jako nárůst > r<.· • φ φ φ ·♦<·· ·· • Φ • · • φ φφ » φ φ φ φφ φφ je schopna se receptorem a po nebo pokles teplotní stability. Modifikace teplotní stability proteinu ligandem indikuje, že se ligand váže na protein. Modifikace teplotní stability proteinu více jak jedním ligandem indikuje, že ligandy se vážou na protein.
Termín „teplota středu, Tm znamená teplotu středu křivky termálního rozvinutí. Hodnotu Tm je možné snadno stanovit za použití metod, které jsou odborníkům známy (Weber, P. C. et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2717-2724 (1994) a Clegg, R. M. et al., Proč. Naci. Acad. Sci. USA 90: 2994-2998 (1993)).
Jak se popisuje shora v textu, je výhodné stanovit účinek jedné nebo více molekul na teplotní stabilitu cílového proteinu podle změny hodnoty Tm křivky termálního rozvinutí proteinu. V jiném případě je možno vliv jedné nebo více molekul na teplotní stabilitu cílového proteinu stanovit na základě změn celé křivky termálního rozvinutí cílového proteinu.
Termín „molekula fluorescenční sondy znamená zevní fiuorofor, kterým je fluorescenční molekula nebo látka, která spojovat s rozvinutým nebo denaturovaným excitaci světlem definované vlnové délky emituje fluorescenční energii. Termín molekula fluorescenční sondy zahrnuje všechny fluorofory. V případě proteinů termín konkrétně zahrnuje fluorofory, jako je thioinosin a Nethenoadenosin, formycin, dansyl, deriváty dansylu, deriváty fluoresceinu, 6-propionyl-2-(dimetylamino)-naftalen (PRODÁN), 2-anilinonaftalen a deriváty N-arylamino-naftalensulfonátu, jako jsou 1-anilinonaftalen-8-sulfonát (1,8-ANS), 2anilinonaftalen-6-sulfonát (2,6-ANS), 2-amino-naftalen-6sulfonát, N,N-dimetyl-2-aminonaftalen-6-sulfonát, N-fenyl-2aminonaftalen, N-cyklohexyl-2-aminonaftalen-6-sulfonát, Nfenyl-2-amino-naftalen-6-sulfonát, N-fenyl-N-methy1-2aminonaftalen-6-sulfonát, N-(o-toluyl)-2-amino-naftalen-6sulfonát, N-(m-toluyl)-2-amino-naftalen-6-sulfonát, N-(pΦΦ ΦΦ
Φ Φ Φ Φ φ e φ φ φ φ φ φ φ · · ·>
φφ φφ ··»· ·· • · ·
Φ · * ·» • Φ • ΦΦΦ » Φ Φ 4
ΦΦ ΦΦ toluyl)-2-aminonaftalen-6-sulfonát, 2-(p-toluidinyl)-naftalen6-sulfonová kyselina (2,6-TNS), 4-(dikyanovinyl)-julolidin (DCVJ), 6-dodekanoyl-2-dimetylaminonaftalen (LAURDAN), 6hexadebanoyl-2- (((2-(trimetylamonium)etyl)metylamino)naftalenchlorid (PATMAN), N-fenyl-l-naftylamin, 1,1dikyano-2-[6-(dimetylamino) naftalen-2-yl]propen (DDNP), 4,4'dianilino-1,1-binaftyl-5,5-disulfonová kyselina (bis-ANS) a derivovaná barviva 5-(4''-dimetylaminofenyl)-2-(4'fenyl)oxazolu, která se prodávají pod značkou DAPOXYL™ (Hol ecular Probes, lne., Eugene, OR) a zahrnují 5-(4''dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazolová barviva, která se popisují v publikaci Diwu, Z. et al., Photochemistry and Photobiology 66 (4): 424-431 (1997) a BioProbes 25: pp.8-9.
Molecular Probes, lne., Eugene, OR. (1997)).
Příklady odvozených barviv 5-(4''-dimetylaminofenyl)-2( 4 '-fenyl)oxazolu a odpovídajících molekulových sond zahrnují 5-(4''-dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazolbutylsulfonamid (D-12801), 5-(4 ''-dimetylaminofenyl)-2-(4''-fenyl)oxazol - (2aminoetyl)sulfonamid (D-10460), 5-(4''-demetylaminofenyl)-2(4~-fenyl)oxazolbutylsulfonamid (D-12801), 5—(4'' — dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazol-3sulf onamidof yenylboronová kyselina (D-10402), 5-(.4''dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazolsulfonová kyselina, sodná sůl (D-12800), 5-(4 ''-dimetylaminofenyl)-2-(4 'fenyl)oxazolsulfonylhydrazin (D-10430) , 5-(4 ''dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazol-(2bromoacetamidoetyl)sulfonamid (D-10300), 5-(4''dimetylamínofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazol-2-(3-(2pyridyldithio)propionamidoetyl)sulfonamid (D-10301), 5-(4''~ dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazol-sulfonylchlorid (D10160), 5-(4''-dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazol-3sulfonamidpropionová kyselina, sukcinimidylester (D-10162), 5(4''-dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazolkarboxylová kyselina, sukcinimidylester (D-10161).
• ·
Termín „molekula fluorescenční sondy s výhodou zahrnuje 1,8-ANS nebo 2,6-TNS a barviva odvozená od 5-(4''dimetylaminofenyl)-2-4'-fenyl)oxazolu, která se prodávají pod ochrannou známkou DAPOXY1™. Jsou to například barviva popsaná v publikaci Diwu, Z. et al., Photochemistry and Photobilogy 66(4) : 424-431 (1997) . Je výhodnější, aby tento termín zahrnoval barviva odvozená od 5-(4''dimetylaminofenyl)-2-(4 ' fenyl)oxazolu, která se prodávají pod ochrannou známkou DAPOXY1™. Jsou to například barviva popsaná v publikaci Diwu, Z. et al., Photochemistry and Photobilogy 66(4): 424-431 (1997). Nejvíce se preferuje, když termín znamená sodnou sůl kyseliny 5 - ( 4 ' '-dimetylaminofenyl)-2-(4'-fenyl)oxazolsulfonové (D-12800).
Termín „nosič znamená desku nebo objekt libovolného tvaru, který samotný je schopen nést alespoň dva kontejnery. Nosič je možné vytvořit z libovolného materiálu, který zahrnuje, ale není omezen na sklo, plast nebo kov. Je výhodné, aby nosičem byla mikrodestička s velkým množství prohlubní. Termíny mikrodestička a mikrotitrační destička jsou synonyma. Nosič je možné odstranit ze zahřívacího elementu. V souladu s vynálezem je možné použít řadu nosičů. Každý nosič nese velký počet kontejnerů.
Termíny „spektrální měření a „spektrofotometrické měření jsou synonyma a znamenají měření změn při absorpci světla. Měření turbidity, měření absorpce viditelného světla a měření absorpce ultrafialového světla jsou příklady spektrálního měření. Měření intrinsické fluorescence cílového proteinu a fluorescence extrinsického f luo.Fo^eNr* ( který je spojen v komplexu s cílovým proteinem nebo se na cílový protein váže, jsou také příklady spektrálního měření a spektrofotometrického měření.
Termín „polarimetrické měření se vztahuje k měření změn světla a fluorescenční emise, optická otáčivost jsou příklady polarizačních vlastností Cirkulární dichroizmus a • » • · polarizačních vlastností světla, které se mohou polarimetricky měřit. Měření cirkulárního dichroismu a optická otáčivosti se provádí za použití spektropolarimetru. „Nepolarimetrická měření jsou ta, které je možné získat za použití spektropolarimetru.
Znalost buněčné a/nebo biologické funkce proteinů je také možné využít při vývoji léků a porozumění terapeutických hypotéz fungování léků při navrhování specifických strategií tvorby léku a při odhalení vedlejších účinků potencionálních léků.
Existuje deset tisíc různých enzymů a receptorů, které obsahují potencionální cíle léků a další se zkoumají prostřednictvím studií sekvenování genomu. Tyto proteiny a buněčné receptory vykazují specifické funkce v biologickém systému, který je částečně definovaný molekulovými ligandy, se kterými tvoří specifické interakce. Typické interakce, které jsou funkčně podstatné, zahrnují enzymatické interakce, kde jako substráty slouží molekulové ligandy nebo substrátové analogy, ko-faktory, oblasti adaptoru, nukleové kyseliny atd. a interakce receptorů se specifickými ligandy, další receptory, buněčné povrchové strukturální komponenty, nukleové kyseliny, polysacharidy atd. .
Zatímco je možné izolovat nebo klonovat a exprimovat proteiny, které jsou putativním cílem léků, v mnoha případech nebude existovat základ funkce proteinu, který může napomáhat úspěšnému vývoji léku. Podstatná frakce známých proteinových molekul spadá do mechanistických tříd, které sdílí důležité charakteristiky. Mezi tyto charakteristiky patří například schopnost vázat se na specifické typy molekulových ligand, které zahrnují ko-faktory enzymů, substráty enzymů nebo substrátové analogy atd.. Pak je možné klasifikovat řadu proteinů s jinak neznámou funkcí na základě jejich schopnosti vázat různé druhy ligand, buď samotných nebo kombinovaných.
• · ···· ·· ·· ·
V případě, že protein váže biologický ligand funkčně podstatnou cestou, dochází k účinku na fyzikální stádium proteinu, což se odráží na jeho stabilitě vztahující se k jeho stádiu bez ligandú. Následně je možné funkčně klasifikovat protein, jehož funkce není dříve známa, inkubací se sadou sond biologických ligandú a kofaktorů (knihovna funkčních sond) a zjišťováním, které ligandy mají účinky na stabilitu proteinu. V jiném případě je možné stanovit dříve neznámou . funkci proteinu, který zahrnuje už dříve známou funkci, tím, že se protein inkuboval se sadou sond biologických ligand a kofaktorů (knihovna funkčních sond) a stanovením, které ligandy mají účinky na stabilitu proteinu.
Jak se zjistilo ze studia termodynamiky interakcí proteinligand, když se dvě molekuly spojují za vzniku specifického interakčního komplexu, vazebné interakce jsou spojeny s redukcí celkové volné energie komplexu a čistá stabilizace komplexu ligand-protein se vztahuje k proteinu bez ligandu. To v praxi znamená, že když enzym nebo receptor interaguje se svými specifickými ko-faktory nebo analogy ko-faktorů, enzym nebo receptor se bude stabilizovat těmito interakcemi. Je však možné, že může nastat speciální situace, kdy navázání ligandu může destabilizovat cílový protein. Některé proteiny například obsahují více než jednu oblast nebo alosterické místo, na které se jeden nebo více ligandú váže.
Přehled metod podle vynálezu.
Metody podle vynálezu stejně jako jiné informace jsou znázorněny na obrázcích 1A a 1B.
A. Identifikace putativního cílového genu
Cílové proteiny jsou proteiny v případě kterých navázání na lék může mít terapeutický potenciál a jejichž funkční charakterizace se může použít v procesu zkoumání léků. Řada genů, které slouží jako potencionální cíle terapeutické • · 9 9 • · · ··· 9 · 9 · • · · · · 9 · · · ·· · • · 9 · 9 · · · 9 · · · 9 22 ·· ·· ·· ·· ·· ·· intervence, se identifikovaly prostřednictvím fenomenologické korelace, která se vztahuje ke genetickému defektu (například když dědičné onemocnění koreluje s genetickým defektem u specifického enzymu nebo receptoru) nebo prostřednictvím rozdílů v paternech exprese proteinů u nemocných versus normálních tkáních.
V mnoha případech je možné stanovit některou „funkci genového produktu na základě sekvenční homologie s homologním proteinem, jehož funkční nebo strukturální data jsou známa.
Ale v některých případech není sekvenční homologie dostatečná pro stanovení funkčního vztahu a pro stanovení funkce způsobem, který může přímo umožnit zkoumání léku, je nutné použít alternativní způsoby.
B. Klonování a exprese proteinu
Aby se metody podle vynálezu zavedly do praxe, je nezbytné získat cílový protein v množství dostatečném pro biologický test. Proteiny, které jsou potencionálními novými terapeutickými cíly a/nebo vyžadují funkční charakterizaci, se mohou izoloval: přímo z přirozeného zdroje za použití řady zavedených biochemických izolačních postupů.
Schopnost kompletovat genové sekvence z genomových sekvenčních dat umožňuje klonování a expresi proteinových cílů identifikovaných prostřednictvím genetických metod. Známou cílovou sekvenci DNA je možné použít pro navržení oligonukleotidových sond, aby se . vybraly klony cDNA v plné délce, které obsahují celou cDNA kódující gen z reprezentativní knihovny řady takových klonů cDNA. V jiném příkladu sekvence známé cílové DNA se může využít pro vytvoření primerů PCR pro selektivní amplifikaci a klonování genu z celkové genomové DNA. Tyto a jiné metody vhodné pro klonování s vysokou průchodností jsou dobře známy v oboru.
Data genová sekvence v plné délce automaticky poskytují přímý způsob pro vysokou prostupnost, paralelní produkci • · proteinových cílů, nezbytný první krok v libovolné molekule, funkční testovací strategii s vysokou prostupností.
C. Testování tepelné stability
Za účelem provést test termálního posunu na mikrotitračních destičkách cílového proteinu je nutné stanovit podmínky testu, které jsou optimální pro provedení testu. Proteiny jsou lineární polymery aminokyselin, které se spontánně svinou do stabilní, vysoce organizované třírozměrné struktury. Biologická aktivita a funkce cílového proteinu zahrnující všechny specifické navázání a katalytické vlastnosti, kreré charakterizují protein, závisí na jeho troj rozměrné struktuře.
Po svinutí se všechny aktivní oblasti proteinů chovají termálně jako organické krystaly, které tají v součinnosti s dobře definovanou fázovou tranzicí pseudofáze prvního řádu. To znamená, že přecházejí do částečně neuspořádaného organického stádia podobného kapalině s dobře definovanou teplotou tání (Tm) , která odráží volnou energii stabilizace proteinu trojrozměrné struktury v podmínkách experimentálního rozpouštědla. Technologie termálního posunu na mikrotitračních destičkách používá prostředí citlivých fluororescenčních barviv k citlivé detekci procesu termálního rozvinutí. Přímo se monitorují účinky na stabilitu proteinu, které pocházejí z perturbací prostředí rozpouštědla nebo působí prostřednictvím navázání ligandů na protein.
Stabilita trojrozměrného svinutého stádia proteinu může v několika způsobech zmatená. Jeden způsob je změnit prostředí vodného rozpouštědla, ve kterém se molekuly proteinu v počátky svinou z neorganizovaného polymeru do trojrozměrného organizovaného stádia. Změnou vlastností rozpouštědla okolo proteinu se může změnit stabilita svinutého stádia vztažená ke stabilitě rozvinutého proteinu. Na základě uvedených skutečností může vzniknout strategie použitelná pro nalezení • ·· · ·· ft » ftft ftft ·· • · · · · · · · · ft ·· · · ftftftft · · ft ·
4 · · · ft· ftft· ·· ft • ftft · · · · · · ftft · • ft <· ·· · · · · ftft optimálních podmínek pro měření navázání ligandů, která je základní vedle testování stability proteinu.
D. Optimalizace testování v testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách
Optimalizace se provádí na základě sady podmínek rozpouštědel a fluorescenčních barviv, které se používají s cílovým prozeinem pro stanovení optimálních podmínek pro provedení testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách. Protein se vystaví působení různých roztoků a/nebo fluorescenčních barviv za účelem hodnotit chování proteinu.
Příklady variací podmínek mohou zahrnovat přidání organického rozpouštědla, variace v pH, solích atd., které mají potenciál změnit relativní stabilitu svinutého nebo rozvinutého stádia proteinu. Příklady variací v barvivech zahrnují rozdíly v náboji, polaritě, excitační vlnové délce, emisní vlnové délky, v intenzitě signálu pozadí nebo v jiných vlastnostech, které nabízí výhody při přesném měření, miniaturizaci nebo optimalizaci signálu za podmínek testu. Optimalizace podmínek, které umožňují testovat stabilitu, je empirický proces a odborník ho může snadno uvést do praxe.
