CS275998B6 - Preparation of coagulative factor concentrate from blood plasma - Google Patents

Abstract

Concentrates of blood coagulation factors II, VII, IX and/or X are new, obtainable by contacting a biological material contg. the factors with a sorbent based on DEAE-poly(hydroxyethyl acrylate) and/or DEAE-poly(hydroxyethyl methacrylate) i.e. DEAE-HE(M)A), and desorption with a buffer soln. of pH 7.2-7.6 with saline concn. 0.3-2.0M. - Also claimed are methods and compsns. for qualitative and quantitative determination of factor VII in biological materials, using concentrates of factors II and X, pref. prepd. as above.

Description

Vynález krevní plasmy koagulačníchThe invention of blood plasma coagulation

Zmíněné koagulační faktory v podobě více či méně čistých koncentrátů jsou důležitou výchozí surovinou pro přípravu intravenosních preparátů užívaných v klinické praxi u pacientů s vrozenou nebo získanou poruchou krevní srážlivosti, u akutních krváceni, při predoperační profylaxi krváceni, dále při získaném nedostatku těchto faktorů, nedostatku vitaminu K, poškození jaterního parenchymu a podobně.Said coagulation factors in the form of more or less pure concentrates are an important starting material for the preparation of intravenous preparations used in clinical practice in patients with congenital or acquired blood clotting disorder, in acute bleeding, in preoperative bleeding prophylaxis, and in acquired deficiency of these factors, vitamin deficiency K, damage to the liver parenchyma and the like.

Je známa příprava koncentrátů těchto faktorů s použitím sorbentů na bázi dietylaminoetylderivátů polysacharidů (dále OEAE-), například DEAE-Sephadexu. Použití těchto sorbentů pro zpracování krevní plasmy na koncentráty koagulačních faktorů má však několik nevýhod: polysacharidová matrice je značně náchylná k mikrobiálnímu napadení, čímž se mění fyrzikálně-chemické vlastnosti sorbentů. Částice polysacharidových sorbentů špatně odolávají změnám pracovních podmínek, jako je teplota, tlak, koncentrace solí a podobně, což se projevuje negativně změnou objemu sorbentů (sloupce) se všemi dalšími nežádoucími důsledky. Snadná mikrobiální kontaminace těchto sorbentů ohrožuje nejen kvalitu připravovaných koagulačních faktorů, ale i přípravu ostatních preparátů (imunoglobulinůa albuminu) z hlediska jejich pyrogenity (produkcí bakteriálních endotoxinů).It is known to prepare concentrates of these factors using sorbents based on diethylaminoethyl derivatives of polysaccharides (hereinafter OEAE-), for example DEAE-Sephadex. However, the use of these sorbents for processing blood plasma into coagulation factor concentrates has several drawbacks: the polysaccharide matrix is highly susceptible to microbial attack, thereby altering the physicochemical properties of the sorbents. The polysaccharide sorbent particles are poorly resistant to changes in operating conditions such as temperature, pressure, salt concentration, and the like, resulting in a negative change in sorbent volume (column) with all other undesirable consequences. Easy microbial contamination of these sorbents threatens not only the quality of prepared coagulation factors, but also the preparation of other preparations (immunoglobulins and albumin) in terms of their pyrogenicity (production of bacterial endotoxins).

