CZ122696A3 - The use of crf corticotropin releasing factor or analogs thereof for preparing a therapeutical preparation - Google Patents

Abstract

Administration of corticotropin-releasing factor to patients suffering from one of the chronic inflammatory arthritides, such as rheumatoid arthritis, reduces episodic acute inflammatory responses to the chronic disease. Doses of administered CRF in accordance with the invention give anti-inflammatory results in a dose responsive manner even in well-established disease.

Description

Oblast techniky oTechnical field o

Vynález se týká obecně způsobu léčení pacienta, trpícího chronickou zánětlivou artritidou, a konkrétně použití faktoru způsobujícího vypouštění kortikotropinu nebo jeho analogů ke snižování otoků během episodických akutních reakcí při chronických zánětlivých stavech.The invention relates generally to a method of treating a patient suffering from chronic inflammatory arthritis, and more particularly to the use of a corticotropin release factor or analogues thereof to reduce swelling during episodic acute reactions in chronic inflammatory conditions.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Mezi onemocnění, která souží lidstvo, patří chronické zánětlivé artritidy, zahrnující revmatickou artritidu, Reitersův syndrom, ankylózní spondylitis, psoriatickou artritidu a zánětlivé onemocnění střev. Odhaduje se, že samotná revmatická artritida je každoročně ve Spojených státech příčinou asi 33000 úmrtí. Dosud neexistuje na tuto nemoc lék a její příčina je nejasná. Nemocní revmatickou artritidou periodicky zakoušejí vzplanutí nebo episodické akutní reakce, trvající asi týden až asi měsíc.Diseases affecting mankind include chronic inflammatory arthritis, including rheumatoid arthritis, Reiters syndrome, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, and inflammatory bowel disease. It is estimated that rheumatoid arthritis alone causes about 33,000 deaths in the United States each year. There is no cure for this disease yet and its cause is unclear. Patients with rheumatoid arthritis periodically experience flares or episodic acute reactions lasting about a week to about a month.

Steinman v „Autoimmune Disease, Scíentific American, str. 107-114 (září 1993), diskutuje některé možné nové přístupy k léčbě autoimunitního onemocnění, jako je revmatická artritida. V jednom z nich se navrhuje vyřazovat buňky T pomocí atrap, zapadajících do štěrbiny HLA (lidského lymfocytového antigenu). V dalším se zdá, že monoklonální protilátka, která se váže na faktor tumorové nekrózy, zvyšuje mobilitu kloubů a snižuje ztuhlost spojenou s revmatickou artritidou. Tyto možné nové přístupy však dosud nejsou terapeuticky stabilizovány z hlediska účinnosti.Steinman, in "Autoimmune Disease, Scientific American, pp. 107-114 (September 1993), discusses some possible new approaches to the treatment of autoimmune disease, such as rheumatoid arthritis. In one of these, it is proposed to knock out T cells using dummies that fit into the HLA (human lymphocyte antigen) cleft. Furthermore, a monoclonal antibody that binds to tumor necrosis factor appears to increase joint mobility and reduce stiffness associated with rheumatoid arthritis. However, these possible novel approaches are not yet therapeutically stabilized in terms of efficacy.

Při hledání možné léčby napomáhá skutečnost, že byly vyvinuty zvířecí modely s použitím kmenů krys, náchylných k artritidě. Mezi jinými možnými abnormalitami mají krysy „Lewis, náchylné k artritidě, deficitní hypothalamickou kortikoliberinovou odpověď na různé stimuly, takže výzkumníci mohou experimentálně vyvolat zánětlivou artritidu a některá další autoimunní onemocnění. U krysího modelu Piebald-ViralGlaxo („PVG) se na rozdíl od krys kmene Lewis nezdá, že by zvířata měla defekt hypothalamo-pituitárně-adrenální („HPA) osy, ale jsou nicméně náchylná k artritidě.The search for a possible treatment is aided by the fact that animal models have been developed using rat susceptible to arthritis. Among other possible abnormalities, Lewis-susceptible arthritis rats have a deficient hypothalamic corticoliberin response to various stimuli, so researchers can experimentally induce inflammatory arthritis and some other autoimmune diseases. In the rat model of Piebald-ViralGlaxo ("PVG"), unlike Lewis rats, animals do not appear to have a defect in the hypothalamic-pituitary-adrenal ("HPA") axis, but are susceptible to arthritis.

Patent US 5,006.330, původci Sternberg a d., vydaný 9.4.1991, popisuje použití zvířecího modelu krys Lewis, kde experimentální zvířata rozvinula artritidu, která simuluje lidskou revmatickou artritidu, v reakci na vystavení zlomkům buněčných stěn streptokoků skupiny A. Sternberg a d. popisují použití tohoto modelu pro testování náchylnosti savců k zánětlivým onemocněním. Sternberg a d. popisují měření „CRH (hormonu uvolňujícího kortikotropin) po injekcích různých prostředků. CRH je alternativní název pro kortikoliberin (faktor způsobující vypouštění kortikotropinu, dále „CRF), což je neuropeptid o 41 aminokyselinách, který je přítomen v mozku a v periferních nervových 'zakončeních a stimuluje uvolňování ACTH z hypofyzárních buněk v mozku a z různých periferních míst, jako jsou nervová zakončení a leukocyty. Sternberg a d. rovněž popisují injekce CRH a následující měření ACTH a kortikosteronu.U.S. Patent No. 5,006,330 to Sternberg et al., Issued April 9, 1991, describes the use of an animal model of Lewis rats where experimental animals developed arthritis that simulates human rheumatoid arthritis in response to exposure to cell wall fragments of group A. Sternberg et al. use of this model to test the susceptibility of mammals to inflammatory diseases. Sternberg et al. Describe the measurement of CRH (corticotropin releasing hormone) after injections of various formulations. CRH is an alternative name to corticoliberin (corticotropin discharging factor, CRF), a 41 amino acid neuropeptide that is present in the brain and peripheral nerve endings and stimulates the release of ACTH from pituitary cells in the brain and from various peripheral sites such as are nerve endings and leukocytes. Sternberg et al. Also describe CRH injections and subsequent ACTH and corticosterone measurements.