E. Knihovna funkčních sond
Podstatná frakce molekul proteinu, která může sloužit jako potencionální cíl léků, spadá do mechanistických tříd, které sdílí důležité charakteristiky. Řada enzymů například používá ATP jako energetický ko-faktor, jiné používají jako ko-faktory pyridinové nukleotidy, některé enzymy využívají obojí.
Průzkumem vědecké literatury nebo experimenty je možné kompilovat sadu enzymatických substrátů, substrátových analogů, kofaktorů, adaptorových proteinových oblastí, analogů nukleových kyselin, polysacharidů, mastných kyselin, nukleových kyselin, efektorových peptidů nebo jiných molekul, u kterých se stanovilo, že se specificky váží na definovanou • · · · · · • · · · « · · « · · • · · · ft··· · ftft · • ft ft·· ftft ftftft ftft · o C ft···········
Zj ·♦ ·· ·· ·· ·· ·· třídu proteinových molekul nebo kde funkční podstata je navázání na funkčně známou třídu molekul.
Termín „knihovna funkčních sond znamená jednu nebo více různých molekul, u kterých se testuje schopnost vázat se na cílový protein a schopnost modifikovat termální stabilitu proteinu jako odezvu na termální rozvinutí. Uskutečněním testu termální stability (přednostně použitím technologie testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách) s proteinem v přítomnosti každého člena knihovny funkčních sond, se látky mohou inkubovat s cílovým proteinem jednotlivě a/nebo ve skupinách, aby se stanovilo, které ligandy samostatně nebo v kombinaci se vážou specificky na cílový protein.
Příklady molekul, které obsahují knihovnu funkčních sond zahrnují, ale nejsou omezeny na:
1. Vitaminy a koenzymy
NADH/NAD, NADPH/NADP, ATP/ADP, ΑΤΡ-γ-S, acetyl-CoA, Biotin, S-adenozyl-methionin, thiamínpyrofosfát (TPP), sulfatované oiigosacharidy, oligosacharidy podobné heparinu, GTP, ΑΤΡ-γ-S, gama-S, pyridoxal-5-fosfát, flavinmononukleotid (FMN), flavinadenindinukleotid (FAD), kyselina listová, kyselina tetrahydrofolová, metotrexát, vitamin Kiř sukcinátová sůl vitaminu Ξ, vitamin D3, vitamin D3-25-hydroxy, vitamin D3Ι-α-25-dihydroxy, vitamín Bi2, vitamin C, vitamin Bg, koenzym A, konezym A-n-butyryl, kyselina transretinová a heme.
2. Funkční skupiny aminokyselinových zbytků a jejich napodobeniny
Stavební bloky:
Guanidínoskupina
Imidazolová skupina
Fenylová skupina
Fenolová skupina
Indolová skupina to ·
Alifatické řetězce
Jednoduché aminokyseliny a blokované deriváty
Struktury vyššího řádu
Peptidové hormony Vasopresin Inzulin
TRH
Kortikotropin
Glukagon
Oblasti SH2, oblasti SH3, oblasti plextrinu, atd. .
Bioaktivní peptidy
Lektiny
3. kovové chelátory chelátory vápníku (Calbiochem, San Diego, CA) chelátory železa
4. kovové ionty přechodové kovy vápník, hořčík
5. Sacharidy
Stavebné bloky
Glukóza
Galaktóza
Xylóza
Biomolekuly vyššího řádu Celulóza Škrob Fruktóza Manóza Sacharóza ·« ·· • · · · • · · · • · • * · · ·
• ·
Laktóza
Bioaktivní sacharidy (dostupné od firmy Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO)
6. Nukleové kyseliny
Stavební bloky:
Uráčil
Tymidin
Cytozin
Adenin
Guanin
Struktury vyššího řádu
01igonukleotidy
Deoxyribonukleová kyselina (DNA)
Ribonukleová kyselina (RNA)
Metody podle vynálezu se mohou také použít k testování proteinů proti knihovnám syntetických a přirozeně se vyskytujících nukleových kyselin (například oligonukleotidy) k testování různých tříd proteinů, které váží nukleové kyseliny. Existují například proteiny vázající DNA, které se mohou identifikovat na základě jejich schopností vázat určité třídy sekvencí DNA. Velké knihovny obsahují řadu různých sekvencí nukleových kyselin (může se syntetizovat například 4096 různých možných syntetických hexamérů). Při vysokých koncentracích je možné detekovat všechny nebo část blízkého vazebného místa proteinů, které se místně specificky vážou na nukleovou kyselinu. V případě, že protein váže několik různých sekvencí, vazebná místa se mohou rekonstruovat syntézou různých kombinací sekvencí nukleových kyselin a pak je možné použít test termálního posunu na mikrotitračních destičkách nebo jiný test pro měření vazebných afinit.
ΦΦΦΦ φφ • φ • · ·· ·· ·· ·· • · · · 9 4·· • 9 9 999 ΦΦΦΦ • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 Φ φ φ • ΦΦΦ 9 9 9 9 9 9 9 9
Φ· 99 99 99 99 99
Existuje řada proteinů, které váží DNA, jenž je možné identifikovat na základě jejich schopnosti vázat určité třídy sekvencí DNA s nižší specifitou. Například je dobře známo, že některé transkripční faktory vážou řadu sekvencí bohatých na A/T, přičemž se preferují sekvence bohaté na G/C. Je známo, že telomerázy rozeznávají sekvence bohaté na G/C. Dále je známo, že helikázy vážou krátké fragmenty jednořetězcové DNA s nízkou specifitou. Menší více generická knihovna může obsahovat následující komponenty vhodné pro detekci uvedených a jiných proteinů vázajících DNA:
Úseky bohaté na AT d (T) 32/d (A) 32, d (ATAT) g/d (TATA) 8, d(AAAT)g/d(TTTA)8, d(AAATT)6/d(TTTAA)6, d (AAATTT) 6/d (TTTAAA) 6, d(AAAATTTT)4/d(TTTTAAAA)4,
Úseky bohaté na GC d (C) 32/d (G) 32, d(GCGC)8/d(CGCG)g, d (GGGCCC) 6/d(CCCGGG) 6, d(GGGGCCCC)4/d(CCCCGGGG)4, j iné d (CA) 32/d (GT) 32, d (CT) 32/d (GA) 32, d (AG) 32/d (TC) 32,
-jednořetězcové komponenty shora uvedených sekvencí dvoušroubovice.
-d (T) 40/d (A) 20 (příklad fragmentu obsahující jednořetězcovou DNA a dvoušroubovici DNA)
-fragmentovaná lidská chromozomální DNA
-„amplifikace celého genomu aplikovaná na různé lidské chromozomy
-fragmentovaná DNA sperma lososa φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφ φφφ φ φφφ φ φ φφφ φ φφφφ φφφφ φ ♦· ·· ·· ·· ··
-fragmentovaná mikrobiální DNA -superhelix plazmidové DNA
-produkty PCR amplifikace ze specifických chromozomálních oblastí (například telomery a centromery)
-jiná známá rozeznávaná místa pro transkripci, zpracování RNA, transpozici.
7. lipidy stavební bloky:
cholin kyselina fosforová glycerol kyselina palmitová kyselina olejová cholesterol struktury vyššího řádu: fosfatidylcholin
8. Inhibitory enzymů
Inhibitory proteáz (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO)
PMSF
Leupeptin Pepstatin A Bestatin
Peptidaldehydcystatin (Inhibitory cysteinové proteázy) Inhibitory proteinové tyrozinové kinázy (Calbiochem, San Diego, CA)
Inhibitory proteinové fosfatázy (Calbiochem, San Diego, CA) Inhibitory proteinové kinázy (Calbiochem, San Diego, CA) Aktivátory proteinové kinázy (Calbiochem, San Diego, CA) Inhibitory fosfodiestarázy (Calbiochem, San Diego, CA)
Inhibitory fosfolipázy
Analogy v přechodném stavu ·*·· 4· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · * · • · · · ··«· · · · « • · · · · · · ♦ · φ 4 4 * • · · · 4 · 4 4 4 4 4 4
94 4· 44 44 44
Podobně metaloproteázy zinku, jako je enzym přeměňující angiotensin a karboxypeptidáza je možné identifikovat a) destabilizací EDTA nebo ortofenantrolinem (chelace Zn2+) a b) stabilizace v přítomnosti hydroxamátu a fosforamidátů, které napodobují stádium tranzice pro hydrolýzu peptidové vazby katalyzovanou Zn2+.
Knihovna funkčních sond může také zahrnovat steroidní látky, hormony a alkaloidy.
Knihovna funkčních sond může být knihovnou generických léků. V jiném případě knihovna funkčních sond může být knihovna přirozených produktů (popisuje se například v publikaci Encyclopedia of Common Natural Ingredients Ušed in Foods, Drugs and Cosmetics, 2nd Edition, Leung and Foster, Eds., Wiley Interscience (1996).
F. Testování funkčních sond
Vedle optimalizace podmínek, které modifikují stabilitu proteinu, existuje další způsob jak ovlivnit stabilitu svinutého proteinu. Je to specifické navázání molekul na bud“rozvinutý nebo svinutý protein. Protože všechny biologicky aktivní proteiny jsou svinuté do organizované trojrozměrné struktury, nejvíce pozornosti se věnuje molekulám ligandů, které se váží a stabilizují svinuté stádium proteinu.
Jak se diskutuje shora v textu, testování funkčních sond je test schopnosti velkého množství různých molekul v knihovně funkčních sond vázat se na protein a modifikovat stabilitu cílového proteinu jako odezvy na termální rozvinutí. Za použití uvedené technologie je možné přímo měřit vazebnou afinitu malých a velkých ligandových molekul k cílovému proteinu prostřednictvím účinku na střední teplotu Tm, při které dojde k rozvinutí proteinu (nebo profil termálního rozvinutí). V případě molekul, které se vážou na protein ve svinutém stádiu, které zahrnuje většinu ligand ve středu biologického zájmu, existuje kvantitativní vztah mezi afinitou • to to to · to · • to · · to · navázání ligand a rozsahem, kam se posune hodnota Tm proteinu ve stádiu s navázanými ligandy vztahující se k Tm proteinu ve stádiu bez navázaných ligandu.
Většina proteinů má funkce, které odráží jejich schopnost vázat buď malé nebo velké molekuly ligandú s vysokou specifitou a s vysokou afinitou. Řada proteinů patří do funkčních tříd (například kinázy, fosfatázy, oxidoreduktázy závislé na pyridin-nukleotidu atd.), které se váží na specifické ko-faktory nebo katalyzují specifické reakce za použití omezené sady katalytických mechanizmů. Pak molekuly dané funkční třídy podobné kinázám, které používají ATP jako ko-faktor, budou v obecném případě vázat nehydrolyzovatelný analog ko-faktoru ATP, jako je AMPPNP. Toto je vlastnost detekovatelné za použití metod podle vynálezu.
Řada proteinů bude vázat kombinaci ligandú a tvořit velké množství sad interakcí s biologickými adaptorovými oblastmi. Za účelem potvrdit, že tyto interakce jsou nezávislé, budou v obecném případě produkovat odchylky stability proteinu v neligované formě.
V případě, že protein se přiřadil k určité třídě.proteinů je možné protein znovu testovat za použití knihovny látek nebo molekul, které jsou známy, že váží uvedenou třídu proteinů.
G. Spektrum aktivity
Po provedení testu termální stability (upřednostňuje se použití technologie testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách) s proteinem v přítomnosti každého člena knihovny funkčních sond, je možné stanovit, které ligandy se specificky vážou na protein a modifikují termální stabilitu cílového proteinu. Seznam látek (to je ligandú), které se vážou na cílový protein a modifikují termální stabilitu cílového proteinu a respektive afinity ligandú pro cílový protein obsahuje spektrum aktivity cílového proteinu.
·»·· 1 • ft • ft ftft • · ► · · · · » ftft 4 • ft ·· • · · · • ft · »
H. Seznam funkčních referenčních spekter
Jak se uvádí shora v textu „seznam funkčních referenčních spekter je seznam tříd cílových proteinů (zahrnující odkazy na vhodné elektronické databáze), připojené ligandy a odpovídající vazebné konstanty, které se mohou použít při funkční klasifikací cílového proteinu. V jiném případě seznam funkčních referenčních spekter může být sada jedné nebo více spekter aktivit pro jeden nebo více proteinů.
Jak se diskutuje shora v textu „seznam funkčních referencí je seznam proteinů, které sdílí jednu . nebo více běžných rysů, jako je navázání na určitý ligand, nebo vykazují běžnou aktivitu. Seznam funkčních referencí je například uveden v tabulce č. 1. Rysy sdílené proteiny uvedenými v tabulce č. 1 jsou: schopnost vázat NAD a vykazovat dehydrogenázovou aktivitu. Seznam proteinů uvedený v tabulce č. 1 zobrazuje, jak je možné diskriminovat funkčně příbuzné proteiny podle jejich schopnosti vázat různé sady ligandů. Proteiny, které se vážou na nikotinamidadenindinukleotid (NAD), NADPH nebo NADH a malát, což ukazuje schopnost těchto látek modifikovat termální stabilitu proteinu, se mohou klasifikovat jako malátová dehydrogenáza. Jiným příkladem je protein, který má modifikovanou termální stabilitu etanolem a NAD. Ten se může klasifikovat jako alkoholová dehydrogenáza.
Tabulka č. 1
Seznam funkčních referencí
Aldehydová dehydrogenáza třída 3
Lidská δ alkoholová dehydrogenáza a-hydroxysteroidová dehydrogenáza malátová dehydrogenáza alkoholová dehydrogenáza z koňských jater alkoholová dehydrogenáza glyceraldehyd-3-fosfátová dehydrogenáza ♦ ·»· ftft • 9 • ·
4« ftft ·« ftft • ··· ftftftft • · · · · · ft ftft 9 ftftft ftft ftftft ftft · ft ftft · · ftft · ft ftft ft • 4 ftft ftft ftft ftft ftft
Lidská β-alkoholová dehydrogenáza
Reduktáza dihydropteridinu
D-2-hydroxyizokaproátová dehydrogenáza
Enoyl-Acp reduktáza pocházející z Brassica Napus
7-a-hydroxysteroidová dehydrogenáza holo-D-glyceraldehyd-3-fosfátová dehydrogenáza glutathionová reduktáza
D-glyceraldehyd-3-fosfátová dehydrogenáza
Glutathionová reduktáza
3-izopropylmalátová dehydrogenáza lidská β-3-alkoholová dehydrogenáza izocitrátová dehydrogenáza dehydrogenáza alkoholu pocházející z koňských jater
M4 laktátová dehydrogenáza
Dihydrolipoamidová dehydrogenáza
Udp-Gal 4-epimeráza
D-3-fosfoglycerátová dehydrogenáza χχ alkoholová dehydrogenáza z lidských jater alfa, 20 β-hydroxysteroidová dehydrogenáza
L-laktátová dehydrogenáza
NADH peroxidáza
I. Komparátor spektra aktivity
Termín „komparátor spektra aktivity je počítačový nebo grafický způsob, kterým je možné porovnat spektrum aktivity získané pozorováním účinků knihovny funkčních sond na cílový protein se seznamem funkčních referenčních spekter. Komparátor spektra aktivity je tabulkový procesor, který je odborníkům snadno dostupný. Může se použít například Microsoft Excel (Microsoft lne., Redmond, WA).
J. Funkční klasifikace
U metod podle vynálezu se funkce proteinu indikuje paternem ligandů, který se vážou na protein. Za použití ·«·« ·ί 99 ·# ·· ·· • V » 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 999 · 9 · 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 99 99 99 komparátoru spektra aktivity je možné porovnat pozorované spektrum cílové aktivity se seznamem funkčních referenčních spekter, přičemž cílový protein je možné funkčně klasifikovat podle relevantních dat získaných pro známé proteiny. Protein je možné například klasifikovat podle sady ligandu, které stabilizují protein proti termálnímu rozvinutí.
Porovnáním stupně, do kterého každá z velkého množství molekula látek modifikuje termální stabilitu proteinu (a proto se váže na protein) se stupněm, do kterého některé molekuly modifikují termální stabilitu známého proteinu (a proto se váží na protein), je možné dedukovat třídu proteinů, do které protein patří.