Uvedené nevýhody se podařilo odstranit vypracováním nového způsobu přípravy koncentrátů koagulačních faktorů z lidské nebo zvířecí krevní plasmy nebo z jejich frakcí, to je koagulačních faktorů II, VII, IX a X, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se výchozí surovina uvádí ve styk se sorbentem na bázi DEAE-hydroxyetylmetakrylátových nebo DEAE-hydroxyetylakrylátovýoh polymerních nosičů, předem ekvilibrovaných pufrem s hodnotou pH 7,2 až 7,6 s přísadou chloridu sodného, načež se po ukončené sorpci koagulačních faktorů odstraní nesorbované bílkoviny promytím stejným pufrem s 0,2 mol/1 chloridu sodného a desorpce bílkovinných podílů, obsahujících buď jednotlivě nebo ve směsi faktory II, VII,These disadvantages have been overcome by the development of a novel process for preparing coagulation factor concentrates from human or animal blood plasma or fractions thereof, i.e., coagulation factors II, VII, IX and X, according to the invention, which comprises contact with a sorbent based on DEAE-hydroxyethyl methacrylate or DEAE-hydroxyethylacrylate polymeric carriers previously equilibrated with a pH 7.2 to 7.6 buffer with sodium chloride addition, after which adsorbed proteins are removed by washing with the same 0.2 0.2 buffer. mol / l sodium chloride and desorption of protein fractions containing either individually or in a mixture of factors II, VII,

IX a X, se provádí pufrem, obsahujícím chlorid sodný v koncentraci 0,3 až 2,0 mol/1.IX and X are carried out with a buffer containing sodium chloride at a concentration of 0.3 to 2.0 mol / l.

Sorbenty na bázi syntetické matrice DEAE-hydroxyetylmetakrylátů a DEAE-hydroxyetylakrylátů, což jsou známé, komerčně dostupné výrobky československé provenience (QEAE-Spheron, LACHEMA Srno a Separon HEMA OEAE, TE55EK, Praha) používané při realizaci způsobu podle vynálezu, shora popsané nedostatky sorbentů na bázi DEAE-polysacharidů nemají. Syntetická matrice není napadána mikrobiální florou, nemění své vlastnosti při změně fyzikálněchemických podmínek, sorbenty jsou velmi trvanlivé a mohou být používány po dlouhou dobu beze změny sorpčních vlastností. Při přípravě koncentrátů koagulačních faktorů je v jistých případech účelné přidávat do plasmy a použitých pufrů inhibitory proteináz k zabránění autoaktivace, jako například benzamidin. Autoaktivaci koagulačních faktorů lze též snížit provedením procesu separace při teplotě +4° až +10 °C. Separaci lze provádět na sloupci v chromatografickém uspořádání nebo vsádkově v nádobě· Při vsádkovém způsobu lze s výhodou využít rychlé sedimentace částic o velikosti 80 až 300 ^um na místě obvykle používané centrifugace. Volba velikosti částic sorbentů se řídí technickými parametry zařízení, které je pro separaci k dispozici. Výhodné fyzikálně-chemické vlastnosti těchto sorbentů podstatně zlepšují možnost komplexního zpracování lidské nebo zvířecí krevní plasmy na požadované produkty. Odolnost sorbentů proti vysokým tlakům dovoluje pracovat rychle a standardně, s možností přesné reprodukce pracovních postupů a s možností automatizace celého separačního procesu. Charakter nosiče umožňuje uskutečnit průtok tekutin tlakově, dodržovat časový limit jednotlivých operaci a optimalizovat jejich průběh. Pokud jsou koagulační faktory připraveny jako koncentráty jednotlivých faktorů ve více nebo i méně purifikovaném stavu, lze je po stabilizaci (například sacharidy) za určitých podmínek pasteurizovat za účelem inaktivace eventuelně přítomných virů infekční hepatitidy nebo virů HIV. Způsob podle vynálezu tedy podstatně zdokonaluje a ekonomizuje společensky důležitou výrobu významných krevních derivátů a tím přispívá ke zlepšení léčebné a preventivní péče. Funkčně čisté koncentráty mají použití v diagnostice. Koncentrátu faktoru II+X lzeSorbents based on synthetic matrix DEAE-hydroxyethyl methacrylates and DEAE-hydroxyethyl acrylates, which are known, commercially available products of Czechoslovak origin (QEAE-Spheron, LACHEMA Srno and Separon HEMA OEAE, TE55EK, Prague) used in carrying out the process of the invention. based on DEAE polysaccharides. Synthetic matrix is not attacked by microbial flora, does not change its properties when changing physico-chemical conditions, sorbents are very durable and can be used for a long time without changing sorption properties. In preparing coagulation factor concentrates, it is useful in certain cases to add proteinase inhibitors to the plasma and buffers used to prevent autoactivation, such as benzamidine. Autoactivation of coagulation factors can also be reduced by performing a separation process at a temperature of + 4 ° to + 10 ° C. Separation can be carried out on a column in a chromatographic arrangement or batchwise in a vessel. In a batch process, rapid sedimentation of particles of 80 to 300 µm in size at the place of conventional centrifugation can be advantageously used. The choice of sorbent particle size is governed by the technical parameters of the equipment available for separation. The advantageous physicochemical properties of these sorbents substantially improve the possibility of complex processing of human or animal blood plasma into the desired products. The high pressure resistance of the sorbents allows to work quickly and standardly, with the possibility of accurate reproduction of the work processes and with the possibility of automation of the entire separation process. The character of the carrier enables the flow of fluids by pressure, keeping the time limit of individual operations and optimizing their course. If the coagulation factors are prepared as concentrates of individual factors in a more or less purified state, they can be pasteurized under stabilization (for example, carbohydrates) under certain conditions to inactivate any infectious hepatitis viruses or HIV viruses present. Thus, the method of the invention substantially improves and economizes the socially important production of significant blood derivatives and thus contributes to improving medical and preventive care. Functionally pure concentrates are used in diagnostics. The factor II + X concentrate can be