Bylo popsáno, že zánětlivou reakci částečně ruší protilátky zaměřené proti CRF, což.vedlo různé výzkumníky k názoru, že CRF je prozánětlivý prostředek. Karalis a d., „Autocrine or paracrine Inflammatory Actions of Corticotropin-Releasing Hormone In Vivo, Science 254, 421423 (1991) .It has been reported that the inflammatory response is partially abolished by antibodies directed against CRF, leading various researchers to believe that CRF is a pro-inflammatory agent. Karalis et al., "Autocrine or Paracrine Inflammatory Actions of Corticotropin-Releasing Hormone In Vivo, Science 254, 421423 (1991).

Patent US 4,489.163, původci Rivier a d., vydaný 18.12.1984, popisuje krysí CRF a jeho analogy. Lidský CRF má tutéž sekvenci jako krysí CRF. V oboru je známo několik analogů CRF. Patent US 4 , 4 15.558, původci Vale Jr. a d., vydaný 15.11.1983, popisuje syntézu ovčího CRF, jeho analogy a izolaci oCRF z ovčích hypothalamických extraktů. Bylo zjištěno, že syntetický oCRF snižuje krevní tlak.U.S. Patent 4,489,163, Rivier et al., Issued December 18, 1984, describes rat CRF and analogs thereof. Human CRF has the same sequence as rat CRF. Several CRF analogs are known in the art. U.S. Patent No. 4,415,558 to Vale Jr. and d., issued November 15, 1983, describe the synthesis of sheep CRF, analogs thereof, and isolation of oCRF from sheep hypothalamic extracts. Synthetic oCRF has been found to lower blood pressure.

Obecně podobný peptid sauvagin byl popsán v Regulátory Peptides 2, str. 1-13 (1981). Sauvagin je peptid o 40 aminokyselinách a bylo uvedeno, že má biologický účinek při snižování krevního tlaku u savců a stimulaci sekrece ACTH a β-endorfinu.A generally similar peptide of sauvagine has been described in Regulators of Peptides 2, pp. 1-13 (1981). Sauvagine is a 40 amino acid peptide and has been reported to have a biological effect in lowering blood pressure in mammals and stimulating secretion of ACTH and β-endorphin.

Patent US 4,528.185, původci Lederis a d., vydanýU.S. Patent 4,528,185 issued to Lederis et al

9.7.1985, a patent US 4,533.654, původci Lederis a d., vydanýAnd U.S. Patent 4,533,654 issued to Lederis et al

6.8.1985, popisují peptidy podobné krysímu a ovčímu CRF a jejich analogy štítonoše, resp.On Aug. 6, 1985, disclose rat and sheep CRF-like peptides and their shieldon analogs, respectively.

uvádějí zjištění, ze tento urotensin kapra stimuluje ACTH a snižuje krevní tlak, Peptid příbuzný CRF, tj. urotensin štítonoše, má stejnou sekvenci aminokyselin jako kapří urotensin s tou výjimkou, že v poloze 24 je aminokyselina isoleucin a v poloze 27 je glutamová kyselina.disclose that this urotensin carp stimulates ACTH and lowers blood pressure. The CRF-related peptide, i.e. urotensin shield bearer, has the same amino acid sequence as carp urotensin except that at position 24 the amino acid isoleucine and at position 27 the glutamic acid.

Ling a d., BBRC 122, str. 1218-1224 (1984), uvádějí strukturu kozího CRF, která je stejná jako u ovčího CRF. Esch a d., BBRC 122, str. 899-905 (1984), uvádějí strukturu hovězího CRF, která se od ovčího a kozího CRF liší pouze v jednom aminokyselinovém zbytku (v poloze 33 je asparagin místo šeřinu, který je v poloze 33 u kozího a ovčího CRF) . Vepřový CRF byl izolován a charakterizován Patthym a d., Proč. Nati. Acad. Sel 82, str. 8762-8766 (1985). Vepřový CRF sdílí společnou aminokyselinovou sekvenci (zbytky 1 až 39) s krysím/lidským CRF a liší se od nich pouze v poloze 40 a 41.Ling et al., BBRC 122, pp. 1218-1224 (1984), disclose a structure of goat CRF that is the same as sheep CRF. Esch et al., BBRC 122, pp. 899-905 (1984) disclose a bovine CRF structure that differs from sheep and goat CRFs in only one amino acid residue (at position 33 there is asparagine instead of lilac, which is at position 33 u goat and sheep CRF). Pig CRF was isolated and characterized by Patthy et al., Proc. Nati. Acad. Sel 82: 8762-8766 (1985). Porcine CRF shares a common amino acid sequence (residues 1-39) with rat / human CRF and differs only at positions 40 and 41.