V jiném případě se protein může klasifikovat porovnáním spektra aktivity cílového proteinu se známého klasifikovaného proteinu. Je konzultovat databáze, jako je PDR online, Medline, SciFinder, STNExpress, vlastní databáze, NAPRALERT Online (popisují se v publikaci Encyclopedia of Common Natural Ingredients Ušed in Foods, Drugs and Cosmetics, 2nd Edition, Leung and Foster, Eds., Wiley Interscience (1996) a Handbook of Enzyme spektrem aktivity například možné
Inhibitors, Part A and B, (1990)) .
^nd
Edition, Ellner, Ed., ECH
Test termálního posunu na mikrotitračních destičkách a přístroj pro tento test
Libovolné způsoby měření účinků inkubace proteinu v přítomnosti panelu testovaných ligandu vhodných pro stanovení, které testované ligandy mohou způsobit stabilitu proteinu, budou dostatečné jako způsoby funkční klasifikace proteinů. Test termálního posunu na mikrotitračních destičkách se používá pro stanovení účinku jedné nebo více molekul nebo ligandů na termální stabilitu cílového proteinu. Test termálního posunu na mikrotitračních destičkách tvoří přímou a • · ► ·· · ·· • · · · • · · · • · ·· ·· kvantitativní technologii testování účinku jedné nebo více molekul na termální stabilitu cílového proteinu.
Test termálního posunu je založen na změně v křivce termálního rozvinutí receptoru v závislosti na ligandu. Takovým receptorem je protein nebo nukleová kyselina. Když se receptor zahřeje na teplotu, která leží mimo uvedené rozmezí, receptor se rozvine. Když se do grafu vynese stupeň rozvinutí, jako funkce teploty, získá se pro receptor křivka termálního rozvinutí. Použitelný referenční bod na křivce termálního rozvinutí je zeplota středu (Tm) , což je hodnota teploty, při které se rozvine polovina molekul receptoru.
Testy termálního posunu jsou založeny na změně hodnoty teploty středu v případě termálně indukovaných křivek rozvinutí závislých na ligandu ÁTm. V případě komplexu ligandreceptor (vztažený k receptoru, který netvoří komplex), je možné v experimentech pozorovat, že tyto změny hodnot teploty středu se přímo vztahují k vazebné afinitě ligandu Kd, což je způsobeno párováním navázání ligandu a volnou energií, která vzniká při rozvinutí receptoru (Shellman, J.A., Biolpolymers 15: 999-1 000 (1976, Brandts, J. F. , Biochemistry 29: 69276940 (1990)). Tato strategie termálního fyzikálního testování využívá termální stability směsi ligand-receptor, jako indikátoru vazebné afinity pro interakce ligand-receptor. Tyto testy se tradičně provádějí v diferenciálních snímacích kalorimetrech (DSC), které monitorují změny tepelné kapacity, jak proteiny procházejí tranzicí vyvolanou teplotou (popisuje se v publikaci Brandts et al., Biochemistry 29: 6927-6940 (1990) a Weber, P. et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2717-2724 (1994)). V jiném případě se mohou testy termálního posunu uskutečnit použitím teplotou regulovaných optických zařízení, které zaznamenávají změny absorbance (popisuje se v publikaci Chavan, A. J. et al., Biochemistry 33: 7193-7202 (1994)), fluorescence (popisuje se v publikací Chavan, A. J. et al., Biochemistry 33: 7193-7202 (1994)) nebo cirkulárního • · ·
• ·· ···· · · · · « · ·· ·· ·· dichroismu (popisuje se v publikaci Bouvier, M. et al.,
Science 265: 398-402 (1994), Morton, A et al., Biochemistry
34: 8564-8575 (1995)), které se objevují při tranzicích rozvinutí proteinů vyvolaných termálně.
Při použití testu termálního posunu existuje řada výhod, Nejsou nutné radioaktivně značené látky, ani fluorescenční ani jiné chromofcbní značky, které se používají při sledování navázání. Otecná aplikovatelnost je důležitým aspektem uvedeného testu, protože je důležité mít možnost použití uvedený nový test pokaždé, kdy se stává dostupný nový terapeutický receptorový protein. Test je zvláště vhodný pro měření navázání ligandu na cíle, které nejsou enzymy, například interakce růstový faktor/receptor, kde není možné obvykle použil spektrofotometrický test.
Jednoduché uspořádání testu metod termálního posunu má omezené využili, zvláště při testování s vysokou prostupností, kdy se testují knihovny látek.
Je možné velmi zrychlit testovací proces protein/ligand vývojem obecně aplikovatelné testovací strategie s vysokou prostupností tím, že se vyvine v obecně aplikovatelná testovací sirategie ligand-receptor ve formátu s 96 prohlubněmi (nebo s vyšší hustotou), který bude identifikovat řadu látek založených na termodynamické stabilizaci komplexů ligand-receptor.
Navázání ligandu stabilizuje receptor (popisuje se v publikaci Sohellman, J. , Biolpolymers 14: 999-1018 (1975)). Rozsah navázání a volná energie interakcí umožňují paralelní průběhy, jako funkci koncentrace ligandu (popisuje se v publikaci Sohellman, J., Biophysical Chemistry 45: 273-279 (1993), Barcelo, F. et al., Chem. Biol. Interactions 74: 315324 (1990)). Jak vyplývá ze stabilizace proteinu ligandem, je k rozvinutí receptorů nutné více energie (teplo). Tak navázání ligandu posune křivku termálního rozvinutí. To znamená, že navázání ligandu zvýší termální stabilitu proteinu. Této • · • · · • · · · · • · · · • · · · ·· ·· vlastnosti lze využít pro stanovení, zda se ligand váže na receptor: dochází ke změně nebo k posunu ve křivce termálního rozvinutí a tak hodnota Tm naznačuje, že se ligand váže na receptor.
Termodynamický základ testu termálního posunu se popisuje v publikaci Schellman, J. A. (Biopolymers 15: 999-1000 (1976) a také Brandts et al·., Biochemistry 29: 6927-6940 (1990)).
Studie diferenciální snímací kalorimetrie popsané v publikaci Brandts te al., Biochemistry 29: 6927-6940 (1990)) vykazuje, že v případě těsných vazebných systémů je stechiometrie 1:1, při které dochází k jedné tranzici rozvinutí. Z následující rovnice je možné odhadnout vazebnou afinitu při hodnotě Tm:
K/ exp
f ΔΗΤ3 | ' 1 | 1 ' | -i---— | \n |
R A. | _1 | rr- - | R |
LT rovnice 1 kde KTmL je asociační konstanta ligandu při hodnotě Tm,
Tm je střední teplota v případě tranzice rozvinutí proteinu v přítomnosti ligandu,
To je střední teplota pro tranzici rozvinutí v nepřítomnosti ligandu,
ΔΗΤ% je entalpie rozvinutí proteinu v nepřítomnosti ligandu při To,
ACpu je změna tepelné kapacity při rozvinutí proteinu v nepřítomnosti ligandu,
LTm je koncentrace volného ligandu při hodnotě Tm a
R je plynová konstanta.
Zjistilo se, že tuto rovnici je možné použít pro navržení azobenzenových ligandú v případě streptavidinu, kde snímače
DSC různých směsí ligan/streptavidin umožňuje měření vazebné afinity při hodnotě Tm (popisuje se v publikaci Weber, P. et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2717-2724 (1994)). Tato měření se
dále kontrolovala provedením smícháním nebo izotermálních titračních kalorimetrických experimentů, které vedou k poznání, že vazebné afinity souhlasí s těmi stanovenými DSC. Jednoduchost a reprodukovatelnost použití proteinového termálního rozvinutí pro stanovení vazebné afinity ligandu je zajímavé a skrývá potenciál pro další rozšíření tohoto přístupu, který se stává výzkumným nástrojem pro vývoj nových léků .
Z experimentů DSC vyplývají obvykle parametry ÁHU a ÁCpu a jsou specifické pro každý protein. Kalorimetrické měření ÁHU a ÁCpu jsou nejvíce přesné odhady parametrů, protože kalorimetry v typickém případě snímají data pro rozvinutí při změně teploty o 0,1 °C. Parametry ÁHU a ÁCpu se mohou také odhadnout v testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách, přičemž ÁHU není kalorimetrická entalpie, ale srovnatelná van't Hoffova entalpie založená na datech rozvinutí získaných při změně teploty o každé 2 stupně za použití uvedeného protokolu. Avšak dokonce, když nejsou dostupné optimální data pro ÁHU a ÁCpu, tyto konstanty jsou specifické pro protein, který je zahrnut při testování látek a nebude se proto v prohlubních měnit, což nemá vliv na výpočet relativních hodnot vazebných afinit, to znamená KL při hodnotě Tm.
Vedle parametrů ÁHU a ÁCpu ,je také nezbytné získat odhady hodnot Tm a To, aby se určila hodnota KTmL v rovnici 1. To je možné dosáhnout použitím nelineární metody nejmenších čtverců, která se použije pro data rozbalení v případě každé jednotlivé prohlubně za použi.tí následující rovnice:
Rovnice 2:
-y„ /f \ + exp
AC
Í_JT~ T +
« ·« · ·· 4· 4 4
9 4 4 9 4 ·· 9 · · · ·· • · 9 · · · · • 9 · · · · · ·· 99 99 99
V rovnici 2 se používá 5 parametrů AHU a ACpu, Tm, yf a yu, kde yf a yu jsou hodnoty fluorescence před tranzicí a po tranzici. Počítačové parametry se stanoví pohybem těchto parametrů k dosažení minima součtu čtverců zbytků tím, že se použije Levenberg-Marquardt algoritmus. V prohlubních, které neobsahují přidaný ligand se získaly hodnoty To a jsou uvedeny jako reference. V oboru je možné použít komerčně dostupný software, který zpracovává hodnoty křivky. Může se například použít Kaleidograph 3.0 (Synergy, Reading, PA).
Za použití rovnice 3, jestliže dojde ke smíchání kalorimetrických dat pro vazebnou entalpii při T, AHl a změna tepelné kapacity při navázáni ligandu ACpL a je také možné vypočítat rovnovážnou konstantu spojenou s ligandem při libovolné teplotě (KL při T) (popisůje se v publikaci Brandts et al., Biochemistry 29:-6927-6940 (1990)).
Rovnice 3:
K!, = Kl·' expAH
__1 +- | 1/7 | T --—4 | -1 | |
R | RU | T rti |
kde K je asociační konstanta ligandu při hodnotě T, kde KTmL je asociační konstanta ligandu při hodnotě Tm,
Tm je střední teplota v případě tranzice rozvinutí proteinu v přítomnosti ligandu,
AHTU je entalpie rozvinutí proteinu v nepřítomnosti ligandu při
ACpu je změna tepelné kapacity při navázání ligandu, R je plynová konstanta.
Druhý exponenciální člen rovnice 3 je obvykle dostatečně malý, aby se mohl ignorovat tak, že přibližné hodnoty KL a T je možné získat za použití prvního exponenciálního členu a rovnice 3 se redukuje na rovnici 4:
• · · · • · · · · » · · · · ·· ··
JL
T~ T
Rovnice 4:
Κ[ - Kp exp
ΔΗ[
Parametr AHTU se může měřit za použití izotermální titrační kalorimetrie za použití kalorimetrického zařízení, jako je Omega (MicroCal; Northampton, ΜΑ). V případě, že kalorimetrická data nejsou dostupná, pak je možné ÁHTU odhadnout tak, že hodnota je přibližně -10,0 kcal/mol, což je průměrná vazebná entalpie (Wiseman et al., Anal. Biochem. 179: 131-137 (1989)).
Pro monitorování termálního rozvinutí se používá fluorescenční spektrometrie. Metoda fluorescence je více citlivá než absorpční metody. V oboru je dobře známo použití intrinsické proteinové fluorescence a fluorescenčních molekul sond při experimentech fluorescenční spektroskopie (popisuje se v publikaci Bashford, C.L. et al., Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach, IRL Press Ltd., pub., pp.
91-114
Ε. , pp.
Spectroscopy in 155-194 (1981), (1987), Bell, J.
Biochemistry, Vol. I, CRC Press, pub.
Brandts, L., et al., Ann. Rev. Biochem. 41: 843 (1972)).
Test termálního posunu na mikrotitračních destičkách se dále popisuje v dokumentu přihláška US patentu č. 08/853/464 podané 9. května 1997, mezinárodní patentová přihláška č. PCT/US97/08154 (publikované 13.11.1997, jako WO 97/42500).
Spektrální odečítání přednostně odečítání fluorescence je možné provést současně u všech vzorků na nosiči. V jiném případě je odečítání možné provést ve skupině alespoň dvou vzorků v jednom okamžiku.
Fluorescenční zobrazovací systém například fluorescenční emisní zobrazovací systém se může použít při monitorování termálního rozvinutí cílové molekuly nebo receptoru.
Fluorescenční zobrazovací systém je dobře znám v oboru.
• ·
Například ALPHAIMAGER™ Gel Documentation and Analysis Systém (Alpha Innotech, San Leandro, CA) používá kameru s integrovaným obvodem s vazbou nábojem s vysokým výkonem (CCD) s rozlišením 768 x 494. Kamera s integrovaným obvodem s vazbou náboje je spojena s počítačem a obrazy se analyzují Image CHEMIIMAGER™ (Alpha Innotech) je vazbou náboje, který umožňuje všechny a zobrazení adičních čepiček a jiných vzorků s nízkou analysis software™, integrovaný obvod s funkce zařízení ALPHAIMAGER™ chemoluminiscenčních vzorků itenzitou. Integrovaný obvod s vazbou nábojem CHEMIIMANIGER™ zahrnuje procesor Pentium (pevný disk 1,2 GB, RAM 16 MB), Analytický software AlphaEase™, komůrku nepropouštějící světlo a UV a transiluminátor s bílým světlem. MRC-1024 UV/Visible Laser Confocal Imaging System (BioRad, Richmond, CA) umožňuje současné zobrazení více jak jednoho fluoro^Toru v celém rozmezí vlnových délek iluminace (350 až 700 nm). „Gel Doc 1000 Fluorescent Gel Documentation Systém (BioRad, Richmond, CA) může jasně zobrazit oblasti vzorků tak velké, jako je oblast 20 x 20 cm nebo tak malé, jako je oblast 5x4 cm. Do oblasti o rozměrech 20 x 20 cm se vejde nejméně 96 prohlubní. „Gel Doc 1 000 systém také umožňuje experimenty založené na čase.
Fluorescenční zobrazovací systém například fluorescenční emisní zobrazovací systém se může použít k monitorování rozvinutí receptorů v testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách. V tomto provedení vynálezu se velké množství vzorků zahřeje současně na teplotu 25 až 110 °C. Odečítání fluorescenční emise se provádí pro každý z velkého množství vzorků současně. Například je možné současně monitorovat fluorescence v každé z 96 nebo 384 prohlubní. V jiném případě je možné odečítání fluorescence provádět kontinuálně a současně u každého vzorku. Při nízkých teplotách všechny vzorky vykazují nízkou hodnotu fluorescence. V případě, že roste teplota, roste také fluorescence každého
9 9
9 ·
9 9 φ · φφφφ φ* • · vzorku. Prohlubně, které obsahují ligandy, jenž se váží na cílovou molekulu s vysokou afinitou posouvají křivku termálního rozvinutí k vyšším teplotám. Výsledkem je, že prohlubně, které obsahují ligandy, jenž váží cílovou molekulu s vysokou afinitou, jsou méně fluorescenční při dané teplotě, která je vyšší než Tm cílové molekuly bez přítomnosti libovolných ligandů ve srovnání s prohlubněmi, které neobsahují ligandy s vysokou afinitou. Jestliže se vzorky postupně zahřívají, současně se zobrazuje fluorescence ve velkém počtu vzorků při každém kroku zahřání. Jestliže se vzorky zahřívají kontinuálně, současně se zobrazuje fluorescence ve velkém počtu vzorků při každém kroku zahřání.
Test termálního posunu se může provést v objemu 100 μΐ. Z následujících důvodů je výhodné uskutečnit test termálního posunu v objemu 1 až 10 μΐ . 1) V případě miniaturizace testu je nutné použít 10 až 100 krát méně proteinu. Tak je nutno v testu pouze použít přibližně 4 až 40 pikomolů proteinu (0,1 pg až 1,0 μρ v případě proteinu o molekulové hmotnosti 25 000) (to je 1 až 10 μΐ pracovního objemu, přičemž koncentrace cílové, molekuly je přibližně 1 až 4 μΜ). Tak v 1 000 až 10 000 testech je možné použít 1 mg proteinu v miniaturizovaném formátu. Je zvláště výhodné, když cílová molekula je dostupná v nepatrném množství.