CS 275998 8 6 využít k průkazu a kvantitativnímu stanovení faktoru VII v krevní plasmě a tělních tekutinách. Totožnost separovaných koagulačních faktorů lze prokazovat funkčními, to je koagulačními a enzymatickými, testy nebo testy na principu reakce antigen-protilátka.CS 275998 8 6 to detect and quantify Factor VII in blood plasma and body fluids. The identity of the separated coagulation factors can be demonstrated by functional, i.e., coagulation and enzymatic, or antigen-antibody reaction assays.

V následujících příkladech provedení je uvedeno pro ilustraci několik možností zpracování krevní plasmy nebo plasmatických frakcí způsobem podle vynálezu. Tyto příklady však vynález pouze ilustrují, ale nijak neomezují na podmínky v nich uvedené.In the following examples, several possibilities of treating plasma or plasma fractions by the method of the invention are illustrated to illustrate. However, these examples are merely illustrative of the invention but are not limited to the conditions set forth therein.

Příklad 1Example 1

Příprava koncentrátu koagulačních faktorů II, VII, IX a XPreparation of concentrate of coagulation factors II, VII, IX and X

Jako zdroje koagulačních faktorů je použito lidské normální plasmy (nativní čerstvé plasmy nebo tak zvané K-plasmy, to je plasmy zbavené kryoprecipitátu) s kontrolovaným pH 7,4-0,1. 100 ml plasmy se přivede do styku s DEAE-hydroxyetylmetakrylátovým gelem na sloupci, který byl ekvilibrován výchozím, pufrem pH 7,4 (0,01 mol/1-terciární citrát sodný obsahující 0,1 mol/1 chlorid sodný). Zrnění sorbentu 100 yum. Po sorpci koagulačních faktorů jsou nesorbované a slabě vázané bílkoviny odstraněny promytím výchozím pufrem s koncentrací 0,2 mol/1 chloridu sodného. Oesorpce všech ostatních bílkovin, které po promytí zůstaly ve vazbě s iontoměničem, je provedena jednorázovým zvýšením koncentrace chloridu sodného v pufru na 1,0 až 2,0 mol/1. V získaném eluátu jsou lokalizovány všechny faktory tak zvaného protrombinového komplexu: faktor II, VII, IX, X a protein C. Frakce je dále zpracována na roztok vhodný k substituční terapii. Pomoci sorbentus průměrným obsahem OEAEskupin (1,2 až 1,3'mekvivalentů/g) a velikostí částic 80 až 100 /um je uvedeným postupem separováno z normální lidské plasmy 60 až 90 % faktorů protrombinového komplexu. Tyto faktory představují hlavní bílkovinný podíl získaného koncentrátu.Human normal plasma (native fresh plasma or so-called K-plasma, i.e. cryoprecipitate-free plasma) with a controlled pH of 7.4-0.1 is used as a source of coagulation factors. 100 ml of plasma is contacted with a DEAE-hydroxyethyl methacrylate gel on a column that has been equilibrated with the initial pH 7.4 buffer (0.01 mol / l sodium tertiary citrate containing 0.1 mol / l sodium chloride). Sorbent grain 100 yum. After the coagulation factors are adsorbed, the unabsorbed and weakly bound proteins are removed by washing with 0.2 M sodium chloride starting buffer. The resorption of all other proteins that remained in the bond with the ion exchanger after washing is performed by a one-time increase in sodium chloride concentration in the buffer to 1.0 to 2.0 mol / l. All the factors of the so-called prothrombin complex: factor II, VII, IX, X and protein C are localized in the eluate obtained. The fraction is further processed into a solution suitable for substitution therapy. Using sorbentus with an average content of OEAE groups (1.2-1.3 equivalents / g) and a particle size of 80-100 µm, 60-90% of the prothrombin complex factors are separated from normal human plasma by this procedure. These factors represent the major protein fraction of the concentrate obtained.

