CZ18920U1 - Univerzální preparát ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a léčbě Uymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití - Google Patents

Description

Univerzální preparát ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a léčbě Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití

Oblast techniky

Technické řešení se týká složení univerzálního preparátu ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a léčbě Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití.

Dosavadní stav techniky

Lymeská borelióza je chronické multisystémové infekční onemocnění, které je nejčastějším infekčním onemocněním přenášeným členovci (arthropod bom) a to v Evropě i ve Spojených státech. O významu tohoto onemocnění svědčí četnost publikaci v časopisech zabývajících se inio fckční problematikou. Z tohoto pohledu je v poslední dekádě borelióza svým významem zařazována za syndrom získané imunodeficience, jak je popsáno např. v článku The biological and sociál phenomenon of Lyme disease (Barhour AG, Fish D, Science. 1993 Jun 11 :260 (5114): 1610-6).

Onemocnění je vyvolané skupinou spirochet souhrnně označovaných jako Borrelia burgdorferi sensu lato. Tato skupina mikroorganismů je tvořena zejména třemi blízce příbuznými subspecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia gariníi. Zatímco Borrelia burgdorferi sensu stncto je příčinou prakticky všech onemocnění Lymcskou boreliózou na severoamerickém kontinentu, v Evropě převládají Borrelia gariníi a Borrelia afzelii.

Závažné poškození savčího hostitelského organismu, stejně jako problémy spojené s diagnostiko kou i terapií Lymeské boreliózy jsou významným stimulem pro vývoj efektivních vakcinačních preparátů. Na druhé straně existují i výhrady k vývoji vakcín a jejich použití zejména u lidí. Jde především o to, že onemocnění není 1 přenosné z člověka na člověka, je relativně snadno léčitelné antibiotiky a klinická manifestace se závažnými důsledky postihuje pouze část infikovaných pacientů. Navíc je toto onemocnění velmi zřídka fatální. Na místě je proto obava z případných vedlejších účinků nové vakcíny, které by za těchto okolností byly velmi těžko přijatelné, jak je popsáno ve stati Experimental immunization against Lyme borreliosis with recombinant Osp proteins: an overview (Sadziene A, Barbour AG., Infecúon. 1996 Mar-Apr;24(2): 195-202),

První veterinární vakcína proti borelióze byla vyvinuta ve Spojených státech v r. 1990 pro psy. Licencována byla v r. 1992, jak je známo z článků Performance pfa Borrelia burgdorferi bacte30 rin in borreliosis-endemic areas (Levý NT, Lissman BA, Fieke CM., J Am Vet Med Assoe. / 993 Jun 1;202(11):1834-8.) nebo Immunization against Lyme disease? (Wormser, GP., Ann Intern Med 123,627-629, 1995).

Vakcína je celobuněčná, chemicky inaktivovaná, aplikovaná s vehikulem obsahujícím polymerové adjuvantní látky. Vakcína je aplikována intramuskulámě dvakrát v intervalu dvou až tri týdnů.

Po roce je doporučena udržovací dávka (booster). Vakcinace domácích zvířat, zejména psů je doporučena bez ohledu na to, zda zvíře bylo infikováno, případně u něho probíhá onemocnění. Příprava této vakcíny vycházela z poznatků získaných v pokusech na hlodavcích. Protektivní efekt celobuněčné vakcíny byl poprvé popsán u křečků.

Vývoj celobuněčné vakcíny pro veterinární účely byl podporován především jednoduchostí pří40 pravý a také nízkou cenou. Tato vakcína však nebyla doporučena pro humánní použití s ohledem na skutečnost, že některé antigeny borelií zkříženě reagují s lidskými antigeny a nelze proto vyloučit indukci imunopatologických procesů, jak je popsáno ve statích Molecular mtmiery and Lyme borreliosis: a shared antigenic determinant be tween Borrelia burgdorferi and human tissue (Aberer E et al., Ann Neuroíl989 Dec; 26(6):732-7) nebo Sérologie response to the Bor45 relia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope eommon to a neuroblastoma cell line. (Fikrig et al. 1993, Proč Nat Acad Se i U S A. 1993 Jan 1:90(1):183-7).

Určitým varováním bylo např. zjištění, že některé antigeny Borrelia burgdorferi aktivují sety specifických T lymfocytů, které se podílely na rozvoji arthritidy u křečků, což je popsáno v

- I LZ teVZU Ul článku bivolvement ofCD4+ T lymphocytes in induction of severe deslructive Lyme arthritis in inhred LSII hamsters (Lim LC et al., Infect Immun. 1995 Dec; 63(12):4818-25).

Králíci jsou chráněni proti infekci, pokud je imunní sérum připravené imunizací zvířat imunogcnními proteiny boreliózového kmene aplikováno před experimentální čelenží. Podání imunního séra po infekci nebrání rozvoji erythema migrans a viscerálním projevům infekce. Podobné výsledky byly zjištěny také u myší a křečků a popsány v Serum-mediated resolution of Lyme arthritis in mice” (Barthold SW et al, Lab. hivest.l996,Jan:74(l ):57-67) nebo Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi (Barthold SW et al., Clin Infect Dis 1997 Jul; 25 Suppl 1:S9-17.) nebo Expenmenial infection of the hamster with

Borrelia Burgdorferi (Johnson RC et al., Ann Acad Sci. 1988; 539:258-63).