Zbytek 40 může tvořit buď asparagin nebo isoleucin a zbytek je fenylalaninamid.The residue 40 can be either asparagine or isoleucine and the residue is phenylalaninamide.

Patent US 4,801.612, původce Wei, vydaný 31.1.1989, popisuje inhibici zánětlivé reakce (akutní) na kůži nebo sliznicích pacienta podáváním CRF nebo jeho analogů a patent US 5,137.871, původce Wei, vydaný 11.8.1992, popisuje použití CRF (nebo jeho soli nebo analogu) při ošetřování pacienta s poškozením nebo onemocněním mozku, nervového systému nebo muskulatury, kde je faktorem otok.U.S. Patent No. 4,801,612 to Wei, issued January 31, 1989, discloses inhibiting an inflammatory response (acute) to the skin or mucous membranes of a patient by administering CRF or analogs thereof, and U.S. Patent No. 5,137,871 to Wei, issued August 11, 1992, discloses the use of CRF (or salt or analogue) in the treatment of a patient with damage or illness of the brain, nervous system or musculature where swelling is a factor.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podávání faktoru způsobujícího vypouštění kortikotropinu pacientům trpícím jednou z chronických zánětlivých artritid, jako je revmatická artritida, snižuje episodické akutní zánětlivé reakce na nemoc. Dávky CRF podle vynálezu poskytují protizánětlivé výsledky formou odezvy na dávku i při stabilizovaném onemocnění. Vynález tedy poskytuje terapeutické ošetření u těchto neremitujících chorob, které nezabírají na běžné terapie.Administration of a corticotropin discharge factor to patients suffering from one of the chronic inflammatory arthritis, such as rheumatoid arthritis, reduces the episodic acute inflammatory response to the disease. The doses of CRF of the invention provide anti-inflammatory results in the form of a dose response even in a stabilized disease. Thus, the invention provides therapeutic treatment for these non-remitting diseases that do not address conventional therapies.

Terapeutické ošetření podle vynálezu by mělo být prováděno pod dohledem odborníka na zdravotní péči, obvykle lékaře, a může probíhat ve spojení s jinými léky a terapiemi. Vzhledem k tomu, že při ošetřování episodických akutních zánětlivých reakcí, které by jinak trvaly typicky týden až měsíce, je zaznamenáván protizánětlivý účinek a jiné příznivé výsledky již po několika dnech, je pacientovi v průběhu ošetření podle vynálezu poskytována účinná úleva od nepříjemných nebo dokonce zneschopňujících příznaků, i když provádění vynálezu nepředstavuje léčbu.The therapeutic treatment of the invention should be performed under the supervision of a health care professional, usually a physician, and may be conducted in conjunction with other drugs and therapies. Since the treatment of episodic acute inflammatory reactions, which would typically last for weeks to months, has been reported to have an anti-inflammatory effect and other favorable results after only a few days, the patient is effectively relieved of unpleasant or even incapacitating symptoms during treatment. although the practice of the invention is not a treatment.

Je možné, že dřívější zprávy, které zjistily přítomnost CRF v kloubech savců se zánětlivou artritidou a vyvozovaly z toho, že CRF je prozánětlivý prostředek, mohly mít pravdu, protože je možné, že tento peptid může být buď prozánětlivý nebo protizánětlivý v závislosti na tom, jaké množství endogenního peptidu je produkováno, jak „zánětlivá buňka na CRF reaguje nebo kdy se CRF objeví v průběhu zánětlivé reakce. Následující popis však demonstruje, že podávání CRF může být terapeuticky účinné při inhibici episodických akutních a chronických zánětlivých reakcí formou odezvy na dávku, a vynález proto představuje terapeutický způsob ošetřování pacientů s chronickými zánětlivými artritidami, jako je revmatická artritida.It is possible that earlier reports that detected the presence of CRF in the joints of mammals with inflammatory arthritis and concluded that CRF is a pro-inflammatory agent might be right because it is possible that this peptide may be either pro-inflammatory or anti-inflammatory depending how much endogenous peptide is produced, how “an inflammatory cell responds to CRF, or when CRF occurs during an inflammatory response. However, the following description demonstrates that administration of CRF may be therapeutically effective in inhibiting episodic acute and chronic inflammatory responses in the form of a dose response, and the invention therefore provides a therapeutic method of treating patients with chronic inflammatory arthritis such as rheumatoid arthritis.

Při provádění vynálezu se používá CRF. Pod označení „CRF se zahrnují v oboru známé analogy a peptidy příbuzné CRF. Terapeutické formulace CRF mohou být upravovány pro skladování smísením CRF s požadovaným stupněm čistoty s případnými fyziologicky přijatelnými nosiči, vehikuly nebo stabilizátory, ve formě lyofilizovnaého koláče nebo vodných roztoků. Přijatelné nosiče, vehikula nebo stabilizátory jsou v dávkách a koncentracích používaných při aplikaci netoxické vůči příjemci a zahrnují pufry, jako je fosfát, citrát a další organické kyseliny, antioxidanty včetně askorbové kyseliny, nízkomolekulární (méně než asi 10 zbytků) polypeptidy, proteiny, jako je sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny. Další složky mohou zahrnovat glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lysin, monosacharidy, disacharidy a další uhlohydráty včetně glukózy, mannózy nebo dextrinů, chelatační prostředky, jako je EDTA, cukerné alkoholy, jako je mannitol nebo sorbitol, protiionty tvořící soli, jako je sodík, a/nebo neiontové surfaktanty, jako je TWEEN, PLURONICS nebo PEG.CRF is used in the practice of the invention. CRF includes CRF-related analogs and peptides known in the art. Therapeutic CRF formulations may be formulated for storage by mixing CRF of the desired degree of purity with optional physiologically acceptable carriers, vehicles or stabilizers, in the form of a lyophilized cake or aqueous solutions. Acceptable carriers, vehicles, or stabilizers are nontoxic to the recipient at dosages and concentrations used in the administration and include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids, antioxidants including ascorbic acid, low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins. Other ingredients may include glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins, chelating agents such as EDTA, sugar alcohols such as mannitol or sorbitol, salt-forming counterions such as sodium , and / or nonionic surfactants such as TWEEN, PLURONICS or PEG.