2) V případě miniaturizace testu je nutné použít 10 až 100 krát méně proteinu. Tato výhoda je velmi důležitá, když se testují hodnotné kombinační knihovny, pro . které se syntetizovaly látkové knihovny v nepatrném množství. V případě lidského a-trombinu je koncentrace ideálního ligandu přibližně 50 μΜ, který se překládá na 25 až 250 pikomolů ligandu nebo 10 až 100 ng (předpokládaná molekulová hmotnost je 500) ligandu v jednom testu v miniaturizovaném formátu.
3) menší pracovní objem umožňuje použít velké uspořádání testů, protože miniaturizovaný test se může vejít na daleko
43 | *»«· ·♦ ··..** • · · · · · _ , t · * ···· • · ··· · · · • ·· · · * ** ·· ·» «· ·· | ·· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · · • · · · | |||
menší plochu. | Destičky s | 384 | prohlubněmi | (uspořádání 16 | x 24) |
nebo s 864 | prohlubněmi | (uspořádání 24 | x 36) mají | stejné | |
rozměry jako | destičky s | 96 | prohlubněmi | (8,5 x 12,5 | cm) . |
Destičky s 384 prohlubněmi a 864 prohlubněmi umožňují provést 4 a 9 krát více testů, než lze provést za použití destiček s 96 prohlubněmi. V jiném případě se mohou použít destičky s více prohlubněmi, jako jsou destičky s 1 536 prohlubněmi (uspořádání 32 x 48; Matrix Technologies Corp.). Destičky s 1 536 prohlubněmi umožní 16 krát více testů než destičky s 96 prohlubněmi.
Za použití uspořádání destiček s 1 536 prohlubněmi se rychlost testu zvýší přibližně 16 krát vzhledem k rychlosti, kterou je možné test provést za použití destiček s 96 prohlubněmi. Uspořádání testu 8 x 12 (na destičkách s 96 prohlubněmi) umožňuje provést 96 testů/hodinu nebo přibližně 2300 testů za 24 hodin. Uspořádání 32 x 48 umožňuje uskutečnit přibližně 1536 testů za hodinu nebo při uspořádání 32 x 48 je možné provést 37000 testů za 24 hodin.
Objem testu je 1 až 100 μΐ. Upřednostňuje se objem testu 1 až 50 μΐ. Více se upřednostňuje objem testu 1 až 25 μΐ. Stále více se upřednostňuje objem testu 1 až 10 μΐ. Ještě více se upřednostňuje objem testu 5 μΐ. Nejvíce se upřednostňuje objem testu 1 nebo 2 μΐ.
V jiném případě se test uskuteční na destičkách s dnem ve tvaru V z polykarbonátu, polystyrenu nebo polypropylenu nebo s důlkem. Destičky s důlkem jsou destičky, které obsahují velké množství prohlubní s kulatým dnem, které pohltí celkový objem 15 μΐ.
Test termálního posunu na mikrotitračních destičkách je možné provést a) kontaktováním proteinu s jednou nebo více molekul z velkého množství různých molekul v každém z velkého množství kontejnerů, b) zahřáním velkého množství kontejnerů popsaných v odst. a), přičemž se upřednostňuje zahřání ···
44 lf*W «pwt I-’ QtW*»
44
4 4 I
4 4 « i 4 9 9 4 1
4 4 « ·♦ ·· *W**-*t*7 provedené současně, c) měření fyzikálních změn v každém kontejneru spojených s termálním rozvinutím cílové molekuly jako výsledek zahřání, d) tvoření křivky termálního rozvinutí v případě cílové molekuly jako funkce teploty v každém kontejneru a e) porovnání každé z křivek rozvinutí popsaných v odstavci d) s 1) každou jinou křivkou termálního rozvinutí a s 2) křivkou termálního rozvinutí získanou v případě proteinu bez přítomnosti libovolné z velkého množství různých molekul a
f) stanovení, zda libovolná z velkého množství různých molekul modifikuje termální stabilitu proteinu, když modifikace v termální stabilitě se indikuje posunem křivky termálního rozvinutí.
Krok d) může dále obsahovat stanovení hodnoty střední teploty (Tm) z křivky termálního rozvinutí. Krok e) .dále obsahuje porovnání hodnoty Tm každé z křivek rozvinutí popsané v kroku d) s 1) s hodnotou Tm každé z jiných křivek termálního rozvinutí a s 2) Tm každé křivky termálního rozvinutí získané pro cílový protein bez přítomnosti různých molekul.
Aby se metody podle vynálezu zavedly do praxe za použití fluorescenční spektroskopie nebo zobrazení, pak krok a) zahrnuje kontakt cílového proteinu s molekulou fluorescenční sondy přítomné v každém z velkého množství kontejnerů a krok c) zahrnuje (cl) excitaci molekuly fluorescenční sondy světlem v každém z velkého množství kontejnerů a (c2) měření fluorescence v každém z velkého množství kontejnerů. Fluorescence například fluorescenční emise se mohou měřit postupně v případě každého z velkého množství kontejnerů.
množství z velkého sub-sady velkého nebo z každého kontejnerů se měří množství -kontejnerů
V případě současně současně.
Aby došlo ke vzniku spektra aktivity, molekuly se dělí podle stupně, do kterého stabilizují cílový protein proti termálnímu rozvinutí. Po té co se molekuly rozdělí, spektrum aktivity cílového proteinu v případě molekul knihovny
9
9
9
9
9999 9» • ·
9 ··
9 9
9 9 9 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9 funkčních sond se porovná s jednou nebo více seznamů funkčních referenčních spekter.
V oboru jsou dobře známy zahřívací zařízení vhodné pro praktikování metod podle vynálezu. Může se například použít ROBOCYCLER©Gradient Temperature Cycler (Stratagene, La Jolla, CA) (popisuje se v US patentu č. 5,525,300). V jiném případě je možné použít zahřívací blok s teplotním gradientem (popisuje se v dokumentu US patent č. 5,255,976). Fluorescenci je možné odečítat za použití libovolného zařízení fluorescenční spektroskopie. Například je možné použít přístroj CytoFluor II (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA).
Element, na kterém se zahřívá nosič se vzorky, může být libovolný element schopný rychle a reprodukovatelně zahřát vzorky. V souladu s vynálezem se současně zahřívá velké množství vzorků. Velké množství vzorků je možné zahřát na jednom zahřívacím elementu. V jiném případě velké množství vzorků se může zahřát na danou teplotu na jednom zahřívacím elementu a pak se přenese na jiný zahřívací element za účelem zahřátí na jinou teplotu. Zahřátí se provádí v pravidelných a nepravidelných intervalech. Aby vznikla hladká křivka rozvinutí, vzorky by se měly zahřívat pravidelně v intervalech 1 nebo 2 hodin. Teplotní rozmezí, ve kterém se vzorky mohou zahřívat je od 4 do 110 °C. Odečítání spektra a zvláště odečítání fluorescence se provádí po každém kroku zahřátí. Vzorky se mohou zahřát a odečítat spektrálním zařízením například kamerou fluorescenčního zobrazení kontinuálním způsobem. V jiném případě po každém kroku zahřátí se vzorky mohou ochladit na nižší teplotu a pak se provede spektrální odečítání. Upřednostňuje se, aby se vzorky zahřívaly kontinuálně a spektrální odečítání se provedlo, zatímco se vzorky zahřívají.
Spektrální (například fluorescenční) odečítání se provádí u všech vzorků na nosiči současně. V jiném případě se odečítání může provést najednou u vzorků ve skupinách po dvou.
·· to· • to • to · toto·· »· • to • to
• ·* ·· · • · · • · ·
Nakonec se odečítání provádí jednotlivě, v jednom okamžiku jeden vzorek.
Upřednostňuje se zařízení umožňující provést test termálního posunu na mikrotitračních destičkách zahrnující skener a kontrolní softwarový systém. Fluorescence například fluorescenční emise, se může detekovat fotonásobičem v detekční komůrce chráněné před přístupem světla. Používá se software instalovaný v PC a skener se řídí prostřednictvím softwaru.
Příklad zařízení 200 je zobrazen na obrázku č. 2. Přesná mechanika X-Y snímá mikrotitrační destičku citlivou sondou s optických vláken, aby se stanovilo množství fluorescence v každé prohlubni. Mikrotitrační destička a vzorky mohou zůstat během snímání každé řady vzorků na jednom místě a sonda optického vlákna se pak posune do vedlejší řady. V jiném případě se mikrotitrační destička a vzorky mohou pohybovat a zaujmou polohu pro odečítání další řady vzorků. Snímací systém je schopen snímat 96 vzorků za jednu minutu. Snímač je schopen držet velké množství excitačních filtrů a velké množství emisních filtrů, aby se změřily nejběžnější fluoropory. Tak odečítání fluorescenční emise se provádí u jednoho vzorku v jednom okamžiku nebo současně u sub-sady vzorků.
Zahřívací element nebo blok, na kterém se zahřívá nosič se vzorky, může být libovolný element schopný zahřát vzorky rychle a reprodukovatelné. Na jednom zahřívacím elementu je možné zahřát velké množství vzorků. V jiném případě se může velké množství vzorků zahřát na danou teplotu na jednom zahřívacím elementu a pak se přenese na jiný zahřívací element za účelem zahřátí na jinou teplotu. Zahřátí je možné provést v pravidelných a nepravidelných intervalech. Za účelem vytvořit hladkou křivku rozvinutí, by se vzorky měly zahřát pravidelně v intervelech 1 nebo 2 °C. Rozmezí kterém se vzorky mohou zahřívat je od 4 do 110 °C.
teploty, ve
99
Φ * · ·
Φ Φ · » • · Φ »
Φ Φ Φ 9
99 • · · • ♦ · • · · • · · · ·· ··
Φ Φ 99
9 9
9 999
9 9 9 · ·
Φ · · 9
99
Upřednostňuje se, aby se velké množství vzorků zahřálo současně. Jestliže se vzorky zahřívají v diskrétních teplotních intervalech postupným způsobem, spektrální odečítání se provádí po každém kroku zahřátí. V jiném případě po každém krcku zahřátí se vzorky mohou ochladit na nižší teplotu a pak se provede spektrální odečtení. V jiném případě se vzorky mohou zahřát kontinuálním způsobem a spektrální odečítání se provádí během zahřívání.
Testovací zařízení je uspořádáno tak, že obsahuje jeden zahřívací blck. V jiném případě testovací zařízení může obsahovat velké množství zahřívacích bloků na pohyblivé desce. Desku je možné posouvat například lineárním kluzným zařízení, které řídí servo. Příkladem lineárního kluzného zařízení je model SA A5 M400 (IAI America, Torrance, CA) . V tomto provedení vynálezu senzor zachytil spektrální emise z každého vzorku na daném zahřívacím bloku. Deska se pak posune na místo jiného zahřívacího bloku a je doprovázena vzorky pod senzorem tak, že obdrží spektrální emise z každého vzorku na uvedeném zahřívacím zařízení. Deska se posouvá pokud se zachycují spektrální emise ze vzorků na všech zahřívacích blocích.
V jiném případě deskou může být rotační deska, která je zobrazena na obrázku č. 2, jenž může rotovat například na servem řízené hřídeli. V pozdějších provedeních vynálezu senzor zachycuje spektrální emise z každého ze vzorků na daném zahřívacím bloku. Deska pak rotuje na místo jiného zahřívacího bloku a vzorky se posouvají pod senzor tak, že zachycuje spektrální emise z každého ze vzorků na zahřívacím bloku. Deska rotuje dokud vzorky na všech místech zahřívacího bloku vyzařují spektrální emise.
V zařízení 200 se na rotující desce nebo karuselu nachází velké množství zahřívacích bloků 204, přičemž každý zahrnuje velké množství prohlubní pro velké množství vzorků 210. Deska nebo karusel 206 je tvořena z materiálu, který vede teplo 204. Hřídel 208 je spojena se základnou 202 tak, že se otáčí.
• · · · .. ·» «· ·· ·« rotuje podél Servo 210 ie • · · * • · · · ·· ‘·
Rotační deska 206 je připevněna axiálně tak, že osy 208. Otáčení hřídele 208 řídí servo 210.
řízeno počítačem 250 způsobem, který je dobře znám v oboru. Počítač 250 řídí servo 210 tak, že otáčí hřídelí 208, přičemž rotuje rotační deskou 206. Tímto způsobem zahřívací bloky 204 jsou sekvenčně umístěny pod sondou z optických vláken 212.
Každý z velkého množství zahřívacích bloků 204 může být nezávisle řízen řídící jednotkou teploty 214. Tak teplota prvního zahřívacího bloku 204 může být vyšší nebo nižší než teplota druhého zahřívacího bloku 204. Podobně teplota třetího zahřívacího bloku 204 může být vyšší nebo nižší než teplota buď prvního nebo druhého zahřívacího bloku 204.
Teplotní kontrolní jednotka 214 je spojena se zahřívacím blokem 204 termoelektrickým spojení 230. Za působení teplotní kontrolní jednotky 214 se může teplota zahřívacího bloku 204 zvýšit, udržovat konstantní nebo snížit. Teplotní kontrolní jednotka 214 se uspořádá tak, aby bylo možné nastavit teplotu na rotační desce 206. Při takovém uspořádání, když se otáčivá deska 206 zahřívá, zahřívají se také zahřívací bloky 204 systémem cirkulované vody, jak se popisuje shora v textu. Zvláště teplota zahřívacího bloku 204 se může měnit teplotní kontrolní jednotkou 214 v souladu s předem stanoveným teplotním profilem. Upřednostňuje se, aby počítačová řídící jednotka teploty 214 se zavedla za použití počítačového systému.
Termín „teplotní profil znamená změnu teploty v čase. Termín „teplotní profil jsou kontinuální teplotní změny a to změny lineární a nelineární. Termín také zahrnuje protokoly libovolných postupných změn teploty. Jsou to protokoly charakterizované postupným zvyšováním nebo snižováním teploty přičemž tento interval je přerušen obdobím, během kterého se teplota udržuje konstantní. V přístroji zobrazeném na obrázku č. 2 je možné teplotní profil předem definovat naprogramováním počítačovou řídící jednotkou 214. Teplotní profily je možné • · • · • · <
• · • · · · • · · > ·· uložit v paměti řídící jednotky teploty 214 nebo zanést přímo do kontrolní jednotky teploty 214 pomocí operátoru.
Testovací přístroj 200 také zahrnuje zdroj světla 218 vhodný pro emisi ekcitační vlnové délky světla. Excitační světlo ze světelného zdroje 218 excituje vzorky 216 s excitačním světlem. Může se použít libovolný vhodný světelný zdroj. Excitační světlo způsobuje spektrální emisi vzorků 216. Spektrální emise může být elektromagnetické záření libovolné vlnové délky v elektromagnetickém spektru. Upřednostňuje se, aby spektrální emise byla fluorescenční emisí.
Senzor je zachycen na senzorové armatuře 226 a je ho možné odmontovat. Příkladem senzoru je sonda z optických vláken 212. Sonda z optických vláken 212 zahrnuje kabel z optických vláken schopný transmitovat excitační světlo vzorků 216. Elektromagnetická radiace se přenáší z excitačního světelného zdroje 218 na sondu z optického vlákna 212 kabelem z optických vláken, který zajišťuje vstup excitačního světla 228.
Servo-řídící jednotka filtru excitačního světla 258 řídí clonu filtru excitačního světla 256. Zdroj excitačního světla 218 a servo-řídící jednotka filtru excitačního světla 258 je komunikativně a operativně spojena s řídící jednotkou excitačního světla 254. Řídící jednotka 254 řídí vlnovou délku excitačního světla přenášenou na vzorky 216 pomocí servořídící jednotky filtru excitačního světla 258. Excitační světlo se přenáší kabelem z optických vláken 228, který zajišťuje vstup excitačního světla na sondu z optických vláken 212 za účelem přenosu na vzorky 216.