Těmito experimentálními poznatky byla naznačena možnost vývoje bezpečné subjednotkové vakeíny. Hlavními kandidátními antigeny pro takovou vakcínu se staly vnější povrchové proteiny (outer surface proteins Osp) označované jako OspA, B, CaD. Intenzívně byl studován zejména protein OspA. Protektivní efekt této subjednotkové vakeíny byl potvrzen experimentálně u myší, křečků a králíků a popsán v článcích Protection ofmice against the Lyme disease agent by immtirtizing with recombinant OspA (Firking E et al., Science 1990 Oct 26; 250(4980):553-6) nebo Long-term protection of mice from Lyme disease by vaccination with OspA (Firking E et al., Infect immun. 1992 Mar; 60(3):773-7). Laboratorní testy potvrdily, že aplikace tohoto proteinu ve formě purifikovaného, lipidovaného rekombinantního proteinu indukuje protektivní imunitu při parenterálním podání a chrání proti infekci borreliemí podanými nejen injekční cestou, ale též s pomocí klíštěcího vektoru. Potvrdilo se také, že infekční klíšťata sající na takto imunizovaných zvířatech ztrácejí svou inťekciozitu, což je popsáno v Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine (Keller D et al.,. JAMA. 1994 Jun 8:271(22): 1764-8) nebo Elimination of Borrelia burgdorferi from vector tieksfeeding on OspA25 immunized mice (Firking E et ak.Proc Nati Acad Sci CSA. 1992 Jun i5;89(12):5418-21).

V nepřítomnosti lipidové jednotky vyžaduje indukce tvorby protilátek adjuvantni efekt Freundova kompletního adjuvans, nebo jiného imunitního adjuvans, jak je popsáno ve stati Role of attaehed lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA (Erdile 1F et al., Infect Immun. 1993 Jan;6I(l);81-90). To naznačuje dvojí možný efekt vakcinaee:

.ίο (1) spirochetyjsou inaktivovány již v organismu klíštěte a je tak zabráněno transmisi infekce, (2) spirochety mohou být inaktivovány krátce po vstupu do hostitelského organismu ještě před antigenní variací a útlumem exprese antigenu OspA.

K verifikaci protektivního efektu antigenu OspA byly připraveny dva různé konstrukty a vakcinační formule:

1. Nativní a čistý rekombinantní OspA, popsaný v Recombinant outer surface protein a from

Borrelia burgdorferi induces antibodics protective against spirochetal infection in mice (Simon MM et aí,.J Infect Dis. 1991 Jul; 164(1): 123-32)

2. OspA inkorporovaný do genomu BCG (Calmette, Guérin). OspA se exprimoval jako membránově asociovaný lipoprotein, což je známo z článku Protective immunity elicited by rBCG vac40 cines (Stover CK et al., Dev Biol Stand. 1994;82:163-70). V této formě byl testován pri intrapentoneální aplikaci a také při intranasálním podání, jak je publikováno v Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorferi (Langermann S et al, Nátuře. 1994 Dec 8;372(6506):552-5). Pri této formě aplikace byly dlouhodobě indukovány specifické IgG i ígA protilátky, což je patrné z článku Protective immunity elicited by recombinant hacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: a candidate Lyme disease vaccine (Stover CK et al., J Exp Med. 1993 Jul l; 178(1): 197-209).

V současné době jsou jediným producentem takové vakeíny pro humánní použití Spojené státy americké. Vakcína byla schválena Food and Drug Administration (FDA) 21. 12 1998 a je popsá50 na ve studii Vaccination against Lyme disease with recombinant Borrelia burgdorferi outersurface lipoprotein A with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group (Steere AC et al., N

CZ 18920 Ul

EnglJ Med. 1998 Jul 23;339(4):209-l5). Jde o výrobek LYMErix firmy SmithKline Beecham. Podle třetí fáze klinických zkoušek poskytuje vakeína 80 až 90% ochranu, jak je prokazováno ve stati A vaccine consisting oj recombinant Borrelia burgdorferi outersurface protein A to prevent Lyme disease. Recombinant Outer-Surface Protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium (Sigal LH et al., N Engl J Med. /998 Jul 23;339(4):216-22. Erratum in: N Engl J Med 1998 Aug 20; 339(8): 571),