Podávání je možno provádět jakýmkoli známým způsobem, se na intraartikulární, subkutánní, injekční, zahrnuj icím, intravenózní, intranasální, avšak neomezujícím intrathekální, orální aplikaci nebo aplikaci pomocí implantovaného zařízení. Vhodné implantáty zahrnují například gelovou pěnu, vosk nebo implantáty na bázi mikročástic. Topická aplikace výhodně zahrnuje prostředky nebo zařízení pro usnadnění dodávání do kůže, jako jsou solubilizační prostředky nebo prostředky řízeného dodávání, které jsou známy a jsou vyvíjeny v rychle se objevujících technologiích systémů dodávání do kůže.Administration can be by any known means, for intraarticular, subcutaneous, injectable, including, intravenous, intranasal, but not intrathecal, oral, or implantable device administration. Suitable implants include, for example, gel foam, wax, or microparticle-based implants. The topical application preferably comprises means or devices for facilitating the delivery to the skin, such as solubilizing or controlled delivery means, which are known and are being developed in the rapidly emerging technologies of the skin delivery systems.

Terapeuticky účinné dávky CRF nebo jeho analogů pro provádění vynálezu činí u lidí výhodně alespoň asi 0,01 pg/kg. Pro systemickou aplikaci (například subkutánní a intravenózní) jsou výhodnější dávky v rozmezí asi 0,1 až asi 50 pg/kg a ne j výhodně j š í asi 1 až asi 30 pg/kg. Pro místní aplikaci (například intraartikulární) je výhodná dávka v rozmezí asi 1 až asi 100 μς/kg. Aplikace dávek CRF může probíhat pomalu, například subkutánně nebo intradermálně, nebo může být prováděna injekčně přímo do postižené části těla.Therapeutically effective doses of CRF or analogs thereof for practicing the invention are preferably at least about 0.01 pg / kg in humans. For systemic administration (e.g., subcutaneous and intravenous), dosages in the range of about 0.1 to about 50 pg / kg, and more preferably about 1 to about 30 pg / kg, are more preferred. For topical administration (e.g., intra-articular), a dose in the range of about 1 to about 100 μς / kg is preferred. CRF doses may be administered slowly, for example, subcutaneously or intradermally, or may be injected directly into the affected part of the body.

Ošetřovaní pacienti budou v péči zdravotního odborníka, jako je lékař, který může sám podávat terapeutický přípravek zahrnující CRF nebo jej může předepsat pacientovi pro samostatnou aplikaci (jako jsou například předem naplněné injekční stříkačky). Systemické aplikační formy jsou zvlášť výhodné z hlediska častého několikanásobného výskytu episodických situací nebo vzplanutí choroby. Přestože se ošetření podle vynálezu, jak je dále osvětleno, ukázalo jako účinné, při přerušení ošetření účinnost také bohužel ustane. Jako u mnoha jiných různých typů terapií může být terapeutický způsob podle vynálezu kombinován s dalšími farmaky a dalšími terapeutickými přístupy k ošetřované chorobě.The patients to be treated will be in the care of a healthcare professional, such as a physician, who can self-administer a therapeutic product comprising CRF or prescribe it to a patient for self-administration (such as pre-filled syringes). Systemic dosage forms are particularly advantageous in view of the frequent multiple occurrence of episodic situations or disease outbreaks. Although the treatment according to the invention has been shown to be effective, as explained below, it is unfortunately also discontinued when treatment is interrupted. As with many other types of therapies, the therapeutic method of the invention may be combined with other pharmaceuticals and other therapeutic approaches to the disease being treated.

V aplikaci CRF podle vynálezu je potenciálně možno pokračovat po dobu až asi tři týdnů, ale po prodlouženém příjmu se mohou vyvinout vedlejší účinky (například Cushingův syndrom). Aplikace vynálezu se tedy primárně předpokládá pro ošetřování akutních, episodických vzplanutí nemoci a k podávání CRF může být přistoupeno v době až čtyřiceti dní po objevení episodického akutního zánětu.The CRF of the invention may potentially be continued for up to about three weeks, but side effects (e.g., Cushing's syndrome) may develop upon prolonged intake. Thus, application of the invention is primarily contemplated for the treatment of acute, episodic outbreaks of the disease and administration of CRF may be initiated up to forty days after the appearance of episodic acute inflammation.

Přestože peptidy, jak jsou typicky syntetizovány, . jsou obvykle rozpustné ve vodě, mohou být podávány ve formě farmaceuticky přijatelných netoxických solí, jako jsou adiční soli s kyselinami. Jako příklady adičních solí s kyselinami je možno uvést hydrochlorid, hydrobromid, síran, acetát, citrát, benzoát, sukcinát, malát, askorbát, tartrát apod. Kromě toho, že CRF může být podáván v jakémkoli farmaceuticky přijatelném nosiči, může být v závislosti na požadovaném způsobu podávání formulován spolu s kapalným nosičem do liposomů, mikrokapslí, polymerů nebo přípravků na bázi vosků s kontrolovaným uvolňováním, nebo může být formulován do formy tablet, pilulek nebo kapslí.Although peptides as typically synthesized,. are generally water-soluble, and can be administered in the form of pharmaceutically acceptable non-toxic salts, such as acid addition salts. Examples of acid addition salts include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, acetate, citrate, benzoate, succinate, malate, ascorbate, tartrate and the like. In addition, CRF may be administered in any pharmaceutically acceptable carrier, depending on the desired The method of administration may be formulated together with the liquid carrier in controlled release liposomes, microcapsules, polymers or wax-based formulations, or may be formulated in the form of tablets, pills or capsules.

Způsob ošetřování pacienta podle vynálezu se týká pacientů trpících jednou z chronických zánětlivých artritid. Chronické zánětlivé artritidy zde zahrnují revmatickou artritidu, Reitersův syndrom, ankylózní spondylitis, psoriatickou artritidu a zánětlivé onemocnění střev. Ošetření je vhodné zejména pro episodické akutní záněty a poskytuje protizánětlivé výsledky formou odezvy na dávku. Popsané experimenty ukazují, že bez ohledu na dobu podání (například až asi čtyřicet dní po episodickém akutním zánětu) se při provádění vynálezu snižuje zánět i u stabilizované choroby; přeruší-li se však ošetřování, bylo zjištěno, že se příznaky znovu objeví. Vynález tedy přestavuje spíše ošetřeni než léčbu.The method of treating a patient of the invention relates to patients suffering from one of the chronic inflammatory arthritis. Chronic inflammatory arthritis herein includes rheumatoid arthritis, Reiters syndrome, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, and inflammatory bowel disease. The treatment is particularly suitable for episodic acute inflammation and provides anti-inflammatory results in the form of a dose response. Described experiments show that irrespective of the time of administration (for example, up to about forty days after episodic acute inflammation) in the practice of the invention, inflammation is also reduced in a stabilized disease; however, if treatment is discontinued, symptoms have been found to recur. Thus, the invention is a treatment rather than a treatment.

Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Obr. 1 představuje perspektivní znázornění dvou nohou samců krys Lewis „LEW/N, u nichž byla mykobakteriálně vyvolána náchylnost k artritidě, přičemž noha 10 je kontrolní a noha 12 byla injekčně ošetřena mykobakteriemi k vyvolání artritidy.Giant. 1 is a perspective view of two legs of male Lewis " LEW / N " rats in which mycobacterial susceptibility to arthritis has been established, with leg 10 being control and leg 12 being injected with mycobacteria to induce arthritis.

Obr. 2 graficky znázorňuje otékání tlapky (jedna jednotka je ekvivalentní 0,001 palce) na zvířecím modelu krys, náchylných k artritidě, v závislosti na čase pro kontrolní zvířata a zvířata ošetřená podle vynálezu dvěma různými dávkami (subkutánní injekce 50 a 100 μg CRF na kg tělesné hmotnosti), přičemž měření otoku tlapky se provádí na nohách injekčně ošetřených mykobakteriemi (levé zadní).Giant. 2 graphically depicts paw swelling (one unit is equivalent to 0.001 inch) in an arthritis-prone rat animal model versus time for control animals and animals treated according to the invention with two different doses (subcutaneous injection of 50 and 100 µg CRF per kg body weight) , wherein the paw swelling is measured on mycobacteria-injected legs (left hind).

Obr. 3 je analogický jako obr. 2, ale znázorňuje měření na nohách v příčné rovině protějších nohám ošetřeným injekcí (pravé zadní).Giant. 3 is analogous to FIG. 2, but shows measurements on the legs in a transverse plane opposite the injected legs (right hind).

Obr. 4 graficky znázorňuje závislost výskytu artritidy na čase pro pravou zadní nohu z obr. 3.Giant. 4 graphically depicts the time-dependence of arthritis for the right hind leg of FIG. 3.

Obr. 5 je analogický jako obr. 4, ale týká se druhého páru nohou (levá a pravá přední).Giant. 5 is analogous to FIG. 4, but relates to a second pair of legs (left and right front).

Obr. 6, obsahující panely A až E, je analogický jako obr. 2, ale je zde vynesena větší dávka (100 μg/kg tělesné hmotnosti), podávaná subkutánně do tlapky, injekčně ošetřené mykobakteriemi (levá zadní), podle vynálezu počínaje časy, zpožděnými až o 40 dní po vyvolání nemoci.Giant. 6, comprising panels A to E, is analogous to FIG. 2, but shows a larger dose (100 µg / kg body weight) administered subcutaneously to a paw injected with mycobacteria (left hind), according to the invention, from times delayed to 40 days after the onset of the disease.

Obr. 7, obsahující panely A až E, je analogický jako obr. 6, ale týká se protější tlapky (pravé zadní) .Giant. 7, comprising panels A to E, is analogous to FIG. 6, but relates to the opposite paw (right rear).