Spektrální emise ze vzorků 216 je zachycena sondou z optických vláken 212 a je přenesena na spektrální emisní filtr 238 výstupním kabelem z optických vláken 250. Servořídící jednotka spektrálních emisí 240 řídí clonu spektrálního emisního filtru 238, přičemž řídí vlnové délky spektrálních emisí, které se přenáší do fotonky s násobičem 220. Servo• · řídící jednotka spektrálních emisí 240 je řízena počítačovou kontrolní jednotkou 242.
Spektrální emise ze vzorků 216 se prochází fotonkou 220. Elektrický výstup 244 spojuje fotonku z násobičem 220 s elektrickou přípojkou 224. Elektrická přípojka 224 spojuje elektrický výstup 244 s počítačem 222. Počítač 222 řízený vhodným software zpracovává spektrální emisní signál ze vzorků 216. Příkladem vhodného software je grafický interface, který automaticky analyzuje fluorescenční data získaná ze vzorků 216. Takový software je dobře známý v oboru. Například odečítací zařízení fluorescence s velkým množstvím prohlubní CytoFluor™II (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) využívá data analyzující systém Cytocalc™ (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) . Jiný vhodný software zahrnuje Microsoft Excel nebo jiný srovnatelný software.
Smysl relativního pohybu armatury senzoru 260 hýbe senzorovou armaturou 226 ve směrech 234 a 236. Druhý smysl relativního pohybu 232 hýbe armaturou senzoru 226 ve směrech 246 a 248 tak, že sonda z optických vláken 212 se může hýbat tak, že detekuje spektrální emise pocházející ze vzorků 216.
Jak se diskutuje shora v textu způsob spektrálního příjmu nebo senzor testovacího přístroje podle vynálezu může obsahovat· fotonku s násobičem. V jiném případě způsob spektrálního příjmu nebo senzor testovacího přístroje může zahrnovat integrovaný obvod s vazbou nábojem (CCD). Dále způsob spektrálního příjmu nebo senzor testovacího přístroje zahrnuje diodové pole. CCD je vyroben ze semi-vodícího silikonu. Když fotony světla padají na CCD, uvolňují se volné elektrony.
Dále pro zobrazení fluorescence, jako je fluorescenční emise, je možné použít kameru CCD. Kamery CCD s vysokým rozlišením detekují velmi malé množství elektromagnetické energie v případě, že pocházejí ze vzdálených hvězd nebo je ohýbána krystaly nebo jsou emitována fluoropóry. Jako • · • · • · elektronické zobrazovací zařízení je kamera CCD zvláště vhodná pro zobrazení fluorescenční emise, protože může detekovat velmi malé objekty. CCD umožňuje velmi citlivou detekci v širokém rozmezí spektra, přičemž umožňuje nízký stupeň elektromagnetického šumu a detekci signálů v širokém dynamickém rozmezí. Zařízení s vázaným nábojem může současně detekovat jasné i slabé objekty. Dále, výstup je lineární, což znamená, že množství zachycených elektronů je přímo úměrný počtu zadržených fotonů. To znamená, že zobrazení jasnosti je mírou reálné jasnosti objektu, což je vlastnost, kterou neposkytuje například fotografická emulze. Vhodné kamery CCD jsou dostupné u firmy Alpha-Innotech (San Leandro, CA), Stratagene (La Jolla, CA) a BioRad (Richmond, CA).
Aparáty vhodné pro použití testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách se popisují v dokumentech přihláška US patentu č. 08/853,459 podaná 9. května 1997 a v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/US97/08154 (publikovaná 13. Listopadu 1997 jako dokument WO 97/42500).
Přehled obrázků na výkrese
Obrázek č. 1 znázorňuje schéma ilustrující způsob podle vynálezu.
Obrázek č. 1B znázorňuje jiné schéma ilustrující způsob podle vynálezu.
Obrázek č. 2 je schématický digram ilustrující pohled shora na testovací zařízení, které je možné použít v testu teplotního posunu na mikrotitračních destičkách.
Obrázek č. 3 zobrazuje výsledky testu teplotního posunu na mikrotitračních destičkách vazebných interakcí jediného ligandu se třemi různými třídami vazebných míst pro lidský atrombin.
W**W ι · · · ·· ··
Obrázek č. 4 ukazuje výsledky testu teplotního posunu na mikrotitračních destičkách vazebných interakcí více ligandů pro lidský a-trombin.
Obrázek č. 5 ukazuje látky přítomné na destičce 1 funkční knihovny sond.
Obrázek č. 6 ukazuje spektrum aktivity faktoru Xa, které se vytvořilo za použití látek na destičce 1 funkční knihovny sond.
Obrázek č. 7 ukazuje spektrum aktivity receptoru růstového faktoru fibroblastů 1 (FGFR1), které se vytvořilo za použití látek na destičce 1 funkční knihovny sond.
Obrázek č. 8 ukazuje výsledky testu teplotního posunu na mikrotitrační destičce při navázání rekombínantního dimerového lac represoru na syntetickou sekvenci 21-méru palindromového lac Operátoru.
Obrázek č. 9 ukazuje výsledek testu teplotního posunu na mikrotitračních destičkách při navázání bovinního svalového myosínu na adenozintrifosfát (ATP).
Obrázek č. 10 ukazuje výsledek testu teplotního posunu na mikrotitračních destičkách při navázání proteinové kinázy bovinního srdce závislé na 3',5'-cAMP na adenozintrifosfát-γsulfát (ΑΤΡ-γ-S) .
Obrázek č. 11 znázorňuje výsledek testu teplotního posunu na mikrotitračních destičkách při navázání bovinní dihydrofolátové reduktázy (DHFR) na metotrexát.
Obrázek č. 12 znázorňuje výsledek testu teplotního posunu na mikrotitračních destičkách při navázání dihydrofolátové reduktázy (DHFR) na NADPH.
Příklad 1: Široké zkřížené cílové využití testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách.
V testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách se testovala řada různých terapeutických proteinových cílů, které se uvádějí v tabulce č. 2. Zahrnují řadu různých proteinů, ♦ « které vykazují širokou odlišnost ve funkcích in vivo. Tyto proteiny zahrnují různé serinové proteázy, proteiny vázající DNA (represor lac), dva růstové faktory (bazický růstový faktor fibroblastů (bFGF) a kyselý růstový faktor fibroblastů (aFGF)) a receptor růstového faktoru (doména II receptoru růstového faktoru fibroblastů 1 (D(II)FGFR1)).
Tabulka č. 2
Terapeutické cíle analyzované testem termálního posunu na mikrotitračních destičkách | |||
cíle | Molekulová hmotnost | Testy/mg (ve formátu 10 μΐ) | |
a-trombin | 37 000 | 1430 | 0,7 pg/test (20 pmol) |
Faktor D | 25 000 | 1000 | 1,0 pg/test (40 pmol) |
Faktor Xa | 45 000 | 1667 | 0,6 pg/test (7 pmol) |
bFGF | 17 500 | 2000 | 0,5 pg/test (29 pmol) |
D(II)FGFR1 | 13 500 | 588 | 1,7 pg/test (126 pmol) |
Represor lac | 77 000 | 1200 | 0,8 pg/test (10 pmol) |
urokináza | 28 000 | 714 | 1,4 pg/test (50 pmol) |
Protein NFkB | 65 000 | 3030 | 0,33 pg/test (5 pmol) |
Receptor GLP1 | 26 000 | ||
MHC II | 45 000 | ||
Von Willebrand faktor | 500 | 400 | 2,5 pg/test |
aFGF | 18 000 |
Molekulová hmotnost cílových proteinů je v rozmezí od 13 500 do přibližně 500 000. V průměru je možné provést 1 322 testů za použití 1,0 mg proteinu při objemu testu 10 μΐ. Počet testů, které se mohou provést se může zdvojnásobit, jestliže se použije test ve formátu objemu 5 μΐ.
Všechny testy termálního posunu na mikrotitračních destičkách se provedly na polykarbonových destičkách s 96 »· ·· • · · (PerSeptive zvyšovala v prohlubněmi s dnem ve tvaru V, kde se jako sonda fluorescence vhodná pro monitorování tranzicí termálního rozbalení použije 200 μΜ 1,8-ANS v případě směsí protein/ligand. Změny fluorescenční emise s vlnovou délkou 460 nm se monitorovaly čtecím zařízením fluorescence CytoFluorlI
Biosystems) (excitace 360 nm) a teplota se přírůstcích 2 °C se zařízením RoboCycler®Gradient Temperature Cycler (Stratagene, La Jolla, CA).
Za použizí testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách se testovala řada proteinů, které zahrnují proteiny z následujících tříd: serinové proteázy (trombin, faktor Xa, faktor D, urokinázu, trypsin, chymotrypsin, subtilizín), povrchové buněčné receptory (receptor FGF 1, MHC třída II, receptor GLP fibronektinu proteiny motorické
1, (IiblIIa) vázající DNA adrenergický růstové β-2, receptor (aFGF, bFGF) , glyceraldehyd-3-fosfatázy, dihydrofolátová reduktáza, receptor faktory (represor lac, NF-K-B, helikáza), proteiny (myozin, helikáza), oxido-reduktázy (křenová peroxidáza, cytochrom c, laktátová dehydrogenáza, laktoperoxidáza, malátová dehydrogenáza, cholesterolová oxidáza, dehydrogenáza fosfoenolpyruvátová karboxyláza, sacharidové modifikace (celuláza, α-amyláza, hyaluronidáza, βglukozidáza, invertáza), imunoglobuliny (IgG Fab, IgG Fc), DNázy (DNáza I, DNáza II), RNázy (RNáza A), vnitrobuněčné receptory vápníku (kalmodulin, protein přenašeče neuronů (acetylcholinesteráza) , radikálů (superoxidová dismutáza) , protein vázající biotin (streptavidin), protein vázající kyslík (myoglobin) a inhibitor proteázy (inhibitor trypsinu).
S100), hydroláza akceptor volných
Příklad 2: Vazebné interakce více ligandů s jedním cílovým proteinem
Skoro univerzální použitelnost testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách je také zobrazena pro případ • · · · 4 • ft • · ft · · · • ft • · ft ft posunu na k testování vazebných interakcí více ligandů, ke kterým v mnoha případech dochází s jednou proteinovou molekulou. Schopnost odhadnout navázání řady různých druhů jednoho proteinu, aniž musí dojít k opětnému vybavení testu, je velkou výhodou testu a jednoduše vede k poznání funkce proteinu, o kterém není známo víc, než primární sekvence. Znalost navázání různých ligandů pomůže při hodnocení funkce vzorku proteinu získaného z genomových informaci.
Jak se dříve ukázalo test termálního mikrotitračních destičkách se může použít schopnosti ligandů, vázat se na jediné místo na cílových proteinech. V závislosti na blízké aditivitě volné energie navázání ligandů a rozvinutí proteinu, je také možné použít test termálního posunu na mikrotitračních destičkách pro analýzu interakcí navázání více ligandů na cílový protein. V případě, že volná energie navázání různých ligandů na stejný protein je skoro aditivní, je možné analyzovat systémy navázání více ligandů buď součinně nebo nesouČinně (pozitivní nebo negativní).
V tomto ohledu je lidský trombin ideální systém pro testování využitelnost testu k analýze interakcí navázání více ligandů, protože trombin obsahuje nejméně čtyři různá vazebná místa: 1) katalytické vazebné místo, 2) vazebné místo pro fibrin (exogenní místo I), 3) vazebné místo pro heparin (exogenní místo II), 4) vazebné místo pro Na+, které se nachází přibližně 15A od katalytického místa.
Nejdříve se stanovilo navázání jednotlivých ligand. 3DP4660, Hirugen (hirudin 53-64) (Sigma) a heparin 5 000 (CalBiochem) se váže na katalytické místo, respektive na vazebné místo pro fibrinogen, respektive na vazebné místo pro heparin na trombinu.
Zásobní roztok trombinu se zředil na koncentraci 1 μΜ v 50 mM Hepes, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1 mM CaCl2 a 100 μΜ 1,8-ANS. Každý ligand trombinu je jediný nebo v různých kombinacích • * * ··’ ♦ · • · obsažen v 1 μΜ roztocích trombinu v konečné koncentraci 50 μΜ s výjimkou heparinu 5000, který je v koncentraci 200 μΜ. Roztok trombinu nebo trombin/ligand o objem 100 μΐ se rozdělil do prohlubní na mikrotitrační polykarbonátové destičce s 96 prohlubněmi s dnem do tvaru V. Obsahy se promíchaly opětným průchodem špičkou pipety o objemu 100 μΐ. Aby se předešlo vypařování vzorků při rostoucí teplotě, na povrch každé reakce se přidala jedna kapka minerálního oleje (Sigma, St. Lois, MO) . Destička se zahřívala po dobu 3 minut v termálním bloku „Gradient Temperature Cycler RoboCycler® (Stratagene, La Jolla, CA), ve kterém se vytvořil teplotní gradient přes celou mikrotitrační destičku. Pak následovalo 30 vteřin chlazení při teplotě 25 °C a následné odečítání fluorescence. Data se analyzovala nelineární metodou nejmenších čtverců.
Výsledky těchto jednotlivých vazebných reakcí jsou uvedeny na obrázku č. 3. Stupeň vazebné afinity je 3DP-4660 > hirugen > heparin 5 COO, odpovídající konstantě Kd 15 nM, 185 nM a 3 434 nM v případě navázání ligandů při každém Tm (uvedeno v rovnici (1)).
Dále se studovalo navázání kombinací dvou ligandů. Data jsou uvedena na obrázku č. 4. Výsledky na obrázku č. 4 vykazují posun termálního rozvinutí, který je trochu menší, než se očekávalo pro úplnou aditivitu. Například samotný Hirugen vykazuje hodnotu ATra 5,8 °C a samotný 3DP-4660 vykazuje hodnotu ÁTm 7,7 °C, ale dohromady vykazují hodnotu Δ Tm 12,2 °C a nikoli očekávaný posun 13,5 °C v případě, že vazebné energie jsou zcela aditivní. Tento výsledek může znamenat, že vazebná afinita jednoho nebo dvou ligandů se redukuje v případě, že se oba ligandy vážou na trombin. Budou příkladem negativní spolupráce mezi vazebným místem pro fibrinogen a katalytickým vazebným místem. Takový výsledek je shodný s výsledky pro trombin popsanými v literatuře, kde se uvádí, že kinetiky hydrolýzy různých chromogenních substrátů jsou závislé na < · * • · · «to · ♦ « · · to ♦ « • · ♦ ·· ·* • · • · ·· • · • · •· ·· navázání ligandú na exogenní místo I. V případě, že je přítomen hurigen pozorovalo se 60 % snížení hodnoty Km pro hydrolýzu D-fenylalanylpipekolylarginyl-p-nitroanilid (Dennis et al., Eur. J. Biochem. 188: 61-66 (1990)). Existuje také strukturální důkaz pro spolupráci mezi katalytickým místem a exogenním místem I. Porovnání izomorfních struktur trombinu vázaného na PPACK (PPACK je inhibitor katalytického místa pro trombin) a trombinu vázaného na hirugen vykazují konformační změny, které se vyskytují na aktivním místě, jako výsledek navázání hirugenu na exogenním místě I (popisuje se v publikaci Vijayalakshmi et al., Protein Science 3: 2254-2271 (1994)). Zjevná kooperativita pozorovaná mezi katalytickým centrem a exogenním místem I jsou konzistentní s funkčními a strukturními daty v literatuře.
Očekává se, že jestliže energie navázání všech tří ligandú je zcela aditivní, je možné dosáhnout hodnoty ÁTm 17,7 °C.
V případě, že jsou však přítomny všechny tři ligandy dohromady, hodnota ÁTm je 12,9 °C. Tento výsledek znázorňuje další negativní kooperativitu, která zahrnuje navázání ligandu na všechny tři . vazebná místa proteinu. V literatuře existují důkazy, které jsou shodné s tímto předpokladem. Například trombin v ternárním komplexu s monomerem heparinu a fibrinu vykazuje sníženou aktivitu vůči tri-peptidovým chromogenním (popisuje v publikaci Hogg and 265: 248-255 (1990)) a značně redukovanou aktivitu s anti-trombinem (popisuje se v publikací Hogg and Jackson, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3619-3623 substrátům a pro-trombinu Jackson, J. Biol. Chem.
(1989)) . et al. komplexy
Také jistá pozorování popsaná v publikaci Hotchkiss
Blood 84: se také indikují, že ternární a značně kompromitují
498-503 (1994)) tvoří v plazmě antikoagulační aktivitu heparinu.