I když je vakeína již v distribuci, je pod permanentní kontrolou s ohledem na minimum znalostí o dlouhodobém použití tohoto preparátu. Vakeína je aplikována injekčně třikrát v průběhu 12 měsíční periody (0, 1, 12) pro dosažení maxima imunitní odpovědi. Efektivnost vakcíny popisuje ío např. Wahlberg, který uvádí, že po dvou dávkách rekombinantního OspA proteinu vázaného na aluminium hydroxid ve fosfátovém pufru byla účinnost vakcíny 50 % (1 rok), po třech vakcinaěnich dávkách (20 měsíců) byla účinnost 79 %. Protilátkový titr klesal poměrně rychle a po dvou letech byl na úrovni prvního roku vakcinace (efektivnost 50 %). Detaily o „booster“ efektu nejsou k dispozici. Doposud není povoleno aplikovat vakcínu dětem pod 15 let a lidem trpícím autoimunitním onemocněním, zejména artritidou. V souboru 5765 vakcinovaných jedinců se u dvou osob s fenotypem HLA-DR4 vyvinula arthritida, jak bylo zveřejněno v článku Guarded endorsement for Lyme disease vaccine” (Marwick C, JAM A. 1998 Jun 24; 279(24): 1937-8).

Komerčně dostupná vakeína je připravena z proteinu OspA z Borrelia burgdorferi sensu stricto. Vzhledem k tomu. že tato bakterie je dominantním infekčním původcem Lymeské boreliózy na severoamerickém kontinentu, může být vakeína relativně efektivní pro obyvatelstvo USA. V evropských podmínkách však toto onemocnění vyvolávají zejména tri patogenní subspecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. U všech těchto kmenů je na evropském kontinentu popsána antigenní variabilita. V evropských podmínkách je proto vakeína připravená pouze z kmene Borrelia burgdorferi sensu stricto pro humánní i veterinární použití nepoužitelná. Pri vývoji účinné formy vakcíny byly využity i nové trendy ve vakcinaěníeh technologiích, kde například účinná DNA vakeína je publikována ve statích Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promotér” (Simon MM et al., Eur J Immunol. 1996 Dec;26(12):283I-40) nebo ”DNA vaccines expressing a fusion product o f outer surface proteins

A and C from Borrelia burgdorferi induce protective antihodies suitablefor prophylaxis but not for resolution ofLyme disease” (Waltich R. et al.,. Infect Immun. 2001 Apr;69(4):2130-6).

Jiným možným východiskem je připravit vakcínu z proteinu OspC, který je exprimován na povrchu mikroorganismů v těle hostitele a podle literárních dokladů má humorální imunita proti tomuto proteinu protektivní charakter, jak je popsáno v Protective immunization with plasmid

DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent ofan eukaryotic promotér” (Simon MM et al., Eur. J, Immunol. 26, 283U2840, 1996).

OspC je hlavním membránovým antigenem vyjádřeným v časné fázi infekce, U Borrelia burgdorferi sensu stricto je OspC vysoce variabilní. Epidemiologickou analýzou a sekvenováním genů pro OspC u jednotlivých izolátu a doplněním s GeneBank bylo pro tento antigen zjištěno 21 alelických skupin označovaných A-U, jak je popisováno v Four dones of Borrelia burgdorferi sensu stricto čase invasive infection in humans” (Seinost G et al., Infect. Immun, 67, 3518-3524, 1999).

Vnější povrchový antigen A (OspA) je hlavním povrchovým antigenem, který je exprimován, když je Borrelia burgdorferi rezidentní v klíštěti. V okamžiku, kdy klíště začne nasávat krev na savcích, je syntéza tohoto antigenu reprimována a naopak je indukována syntéza antigenu OspC. Takto se OspC stává hlavním antigenem vnější povrchové membrány v časné fázi infekce, což je popsáno například v Induction of an outer surface protein of Borrelia burgdorferi during tiek feeding” (Schwan TG et al., Proč, Nati. Acad. Sci. USA 92, 2909-2913. 1995). I když bylo prokázáno, že OspC má limitovanou povrchovou expozici, je potentním imunogenem. Imunizace

OspC je protektivní proti boreliové infekci. Ochrana je však vázána na konkrétní alelu OspC, která kontroluje syntézu konkrétního proteinu, infekce jiným typem borelie vede u těchto imuni- j cl ι»9ζυ υι zovaných jedinců k onemocnění. To samozřejmé limituje použití tohoto antigenu získaného pouze z jedné genomospecies borrelií pro přípravu univerzální vakciny.

Otázka úspěšné vakcinace proti Lymeské boretióze zůstává tedy otevřenou otázkou. V Evropě je navíc komplikována existencí tří různých genomospecies (Borrelia burgdorferi sensu stricto,

Borrelia aťzelíi a Borrelia garinii) a onemocněním Lymeskou boreliózou vedle člověka i u různých druhů domácích a hospodářských zvířat. Problematikou onemocnění u psu a koček se věnuje stať Canine borreliosis” fLittman MP, Vet Clin Smáli Anim 33, 2003, 827-862) a u koní Eguine Abortion Associated with the Borrelia parker i- B. turicatae Tick-Borne Relapsing Fever Spirochete Group (Walker RL et al., Journal vfCIinical Microbiology, 2002, 40, 4, 1558-1562).

io O možnost překonat tyto problémy přípravou tzv. „kokteilových vakcín“ se pokusili např. Livey et al., a své výsledky publikovali ve stati OspC vaccine candidate” (Abstract ofthe Symposium on the Pathogenesis and Management ofTick-borne Diseases. 1998 Sept. 28-30, Vienna, Austria. 1998).