Obr. 8 graficky znázorňuje závislost výskytu artritidy podobným způsobem jako obr. 4, ale v podobném formátu jako obr. 6.Giant. 8 graphically depicts the dependence of arthritis in a manner similar to FIG. 4 but in a similar format to FIG. 6.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Terapeutická účinnost byla demonstrována na krysím modelu adjuvantní artritidy, v němž byly samcům krys Lewis „LEW/N, náchylným k artritidě, do levé zadní tlapky injekčně vpraveny usmrcené mykobakterie k vyvolání artritidy.Therapeutic efficacy was demonstrated in a rat model of adjuvant arthritis in which male Lewis rats "LEW / N, susceptible to arthritis, were injected into the left hind paw of killed mycobacteria to induce arthritis.

S odkazem obecně na obr. 1 měla zvířata (tj. zvířata ošetřená solným roztokem) přibližně po šestnácti dnech od vyvolání choroby nohy znázorněné jako noha 10; krátce po vyvolání choroby však dochází u nohou 12 ošetřených mykobakteriemi (a později, jak bude popsáno, i u dalších nohou) k otoku tlapky. Otok tlapky je signálem zánětu. Jak je známo, zánět se projevuje rudnutím, otokem, teplem a bolestí jako reakcí organismu proti poranění nebo napadení. Po pěti dnech od vyvolání choroby u krys byl subkutánně dvakrát denně podáván CRF v dávce pro jedno podání buď 50 pg/kg nebo 100 μg/kg. V tomto podávání dvakrát denně se pokračovalo po dobu 20 dní. Přibližně v době 16. dne po vyvolání choroby měla zvířata ošetřovaná CRF relativně menší otok nebo zánět.Referring generally to Fig. 1, the animals (i.e., saline-treated animals) had their legs shown as foot 10 approximately sixteen days after the disease was induced; however, shortly after disease induction, mycobacteria-treated legs 12 (and later, as described, other legs) experience paw swelling. Paw swelling is an inflammatory signal. As is known, inflammation is manifested by redness, swelling, heat and pain as a reaction of the body against injury or attack. Five days after disease induction in rats, CRF was administered subcutaneously twice daily at either 50 µg / kg or 100 µg / kg single dose. This twice daily administration was continued for 20 days. At approximately day 16 after disease induction, CRF treated animals had relatively less swelling or inflammation.

Počínaje prvním dnem podávání (tj. den 5 po injekčním vpravení usmrcených mykobakterií) byla zjišťována velikost otoku pomocí kaliperů měřením tloušťky levé zadní (s injekcí) nohy. Toto měření sloužilo jako stanovení stupně „primárního nebo akutního zánětu. Následně (obvykle po dalších asi 10 až dnech) rovněž oteče a zanítí se také pravá zadní noha. To představuje chronickou zánětlivou reakci.Beginning on the first day of administration (i.e., day 5 after injection of killed mycobacteria), the magnitude of the swelling was determined by calipers by measuring the thickness of the left hind (injected) leg. This measurement served to determine the degree of "primary or acute inflammation." Subsequently (usually after about another 10 to days) it also swells and the right hind leg also becomes inflamed. This is a chronic inflammatory reaction.

Na obr. 2 jsou znázorněny údaje o otoku pro primárně zanícenou levou zadní nohu (měřeno do dne 32) pro kontrolní krysy, pro krysy, které dostávaly dvakrát denně 50 tělesné hmotnosti CRF, a pro krysy, které dostávaly dvakrát denně dávku.100 μρ/kg tělesné hmotnosti CRF. Svislá osa je označena jednotkami, z nichž jedna odpovídá 0,001 palce. Jak je z údajů na obr. 2 patrné, podávání CRF podle vynálezu poskytlo protizánětlivé výsledky, a to formou odezvy na dávku. Všechny tři grafy na obr. 2 začínají 5 dní od provokační injekce mykobakterií. Při injekčním ošetření 50 pg/kg CRF dvakrát denně byl otok oproti kontrole zmenšen. Při podávání 100 μρ/kg měly výsledky ještě větší významnost.Figure 2 shows swelling data for the primary inflamed left hind leg (measured until day 32) for control rats, for rats receiving 50 CRF body weight twice daily, and for rats receiving twice daily dosing.100 μρ / kg body weight CRF. The vertical axis is indicated by units, one of which is 0.001 inch. As can be seen from the data in Figure 2, administration of the CRF of the invention gave anti-inflammatory results in the form of a dose response. All three plots in Figure 2 start 5 days after challenge with mycobacteria. At 50 µg / kg CRF injection twice daily, swelling was reduced compared to control. At 100 μρ / kg, the results were even more significant.

Na obr. 3 jsou znázorněny analogické údaje jako na obr. 2, ale měřený stupeň otoku tlapky se týká pravé zadní nohy, a představuje tedy chronickou zánětlivou reakci. Podávání CRF v dávkách bud’ 50 μς/kg nebo 100 μς/kg bylo zahájeno 5 dní po provokační injekci stejně jako na obr. 2, avšak pravá zadní noha měla nástup otoku později než levá, pro niž jsou údaje znázorněny na obr. 2. Pravá zadní noha vykazuje rovněž menší otok než levá. Pravá zadní noha však samozřejmě není přímo vyprovokována jako levá. Nicméně, jak je zřejmé, počínaje asi dnem 11 začíná pravá zadní noha otékat; v případě zvířat dostávajících CRF podle vynálezu je však zaznamenán velmi malý otok (při 50 μg/kg i 100 μg/kg tělesné hmotnosti).Fig. 3 shows analogous data to Fig. 2, but the measured degree of paw swelling relates to the right hind leg and thus represents a chronic inflammatory reaction. CRF dosing at either 50 μς / kg or 100 μς / kg was started 5 days after the challenge as in Fig. 2, but the right hind leg had swelling later than the left, for which data is shown in Fig. 2. The right hind leg also exhibits less swelling than the left hind leg. Of course, the right hind leg is not directly provoked as the left leg. However, starting from day 11, the right hind leg begins to swell; however, in the case of animals receiving the CRFs according to the invention, a very small swelling (at both 50 μg / kg and 100 μg / kg body weight) is reported.

Jak je znázorněno na obr. 4, byl u zvířat uvedených na obr. 3 hodnocen rozsah artritidy pomocí hodnotícího systému, v němž „0 znamená žádnou artritidu a „4 představuje těžkou artritidu. Hodnocení artritidy bylo prováděno na základě kombinace faktorů, zahrnujících procentický podíl otoku tlapky plus celkové příznaky choroby (které zahrnují otok, rudnutí a znetvoření). Údaje na obr. 4 ukazují, že obě dávky CRF (50 μς/kg i 100 byly účinné při snižování příznaků artritidy, avšak, jak se zdá, dávka 100 μς/kg vykazuje větší účinek. Pro hodnocení na obr. 4 byly použity pravé zadní nohy zvířat.As shown in FIG. 4, the extent of arthritis in the animals shown in FIG. 3 was evaluated by a scoring system in which “0 represents no arthritis and“ 4 represents severe arthritis. Arthritis assessment was performed based on a combination of factors including the percentage of paw edema plus the overall symptoms of the disease (which include swelling, redness, and disfigurement). The data in Fig. 4 show that both doses of CRF (50 μς / kg and 100 were effective in reducing the symptoms of arthritis, but appear to have a greater effect at the dose of 100 μς / kg). animal feet.

Na obr. 5 byly analogicky jako u obr. 4 hodnoceny obě přední nohy. Obr. 4 a 5 tedy představují spíše chronické než akutní stavy. Přední nohy, použité pro údaje na obr. 5, však zaznamenaly ještě opožděnější a méně výrazný nástup otoku a jiné příznaky než pravé zadní nohy podle obr. 4. Jak je patrné zejména z údajů na obr. 5, podávání CRF podle vynálezu je velmi účinné při ošetřování klinických projevů chronické zánětlivé artritidy.In Fig. 5, both front legs were evaluated analogously to Fig. 4. Giant. 4 and 5 therefore represent chronic rather than acute conditions. However, the anterior legs used for the data in Fig. 5 experienced even more delayed and less pronounced onset of swelling and other symptoms than the right hind leg of Fig. 4. As can be seen in particular from Fig. 5, CRF administration according to the invention is very effective. in the treatment of clinical manifestations of chronic inflammatory arthritis.

V experimentech., jejichž údaje jsou shrnuty na obr. 2 až 5, bylo ošetření zahájeno 5 dní po vyvolání choroby. Byla provedena další sada experimentů, kde byla choroba vyvolána jako předtím a zvířata byla ošetřována podle vynálezu (subkutánní dávkou 100 μρ/kg dvakrát denně) po dobu 20 dní s výjimkou toho, že běh ošetření započal 5 dní, 10 dní, 15 dní, 25 dní nebo 40 dní po vyvolání choroby. Údaje z těchto experimentů jsou shrnuty na obr. 6 až 8.In the experiments whose data are summarized in Figures 2 to 5, treatment was started 5 days after disease induction. Another set of experiments was performed where the disease was induced as before and the animals were treated according to the invention (with a subcutaneous dose of 100 μρ / kg twice daily) for 20 days except that the course of treatment began 5 days, 10 days, 15 days, 25 days. days or 40 days after the disease is induced. Data from these experiments are summarized in Figures 6 to 8.

Na obr. 6 zobrazují panely A až E měření, odebraná na levé zadní tlapce. V panelu A je vynesena tloušťka tlapky pro kontrolní krysy a pro krysy, které dostávaly ošetření počínaje dnem 5 po vyvolání choroby (označeno prázdnou šipkou) a konče dnem 20 (označeno plnou šipkou). Počínaje těsně po ošetření podle vynálezu 5 dní po vyvolání choroby tedy byla tloušťka tlapky značně snížena oproti kontrole a snižování tloušťky pokračovalo do přerušení ošetřování, kdy začal otok a pokračoval až asi do dne 60, kdy nebyl v podstatě žádný rozdíl mezi předem ošetřenou tlapkou a kontrolní (nikdy neošetřenou) tlapkou. Podobně panel B zobrazuje údaje pro kontrolní a zkušební krysy při zahájení ošetřování v den 10 a skončení v den 30, panel C se zahájením ošetřování v den 15 a skončením v den 35, panel D se zahájením ošetřování v den 25 a skončením v den 45 a panel E se zahájením ošetřování v den 40 a skončením v den 60. Tyto údaje demonstrují, že při ošetřování CRF se pronikavě snižuje otok tlapky i u stabilizované choroby, znázorněné na panelu E. Na panelu E na obr. 6 tedy ošetřování začalo 40 dní po vyvolání choroby, avšak ihned po zahájení ošetřování došlo u ošetřené tlapky ke snížení otoku.In Fig. 6 panels A to E show measurements taken on the left hind paw. In panel A, the paw thickness is plotted for control rats and for rats receiving treatment starting on day 5 after disease induction (indicated by an empty arrow) and ending on day 20 (indicated by a solid arrow). Thus, starting just after the treatment of the invention 5 days after disease induction, the paw thickness was greatly reduced compared to control and the thickness reduction continued until treatment was discontinued when swelling began and continued until about day 60 when there was essentially no difference between pretreated paw and control. (never treated) paw. Similarly, panel B shows data for control and test rats at start of treatment at day 10 and end at day 30, panel C at start of treatment at day 15 and end at day 35, panel D at start of treatment at day 25 and end at day 45 and panel E starting treatment at day 40 and ending at day 60. These data demonstrate that in CRF treatment, paw edema is dramatically reduced even in the stabilized disease shown in panel E. Thus, in panel E in Figure 6, treatment began 40 days after induction. disease, but immediately after the start of treatment, the treated paw decreased in swelling.

Na obr. 7 jsou na panelech A až E znázorněny analogické údaje jako na obr. 6, avšak otok tlapky byl měřen na pravé zadní noze zvířete. To znamená, podobně jako na obr. 3, že protože byl stupeň otoku tlapky měřen na pravé zadní noze (přičemž místem injekce mykobakterií je levá zadní noha, která může představovat akutní vzplanutí), může pravá noha představovat chronické zánětlivé reakce. Ještě jednou řečeno, tyto údaje demonstrují, že podávání CRF podle vynálezu v případě chronických zánětlivých stavů pronikavě snižuje otok i u stabilizované choroby.In Fig. 7 panels A to E show analogous data to Fig. 6, but the paw swelling was measured on the right hind leg of the animal. That is, as in Fig. 3, since the degree of paw edema was measured on the right hind leg (where the mycobacteria injection site is the left hind leg, which may represent an acute flare), the right leg may represent chronic inflammatory reactions. Once again, these data demonstrate that administration of the CRF of the invention in the case of chronic inflammatory conditions markedly reduces swelling even in stabilized disease.

V experimentech podobných jako na obr. 6 a 7, kde však byl u zvířat hodnocen rozsah artritidy pomocí systému, popsaného pro obr. 4, působí provádění vynálezu významně proti celkovému artritickému stavu, i když snad méně, než je patrné ze snížení otoku tlapky. Na obr. 8 jsou v každém z panelů A až E uvedena ošetřovaná zvířata, kde doba zahájení ošetřování je označena prázdnými šipkami. Doba ukončení ošetřování je označena plnými šipkami.In experiments similar to Figures 6 and 7, however, where the extent of arthritis in animals was assessed by the system described for Figure 4, the practice of the invention has a significant effect against the overall arthritic condition, albeit less than the apparent decrease in paw edema. In Fig. 8, treated animals are shown in each of panels A to E, wherein the start time of treatment is indicated by empty arrows. The treatment end time is indicated by solid arrows.

S odkazem na panel A obr. 8 tedy 5 dní po vyprovokování tlapky levé zadní nohy zvířete usmrcenými mykobakteriemi bylo zahájeno podávání CRF podle vynálezu do pravé zadní nohy a bylo v něm pokračováno po dobu 20 dní. V průběhu ošetřování se hodnocení artritidy oproti kontrole snížilo, ale po přerušeni ošetřování opět vzrostlo. Provádění vynálezu je tedy terapeutické, nikoli profylaktické. Je však důležité uvést, že jak je znázorněno na panelu D obr. 8, zahájení ošetřování podle vynálezu až po 25 dnech choroby je stále ještě účinné.Referring to panel A of Figure 8, i.e. 5 days after provoking the left hind paw of the animal by killed mycobacteria, administration of the CRF of the invention to the right hind leg was started and continued for 20 days. During treatment, arthritis scores decreased compared to controls, but increased again after treatment was discontinued. Thus, the practice of the invention is therapeutic, not prophylactic. However, it is important to note that, as shown in panel D of Figure 8, initiation of the treatment of the invention after 25 days of disease is still effective.

Vynález, který zde byl popsán v souvislosti s výhodnými konkrétními provedeními, je třeba chápat tak, že popis a příklady jsou uvedeny pouze pro osvětlení a nikoli pro omezení rozsahu vynálezu, který je definován připojenými patentovými nároky.The invention, which has been described herein in connection with the preferred specific embodiments, is to be understood that the description and examples are given only for illumination and not for limiting the scope of the invention, which is defined by the appended claims.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Použití faktoru uvolňujícího kortikotropin CRF nebo jeho analogů pro přípravu terapeutického prostředku pro ošetřování chronických zánětlivých artritid.Use of corticotropin releasing factor CRF or an analogue thereof for the preparation of a therapeutic agent for the treatment of chronic inflammatory arthritis. 2. Použití podle nároku 1 pro přípravu terapeutického prostředku pro ošetřování revmatické artritidy.Use according to claim 1 for the preparation of a therapeutic composition for the treatment of rheumatoid arthritis. Použití podle nároku 1, kde CRF je ve formě soli.Use according to claim 1, wherein the CRF is in the form of a salt. Použití podle nároku 1, kde je použit analog CRF.Use according to claim 1, wherein a CRF analog is used.