Shrnutí výsledků navázání více ligandú na trombin je uvedeno v tabulce č. 3. Na základě těchto výsledků zobrazených v tabulce č. 3 a 4 a v tabulce č. 5 se udělal následující ·· ·· * * · • · · * i .··. · :: :
···· ·· závěr. V přítomnosti heparinu 5000 se hirudin 53-65 váže na
trombin přibližně | 21 krát | méně | pevněji | než v nepřítomnosti | |
heparinu a | v přítomnosti heparinu | 5000 se 3DP-46600 váže na | |||
trombin přibližně | 10 krát | méně | pevněj i | než v případě, kdy | |
heparin není přítomen. | |||||
Dále, | v přítomnosti hirudinu | 53-65 | se heparin váže na | ||
trombin přibližně | 18 krát | méně | pevněj i | než v nepřítomnosti | |
hirudinu 53 | -65 a v | přítomnosti hirudinu 53 | -65 se 3DP-4660 váže | ||
na trombin | přibližně 3 krát | méně | pevněj i | než v nepřítomnosti | |
hirudinu 53 | -65. | ||||
Za třetí v přítomnosti 3DP-4660 se heparin váže na trombin | |||||
přibližně | z 25 % | pevněj i | než | v nepřítomnosti 3DP-4660 a | |
v nepřítomnosti 3DP | -4660 se | hirudin váže | na trombin přibližně | ||
2,3 krát méně pevně | , než v nepřítomnosti 3DP-4660. | ||||
Tabulka č. | 3: Test | navázání | ligandu na aktivní místo, exogenní | ||
místo | a vazebné místo heparinu na trombinu | ||||
Protcin/Ligand | [LigandJ | Tm | ATm | KdatTm a | Kd at298°Kb |
(μΜ) | (°K) | (°K) | (nM) | (nM) | |
Thrombin (TH) | none | 323.75 | 0.0 | ||
TH/Heparin 5000 | 200 | 327.95 | 4.2 | 3434 | 470 |
TH/Hirudin 53-65 | 50 | 329.52 | 5.8 | 185 | 23 |
TH/3dp-4660 | 50 | 331.40 | 7.7 | 29 | 3 |
TH/Heparin 5000 | 200 | 327.95 | |||
TH/Hep./Hir. | .50 | 330.57 | 2.6 | 4254 | 478 |
TH/Heparin 5000 | 200 | 327.95 | |||
TH/Hep./3dp 4660 | 50 | 333.20 | 5.3 | 350 | 32 |
TH/Hirudin 53-65 | 50 | 329.52 | |||
TH/Hir./Hep. | 200 | 330.57 | 1.1 | 75422 | 8467 |
TH/Hirudin 53-65 | 50 | 329.52 | |||
TH/Hir./3dp-4660 | 50 | 335.97 | 6.5 | 117 | 9 |
TH/3dp-4660 | 50 | 331.40 | |||
TH/3dp-4660/Hep. | 200 | 333.20 | 1.8 | 38205 | 351 |
• · • · .··· ··, ♦ · • * «* <
• · · • »·· • ♦ • ·
TH/dp-4660
TH/3dp-4660/Hir.
331.40
335.97
4.6
731 a: výpočet hodnot Kd a Tm se provedl za použití rovnice (1), přičemž hodnota ÁHTOU je 200 kcal/mol, jak se popisuje pro pre-trombin v publikaci Leinitz et al., Biochemistry 33: 54604568 (1994) a hodnota ÁCpu je 2,0 kcal/mol- °K a Kd je 1/Ka. b: odhady hodnoty Kd pro teplotu T-298 °K se provedly za použití rovnice (3), kde hodnota AHTOU se odhadla, že je -10,0 kcal/mol.
Tak test termálního posunu na mikrotitračních deskách nabízí řadu výhod při analýze interakcí navázání více ligandů při studiu funkční klasifikaci organizace genomů. Stejný test může například současně detekovat navázání různých druhů ligandů, které se váží na více vazebných míst na cílovém proteinu. Každá identifikovaná interakce navázání ligandu je nápomocná při stanovení funkce proteinu. Když shrnou, je možné získat křivku odezvy, charakteristická pro určitou třídu proteinů.
Jestliže se například zvažuje .informace získaná pro trombin a jestliže v daný okamžik zapomeneme, co je o proteinu známo, vazebná data heparinu mohou naznačit extracelulární roli tohoto proteinu, protože heparin jiný sulfatovaný oligosacharid je' důležitý komponent v extracelulární matrici tkání vyšších organizmů. Ligand vázající se na katalytické vazebné místo, což je 3DP-4660 je nepeptidová napodobenina peptidu, který vykazuje arginylový boční řetězec v poloze Pl charakteristický pro substráty a inhibitory serinových proteáz podobných trypsinu. Podobně se zjistilo, že analogy stádia tranzice boroargininu, které mají argininovou skupinu v případě syntetické peptidové napodobeniny v poloze Pl jsou se funkce která je • · * • · · · · • · ♦ · • · · # ·♦ ·· specifickými inhibitory serinových proteáz, trombinu, trypsinu a plazminu (popisuje se v publikaci Tapparelli et al., J. Biol. Chem. 268: 4734-4741 (1993)) s pozorovanou specifitou: Kd přibližně 10 nM (trombin), Kd přibližně 1 000 nM (trypsin), Kd přibližně 10 000 nM (plazmin). Tak kombinace znalostí navázání heparinu s pozorováním navázání na analogy stádia tranzice boroargininu by se rychle zaměřily na přiřazení k tomuto proteinu extracelulární proteolytickou funkci, aniž je dostupná libovolná další informace.
Dále je možné použít test termálního posunu způsobem s vysokou prostupností za účelem detekce kooperativity při navázání ligandu. Informace o kooperativitě navázání ligandu se mohou získat a analyzovat velmi rychle během několika hodin, spíše než během několika měsíců, jak je nutné, když se používají pro klasifikaci funkce proteinu.
Příklad 3: Testování knihovny funkčních sond proti lidskému faktoru Xa
Knihovna funkčních sond se zobrazila na obrázku č. 5. Destička s 96 prohlubněmi (destička 1) obsahovala 94 látek (a dvě kontrolní prohlubně) a zahrnuje řadu látek, které se považují za použitelné při získání informací o preferencích navázání ligandů a pravděpodobné funkci proteinu. Ko-faktory, jako je NAD a ATP, se nacházejí v prohlubních A4 a A5. Tato určitá destička také obsahovala velké množství podmínek vhodných pro navázání kovových iontů, které pomáhají testovat cílový protein pro ko-faktory kovového iontu.
Za účelem ověřit testování funkční sondy se dva známé proteiny inkubovaly s látkami na destičce 1 a pak se testovaly za použití testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách. Spektrum aktivity získané v případě faktoru Xa (Enzyme Research Labs) je zobrazeno na obrázku č. 6.
Faktor Xa se získal z instituce Enzyme research Labs (South Bend, IN) . Reakce se připravila na polykarbonátových ·♦ ··......
* · · 1 « » · · • · · : i ί • ·♦ ·♦ ···· ♦· • * · « · • « • · · ·· ·* • t ·« 9 · ♦
9 ····
9 9 4 4 · * ·« »· hodnotě ATm vyšší než 1,0 MgSO4, (3) 0,5 M Li2SO4, polyposfát a (6) 0,1 M mikrotitračních destičkách s 96 prohlubněmi se dnem ve tvaru V. Konečná koncentrace faktoru Xa je 1,4 μΜ (55 ng/ml) v roztoku 200 mM Tris-HCl pH 8. Konečná koncentrace 1,8-ANS je 100 μΜ. Konečná koncentrace každé molekuly, u které se testuje schopnost navázání je zobrazena na obrázku č. 6. Obsahy se promíchaly opakovaným nasáním do špičky o objemu 100 μΐ. Na povrch každé reakce se přidala kapka minerálního oleje (Sigma, St. Lois, MO), aby se omezilo odpařování ze vzorků při zvyšující se teplotě. Reakce na mikrotitračních destičkách se současně zahřály ve dvou stupních a to ze 40 na 70 °C za použití zařízení Gradient Temperature Cycler RoboCycler (Stratagene, La Jolla, CA). Po každém kroku zahřání před zaznamenání fluorescence se vzorek ochladil na teplotu 25 °C. Fluorescence se měřila za použití odečítacího zařízení na mikrotitračních destičkách CytoFluorlI. (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) . 1,8-ANS se excitoval světlem s vlnovou délkou 360 nm. Fluorescenční emise se měřily při vlnové délce 460 nm. Zjistilo se,· že šest látek stabilizuje tento enzym při °C: (1) 0,5 M (NH4)2SO4, (2) 0,5 (4) 0,5 M KC1, (5) 0,1 M triCaCl2. Poslední dvě látky jsou pravděpodobně nejpodstatnější, protože tri-polyfosforečnan je polyelektrolyt, který napodobuje heparin a jiné sulfátované oligosacharidy a jeho navázání na proteiny naznačuje přítomnost vazebného místa pro heparin, což je dobře známo u faktoru Xa. Podobně je známo, že ionty Ca2+ vážou doménu Gla faktoru Xa, která se podílí na stabilizačním účinku, který vykazuje 0,1 M CaCl2.
Zjistilo se, že některé kovové ionty vykazují silný destabilizační účinek v případě faktoru Xa. zjistilo, že [Co (NH3) 6]C13, BaCl2, CdCl2, destabilizují faktor Xa při teplotě 6 až 17 °C. Důvod této destabilizace není znám. Je možné, že tyto kovové ionty
Například se YC12 a NiSO4 i ·,η ?» .*ι·χμ χ·χ »w • · · · · ··· s výhodou vážou rozvinutou formu faktoru Xa. Je také možné, že nastanou některé interference se sondou fluorescence.
Příklad 4: testování knihovny funkčních sond proti lidskému D (II)FGFR1
Látky na destičce 1 knihovny funkčních sond se také použily při přípravě spektra aktivity v případě D(II) FGFR1. D(II) FGFR1 se klonoval a exprimoval v mikroorganizmu E. coli. Rekombinantní D(II)FGFR1 se opětně renaturoval z inkluzních tělísek v podstatě, jak se popisuje v publikaci Wetmore, D. R. et al., Proč. Soc. Mtg., San Diego, CA (1994)) s tou výjimkou, že hexa-histidinový tag je zahrnutá na N-konci a umožňuje získání pomocí afinitní chromatografie na Ni2+ chelátové koloně (Janknecht, R. et al., Nati. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976 (1991)). D(II) FGFR1 se dále čistil na heparin-sefarózové koloně (Kan, M. et al., Science 259: 1918-1921 (1993),
Pantoliano, M. W. et al., Biochemistry 33: 10229-10248 (19991)). Čistota látky byla vyšší než 95 %, jak se potvrdilo testem SDS-PAGE. Protein D(II) FGFR+ se koncentroval na koncentraci 12 mg/ml (přibližně 1 mM) a skladoval se při teplotě 4 °C.
Reakce se připravily na polykarbonátových. mikrotitračních destičkách s 96 prohlubněmi, kdy prohlubně mají dno ve tvaru V. Konečná koncentrace D(II) FGFR1 byla 50 μΜ v roztoku 200 mM Tris HCI, pH 8 v každé prohlubni polykarbonátových mikrotitračních destiček s 96 prohlubněmi.. Konečná koncentrace 1,8-ANS je 100 μΜ. Konečná koncentrace každé z molekul, kde se testuje její schopnost vázat se, je zobrazena na obrázku č. 7. Objemy se promíchaly opakovaným průchodem špičkou pipety o objemu 100 μΐ. Nakonec se na povrch každé reakce přidala jedna kapka minerálního oleje (Sigma, St. Lois, Mo) , aby se snížilo odpařování ze vzorků při zvyšujících se teplotách.
Reakce na mikrotitračních destičkách se zahřály současně ve dvou krocích z teploty 25 °C na teplotu 60 °C za použití • · · · ·· ·· ·· ·· · ·
9 · 999 9*9«
9 · 9 9 9 99 9 «9 ·
zařízení Gradient Temperature Cycler RoboCycler® (Stratagene, před měřením Fluorescence fluorescence (PerSeptive
La Jolla, CA) . Po každém kroku zahřání fluorescence se vzorek ochladil na teplotu 25 °C se měřila za použití odečítacího zařízení
CytoFluorlI na mikrotitračních destičkách
Biosystems, Framingham, Ma) . 1,8-ANS se excitoval světlem při vlnové délce 360 nm. Fluorescenční emise se měřily při vlnové délce 460 nm.
Výsledné spektrum aktivity se zobrazilo na obrázku č. 7. Zjistilo se, že velké množství látek stabilizuje D(II) FGFR1. Dále se zjistilo, že všechny cukry D(+)-glukóza, D(+)sacharóza, xylitol a sorbitol stabilizují (a pravděpodobně se váží) na D(ZI) FGFR1. Výsledek může být konzistentní se známými vlastnostmi pro navázání heparinu na tento protein. Tri-polyfosfáz, který je známý jako elektrolytová napodobenina heparinu, způsobuje největší posun: přibližně 11 °C. Výsledek je konzistenzní s vlastnostmi navázání heparinu uvedeného proteinu (Pantoliano, M. W.. et al., Biochemistry 33: 1022910248 (1994)).
Situace, kde uživatel neví nic o uvedeném proteinu (jak je typické v případě, kdy se klonuje nový gen a funkce kódovaného proteinu není známa) , pak informace -získané testováním látek na destičce 1 poskytnou uživateli nějaký důkaz, že D(II) FGFR1 by se mohl klasifikovat jako protein vázající heparin.
Příklad 5: Identifikace proteinových cílů obsahující vazebná místa pro DNA
Represor lac je v normálním případě tetraměrový protein tedy dimér dimérů. Ukázalo se, že tento protein však váže DNA ve svém dimerovém stádiu. V publikaci Lewis et al., 1996, Science 271: 1247-1254 se řeší krystalová struktura represoru Lac vázaného na jeho příbuzný ligand DNA. Geneticky upravený dimer, který není schopen tvořit tetramer a syntetický 21merový oligonukleotid, palindromická sekvence přirozeného
• · · · » · · » · · ·· operátoru lac se získaly od Dr. Mitch Lewis z University Pennsylvania. Navázání syntetického operátoru lac na mutantní represor lac se testuje za použití testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách.
Konečná koncentrace represoru lac je 60 μΜ v roztoku 200 mM Tris-HCl, pH 8. Reakce se připravily na polykarbonátové mikrotitrační destičce s 96 prohlubněmi. Konečná koncentrace 1,8-ANS je 10C μΜ. Konečná koncentrace každé z molekul, u které se testuje schopnost navázání se uvádí na obrázku č. 7. Objemy se zamíchaly opakovaným průchodem špičky pipety o objemu 100 μΐ. Nakonec se přidá na povrch každé reakce jedna kapka minerálního oleje (Sigma, St. Lois, MO), aby se snížilo odpařování ze vzorků při zvyšujících se teplotách.
Reakce na mikrotitračních destičkách se zahřály současně ve dvou stupních z teploty 25 °C na 75 °C. za použití zařízení Gradient Temperature Cycler ROBOCYCLER® (Stratagene, La Jolla, CA) . Po každém kroku zahřátí před snímáním fluorescence se vzorek ochladil na teplotu 25 °C. Fluorescence se měřila za použití čtecího zařízení fluorescence pro mikrotitrační destičky CytoFluor II (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA). ANS se excitoval světlem s vlnovou délkou 360 nm. Fluorescenční emise se měřily při vlnové délce 460 nm.
V přítomnosti 80 μΜ syntetické operátorové DNA se hodnota Tm pro rozvinutou tranzici represoru lac posunula o 5,6 °C (obrázek č. 8) . Vypočítaná hodnota Kd při Tm je použití rozumného odhadu v případě AHL (-10,0 vypočítaná hodnota Kd při 25 °C je 1,2 μΜ a vypočítaná hodnota Kd při fyziologické teplotě 37 °C je 3,4 μΜ. Fluorescenční sonda 1,8-ANS se neváže na samotnou DNA (to znamená, že kontrolní reakce, jenž neobsahuje nevykazuje žádný fluorescenční signál) .