Se stávajícími problémy s diagnostikou a léčbou Lymeské boreliózy a vzhledem k nemožnosti t5 účinně kontrolovat a snižovat rozšíření vektorů borrelií, naléhavě vyvstala potřeba vakciny schopné účinně imunizovat vnímavé druhy domácích a hospodářských zvířat i lidí proti infekci

Borrelia burgdorferi sensu lato. Byly vyvinuty vakciny na bázi celobuněčného baktennu Borrelia burgdorferi pro použití u domácích zvířat, popsané např. v patentech US 4721617, US 6316005. Byly vyvinuty i vakciny založené na obsahu proteinu OspA, OspC či dalších povrchových (outer suríáce proteins) imunogenních proteinů, izolovaných z kultivovaných kultur borrelií, exprimovaných jako rekombínantní proteiny v různých hostitelích (E. coli), nebo připravených synteticky, z nichž jako příklady je možno uvést spisy WO 94/25596, WO 96/05313, WO 97/49812, US 6716574, US 2004067517, US 6676942, WO 02/16422, US 5530103, US 6486130, US 6464985, EP 633028).

Tyto celobuněčné nebo subjednotkové vakciny však nezahrnují ochranu proti celé šíři patogenních borelií všech genomospecies, tedy zejména Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii a případně dalších. Jsou odvozeny vždy pouze z jedné genomospecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto. Dále při použití těchto preparátů zůstává riziko indukce nežádoucích imunopatologických procesů.

Úkolem technického řešení je představit nový univerzální prostředek, který obsahuje hlavní imunogenní proteiny OspA a OspC v různé kombinaci minimálně jednoho, dvou, s výhodou všech tří nej známějších patogenních genomospecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii a případně dalších, může být úspěšně aplikovatelný bez teritoriálního omezení, a to včetně způsobu per os (orálně, ústy), což vylučuje indukci imunopatologických procesů při tomto způsobu podání.

Podstata technického řešení

Uvedeného cíle je dosaženo technickým řešením, kterým je univerzální preparát ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a léčbě Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, vytvořený na bázi celobuněčných bakterinů nebo bakteriálních lyzátů nebo bakteriálních purifi4o katů v tekuté podobě nebo jako lyofilizátů alespoň jedné nebo více genomospecies patogenních borelií, kde podstata vynálezu spočívá v tom, že každá z genomospecies borelií, vybraných přednostně ze skupiny Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinti, obsahuje jednak minimálně jeden imunogenní protekuvní protein vnější membrány, buď OspA nebo OspC, nebo současně oba imunogenní protektivní proteiny OspA a OspC, popřípadně obsahuje i další imunogenní protektivní proteiny vnější membrány, a jednak celobuněčný bakterin nebo bakteriální lyzát nebo bakteriální purifikát v tekuté nebo lyofilizované podobě vybraného imunomodulačního kmene Propionibacterium acnes nebo jiného bakteriálního imunomodulačního kmene.

Ve výhodném provedení preparát obsahuje bakteriální lyzáty všech tři nej patogennější genomo50 species Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, z nichž každý obsa_ Λ _

CZ 18920 Ul huje současně oba imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC, a zároveň obsahuje bakteriální lyzát bakteriálního imunomodulačního kmene Propionibaeterium acnes.

Další podstatou technického řešení je, že v optimálním případě jsou imunogenní protektivní proteiny vnější membrány kmenů Borrelia burgdorťeri sensu stncto, Borreha afzelii a Borrelia gari5 mi OspA a OspC ve vakcíné obsaženy s výhodou v poměru 8 : 1 : 1 až 1 : 1 : 1,

Rovněž je výhodné, když lyofilizovanc bakteriální lyzáty kmenů Borrelia burgdorťeri sensu stncto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii jsou ve vzájemném poměru 1:1:1a poměr směsi lyofílizovaných bakteriálních lyzátů kmenů Borrelia burgdorťeri sensu stncto, Borrelia afzelii a Borrelia gannii k bakteriálnímu lyzátu kmene Propionibaeterium acnes je v poměru 9 : 1 až 1 : 1 ío a celkový obsah sušiny lyofilizátů všech kmenů v jedné aplikační dávce je 1 až 1000 mg.

Také je podstatou technického řešení, že preparát je vytvořen v lyofilizované ěi tekuté formě a je aplikován v pufrovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, případně dalšími imunomodulátory přírodního ěi syntetického charakteru ěi dalšími pomocnými látkami, s výhodou vehiculem, přičemž imunomodulátory přírodního charakteru jsou vybrány ze skupiny bakteriálních imunomodulátoru nebo glukanů nebo minerálních prvků a pH preparátu se pohybuje v rozmezí hodnot 4 až 9.