Regenerace sorbentu je provedena intensivním promytím sorbentu citrátovým pufrem obsahujícím 2,0 mol/1 chloridu sodného, pak destilovanou vodou a pufrem, který je výchozí při dalším použití ionexu.The sorbent regeneration is accomplished by intensive washing of the sorbent with citrate buffer containing 2.0 mol / L sodium chloride, then with distilled water and a buffer that is the starting material of the next ion exchange resin.

Příklad 2Example 2

Příprava koncentrátu faktorů II+X, vedle faktoru IX a vedle faktoru VIIPreparation of Factor II + X concentrate, in addition to Factor IX and Factor VII

100 ml lidské plasmy je pasážováno přes sloupec OEAE-hydroxyetylnietakrylátu za stejných podmínek jako v příkladu 1. Po vymytí balastních bílkovin citrátovým pufrem pH 7,4 s obsahem 0,2 mol/1 chloridu sodného je eluce provedena solným gradientem od 0,2 do 0,8 mol/1 chloridu sodného v pufru pH 7,4 za kontroly bílkovin vytékajících ze sloupce registračním fotometrem při vlnové délce 280 nm. Při koncentraci chloridu sodného 0,3 až 0,4 mol/1 je ze sloupce el.uována frakce obsahující faktor IX, při koncentraci 0,45 až 0,55 mol/1 vytéká ze sloupce roztok obsahující veškerý podíl faktorů II a X a při koncentraci chloridu sodného 0,7 až 0,8 mol/1 vytéká podíl obsahující funkčně čistý faktor VII. Pro některé účely je vhodné spojit frakce s obsahem faktoru IX a II+X v jediný podíl. V tomto případě je výhodné eluci provést stupňovitým způsobem. Při koncentraci chloridu sodného 0,5 mol/1 je získána frakce obsahující faktory IX, II a X, zvýšením koncentrace chloridu sodného na 0,8 mol/1 je eluována frakce s lokalizovaným faktorem VII. Ve všech případech se proces odehrává v citrátovém pufru pH 7,4. Získaný koncentrát faktorů IX, II a X je prostý faktoru VII a koncentrát faktoru VII je prostý ostatních faktorů protrombinového komplexu. Kvantitativní poměry jsou obdobné jako v příkladu 1.100 ml of human plasma is passaged through a column of OEAE-hydroxyethyl nitroacrylate under the same conditions as in Example 1. After washing off the ballast proteins with 0.2 M citrate buffer pH 7.4 containing sodium chloride, elution is performed with a salt gradient of 0.2 to 0 , 8 mol / l sodium chloride in pH 7.4 buffer, under control of the proteins exiting the column with a registration photometer at 280 nm. At a sodium chloride concentration of 0.3 to 0.4 mol / l, a fraction containing factor IX is eluted from the column, at a concentration of 0.45 to 0.55 mol / l a solution containing all of the factors II and X flows out of the column and a sodium chloride concentration of 0.7 to 0.8 mol / l flows out containing a functionally pure factor VII. For some purposes, it is appropriate to pool the fractions containing factor IX and II + X in a single fraction. In this case, it is advantageous to perform the elution in a stepwise manner. At a sodium chloride concentration of 0.5 mol / l, a fraction containing factors IX, II and X is obtained; by increasing the sodium chloride concentration to 0.8 mol / l, the fraction with localized factor VII is eluted. In all cases, the process takes place in citrate buffer pH 7.4. The factor IX, II and X concentrate obtained is free from factor VII and the factor VII concentrate is free from other factors of the prothrombin complex. The quantitative ratios are similar to those of Example 1.

Příklad 3Example 3

Příprava koncentrátu protrombinu (faktoru II) z promývacího roztoku (0,4 mol/1 acetát sodný pH 7,4) získaného při separaci antitrombinu III (čs. A0 263 615) z lidské plasmy.Preparation of prothrombin concentrate (factor II) from a washing solution (0.4 mol / l sodium acetate pH 7.4) obtained by separating antithrombin III (ref. A0 263 615) from human plasma.

Odpadová frakce získaná při separaci antitrombinu III na heparin-hydroxyetylmetakrylátu obsahuje vedle menšího množství koagulačních faktorů IX, X a proteinu C značně protromblnu, který lze separovat způsobem podle vynálezu.The waste fraction obtained in the separation of antithrombin III into heparin hydroxyethyl methacrylate contains, in addition to a smaller amount of coagulation factors IX, X and protein C, a significant amount of prothrombin, which can be separated by the process according to the invention.

fc3 CS 275998 B 6fc3 EN 275998 B 6

100 ml promývacího pufru je naředěno destilovanou vodu na dvojnásobný objem a filtrováno přes sloupec DEAE- hydroxyetylnietakrylátu ekvilibrovaného 0,2 mol/1 acetátem sodným pH 7,4 velikosti 1,5 x 20 cm. Po sorpci a promytí sloupce 0,2 mol/1 acetátovým pufrem je eluce provedena chloridem sodným podle příkladu 1 a 2.100 ml wash buffer is diluted to twice the volume of distilled water and filtered through a column of DEAE-hydroxyethyl methacrylate equilibrated with 0.2M sodium acetate pH 7.4, 1.5 x 20 cm. After the sorption and washing of the column with 0.2 mol / l acetate buffer, the elution is carried out with sodium chloride according to Examples 1 and 2.

Příklad 4Example 4

Příprava koagulačních faktorů protrombinového komplexu z etanolové frakce IIIPreparation of coagulation factors of prothrombin complex from ethanol fraction III

Jako výchozí surovina slouží etanolová frakce III získaná při frakcionaci lidské krevní plasmy etanolem obsahující protrombin vedle menšího množství faktoru IX, X a VII. 100 g této frakce v podobě vlhké sraženiny je suspendováno v 1 litru citrátového pufru pH 7,4 (0,01 mol/1) s obsahem 0,1 mol/1 chloridu sodného. Po 2 h míchání při 0 až 4 °C je suspenze centrifugo vána a supernatant je po případné filtraci zpracován podle příkladu 1 nebo 2.Ethanol fraction III obtained by fractionating human blood plasma with prothrombin-containing ethanol in addition to minor amounts of factor IX, X and VII serves as starting material. 100 g of this wet precipitate fraction is suspended in 1 liter of pH 7.4 (0.01 mol / l) citrate buffer containing 0.1 mol / l sodium chloride. After stirring at 0 to 4 ° C for 2 h, the suspension is centrifuged and the supernatant is treated according to Example 1 or 2 after optional filtration.

Příklad 5Example 5

Příprava koagulačních faktorů protrombinového komplexu z hovězí plasmyPreparation of coagulation factors of prothrombin complex from bovine plasma

Postupuje se podle příkladu 2 s tím, že jako výchozí surovina je použita hovězí plasma získaná z krve odebrané do 3,8 % hmot. citrátu sodného v poměru 1 : 9. Získaný koncentrát faktoru II+X slouží jako reagens k průkazu faktoru VII v plasmě a tělních tekutinách lidí a skotu, což umožňuje průkaz mastitidy skotu analýzou mléka.The procedure of Example 2 is followed except that bovine plasma obtained from blood collected up to 3.8% by weight is used as starting material. sodium citrate at a ratio of 1: 9. The obtained Factor II + X concentrate serves as a reagent to detect Factor VII in the plasma and body fluids of humans and cattle, which allows the detection of bovine mastitis by milk analysis.

Claims (6)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Způsob přípravy koncentrátů koagulačních faktorů z lidské nebo zvířecí krevní plasmy nebo z jejich frakcí, to je koagulačních faktorů II, VII, IX a X, vyznačující se tím, že se výchozí surovina uvádí ve styk se sorbentem na bázi dietylaminoetylhydroxymetakrylátových nebo dietylaminoetyl-hydroxyetylakrylátových polymerních iontoměničů, předem ekvilibrovaných pufrem s hodnotou pH 7,2 až 7,6 s přísadou chloridu sodného, načež se po ukončené sorpci koagulačních faktorů odstraní balaštní bílkoviny promytím stejným pufrem s 0,2 mol/1 chloridu sodného a desorpce bílkovinných podílů, obsahujících faktory ΙΓ, VII, IX a X se provádí elucí pufrem, obsahujícím chlorid sodný v koncentraci 0,3 až 2,0 mol/1.Process for the preparation of coagulation factor concentrates from human or animal blood plasma or fractions thereof, i.e. coagulation factors II, VII, IX and X, characterized in that the starting material is contacted with a sorbent based on diethylaminoethyl hydroxymethyl methacrylate or diethylaminoethyl hydroxyethyl acrylate polymer ion exchangers pre-equilibrated with a pH 7.2 to 7.6 buffer containing sodium chloride, after which the coagulation factors are removed by washing with the same buffer of 0.2 mol / l sodium chloride and desorption of protein fractions containing the factors VII, VII, IX and X are eluted with a buffer containing sodium chloride at a concentration of 0.3 to 2.0 mol / l. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako pufru s hodnotoupK 7,2 až 7,6 používá citrátového pufru, obsahujícího 0,01 mol/1 terciárního citrátu sodného a 0,1 mol/1 chloridu sodného.2. A process according to claim 1, wherein the buffer having a pH value of 7.2 to 7.6 is a citrate buffer containing 0.01 mol / l of tertiary sodium citrate and 0.1 mol / l of sodium chloride. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako pufru s hodnotu pH 7,2 až 7,6 používá 0,2 mol/1 roztoku acetátu sodného.3. The process according to claim 1, wherein a buffer of pH 7.2 to 7.6 is used with a 0.2 mol / l sodium acetate solution. IAND 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se výchozí surovina uvádí ve styk se sorbentem průtokově nebo vsádkově.4. A process according to claim 1, wherein the starting material is contacted with the sorbent by flow or batch. 5. Způsob podle bodu 1 až 4, vyznačující se tím, že se do výchozí suroviny a pufru přidává inhibitor proteinázové aktivity koagulačních faktorů.5. A method according to any one of claims 1 to 4, wherein a proteinase inhibitor of the coagulation factors is added to the starting material and buffer. 6. Způsob podle bodu 1 až 5, vyznačující se tím, že se proces provádí při teplotě +2 až +4 °C,6. A method according to any one of claims 1 to 5, wherein the process is carried out at a temperature of +2 to +4 ° C.