μΜ. Za kcal/mol) žádný represor lac,
65 | ···· · · · · • · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · | ·· ·· ·· • · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · · | ||
Výsledky ukazují, | že | test | termálního | posunu na |
mikrotitrační destičce | se | může | použít v testu | interakcí |
DNA/protein. | ||||
Příklad 6: Testy navázání | ATP |
Navázání adenozintrifosfátu (ATP) a analogu ATP se může testovat za použití testu termálního posunu na mikrotitrační destičce. Bovinní svalový myozin (Sigma), proteinová kináza ze srdce telete závislá na 3'-5'cAMP (Sigma) a pyruvátová kináza z kuřecích svalů (Sigma) se každá zvlášť rozpustila v pufru A za vzniku zásobních roztoků, kdy konečná koncentrace je 2 mg/ml. Chlorid hořečnatý (MgCl2) , adenozintrifosfát-y-S (ATP-yS), fluorid hlinitý (AIF3) a fluorid sodíku NaF) se rozpustily v pufru A (50 mM HEPES, PH 7,5, 100 mM NaCl) na koncentraci roztoku používanou v každém experimentu. Roztok látky Dapoxyl™12800 se připravil ředěním zásobního roztoku látky Dapoxyl™12800 (5-(4''-dimetylaminofenyl)-2-(4'fenyl)oxazolsulfonová kyselina, sodná sůl, Molecular Probes, lne.) v dimetylsulfoxidu na vhodnou koncentraci v pufru A.
V reakcích s ATP a ΑΤΡ-γ-S každý vzorek obsahoval 12 μΐ zásobního roztoku proteinu (2mg/ml), 9,6 μί každého ATP nebo ΑΤΡ-γ-S (50 mM), 4,8 μΐ MgCl2 (100 mM) a 21,6 μί roztoku 222 μΜ látky dapoxyl 12800 v pufru A. V reakcích ATP, fluorid hlinitý a fluorid sodný, každý vzorek obsahoval 12 μΐ zásobního roztoku proteinu (2 mg/ml), 9,6 μΙΑΤΡ (50 mM), 9,6 ml fluoridu hlinitého (50 mM) + fluoridu sodného (50 mM) , 4,8 μΐ 100 mM MgCl2 a 12 μΐ roztoku 400 μΜ látky Dapoxylu 12800 v pufru A.
V případě testu termálního posunu se 4 alikvoty každé testovací směsi o objemu 10 μΐ rozdělily do čtyř prohlubní, které se nachází v různých kvadrátech destičky termocycleru s MJ Research s 384 prohlubněmi. Aby se předešlo odpařování, do každé ze čtyř prohlubní se přidalo 10 μί minerálního oleje Každý bod dat se získal zahříváním destičky při teplotách po • · • · mikrotitračních myozinem. Data dobu 3 minut. Destičky se například zahřály při dané teplotě a pak se nechaly ochladit na teplotu 25 °C po dobu 1 minuty. Pak následuje ozáření UV zářením a sběr dat. Pak se destička zahřála na další vyšší teplotu atd. UV ozáření se provedlo za použití záření s dlouhou vlnovou délkou při 200 až 420 nm, které má vrchol při vlnové délce 365 nm. Fluorescence se zobrazila za použití kamery CCD, která má pásmovou propust při 550 nm.
Obrázek č. 9 ukazuje výsledky testu termálního posunu na destičkách pro ATP s bovinním svalovým se vynesla do grafu ve formě intenzita fluorescence jako funkce teploty. Hodnota Tm kontrolní křivky termálního rozvinutí (nikoli ATP) je 49,3 °C (prohlubeň na mikrotitrační destičce K2) . Hodnota Tm křivky termálního rozvinutí pro bovinní svalový myozin vázaný na ATP ((+)ATP) je 51,4 °C (prohlubeň na mikrotitrační destičce K16)). Hodnota Δ Tm pro navázání ATP je 2,1 °C. Hodnota Kd je 440 μΜ.
Obrázek č. 10 ukazuje výsledky testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách ΑΤΡ-γ-S a proteinové kinázy závislé na 3', 5'-cAMP. Do grafu se vynesla intenzita fluorescence jako funkce teploty. Hodnota Tm kontrolní křivky termálního rozvinutí (bez ΑΤΡ-γ-S) je 46,2 °C (prohlubeň na destičce E14). Hodnota Tm kontrolní křivky termálního 'rozvinutí pro proteinovou kinázu závislé na 3',5'-cAMP vázanou na ΑΤΡ-γS((+)ΑΤΡ-γ-S je 51,8 °C (prohlubeň na mikrotitrační destičce M15) . Hodnota Δ Tm pro ATP—γ-S je 5,6 °C. Hodnota Kd je 200 μΜ. Výsledky zahrnující výsledky v případě pyruvátové kinázy jsou shrnuty v tabulce č. 4.
Tabulka č. 4: Souhrn výsledků enzymů, které se váží na ATP. Hodnota v závorkách je standardní odchylka
Protein | referenční | ΑΤΡ-γ-S | ATP (10 mM) | ATP+AIF3 |
• · • φ φ φ
ΦΦΦΦ φφ · · φφφ φφφ φ φφφ φφφφφ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ · · ··
(10 | mM) | (10 mM) | |||
Tm | ATm | ATm | ATm | ||
Myozin | 49, 4 | 0,0 | (±0,2) | 2,2 (±0,4) | 2,8 (±0,4) |
3'-5'cAMP proteinová kináza | 44, 7 | 5, 6 | (±1,7) | 7,5 (±0,7) | 8,2 (±1,4) |
Pyruvátová kináza | 54,5 | 0,8 | (±0,11) | -0,44(±0,1) | -0,27 (±0,2) |
Příklad 7: Test navázání kyseliny listové
Navázání kyseliny listové se může testovat za použití testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách. Dihydrofolátová reduktáza z bovinních jater (DHFR, Sigma), dihydrofolátová reduktáza z kuřecích jater (DHFR, Sigma), arylaminová acetyltransferáza holubích jater (ArAcT, Sigma) a transferáza formiminoglutamové kyseliny z prasečích jater (FGT, Sigma) se jednotlivě rozpustilo v pufru A (50 mm HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl) za vzniku zásobních roztoků s koncentrací 2 mg/ml. Roztoky kyseliny dihydrofolové (FAH2) , metotrexát, nikotinamíddenindinukleotidfosfát (NADP) se připravily rozpuštěním pevného materiálu v pufru A bezprostředně před použitím. Roztok Dapoxylu™12800 se připravil ředěním zásobního roztoku 20 mM Dapoxylu™12800 v dimetylsulfoxidu na vhodnou koncentraci v pufru A.
Každý testovaný vzorek obsahoval 12 μΐ proteinového zásobního roztoku (2 mg/ml), 4,8 μΐ buď kyseliny dihydrofolové (EAH2) nebo zásobní roztok metotrexá.tu (1 mM) a 31,2 μΐ roztoku 154 μΜ Dapoxyl™ 12800 v pufru A. Každý vzorek obsahoval 12 μΐ zásobního roztoku proteinu 2mg/ml), 4,8 μΐ zásobního roztoku NADP (50 mM) a 31,2 μΐ roztoku 154 μΜ Dapoxyl™ 12800 v pufru A.
, ,··,., ·- - -.,-. - - - ·· ·« - .-ΛΛΛ5η5.·.Ί.0.--.0-,00 - ···· ΦΦ · · ·Φ ·· Φ ♦ • · · · · · · · · · φ · · · Φ ΦΦΦ Φ · · · ·· Φ·· · · · · · ΦΦ Φ • Φ · Φ ΦΦΦΦ · · · · ·* ·· ·· ·· ·· ··
V případě testu termálního posunu se do čtyř prohlubní lokalizovaných v různých kvadrantech destičky termocycleru s 384 prohlubněmi MJ Research rozdělily čtyři alikvoty o objemu 10 μΐ každé testovací směsi. Do každé ze čtyř prohlubní se přidalo 10 μΐ minerálního oleje, aby se předešlo vypařování. Každý bod se získal zahřáním destičky při zobrazené teplotě po dobu tří minut, pak následuje inkubace při teplotě 25 °C po dobu 1 minuty. Pak se ozáří UV zářením a získají se data. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 5.
Tabulka č. 5: Souhrn výsledků proteinů, které se váží na metotrexát, FAH2 a NADP. Hodnota v závorkách je standardní odchylka
Protein | Referenční | Metotrexát | FAH2 (100 μΜ) | NADP (5.mM) | |
(100 | μΜ) | ||||
Tm | ATm | .ATm | ATm | ||
DHFR | 52,47 | 7,0 | (+-0,1) | -0, 64 (±0,2) | 3,2 (±0,13) |
DHFR | 56, 6 | 8,6 | (±0,2) | 2,5 (±0,2) | 3,8 (±0,4) |
Akrylaminac etyltransfe ráza | 49, 8 | 1,0 | (±0,4) | -1,8(±0,5) | 2,8(±0,4) |
Transferáza formamino- L-glutamové kyseliny | 47,2 | 0,9 | (±0,5) | 3,62 (±0,4) | 0,0 (±0,2) |
Příklad 8: Test navázání metotrexátu/NADP(H)
Schopnost měřit teplotní posuny při navázání metotrexátu a
NADPH, jak odděleně tak současně je další příklad využití vynálezu při měření interakcí navázání více ligandů. V tomto případě vazebná místa dvou ligandů jsou proximální a existuje
• φ· φ Φ· φ φ · φ · φ • · · φ ·· ·· φ« φφ • · φ • · φ · φ • · · φ φφ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ · · φ φ φ φ φ φφ φφ pozitivní kooperativita při navázání dvou ligandů, což zobrazuje skutečnost, že termální posun pro navázání obou ligandů současně je o 2 až 4 stupně více než celkový posun při navázání každého ligandu odděleně (tabulka č. 6).
Navázání metotrexátu (MTX) a NADPH se může testovat za použití testu termálního posunu na mikrotitračních destičkách. Dihydrofolátová reduktáza z bovinních jater (DHFR, Sigma) a dihydrofolátová reduktáza z kuřecích jater (DHFR, Sigma) se rozpustily odděleně v pufru A (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl) za vzniku zásobních roztoků s konečnou koncentrací 2 mg/ml. Všechny zásobní roztoky ligandů se připravily rozpuštěním pevného materiálu v pufru A bezprostředně před použitím. Zásobní roztoky redukované formy nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH, 100 mM) , NADP (100 mM) a metotrexátu (1 mM) se dále dvakrát ředily v pufru A na konečnou koncentraci: metotrexát (200 μΜ) , NADP (20 mM) , NADPH (20 mM), metotrexát + NADP (200 μΜ + 20 mM), metotrexát + NADPH (200 μΜ + 20 mM). Roztoky Dapoxyl™ 12800 se připravily ředěním zásobního roztoku 20 mM roztoku Dapoxyl™
12800 | v | |
A. | 5 | μΐ |
25 | μΐ | 2x |
) s | 20 | μΐ |
roztoku 250 μΜ Dapoxyl™ 12800 v pufru A.
Konečné koncentrace ligandu je 10 mM NADP, 10 mM NADPH a
100 μΜ MTX.
V případě testu termálního posunu se do čtyř prohlubní lokalizovaných v různých kvadrantech destičky termocycleru s 384 prohlubněmi MJ Research rozdělily čtyři alikvoty o objemu 10 μΐ každé testovací směsi. Do každé ze čtyř prohlubní se přidalo 10 μΐ minerálního oleje, aby se předešlo vypařování. Každý bod se získal zahřáním destičky při zobrazené teplotě po dobu tří minut, pak následuje inkubace při teplotě 25 °C po dobu 1 minuty. Pak se ozáří UV zářením a získají se data.
ΊΟ ···· ·* • · · • · · «ft ft* • ftft • ftftftft «ft ftft • ft · · • ftft * ft ftft ft ft ftft ft ftft ftft
Na obrázku č.
posunu na je zobrazen výsledek testu termálního destičce mikrotitrační s dihydrofolátovou reduktázou. Do grafu se vynesla intenzita fluorescence jako funkce teploty. Hodnota Tm kontrolní křivky termálního rozvinutí (bez MTX) je 47,2 °C (prohlubeň na destičce Ml). Hodnota Tm kontrolní křivky termálního rozvinutí pro DHFR vázanou na metotrexát ((+)MTX) je 56,4 °C (prohlubeň na mikrotitrační destičce G6) . Hodnota Δ Tm pro navázání metotrexátu je 9,2 °C. Hodnota Kd je 24 nM.
Na obrázku č. 12 je zobrazen výsledek testu termálního posunu na mikrotitrační destičce NADPH ' s dihydrofolátovou reduktázou. Do grafu se vynesla intenzita fluorescence jako funkce teploty. Hodnota Tm kontrolní křivky termálního rozvinutí (bez NADPH) je 50,8 °C (prohlubeň na destičce G8). Hodnota Tm kontrolní křivky termálního rozvinutí pro DHFR vázanou na NADPH ((+)NADPH) je 53,8 °C (prohlubeň na mikrotitrační destičce B20). Hodnota Δ Tra pro navázání NADPH je 3 °C. Hodnota Kd je 0,7 μΜ.
metotrexátu
Tabulka č. 6: ΔΤπι ligandu v komplexu DHFR. Hodnota v závorkách je standardní odchylka.
Prótei n | NADPH | MTX | SUMa | NADPH+ MTXb | NADPH | MTX | SUMa | NADPH± MTXb |
DHFR | 7,5 | 10,1 | 17,6 | 20,9 | 11,9 | 10, 1 | 22 | 23,8 |
(kuře) | (±0,38 ) | (±0,32 ) | (±0,4) | (±1,3) | (±0,32 ) | (±0,4) | ||
DHFR | 6,3 | 7,7 | 14 | 18,1 | 9,7 | 7,7 | 17,4 | 24,6 |
(kráva ) | (+0,1) | (±0,3) | (±0,4) | (±0,2) | (±0,3) | (±0,6) |
a Uvedená hodnota je součet jednotlivých ΔΤιη pozorovaných u proteinu inkubovaného odděleně s každým ligandem.
·*··
0 « • · · »» • · 0 • 0 0·· • r ·· • ♦ · · • 0 · <
• 0 0 0 00 00 · · 0 • 0 «0
0 0 0 00 00
Uvedená hodnota je ATm pozorovaná u proteinu inkubovaného současně s oběma ligandy.
Příklad 9:
Kyselina dihydrofolová je substrát dihydrofolátové reduktázy (DHFR). Metotrexát je analog kyseliny folové, který se váže na DHFR. Důkazem, že metoda podle vynálezu je spolehlivá, se ukázalo, že se metoda může použít při detekci navázání dihydrofolové kyseliny na DHFR. Za účelem testovat funkci proteinu DHFR bovinních jater se kombinovala s 80 látkami a detekovalo se navázání na metotrexát, nikoli však na řadu jiných látek.
Každá prohlubeň destičky #198104 obsahovala jednu z 80 různých látek v koncentraci 10 mM v dimetylsulfoxidu. Roztok každé látky se zředil v pufru A (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl) na konečnou koncentraci 200 μΜ v oddělených prohlubních na polystyrénové destičce s 384 prohlubněmi. 5 μΐ roztoku obsažených v každé prohlubni se přeneslo na polypropylenovou destičku MJ Research obsahující 5 μΐ DHFR bovinních jater (při koncentraci 0,5 mg/ml a barviva Dapoxyl™12800 při koncentraci 200 μΜ, což vede ke konečné koncentraci ligandu 100 μΜ, DHFR 0,25 mg/ml a 100 μΜ látky Dapoxyl v objemu 10 μΐ v každé prohlubni.
Aby se předešlo vypařování, do každé prohlubně se přidalo 10 μΐ minerálního oleje. Profily termálního rozvinutí se pak měřily pro každou prohlubeň při teplotě od 25 do 70 °C, kdy se shromáždily data pro každou teplotu oddělené jednostupňovým krokem. Každý datový bod se získal zahřáním destičky při uvedené teplotě po dobu 3 minut, pak následovala inkubace při teplotě 25 °C po dobu jedné minuty. Pak se vzorky ozářily UV zářením s dlouhou vlnovou délkou a data se získala za použití kamery CCD.