Předkládaným technickým řešením se dosahuje nového účinku v tom, že po aplikací, včetně orální aplikace, dochází u vakcinovaných zvířat či člověka k tvorbě specifických OspA a OspC protilátek, které zabraňují přestupu patogenních borelií z klíštěte do vakcinovaného organismu zo (OspA protilátky) a napomáhají jejich destrukcí krátce po případném přestupu patogenních borelií do vakcinovaného organismu (OspC protilátky) a případně k tvorbě dalších blíže nedefinovaných postvakcinaěních protektivních protilátek a stimulaci imunitních mechanismů. Dalším přínosem je, že kromě běžných dospělých jedinců je preparát možno aplikovat mláďatům domácích zvířat (přednostně psi a kočky) a mláďatům hospodářských zvířat (přednostně koně) od 3 týdnů jejich věku k navození aktivní protektivní imunity proti Lymeské borelióze. Rovněž je možno preparát současně aplikovat s jinými přípravky, léčivy a vakeínami proti virovým, bakteriálním, mykotickým a jiným onemocněním psu, koček, koní a jiných druhů zvířat, pro které je preparát určen a jinými přípravky, léčivy a vakeínami pro humánní použití při humánním použití preparátu. Dalším přínosem technického řešení je, že kromě běžných způsobů aplikace (vnitrosvalově (intramuskulámě), podkožně (subkutánně), vnitrokožnč (intradermálně), bezjehelně (transkutánnč), na pokožku a kůži (kutánně) je možno preparát aplikovat orálně (ústy) k navození aktivní protektivní imunity proti Lymeské borelióze. Užití aplikace preparátu orálně (ústy) vylučuje vyvolání nežádoucích imunopatologických procesů.

Příklady provedení technického řešení

Příklad 1

Tento příklad provedení demonstruje ověření protektivity univerzálního preparátu po orální imunizaci pokusných psů vůči čelenži virulentními kmeny Borrelia burgdorferi sensu lato, v žádném případě však neomezuje práva vztahující se k tomuto technickému řešení.

Příprava pokusného vzorku preparátu a výsledky testací:

A) Kultivace výrobních kmenů borelií za účelem exprese antigenu OspA:

Při kultivaci výrobních kmenů borrelií za účelem exprese antigenu OspA, byla jako výchozí surovina použita jedna z položek

- Médium BSK - H + králičí sérum

- Médium BSK - II completc a výrobní kmeny Borrelia afzelii, Borrelia garinii a Borrelia burgdorferi sensu strieto podle následné znázorněného schematického výrobního postupu:

-5CZ 18920 Ul

Příprava kultivační půdy

Výrobní kmeny

Kontrola růstu a čistoty

Oživení

Inaktivace jednotlivých kmenů

Kontrola růstu a čistoty Stanovení počtu Stanovení přítomnosti OspA

Zkouška inaktivace

Koncentrace, puriťikace antigenů

Stanovení nepřítomnosti séra

Příprava lyzátu

Lyofilizace

Poznámka: Každý kmen borelií (Borrelia afzelii, garinii a burgdorferi sensu stricto) se kultivuje, kontroluje, inaktivuje, lyofilizuje a testuje zvlášť až do stavu smísení všech kmenů (včetně kmenů s expresí antigenů OspC).

Vlastní kultivace se prováděla v plastových nebo skleněných Roux láhvích určených ke kultivaci kultur borelií, když kultivační médium BSK se před vlastní kultivací obohatí 6 % sterilního králičího séra vhodného pro kultivaci borelií, popř. lze použít přímo kompletní BSK-H médium s obsahem 6 % králičího séra. Matečné i pracovní výrobní kmeny jsou udržovány v zamraženém ío stavu při teplotě -196 °C v tekutém dusíku,

Při oživování kultury se ampule s kulturou vyjme z tekutého dusíku a rozmrazí se při teplotě cca 30 °C. Ihned po rozpuštění se inokuluje do zkumavky s živným médiem vytemperovaným na teplotu cca 28 ^ŮC v poměru 1 + 9 (1 díl kultury + 9 dílů média). Každý kmen se kultivuje samostatně inkubace probíhá při teplotě 26 až 35 °C po dobu 6 až 18 dní.

i5 Při pomnožování kultury se dobře narostlá, životaschopná kultura (mění barvu kultivačního média z červené na žlutou) po mikroskopické kontrole za aseptických podmínek inokuluje do živného média v poměru 1 díl kultury + 9 dílů média. Kultivace probíhá 6 až 10 dnů při teplotě 26 až 35 °C. Další subpasáže dobře narostlých borelií se provádí v poměru 1 díl násady : 10 až 100 dílům kultivačního média. Počet dalších subpasáží je závislý na požadovaném objemu borelií pro přípravu preparátu.

Při produkci kultury pro výrobu preparátu se narostlé kultury z předchozích kultivací za aseptických podmínek použijí jako inokulum do živné půdy v 1000 ml lahvích v poměru 1 díl násady : 10 až 100 dílům kultivačního média. Kultivace probíhá 6 až 10 dnů při teplotě 26 až 35 °C.

Stanovení počtu borelií se provádí v temném poli mikroskopu pomocí PETROFF HAUSSER

COUNTING CHAMBER.

Během procesu se prováděj í mezioperační kontroly růstu a čistoty kultury pomocí makroskopického vyšetření, mikroskopického vyšetření a kultivačního vyšetření, Makroskopické vyšetření spočívá ve vizuálním sledování, když vhodná kultura mění barvu kultivačního media z červené barvy do žluté a v mediu se vyskytuje sediment. Mikroskopické vyšetření v temném poli mikro30 skopu sleduje, zda jsou borelie přiměřeně pohyblivé s malým množstvím detritu, bez známek bakteriální kontaminace. Při kultivačním vyšetření se hodnocená kultura borelií přenese v množství 0,5 ml na předsušený krevní agar a kultivace probíhá při 35 až 37 °C po dobu 48 hod.

CZ 18920 Ul

Při posouzení zkoušky se sleduje přítomnost jakéhokoliv bakteriálního nárůstu, který je nežádoucí a kultury s bakteriální kontaminací se vyřadí.

Stanovení přítomnosti OspA se provádí se pomocí proteinové elektroťorézy na SDS PAGE po obarvení Coomasie Blue nebo imunodetekcí metodou Western Blot s použitím anti OspA séra.

B) Kultivace výrobních kmenů borelií za účelem exprese antigenu OspC:

Při přípravě kultivace se použijí stejné suroviny a stejné výrobní kmeny a postupuje se dle stejného schematického výrobního postupu jako u exprese antigenu OspA popsaného ad A),

Rovněž vlastní kultivace probíhá ve stejném procesu s tím rozdílem, že při oživování kultury se ampule s kulturou po rozpuštění inokuluje do zkumavky s živným médiem vytemperovaným na teplotu cca 37 °C v poměru 1 + 9 (1 díl kultury + 9 dílů média) a inkubace probíhá pri teplotě 36 až 38 °C po dobu 6 až 18 dní. Rovněž pomnožování kultury probíhá analogicky s tím rozdílem, že kultivace probíhá 6 až 10 dnů pri teplotě 36 až 38 °C. Identicky s popisem v ad A) se provádí produkce kultury pro výrobu vakcíny, stanovení počtu borelií, mezioperační kontroly, kontrola růstu a čistoty kultury a stanovení přítomnosti OspC,

C) Kultivace výrobního kmene Propionibacterium acnes:

Tento proces probíhá v několika krocích:

a) Kultivace

Kmen se uchovává v lyofílizovaném stavu. Lyofilizát v ampuli se rehydratuje, naočkuje se na Petriho misky s předsušeným médiem Reinforced Clostridial agar (VL agar). Následuje kultivace v anaerobním prostředí pri teplotě 35 až 39 °C po dobu 48 hodin.

b) Extrakce

Extrakce probíhá pri teplotě 2 až 8 °C po dobu 22 až 26 hodin.

c) Koncentrace a purifikace antigenu

Koncentrace a purifikace probíhá metodou ultrafiltrace pres kazetu o porezité 300 kDa.

d) Inaktivace

Puntíkovaný retentát se umístí do vodní lázně, vyhřáté na teplotu 56 až 62 °C a následuje inaktivace po dobu 60 minut. Po vyjmutí z lázně se lahve umístí pri tepote 2 až 8 °C do druhého dne. Následuje znovu zahřátí na teplotu 56 až 62 °C. Tato inaktivace se provede opakovaně 3x. e) Lyofilizace

Po ukončení lyofilizace se obsah jednotlivých lahví sesype a důkladně zhomogenizuje. Odeberou se vzorky pro stanovení zbytkové vlhkosti a lyofilizát se uchovává ve vzduchotěsně uzavřené nádobě v suchu a temnu při teplotě 2 až 8 °C.

D) Vlastní příprava finální podoby preparátu:

Všechny lyofilizáty jednotlivých výrobních vakcinačních kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto lysatum cryodesiccatum, Borrelia garínii lysatum cryodesiccatum, Borrelia afzelii lysatum cryodesiccatum a Propionibacterium acnes lysatum cryodesiccatum se smíchají tak, aby zastoupení jednotlivých lyofilizátů bakteriálních lyzátů kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto lysatum cryodesiccatum, Borrelia garinii lysatum cryodesiccatum, Borrelia afzelii lysatum cryodesiccatum bylo rovnocenné (1 : 1 : 1) a poměr směsi lyofilizátů bakteriálních lyzátů Borrelia burg40 dorferi sensu stricto lysatum cryodesiccatum, Borrelia garinii lysatum cryodesiccatum, Borrelia afzelii lysatum cryodesiccatum k lyofilizátů bakteriálního lyzátů Propionibacterium acnes lysatum cryodesiccatum byl 1 : 1 a celkový objem sušiny všech 4 kmenů ve finálním produktu byl 5 mg v jedné kapsli (tj. jedné aplikační dávce). Všechny lyofilizáty bakteriálních lyzátů se mísí s pomocnými látkami (vehikulem) tak, že k 5 mg účinných látek se přidává 200 mg vehikula a jedna aplikační dávka v kapsli má celkem hmotnost 205 mg.

- 7 CZ 18920 Ul

E) Výsledky testací:

Zkouška účinnosti na psech:

Provedla se orální aplikace preparátu 6 psům pokusným vzorkem preparátu a za 90 dní po poslední aplikované dávce čelení prostřednictvím přirozeně infikovaných klíšťat obecných (Ixodes ricinus) genomospeciemi borelií, a to Borrelia burgdortéri sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. včetně infekce 3 psu, kterým preparát nebyl aplikován, kontrolním psům.Aplikace preparátu byla zabezpečena kapslemi per os (orálně) po dobu 10 dní, poté následovala 20 denní přestávka, opětovná aplikace 10 dní, opět 20 denní přestávka a opět opakovaná aplikace po dobu 10 dní.

io Před aplikací preparátu byl proveden odběr krve, Za 3 měsíce po aplikaci preparátu byla provedena čelenž prostřednictvím klíšťat obecných (ixodes ricinus) z přírodního sběru, která byla přirozeně infikována všemi třemi nejpatogenéjšími genomospecies - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. Stupeň infekce klíšťat byl ověřen před zahájením čelenžního experimentu.

i? Po infekci byli všichni pokusní psi denně klinicky hodnoceni a byl zaznamenáván jejich zdravotní stav, včetně měření tělesné teploty, Po infekci byly provedeny probatomí odběry krve ode všech pokusných zvířat 14. den, 28. den, 42. den a 60. den. Krev byla odebrána i v den čelenže, těsně před infekcí prostřednictvím klíšťat. 7., 28. a 60. den po čelenži byly provedeny biopsie kůže v místě přisátí klíšťat s cílem reizolace borelií z těchto vzorků. 60. den po čelenži byla

2o všechna pokusná zvířata utracena a byla provedena patologicko - anatomická pitva s odběrem vzorků ze svalu, kloubní synovie, mízní uzliny, kůže a ledviny, s cílem reizolace borelií z těchto predilekčních míst.

Dosažené výsledky jsou názorně presentovány v přehledných tabulkách č. 1, 2, 3 a 4. Z dosažených výsledků jednoznačně vyplývá, že preparát proti borelióze připravený z výrobních kmenů

Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii exprimujících povrchové proteiny OspA a OspC a imunomodulačního kmene Propionibactenum aenes je pro psy neškodný a vyvolává u nich po orální aplikací aktivní protektivní imunitu vůči přirozené infekci prostřednictvím infikovaných klíšťat obecných všemi třemi nejpatogenějšími genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii a z důvodu principu křížové imu30 nity případně i vůči dalším známým genomospecies borelií.

Tabulka č. 1 - Schéma čelenžního pokusu

Pesč.	Imunizace 1	Čelenž 1	Odběry biologického materiálu po čelenži/dny	Poznámka
7 !	14	28	35	42 ,	49	56 60
IV	+	+	; b	K	BK	-	K	-	- BKP	Klinika - denně
2V :	+	+	B	K	BK	-	K	-	• , BKP	Klinika - denně ’
' 3V	+	+	B	K	! BK		K	-	: - BKP	Klinika - denně
4 V	+	-i-	B	: κ	BK	-	K	, - ί BKP	Klinika - denně i
5V	j +		1 B	K	í BK	-	K		| - [BKP	Klinika - denně 1
, 6V ’	1 +	1 T	1 B i	K	i BK	— )	K		1 - BKP	Klinika - denně 1
' 7KO	-	+	B i	K	i BK		K	--	Γ BKP	Klinika - denně
8KO	-	+	B	K	' BK	-	K	-	- I BKP	Klinika - denně
9KO			1 B i	K	I BK ;	-	K	1	1 - í BKP	Klinika - denně!

Vysvětlivky:

V - aplikace preparátu

KO - bez aplikace (kontrola) + - proveden úkon

- neproveden úkon

B - biopsie kůže

K - odběr krve

CZ 18920 Ul

P - patologicko-anatomická pitva. Tabulka č. 2 - Klinické hodnocení po čelenži

Pes c.	Klinické změny po čelenži - dny	56	60	Poznámka
7	' 14	21 ' 28 35 42	49
IV ’ -	—	- -	- 1	-	! -	Klinika - sledována denně
' 2 V ‘ -	—			-	-	Khmka - sledována denně .
3V ' -	-	1 - ' - - i		-	-	Klinika - sledována denně
4V~					1	Klinika - sledována denně
' 5V ' -	-	, _ _ - ' - .		-	-	Klinika - sledována denně 1
6V -	-	_____		-	-	Klinika - sledována denně
7KO ' -		-	T		' +	; Klinika - sledována denně ,
SKO	í _	: -	-	+		Klinika - sledována denně
9KO I -	-		_ 1		1 +	Klinika - sledována denně

Vysvětlivky:

+ - klinické příznaky

- bez klinických příznaků.

Tabulka č. 3 - Nález borelií v bioptátech kůže po čelenži

Pes ě. , _ Termín odběru bioptátů kůže - dny . Poznámka i ~ 7 28 í 60 1_

IV ~ j ” ~

2V___¹ ·

V ! - ’ í · ¹

ÓV___u -___7KO i ____ Í8KO I + | _ Í 9KO ’ + ~T +

Vysvětlivky:

ío + - pozitivní záchyt

- negativní záchyt.

Tabulka č. 4 - Nález borelií v orgánech

Pes ě. , Γ	Predilekění orgány (60. den - pitva) 1	Poznámka
sval i	kůže mízní uzlina kloubní synovie	ledvina |
				PA - neg.
2V i	- I	Τ' 1 ' _ 1 _ |		PA - neg. !
3V	1	1 i	1	PA - neg. 1
| 4 V !	-		-	PA - neg.
1 5V		1 I		PA - neg. ί
;6V |		i - !	-	PA - neg.
'7KO 1	-	- . + +_	i “ 1	PA - poz.
| 8KO	+ t	- , 9- í +		PA - poz.
9KO |		J:\i	PA - poz.

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt

- negativní záchyt

-9Cz. ίονΐΰ υΊ

PA - patologicko-anatomieká pitva.

Popsaný příklad složení, přípravy a použití preparátu nejsou jediným možným složením, provedením a použitím podle technického řešení, ale bez vlivu na jeho podstatu mohou být celobuněčné bakteriny nebo bakteriální lyzáty nebo purifikáty v tekuté podobě nebo jako lyofilizáty s obsas hem specifických a nespecifických imunogenních protektivních proteinů aplikovány v pufrovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, popřípadě s imunitními komplexy (1SCOM), liposómy a dalšími přírodními (bakteriální ímunomodulátory, glukany, minerální prvky aj.) ěi syntetickými imunitními adjutanty či dalšími pomocnými látkami, s výhodou vehikulem.

ío Průmyslová využitelnost

Univerzální preparát ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a léčbě Lymeské boreliózy je možno použít ve veterinární i humánní medicíně ěi jako doplněk stravy a je možno jej úspěšně aplikovat vnitrosvalově (intramuskulámě), podkožně (subkutánně), vnitrokožně (íntradermálně) nebo bezjehelně (transkutánně), ústy (orálně), na pokožku a kůži (kutánně) či jiným způsobem, vyvolávajícím aktivní protektivní imunitní odpověď organismu, kterému je preparát aplikován.

Claims (7)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Univerzální preparát ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a léčbě Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, vytvořený na bázi celobuněčných bakterinů nebo bakteriálních lyzátů nebo bakteriálních purifikátů v tekuté podobě nebo jako lyofilizátů alespoň
2. 2o jedné nebo více genomospecies patogenních borelií, vyznačující se tím, že každá z genomospecies borelií, vybraných přednostně ze skupiny Borrelía burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, obsahuje jednak minimálně jeden imunogenní protektivní protein vnější membrány, buď OspA nebo OspC, nebo současně oba imunogenní protektivní proteiny OspA a OspC, popři padne obsahuje i další imunogenní protektivní proteiny vnější membrány, a

   25 jednak celobuněčný bakterin nebo bakteriální lyzát nebo bakteriální purifikát v tekuté nebo lyofilizované podobě vybraného imunomodulačního kmene Propionibacterium acnes nebo jiného bakteriálního imunomodulačního kmene.

   2. Lniverzální preparát podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje bakteriální lyzáty všech tri nej patogennější genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia

   30 afzelii a Borrelia garinii, z nichž každý obsahuje současně oba imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC, a zároveň obsahuje bakteriální lyzát bakteriálního imunomodulačního kmene Propionibacterium acnes.
3. 3. Univerzální preparát podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že imunogenní protektivní proteiny vnější membrány kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a

   35 Borrelia garinii OspA a OspC jsou ve vakcíně obsaženy s výhodou v poměru 8 : 1 : 1 až 1 : 1 : 1.
4. 4. Univerzální preparát podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že lyofilizované bakteriální lyzáty kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii jsou ve vzájemném poměru 1:1:1a poměr směsi lyofilizováných bakteriálních lyzátů kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii k bakteriálnímu lyzátů kmene

   40 Propionibacterium acnes je v poměru 9 : 1 až 1 : 1 a celkový obsah sušiny lyofilizátů všech kmenů v jedné aplikační dávce je 1 až 1000 mg.
5. 5. Univerzální preparát podle některého z nároků 1 až 4, v y z n a č u j í c í se tím, že je vytvořen v lyofilizované či tekuté formě a je aplikován v pufrovaném fyziologickém roztoku

   CZ 18920 Ul nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, případně dalšími imunomodulátory přírodního či syntetického charakteru či dalšími pomocnými látkami, s výhodou vehiculem,
6. 6. Univerzální preparát podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že imunomodulátory přírodního charakteru jsou vybrány ze skupiny bakteriálních imunomodulátoru

   5 nebo glukanů nebo minerálních prvků.
7. 7. Univerzální preparát podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že jeho pH se pohybuje v rozmezí hodnot 4 až 9.