Data se získala jako čtyři kopie 80 látek v kvadrantech destičky s 384 prohlubněmi. Čtyři kvadranty obsahují: prohlubně A2 až Hll (první kvadrant) , prohlubně A14 až H23 (druhý kvadrant), prohlubně 12 až Pil (třetí kvadrant) a prohlubně 114 až 123 (čtvrtý kvadrant). Sloupce 1, 12, 13 a 24 zahrnují referenční prohlubně obsahující pouze DHFR a dimetylsulfoxid.
Prohlubně F2, F14, N2 a N14 obsahovaly metotrexát.
Navázání se projevilo použitím softwaru jako červená Metotrexát posunul hodnotu Tm o 5,13 ± 0,19 stupňů prohlubeň.
(průměrná hodnota čtyř kvadrantů) mají malý nebo žádný účinek
Ostatní látky na destičce zobrazují se jako bílé prohlubně). Tyto výsledky ukazují, že DHFR váže metotrexát
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY• · · · ·· ·· /v1. Způsob funkční klasifikace proteinu, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:a) testování schopnosti jedné nebo několika molekul z většího množství různých molekul modifikovat stabilitu uvedeného proteinu, přičemž modifikace stability proteinu indikuje, že se molekula váže na protein,b) vytvoření spektra aktivity uvedeného proteinu na základě testování popsaného v kroku a), kde uvedené spektrum aktivity odráží sub-sadu molekul z uvedeného většího množství různých molekul, které modifikují stabilitu uvedeného proteinu a proto jsou ligandy, které se váží na protein,c) porovnání uvedeného spektra aktivity pro uvedený protein s jedním nebo více seznamy funkčních referenčních spekter ad) klasifikace uvedeného proteinu podle sady molekul v uvedeném větším množství různých molekul, které modifikují stabilitu uvedeného proteinu.2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený krok testování a) zahrnuje:al) kontakt uvedeného proteinu s jednou nebo několika z uvedeného většího množství různých molekul v každém z několika kontejnerů, a2) ošetření uvedeného proteinu v každém z těchto několika kontejnerů, aby došlo k rozvinutí uvedeného proteinu, a3) měření fyzikálních změn spojených s rozvinutím uvedené cílové molekuly v každém z uvedených kontejnerů, a4) vytvoření křivky rozvinutí pro uvedenou cílovou molekulu v případě každého z uvedených kontejnerů a a5) porovnání každé z uvedených křivek rozvinutí v kroku d) 1) s každou s uvedených jiných křivek rozvinutí a 2) s křivkou rozvinutí získanou pro uvedený protein v nepřítomnostilibovolné molekuly z uvedeného většího množství různých molekul a a6) stanovení, zda libovolná z uvedeného většího množství různých molekul modifikuje stabilitu uvedeného proteinu, kde modifikace stability se indikuje změnou uvedené křivky rozvinutí.3. Způsob funkční klasifikace proteinu, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:a) testování schopnosti jedné nebo několika molekul z většího množství různých molekul, které jsou známy tím, že se váží na určitou třídu proteinů, modifikovat stabilitu uvedeného proteinu, přičemž modifikace stability proteinu indikuje, že se molekula váže na protein,
b) vytvoření spektra aktivity uvedeného proteinu na základě testování popsaného v kroku a), kde uvedené spektrum a ktivity odráží sub-sadu molekul z uvedeného většího množství různých molekul, které modifikují s tabilitu uvedeného proteinu a proto jsou ligandy, které se váží na protein a c) klasifikace uvedeného proteinu jako člena uvedené třídy proteinů, jestliže uvedená jedna nebo více molekul z uvedeného většího množství různých molekul modifikuje stabilitu uvedeného proteinu.4. Způsob podle nároku 3, .vyznačující se tím, že uvedený krok testování a) zahrnuje:al) kontakt uvedeného proteinu s jednou nebo několika molekul z uvedeného většího množství různých molekul v každém z několika kontejnerů, a2) ošetření uvedeného proteinu v každém z uvedených kontejnerů, aby došlo k rozvinutí uvedeného proteinu, a3) měření fyzikálních změn spojených s rozvinutím uvedené cílové molekuly v každém z uvedených kontejnerů, a4) vytvoření křivky rozvinutí pro uvedenou cílovou molekulu v případě každého z uvedených kontejnerů aRwr φφφφ φ φ φ φφφ a5) porovnání každé z uvedených křivek rozvinutí v kroku d) 1) s každou s uvedených jiných křivek rozvinutí a 2) s křivkou rozvinutí získanou pro uvedený protein v nepřítomnosti libovolné molekuly z uvedeného většího množství různých molekul a a6) stanovení, zda libovolná z uvedeného většího množství různých molekul modifikuje stabilitu uvedeného proteinu, kde modifikace stability se indikuje změnou uvedené křivky rozvinutí.5. Způsob funkční klasifikace proteinu, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje klasifikaci uvedeného proteinu podle sady molekul ve větším množství různých molekul, které modifikují stabilitu uvedeného proteinu.6. Způsob funkční klasifikace proteinu, který je schopný se na základě termální změny rozvinout, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:a) testování schopnosti jedné nebo několika molekul z většího množství různých molekul posunout křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu, přičemž posun v křivce termálního rozvinutí proteinu indikuje, že se molekula váže na protein,b) vytvoření spektra aktivity uvedeného proteinu na základě testování popsaného v kroku a) , kde uvedené spektrum aktivity odráží sub-sadu molekul z uvedeného většího množství různých molekul, které posouvají křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu a proto jsou ligandy, které se váží na protein,c) porovnání uvedeného spektra aktivity v případě uvedeného proteinu s jedním nebo více seznamy funkčních referenčních spekter ad) klasifikace uvedeného proteinu podle sady molekul v uvedeném větším množství různých molekul, které posouvají křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu.k-s/v-. -V'·.ysř«^rv^X.X»OM»«»WWÍl*í><XXWXMM X’i'·ίΧ>Λ·>ςΚΧ><>ΥΧ'Χ'Χ'ΧΧ^Χ^:·*'^Υ*^ m7. Způsob podle nároku 6, kde uvedené testování popsané v kroku a)sevyznačuje tím, že zahrnuje:al) kontakt uvedeného proteinu s jednou nebo několika molekulami z uvedeného většího množství různých molekul v každém z několika kontejnerů, a2) zahřátí uvedených kontejnerů popsaných v kroku al), a3) měření fyzikální změny v každém z uvedených kontejnerů, která je spojená s rozvinutím uvedené cílové molekuly, což je výsledkem uvedeného zahřátí, a4) vytvoření křivky termálního rozvinutí pro uvedenou cílovou molekulu jako funkce teploty v případě každého z uvedených kontejnerů a a5) porovnání každé z uvedených křivek rozvinutí popsaných v odstavci a4) 1) s každou z uvedených jiných křivek termálního rozvinutí a 2) s křivkou termálního rozvinutí získanou pro uvedený protein v nepřítomnosti libovolné molekuly z uvedeného většího množství různých molekul a a6) stanovení, zda libovolná z uvedeného většího množství různých molekul posune křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu.8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený srovnávací krok (a5) zahrnuje rozdělení uvedených molekul v uvedeném větším množství různých molekul pro uvedený protein na základě schopnosti každé z uvedeného většího množství různých molekul posunout křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu.9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že v uvedeném kroku zahřátí (a2) se uvedené kontejnery zahřívají současně.10. Způsob podle nároku 7, tím, že uvedený krok (a4) vyznačující se dále zahrnuje stanovení teploty středu (Tm) z křivky termálního rozvinutí a kde uvedený krok (a5) dále zahrnuje porovnání Tn každé z uvedených křivek v kroku (a4) 1) s Tm každé z uvedených • * ·· ·♦ • · · · · · · • · jiných křivek termálního rozvinutí a 2) s Tm křivky termálního rozvinutí získané pro cílový protein, přičemž není přítomna žádná z uvedených různých molekul.11. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený krok (a3) zahrnuje měření absorbance světla uvedeným obsahem každého z uvedených kontejnerů.12. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedený krok (al) zahrnuje kontakt uvedeného proteinu s molekulou fluorescenční sondy přítomné v každém z uvedených kontejnerů a kde uvedený krok (a3) obsahuje (i) excitaci uvedené molekuly fluorescenční sondy v každém z uvedených kontejnerů světlem a (ii) měření fluorescence v každém z uvedených kontejnerů.13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedený krok (a3)(ii) dále zahrnuje měření fluorescence v každém z uvedených kontejnerů postupně vždy jen v jednom kontejneru současně.Způsob podle nároku 12, v y z n a č u j í c í s e tím, ž e uvedený krok (a3) (ii) dále zahrnuj e současné měření fluorescence v sub-sadě uvedených kontejnerů Způsob podle nároku 12, v y z n a č u j í c í s e tím, ž e uvedený krok (a3) (ii) dále zahrnuje současné měření fluorescence v každém z uvedených kontejnerů Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í s e t í m, ž e uvedený krok (a3) z :ahrnuje: excitaci tryptofanových zbytků v uvedeném proteinu v každém z uvedených kontejnerů světlem a (ii) měření fluorescence v každém z uvedených kontejnerů.17.Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že uvedených několik kontejnerů v kroku (al) obsahuje na mikrotitrační destičce větší množství prohlubní.toto·· ·· toto ·· ·· ·· to·* ··· ···· • · · toto ··· · · · · ·· ··· ·· ··· ·· to ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ·· · ·18. Způsob funkční klasifikace proteinu, který je schopný se na základě termální změny rozvinout, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:a) testování schopnosti jedné nebo několika molekul z většího množství různých molekul, které jsou známy, že se váží na určitou třídu proteinů, posunout křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu, přičemž posun v křivce termálního rozvinuti proteinu indikuje, že molekula se váže na protein,b) vytvoření spektra aktivity uvedeného proteinu na základě testování popsaného v kroku a), kde uvedené spektrum aktivity odráží sub-sadu molekul z uvedeného většího množství různých molekul, které posouvají křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu a proto jsou ligandy, který se váží na protein ac) klasifikace uvedeného proteinu jako člena uvedené třídy proteinů, jestliže uvedená jedna nebo několik molekul z uvedeného většího množství různých molekul posouvá křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu.19. Způsob podle nároku 18, kde uvedené testování pospané v kroku a)sevyznačuje tím, že zahrnuje:al) kontakt uvedeného proteinu s jednou nebo několika molekulami z uvedeného většího množství různých molekul v každém z několika kontejnerů, a2) zahřátí uvedených kontejnerů popsaných v kroku al), a3) měření fyzikální změny v každém z uvedených kontejnerů, která je spojená s termálním rozvinutím uvedené cílové molekuly následkem uvedeného zahřátí, a4) vytvoření křivky termálního rozvinutí pro uvedenou cílovou molekulu jako funkci teploty v případě každého z uvedených kontejnerů, a a5) porovnání každé z uvedených křivek rozvinutí v kroku a4)1) s každou z uvedených jiných křivek termálního rozvinutí a 2) s křivkou termálního rozvinutí získanou pro uvedený9 9999 9 « » 9999 99 ' 9 9 4 » 9 9 <protein v nepřítomnosti libovolné molekuly z uvedeného většího množství různých molekul a a6) stanovení, zda libovolná z uvedeného většího množství různých molekul posune křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu.20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený srovnávací krok (a5) zahrnuje rozdělení uvedených molekul v uvedeném větším molekul pro uvedený protein podle z uvedeného většího množství různých křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu.21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že v uvedeném kroku zahřátí (a2) se uvedené kontejnery zahřívají současně.22. Způsob podle nároku 19, ž e uvedený krok (a4) množství různých schopnosti každé molekul posunout tím, teploty středu (Tm) uvedený krok (a5) vyznačující se dále zahrnuje stanovení z křivky termálního rozvinutí a kde dále zahrnuje porovnáníTn každé z uvedených křivek v kroku (a4) 1) s Tm každé z uvedených - 2) jiných křivek termálního rozvinutí termálního rozvinutí získané pro cílový protein, přičemž není přítomna žádná z uvedených různých molekul.23. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený krok (a3) zahrnuje měření absorbance světla uvedeným obsahem každého z uvedených kontejnerů.24. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený krok (al) zahrnuje kontakt uvedeného proteinu s molekulou fluorescenční sondy přítomné v každém z uvedených kontejnerů a kde uvedený krok (a3) obsahuje (i) excitaci uvedené molekuly fluorescenční sondy v každém z uvedených kontejnerů světlem a (ii) měření fluorescence v každém z uvedených kontejnerů.25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený krok (a3)(ii) dále obsahuje měření s křivky ;s WWW-OfXVtfΛΛίν.ί·'.·\ i ···· ·« ·· ·· » · · » * »*♦ t9 99 9 9 9 > ftft ·99 9999 99 fluorescence v každém z uvedených kontejnerů vždy v jednom kontejneru současně.26. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený krok (a3) (ii) dále zahrnuje současné měření fluorescence z podsady uvedených kontejnerů.27. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený krok (a3) (ii) dále zahrnuje současné měření fluorescence v každém.z uvedených kontejnerů.28. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený krok (a3) dále zahrnuje:(i) , excitaci tryptofanových zbytků v uvedeném proteinu v každém z uvedených kontejnerů světlem a (ii) měření fluorescence v každém z uvedených kontejnerů.29. Způsob podle nároku 18, tím, že uvedených několik obsahuje . na mikrotitrační prohlubní.30. Způsob funkční klasifikace proteinu schopného se rozvinout na základě termální změny, vyznačující se tím, že zahrnuje klasifikaci uvedeného proteinu podle sady molekul ve větším množství různých molekul, které posunou křivku termálního rozvinutí uvedeného proteinu.vyznačující se kontejnerů v kroku (al) destičce větší množství
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ20001776A CZ20001776A3 (cs) | 1998-11-12 | 1998-11-12 | Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ20001776A CZ20001776A3 (cs) | 1998-11-12 | 1998-11-12 | Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20001776A3 true CZ20001776A3 (cs) | 2000-11-15 |
Family
ID=5470646
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20001776A CZ20001776A3 (cs) | 1998-11-12 | 1998-11-12 | Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ20001776A3 (cs) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4040137A1 (de) * | 2015-10-01 | 2022-08-10 | NanoTemper Technologies GmbH | System und verfahren zur optischen messung der stabilität und aggregation von teilchen |
-
1998
- 1998-11-12 CZ CZ20001776A patent/CZ20001776A3/cs unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP4040137A1 (de) * | 2015-10-01 | 2022-08-10 | NanoTemper Technologies GmbH | System und verfahren zur optischen messung der stabilität und aggregation von teilchen |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7122321B2 (en) | High throughput method for functionally classifying proteins identified using a genomics approach | |
US6291191B1 (en) | Microplate thermal shift assay for ligand development and multi-variable protein chemistry optimization | |
US6569631B1 (en) | Microplate thermal shift assay for ligand development using 5-(4″dimethylaminophenyl)-2-(4′-phenyl)oxazole derivative fluorescent dyes | |
Albanese et al. | An open library of human kinase domain constructs for automated bacterial expression | |
Stout et al. | High-throughput structural biology in drug discovery: protein kinases | |
Henriques et al. | A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry | |
Chakraborty et al. | Profiling of the drug resistance of thousands of Src tyrosine kinase mutants uncovers a regulatory network that couples autoinhibition to catalytic domain dynamics | |
CZ20001776A3 (cs) | Metoda s vysokou prostupností pro funkční klasifikaci proteinů identifikovaných s použitím přístupu strukturní organizace genomu | |
Galletto et al. | Global conformation of the Escherichia coli replication factor DnaC protein in absence and presence of nucleotide cofactors | |
Bogomolovas et al. | Production and analysis of titin kinase: Exploiting active/inactive kinase homologs in pseudokinase validation | |
NZ521789A (en) | Functional probe library and apparatus for identifying the previously unidentified biological function of target proteins | |
Webb et al. | Rapid discovery of drug target engagement by isothermal shift assay | |
MXPA00004638A (en) | High throughput method for functionally classifying proteins identified using a genomics approach | |
Maryu et al. | Nuclear-cytoplasmic compartmentalization promotes robust timing of mitotic events by cyclin B1-Cdk1 | |
Lindberg et al. | Inhibitor screening of proprotein convertases using positional scanning libraries | |
MXPA98009291A (en) | Proof of thermal change in microplates and apparatus for developing ligands and chemical optimization multivariable protei |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |