CS270410B2 - Method of biologically active substance production with immunostimulating effect - Google Patents

Abstract

1. Immunomodulating medicament of biological origin, of which the active principle is formed by the products of lysis or a fraction of these products of bacteria lysed by bacteriophagic route, characterised in that it contains, as active principle, the sterile lysis filtrate of at least two bacteria lysed by homologous bacteriophagic route ; the bacteria chosen being Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli.

Description

(57) Léčivo ovlivňující imunitní odpověd je tvořeno produkty lýze nebo frakcí produktů lýze bakterií rodu Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus nebo jiných pomocí bakteriofágů. Provede se prvé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedeiých rodů, během fáze růstu se bakterie uvedeného rodu infikují četností 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů a sleduje se vývoj lýze až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na ml. Pak se provede druhé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedených rodů. Během fáze růstu bakterií druhého rodu se bakterie tohoto druhého rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů. Sleduje se vývoj lýze těchto bakterií druhého rodu až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na ml. Nakonec se odstraní nelyžované bakterie a odebere se filtrát lýze získaný od obou rodů bakterií.(57) The medicinal product affecting the immune response consists of the lysis products or fractions of the lysis products of bacteria of the genus Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus or others using bacteriophages. A first inoculation of the culture broth with the inoculum of a bacterium of one of the genera is carried out, during the growth phase, the bacteria of said genus are infected with a frequency of 0.01 to 0.1 by introducing their respective phages. per ml. A second inoculation of the culture broth is then carried out with an inoculum of bacteria of one of the genera mentioned. During the growth phase of the second genus, the bacteria of the second genus are infected with an infection rate of 0.01 to 0.1 by introducing their respective phages. The development of lysis of these second genus bacteria is monitored to a specified degree of 10 to 1000 bacteria per ml. Finally, the non-lysed bacteria are removed and the lysis filtrate obtained from both genera of bacteria is collected.

CS 270 410 B2CS 270 410 B2

Vynález se týká způsobu přípravy imunomodulačních léčiv biologického původu.The invention relates to a process for the preparation of immunomodulatory drugs of biological origin.

Je známo mnoho přípravků upravujících imunitní odpověň frakcemi nebo extrakty lyžovaných mirobiálních buněk. Lze citovat zejména produkty popsané ve francouzských patentech č. 2 374 042, 2 396 018 a 2 426 470.Many preparations are known to modulate the immune response by fractions or extracts of lysed mirobial cells. Particular mention may be made of the products described in French patents 2,374,042, 2,396,018 and 2,426,470.

Tyto lyzáty nebo extrakty se obvykle získávají fyzikálními, chemickými nebo méně často enzymatickými postupy. I když většina těchto přípravků má určitou imunomodulační aktivi tu projevující se u zvířat, je jejich therapeutická účinnost u člověka teprve předmětem řady prací (Immunopharmacologie clinique. Realités et Perspectives G. RENOUX. Pharmacologs et thérapeutique. R.P. 1982, 32, 41-42).These lysates or extracts are usually obtained by physical, chemical or less often enzymatic processes. Although most of these formulations have some immunomodulatory activity in animals, their therapeutic efficacy in humans is only the subject of a number of studies (Immunopharmacologie clinique. Realités et Perspectives G. RENOUX. Pharmacologs et thérapeutique. R.P. 1982, 32, 41-42).

Bylo proto důležité nalézt léčiva, která by představovala jak pro humánní, tak pro veterinární medicínu zbraň použitelnou vždy, když se jedná o potřebu obnovit nebo zesílit imunitní obranu. <It was therefore important to find drugs that would be a weapon applicable to both human and veterinary medicine whenever there was a need to renew or strengthen immune defense. <

Byl nalezen nový způsob přípravy využívající bakteriofágu. Bakteriofágu, který představuje výborný prostředek pro bakteriální lyži, bylo použito prd výrobu imunomodulačních přípravků s různými rody a druhy bakterií. Tato technika bakterielní lyže pomocí bakteriofágu není omezena pokud se týká rodu nebo druhu bakterií· Tento způsob umožnil získat léčiva vynikající svými schopnostmi upravit imunitní systém, připravená z jednoho nebo více druhů bakterií nebo ze směsi těchto druhů bakterií. Tato láčiva mají zejména schopnost navodit tvorbu interferonů.A new preparation method using bacteriophage has been found. Bacteriophage, which is an excellent agent for bacterial lysis, has been used to produce immunomodulatory preparations with different genera and species of bacteria. This bacterial lysis technique using bacteriophage is not limited as to the genus or species of bacteria. This method has made it possible to obtain drugs excellent in their ability to modify the immune system, prepared from one or more species of bacteria or a mixture of these species. In particular, these pharmaceuticals have the ability to induce the production of interferons.

Tato léčiva ovlivňující imunitní odpověcí, jejichž účinná látka je tvořena produkty lyže nebo frakcí lyže bakterií bakteriofágem podle vynálezu, obsahují jako účinnou látku produkty lyže nejméně dvou bakterií odpovídajícími bakteriofágy.These immune response medicaments, the active ingredient of which is a lysate product or a fraction of lyses of bacteria by a bacteriophage according to the invention, contain as active substance lysate products of at least two bacteria by the corresponding bacteriophages.

Z bakterií lze jmenovat například Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus. Zejména zajímavý je přípravek získaný s použitím bak terií rodů Klebsiella a Escherichia.Bacteria include, for example, Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus. Of particular interest is the preparation obtained using the species of Klebsiella and Escherichia.

Získané léčivo lze kombinovat s přípravkem antibiotickým, jako jsou tetracykliny, antivirovým, jako jsou synthetické nukleosidy blokující synthesu virové kyseliny nukleové, antifungálním, jako je buklosamid, nebo antiparasitárním, jako je chlorochin. ,The obtained drug may be combined with an antibiotic preparation such as tetracyclines, antiviral such as synthetic nucleosides blocking the synthesis of viral nucleic acid, antifungal such as buclosamide, or antiparasitic such as chloroquine. ,

Léčivo získané způsobem podle vynálezu lze též kombinovat s jinými farmaceutickými pro dukty a komposicemi, jako například prostředkem protinádorovým (cytostatika), prostředkem imunosupresivním (antilymfocytární imunoglobuliny), prostředkem potlačujícím mitosy, jako jsou deriváty kyseliny listové, nebo protizánětlivým, jako je indomethacin.The medicament obtained by the method of the invention may also be combined with other pharmaceutical products and compositions, such as an anti-tumor agent (cytostatics), an immunosuppressive agent (antilymphocytic immunoglobulins), a mitosis suppressant such as folic acid derivatives, or an anti-inflammatory such as indomethacin.

Léčivo připravené způsobem podle vynálezu lze aplikovat v různých formách lntradermál ně, subkutánně, sublinguálně, místně, perorálně, parenterálně nebo bronchiálně. Podle potřeby se léčivo smíchá s vhodným vehikulem a používá se ve formě vodného nebo alkoholického roztoku nebo supspenze v olejovém vehikulu, nebo ve formě lyofilizované nebo jako aerosol nebo mast.The medicament prepared by the method of the invention may be administered in various forms by intradermal, subcutaneous, sublingual, topical, oral, parenteral or bronchial. If desired, the medicament is mixed with a suitable vehicle and used in the form of an aqueous or alcoholic solution or suspension in an oily vehicle, or in the form of a lyophilized or aerosol or ointment.

Dávkování léčiva vyrobeného způsobem podle vynálezu se může měnit v širokých mezích podle složení léčiva, podle předepsané indikace, formy podávání a věku léčeného subjektu. Stanovení vhodných dávek při ovlivňování imunitní odpovědi je ponecháno к úvaze lékaři nebo veterináři, jak je to obvyklé.The dosage of the drug produced by the method of the invention may vary within wide limits depending on the composition of the drug, the prescribed indication, the form of administration and the age of the subject being treated. The determination of appropriate doses in influencing the immune response is left to the discretion of the physician or veterinarian as is conventional.

Tak například může denní dávkování při léčení chronických nebo recidivujících infekcí dýchacích cest, při prevenci pooperačních komplikací nebo při profylaxi infekcí močových cest spočívat v dávkách od 1 do 50 ml, podle koncentrace imunomodulačního přípravku.For example, daily dosages for the treatment of chronic or recurrent respiratory tract infections, for the prevention of postoperative complications or for the prophylaxis of urinary tract infections may range from 1 to 50 ml, depending on the concentration of the immunomodulatory agent.

CS 270 410 B2CS 270 410 B2

Léčivo vyrobené způsobem podle vynálezu je výborným způsobem tolerováno; jeho toxicito je nízká, jak ukazuje test OL^q, který nemohl být dokončen per os vzhledem к Žaludeční ka pacitě použitých pokusných zvířat (myši, krysy).The medicament produced by the method of the invention is well tolerated; its toxicity is low, as shown by the OL ^ q test, which could not be completed orally due to the gastric capacity of the test animals (mice, rats).

Léčiva získaná způsobem podle vynálezu jsou zejména indikována při léčení poruch imunitní odpovědi, při prevenci nebo léčení závažných infekcí bakteriálních, virových, fungál nich nebo parazitárních, jakož i v reumatologii a při zajizvování a ochraně ran.In particular, the medicaments obtained by the method according to the invention are indicated in the treatment of immune response disorders, in the prevention or treatment of serious bacterial, viral, fungal or parasitic infections, as well as in rheumatology and in the scarring and protection of wounds.

Podstatou způsobu výroby biologicky aktivní látky s imunostimulačním účinkem, která je tvořena produkty lýze nebo frakcí produktů lýze bakterií rodu Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus nebo jiných pomocí bakteriofágů podle vynálezu je, že se provede prvé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho ze shora uvedených rodů, během fáze růstu se bakterie uvedeného rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze až do stanoveného stupně, který Činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, pak se provede druhé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedených druhů, během fáze růstu bakterií druhého rodu se bakterie tohoto druhého rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze těchto bakterií druhého rodu až do stanovení stupně, který Činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, nakonec se odstraní nelyžované bakterie a odebere se filtrát získaný od obou rodů bakterií. Odstranění nelyžovaných bakterií a bakteriálních zbytků se provede způsobem odborníkům známým, jako je filtrace, centrifugace atp. Způsob podle vynálezu lze s výhodou realizovat s postupným použitím bakterií rodu Klebsiella a Escherichia.The method for producing a biologically active substance having an immunostimulatory effect, which consists of the lysis products or the fraction of the lysis products of bacteria of the genus Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus or the other using bacteriophages according to the invention is that , during the growth phase, the bacteria of said genus are infected with an infection rate of 0.01 to 0.1 by introducing their respective phages, monitoring the lysis development to a predetermined level of 10 to 1000 bacteria per milliliter, then inoculating the culture broth a second time bacteria of one species, during the growth phase of the bacteria of the second genus, the bacteria of the other genus are infected with an infection rate of 0.01 to 0.1 by introducing their respective phages, monitoring the development of lysis of these bacteria of the second genus until a degree of 10 to 1 000 bacteria per milliliter, finally remove the non-lysed bacteria and collect the filtrate obtained from both genera. Removal of non-lysed bacteria and bacterial residues is accomplished by methods known to those skilled in the art, such as filtration, centrifugation, and the like. The process according to the invention can advantageously be carried out by successive use of Klebsiella and Escherichia.

Oále jsou uvedeny příklady provedení, které vynález objasňují, aniž by jej omezovaly.The following are exemplary embodiments that illustrate the invention without limiting it.

Příklad 1Example 1

Příprava vycházející z jedné bakterie rodu EscherichiaPreparation based on one bacterium of the genus Escherichia

Použitá bakterie Je rodu Escherichia, druhu coli, serotyp 0119 : В 14, zaregistrovaná Pasteurovým ústavem v Paříži pod číslem 62.23.The bacterium used is of the genus Escherichia, coli species, serotype 0119: В 14, registered by the Pasteur Institute in Paris under number 62.23.

Colifág patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomise Taxonomie bakteriofá gů International Comittee for Taxonomy of Virus I.A.M.S.). Má izometrickou hlavičku, velmi krátký ocas, který je těžko prokazatelný, pouzdro a koncovou destičku, které nejsou vidět. Na agaru mají dvorce lyže průměr 1 až 1,5 mm, okrouhlou formu, pravidelné okraje, zakalený střed a klony ^{r 7} sbíhavé.The colifage belongs to the morphological group (Nomenclature of the Subcommittee on Taxonomy of Bacteriophages of the International Committee for Taxonomy of Virus IAMS). It has an isometric head, a very short tail that is hard to detect, a sleeve and end plate that are not visible. On agar, the backyards of the skis have a diameter of 1 to 1.5 mm, a round form, regular edges, a cloudy center, and converging clones ^{r 7} .

Kultivační půda obsahuje na litr: hovězí extrakt 2,5 g, pepton 4,1 g, chlorid sodný 7,0 g, zbytek redestilovaná voda.The culture medium contains per liter: bovine extract 2.5 g, peptone 4.1 g, sodium chloride 7.0 g, the rest redistilled water.

Půda se naočkuje inokulem bakterií, které jsou ve fázi exponenciálního růstu. Počáteční hustota kultury je 1.10^ bakterií na ml. Inkubace se provádí při 37 °C za mírného míchání.The soil is inoculated with an inoculum of bacteria that are in an exponential growth phase. The initial density of the culture is 1 .mu.g bacteria per ml. Incubation is performed at 37 ° C with gentle agitation.

Uprostřed fáze exponenciálního růstu, to jest přibližně 60 minut po naočkování se bak terie infikují svými příslušnými fágy. Infikuje se 0,02 násobně.In the middle of the exponential growth phase, i.e. approximately 60 minutes after inoculation, the bacteria are infected with their respective phages. Infect 0.02 fold.

Rozvoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk předem kalibrovaného. Když bývá méně než 1 000 bakterií na ml, provede se sterilní filtrace průchodem filtrační membránou o porozitě blízké 0,22 ajm. Filtrát lyže tvoří již imonomodulační přípravek.Ski development is monitored using a cell calibrated in advance. When less than 1,000 bacteria per ml are used, sterile filtration is performed by passing through a filter membrane having a porosity close to 0.22 µm. The ski filtrate is already an imonomodulatory preparation.

CS 270 410 B2CS 270 410 B2

Příklad 2Example 2

Příprava vycházející z jedné bakterie rodu StreptococcusPreparation based on one bacterium of the genus Streptococcus

Použije se bakterie rodu Streptococcus, druhu faecalis, varianta zymogenes, která je registrována Pasteurovým ústavem v Paříži pod číslem 53.152.The bacterium of the genus Streptococcus, faecalis species, variant of zymogenes, registered by the Pasteur Institute in Paris under number 53.152 shall be used.

Fág patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomise Taxonomie bakteriofáqú International Commitee for Taxonomy of Virus I.A.M.S). Jeho hlavička je isometrická, ocas dlouhý, použdro viditelné a koncová destička je komplexní. Na agaru jsou dvorce lyže okrouhle, iiiohsí наг u,B Hint v průměru, jtijioh okraje jsou pravidelné na strad čirý. Nejsou lani klony ^{r T} anebo jen jediný.The phage belongs to the morphological group (nomenclature of the Taxonomy of bacteriophages subcommittee of the International Community for Taxonomy of Virus IAMS). Its head is isometric, the tail is long, the case is visible and the end plate is complex. On agar, the backyard skis are round, iiiohsi наг, B Hint on average, jtijioh's edges are regular to strad clear. There are no ^{r T} clones or only one.

Kultivační půda obsahuje na litr: hovězí extrakt 0,3 g, tryptasu 1,0 g, dextrosu 1,0 g, chlorid sodný 0,5 g, zbytek redestilovanou vodu.The culture medium contains per liter: bovine extract 0.3 g, tryptase 1.0 g, dextrose 1.0 g, sodium chloride 0.5 g, the rest redistilled water.

Půda se naočkuje inokulem bakterií, které jsou ve stacionární fázi. Počáteční hustota je 1.10⁷ bakterií na ml. Uloží se do tmy při teplotě 37 °C za mírného míchání.The soil is inoculated with bacteria in stationary phase. The initial density is 1.10 ⁷ bacteria per ml. Store in the dark at 37 ° C with gentle stirring.

Na počátku fáze exponenciálního růstu, to jest přibližně 40 minut po naočkování, se bakterie infikují svými příslušnými fágy. Četnost Infekce je 0,1.At the beginning of the exponential growth phase, i.e. approximately 40 minutes after seeding, the bacteria are infected with their respective phages. The infection rate is 0.1.

Rozvoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Když zbývá ménč než 10 bakterií na ml, kultura se sterilně odstředí, aby se odstranily lyzogenní bakterie a nelyžované bakterielní buňky. Zbytek je imunomodulační přípravek.Ski development is monitored using a cell counter. When less than 10 bacteria per ml remain, the culture is sterile centrifuged to remove lysogenic bacteria and non-lysed bacterial cells. The rest is an immunomodulatory preparation.

Příklad 3Example 3

Příprava s postupným použitím bakterií rodu Klebsiella a EscherichiaPreparation with the gradual use of Klebsiella and Escherichia

Bakterie rodu Klebsiella, druhu pneumoniae, je registrována Pasteurovým ústavem v Paříži pod čínlum 50.5.The bacterium of the genus Klebsiella, a species of pneumoniae, is registered by the Institute of Pasteur in Paris under chimney 50.5.

Bližší údaje o použité bakterii rodu Escherichia jsou uvedeny v příkladu 1.Further details on the bacterium of the genus Escherichia are given in Example 1.

Fág příslušný Klebsielle patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomise Taxonomie baktariofágů International Committee for Taxonomy of Virus I.A.M.S.). Hlavičku má lkosaedrickou, ocas krátký, těžko prokazatelný. Pouzdro a koncová destička nejsou zjistitelné. Na agaru mají dvorce lyže průměr 0,5 až 3 mm a mají tvar velmi nepravidelný, s rozplývajícími se okraji a čirým středem. Klony ^{r T} jsou řídké.The Klebsielle phage belong to the morphological group (Nomenclature of the Subcommittee on Bacterariophage Taxonomy of the International Committee for Taxonomy of Virus IAMS). The head has a lkosaedrickou, tail short, hard to detect. The housing and end plate are not detectable. On agar, the backyard skis have a diameter of 0.5 to 3 mm and have a very irregular shape with melting edges and a clear center. Clones ^{r T} are sparse.

Vlastnosti colifágu jsou popsány v příkladu 1.The properties of colifag are described in Example 1.

Kultivační půda obsahuje na litr: hovězí extrakt 3 g, popton 5 g, chlorid sodný 7 g, zbytek redestilovaná voda.The culture medium contains per liter: beef extract 3 g, popton 5 g, sodium chloride 7 g, the rest redistilled water.

Půda se naočkuje inokulem Klebsielly pneumoniae ve fázi stacionárního růstu. Počáteční hustota je 1.10⁷ bakterií na ml. Kultura se zahřívá na 37 °C za mírného míchání.The soil is inoculated with Klebsielly pneumoniae inoculum in the stationary growth phase. The initial density is 1.10 ⁷ bacteria per ml. The culture is heated to 37 ° C with gentle stirring.

Ke konci latentní fáze, to jest přibližné za 60 minut po naočkování, se bakterie infikují svými příslušnými fágy.Towards the end of the latent phase, i.e. approximately 60 minutes after seeding, the bacteria are infected with their respective phages.

Četnost infekce je 0,03.The infection rate is 0.03.

Vývoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Jakmile zbývá méně než 10 bakterií na ml , půda se znovu naočkuje inokulem Escherichia ve fázi stacionárního růstu. Počáteční hustotaThe development of the ski is monitored using a cell counter. As soon as less than 10 bacteria per ml remain, the soil is inoculated with the Escherichia inoculum in the stationary growth phase. Initial density

CS 270 410 B2 této nové kultury je 5.10? Escherichia na ml.CS 270 410 B2 of this new culture is 5.10? Escherichia per ml

Ke konci fáze latence, což je za těchto pokusných podmínek 20 minut po druhém naočkování, se bakterie infikují colifágy. Četnost infekce je 0,1.Towards the end of the latency phase, which is 20 minutes after the second inoculation under these experimental conditions, the bacteria are infected with colifages. The infection rate is 0.1.

Vývoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Když zůstane méně než 10^ Escherichia na ml, kultura se ponechá projít sterilizační filtrační membránou o 0,22 ^um. Získaný filtrát lyže získaný od dvou bakterií, a to Klebsiella pneumoniae a Escherichia coli, představuje imonomodulační přípravek.The development of the ski is monitored using a cell counter. When less than 10 µm Escherichia per ml remains, the culture is allowed to pass through a 0.22 µm sterilizing filter membrane. The obtained lysate filtrate obtained from two bacteria, Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli, is an immunomodulatory preparation.

Příklad 4Example 4

Příprava a použití jedné bakterie rodu StaphylococcusPreparation and use of one bacterium of the genus Staphylococcus

Bakterie rodu Staphylococcus, druh aureus, seřotyp 1 je registrována Pasteurovým ústa vem v Paříži pod číslem 65.6.A bacterium of the genus Staphylococcus, aureus species, serotype 1 is registered by Pasteur's mouth in Paris under number 65.6.

Příslušný fág Staphylococca patří do morfologické skupiny (nomenklatura subkomice Taxonomie bakteriofágů International Committee for.Taxonomy of Virus.de I I.A.M.S.). Má hlavičku oktaedrickou a ocas úplně přikrytý pouzdrem a komplexní koncovou destičkou. Na agaru mají dvorce lyže průměr I až 2 mm, jsou okrouhlé a pravidlené, jejich střed je čirý. Nejsou tam žádné klony ^{r T} .The respective Staphylococca phage belong to the morphological group (subcommittee Nomenclature of the bacteriophage taxonomy International Committee for Taxonomy of Virus.de IAMS). It has an octahedral head and the tail is completely covered with a holster and a complex end plate. On agar, the backyard skis have a diameter of 1 to 2 mm, are round and regular, their center is clear. There are no ^{r T} clones.

Bakterie se rozloží na pevnou půdu obsahující na litr: bílkovinný pepton č. 3 Oifco 10,0 g, dextrosu 1,2 g, rozpustný škrob 6,0 g, chlorid sodný 3,0 g, fosforečnan sodný 2,0g, Bacto želatinu 13,0 g, Bacto agar 6,0 g, destilovanou vodu q.s.The bacteria are decomposed into solid soil containing per liter: protein peptone No. 3 Oifco 10.0 g, dextrose 1.2 g, soluble starch 6.0 g, sodium chloride 3.0 g, sodium phosphate 2.0 g, Bacto gelatin 13 0 g, Bacto agar 6.0 g, distilled water qs

Po 24 hodinách se mikroorganismy, které vytvořily hustý bakteriální koberec, sterilně seberou, očíslují a znovu suspendují v půdě obsahující na 1 litr: hovězí extrakt 2,5 g, pepton 4,1 g, chlorid sodný 7,0 g, redestilovanou vodu q.s. tak, aby byla hustota 5.10⁶ bakterií na ml.After 24 hours, the microorganisms that formed the dense bacterial carpet are sterile collected, numbered and resuspended in soil containing per liter: bovine extract 2.5 g, peptone 4.1 g, sodium chloride 7.0 g, redistilled water qs so to a density of 5.10 ⁶ bacteria per ml.

Současně se vnesou do půdy odpovídající fágy. Četnost infekce je 0,01.At the same time, corresponding phages are introduced into the soil. The infection rate is 0.01.

• 2• 2

Vývoj lyže se sleduje pomocí počítače buněk. Jakmile zbývá méně než 10 bakterií na ml, provede se filtrace membránou o porozitě přibližně na 0,22 um. Filtrát lyže již tvoří imunomodulační přípravek.The development of the ski is monitored using a cell counter. Once less than 10 bacteria per ml are left, membrane filtration is performed with a porosity of approximately 0.22 µm. The lysate filtrate already constitutes an immunomodulatory preparation.

Farmakologická studie: ’Pharmacological Study:

Účinky přípravků podle vynálezu u zvířat byly prokázány přípravkem odpovídajícím filtrátu lyže Escherichie coli získanému způsobem popsaným v příkladu 1. Filtrát byl lyofilizován, pak znovu rozpuštěn vesterilní destilované vodě. Faktor koncentrace tohoto nového roztoku byl vyjádřen ve srovnání s přípravkem před lyofilizací.The effects of the formulations of the invention in animals were demonstrated by the formulation corresponding to the Escherichie coli ski filtrate obtained as described in Example 1. The filtrate was lyophilized, then redissolved in sterile distilled water. The concentration factor of this new solution was expressed compared to the formulation prior to lyophilization.

Ochranný účinek proti akutní bakteriální infekciProtective effect against acute bacterial infection

Tento test prokazující celkovou simulaci imunitního systému byl proveden s mikroorganismy vyvolávajícími infekci, odlišnými od těch, kterých bylo použito při výrobě léčiva podle vynálezu, a to proto, aby bylo zřejmé, že přípravek není účinný svou případnou schopností vakcinační nebo přímým působením jako bakteriofág, nýbrž stimulací imunitní obrany.This test, demonstrating an overall simulation of the immune system, was performed with infectious microorganisms different from those used in the manufacture of the medicament of the invention, in order to make it clear that the preparation is not effective by its potential vaccine or direct action as bacteriophage but by stimulating immune defense.

Byly zkoušeny dva mikroorganismy, a to Klebsiella pneumoniae, bakterie s vývojem intracelulárním, a Staphylococcus aureus, bakterie s vývojem extracelulárním.Two microorganisms, Klebsiella pneumoniae, bacteria with intracellular development, and Staphylococcus aureus, bacteria with extracellular development, were tested.

CS 270 410 B2CS 270 410 B2

Bakterie vyvolávající infekci byly podány skupinám 10 samic švýcarských myší o průměr né hmotnosti 18 g dne D_Q intraperitoneální injekcí o objemu 0,5 ml.Bacteria causing infection were given to groups of 10 female Swiss mice weighing 18 g on day D _{Q by} intraperitoneal injection of 0.5 ml.

Imunomodulační přípravek byl aplikován injekčně den předcházející infekci 0 j. Jde tedy o zjišťování preventivního účinku. Přípravek byl podán intraperitoneálně nebo intravenózně, aby se vyloučil případný kladný výsledek dosažený přímým vlivem přípravku na mikroorganismy v okamžiku podání injekce.The immunomodulatory preparation was injected the day before the infection was 0. The product was administered intraperitoneally or intravenously in order to avoid a possible positive result from the direct effect of the product on microorganisms at the time of injection.

Aby se zjistila virulence mikroorganismu vyvolávajícího infekci, která se může pohybovat v širokých mezích od jednoho pokusu ke druhému, byla jeho letální dávka stanovena při každém testu.In order to detect the virulence of the infectious microorganism, which can vary within wide limits from one experiment to another, its lethal dose was determined in each test.

Ochranný účinek přípravku vyrobeného způsobem podle vynálezu proti skutní bakteriální infekci je dokumentován v následující tabulce I.The protective effect of the preparation according to the invention against the actual bacterial infection is documented in the following Table I.

Tabulkal 'Tabulkal '

bakterie bacteria aplikace application přípravku preparation přežívající surviving (%) (%) vyvolávající infekci causing infection ^DL50 ^DL 50 cesta way objem volume □ avKa faktor koncentrace □ avKa concentration factor po aplikaci přípravku (n=10) after application (n = 10) kontrola (n=10) control (n = 10) P P

Klebsiella Klebsiella 10'² 10 ' ² i.p. i.p. 1,0 ml 1.0 ml 1 1 X X 0 0 10 10 NS NS 10”³ 10 ” ³ i.p. i.p. 1,0 ml 1.0 ml 1 1 X X 70 70 30 30 0,050 0.050 Ю'^{4 4} ' ⁴ i.p. i.p. 1,0 ml 1.0 ml 1 1 X X 100 100 ALIGN! 20 20 May 0,001 0.001 10’² 10 ' ² i.v. i.v. 0,5 ml 0.5 ml 1 1 X X 20 20 May 10 10 NS NS 10~³ 10 ~ ³ i.v. i.v. 0,5 ml 0.5 ml 1 1 X X 80 80 20 20 May 0,025 0,025 10“⁴ 10 “ ⁴ i.v. i.v. 0,5 ml 0.5 ml 1 1 X X 100 100 ALIGN! 20 20 May 0,001 0.001 Staphyloco- Staphyloco- 10’² 10 ' ² i.p. i.p. 1,0 ml 1.0 ml 1 1 X X 10 10 10 10 NS NS ccus aureus ccus aureus 10’³ 10 ' ³ i.p. i.p. 1,0 ml 1.0 ml 1 1 X X 80 80 10 10 0,001 0.001 10'² 10 ' ² i. v. i. v. 0,5 ml 0.5 ml 1 1 X X 10 10 20 20 May NS NS 10’³ 10 ' ³ i. v. i. v. 0,5 ml 0.5 ml 1 1 X X 100 100 ALIGN! 30 30 0,001 0.001

Stimulace fagocytárního účinku makrofágůStimulation of phagocytic effect of macrophages

Halpernův.test (Stiffel С., 1958. ΰ. Phys. 58, 911-949) spočívá v tom, že se myším aplikují intravenózně částice koloidního uhlíku, které jsou řagocytovány zejména retikuloendotheliálními buňkami jater a sleziny. Rychlost jejich čištění odpovídá fagocytárnímu účinku. Maří se tím, že se stanovují fotometricky v závislosti na čase volné částice zbylé v krvi. Jako referenční látka se používá LPS, což je lipopolysacharidický endotoxin extrahovaný z endobakterií, který je silným aktivátorem makrofágů.The Halper test (Stiffel С., 1958. Phys Phys. 58, 911-949) consists in injecting mice intravenously with colloidal carbon particles, which are mainly coagulated by reticuloendothelial cells of the liver and spleen. The speed of their purification corresponds to the phagocytic effect. They are frustrated by the determination of the free particles remaining in the blood photometrically against time. LPS, a lipopolysaccharide endotoxin extracted from endobacteria, is a potent activator of macrophages.

Test se provádí následujícím způsobem:The test is performed as follows:

- skupinám po 5 samicích švýcarských myší o průměrné hmotnosti 24 g se aplikuje intraperitoneálně 0,6 ml filtrátu z Escherichia coli nebo roztoku LPS (lipopolysacharidy) o koncentraci 0,625 £jg/ml.- groups of 5 female Swiss mice with an average weight of 24 g were administered intraperitoneally with 0.6 ml of Escherichia coli filtrate or LPS (lipopolysaccharide) solution at a concentration of 0.625 µg / ml.

- po 24 hodinách se myším aplikuje intravenpzně 0,12 ml suspenze koloidního uhlíku obsahující 32 mg/ml uhlíku v 4 želatině.- after 24 hours, the mice are injected intravenously with 0.12 ml of a colloidal carbon suspension containing 32 mg / ml carbon in 4 gelatin.

CS 270 410 02CS 270 410 02

- během 12 minut se myším odebere každé 2 minuty 20 <ul krve z retroorbitální dutiny. Tato odebraná krev se okamžitě zředí 4 ml 1% Na₂C0j. Roztok se pak měří fotometricky.- within 12 minutes, 20 µl of blood from the retro-orbital cavity is collected every 2 minutes from the mice. This collected blood is immediately diluted with 4 ml of 1% Na ₂ CO 3. The solution is then measured photometrically.

- otluč í tóní ox tlnkcQ no provádí při 620 nm, .the knotting of the oxonocyanate is carried out at 620 nm,.

- koncentrace koloidního uhlíku v krvi v čase t pokusu se zjistí odečtením na předem sentnvnnó kalibrované únečce. Fagocytární index ee vypočte podle následujícího vzorem . i.p. . .12Β.9₂-:-^0-5ι ' ^Tz - ^Ti přičemž C₂ a Cj představují koncentraci koloidního uhlíku v krvi při posledním a prvním odběru krve, T? a T^ představují okamžik těchto odběrů.- the colloidal carbon concentration in the blood at time t of the experiment is determined by subtraction on a pre-calibrated handle. The phagocytic index ee is calculated according to the following pattern. ip. .12Β.9 ₂ -: - ^ 0-5ι ' ^T z - ^T i where C ₂ and Cj represent the concentration of colloidal carbon in the blood at the last and first blood collection, T? and T 1 represent the moment of these subscriptions.

Výsledky shrnuté v tabulce II prokazují, že účinek peritoneálních makrofágů myší je stimulován po intraperitoneálním podání přípravku.The results summarized in Table II demonstrate that the effect of mouse peritoneal macrophages is stimulated after intraperitoneal administration of the formulation.

Tabulka II přípravek (filtrát lyže E. со1Д pomocí bakteriofágu) neočkovaný bujón (negativní kontrola)Table II preparation (E. lyophilized lysate filtrate using bacteriophage) unvaccinated broth (negative control)

LPS (positivní kontrola) aplikace . objem injekce I.P.LPS (positive control) application. injection volume I.P.

0,6 ml 0,028 - 0,0030.6 ml 0.028 - 0.003

0,6 ml 0,012 - 0,0010.6 ml 0.012 - 0.001

0,6 ml ; 0,025 - 0,0020.6 ml; 0.025 - 0.002

Schopnost navodit tvorbu sérového interferonu (IFN sérový) *Ability to induce serum interferon (IFN serum) production *

IFN je glykoprotein o molekulové hmotnosti 10*000 až 20 000 daltonů. Má mnoho imunomodulačních účinků, zejména stimuluje aktivitu buněk NK (Natural Killer). Způsob jeho účinku je ještě ve stadiu zkoumání. Jeho účast na protivirové obraně je jasně prokázána.IFN is a glycoprotein having a molecular weight of 10,000 to 20,000 daltons. It has many immunomodulatory effects, in particular it stimulates the activity of Natural Killer (NK) cells. Its mode of action is still under investigation. His involvement in anti-virus defense is clearly proven.

Ově hodiny po podání přípravku 8 samicím švýcárskýcg myší o hmotnosti 25 g se od každé odebere 0,3 ml krve do neheparinizované zkumavky. Sérový IFN se stanovuje klasickým způ sobem tím, že se měří cytopathický efekt viru VSV (Vesicular Stonatitis Virus) infikující myší buňky L kultivované 24 hodin v přítomnosti séra, které se eá testovat. (Havell E.A. a Vilček J., Antimicrob. Agents Chemotherapy 2, 476-484, 1972). Navozený ochranný účinek IFN se srovnává s účinkem IFN myším, což je mezinárodní standard z National Institute of Health, Bethesda, Sp.st. am. . .Verify hours after administration of 8 female 25 g Swiss mice, 0.3 ml of blood is collected from each into a non-heparinized tube. Serum IFN is determined by the classical method of measuring the cytopathic effect of Vesicular Stonatitis Virus (VSV) infecting mouse L cells cultured for 24 hours in the presence of serum to be tested. (Havell E.A. and Vilcek J., Antimicrob. Agents Chemotherapy 2, 476-484, 1972). The induced protective effect of IFN is compared to that of IFN in mice, an international standard from the National Institute of Health, Bethesda, Sp.st. am. . .

Přípravek navozuje sérový IFN u myší dvě hodiny po jeho intraperitoneálním, intraveniním nebo perorálním podání, jak je zřejmo z tabulky III.The preparation induces serum IFN in mice two hours after its intraperitoneal, intravenous or oral administration, as shown in Table III.

CS 270 410 B2CS 270 410 B2

Tabulka IIITable III

cesta way produkt product objem volume faktor koncentrace concentration factor U.I. IFN/ml U.I. IFN / ml i.p. i.p. přípravek preparation 1*5 ml 1 * 5 ml 80 80 1058 1058 placebo placebo 1*5 ml 1 * 5 ml 80 80 0 0 i. v. i. v. přípravek preparation 0*7 ml 0 * 7 ml 80 80 950 950 placebo placebo 0*7 ml 0 * 7 ml 80 80 0 0 p.o. after. přípravek preparation 1*0 ml 1 * 0 ml 1000 1000 1200 1200 placebo placebo 1*0 ml 1 * 0 ml 1000 1000 0 0

Aktivita u člověka byla testována s přípravkem podle příkladu 3 aplikovaným nejprve u dobrovolníka* pak u nemocného.Human activity was tested with the formulation of Example 3 applied first to a volunteer * then to a patient.

Dvojitý slepý pokus provedený u 15 dobrovolných pacientů umožnil prokázat* že perorální podání přípravku způsobí po 10 dnech značné zvětšení imunitních odpovědí zprostředkovaných buňkami. .A double-blind, conducted in 15 volunteer patients, made it possible to demonstrate that oral administration of the preparation caused a significant increase in cell-mediated immune responses after 10 days. .

Druhý pokus provedený u 25 pacientů ukázal* že jediná perorální podání různých dávek přípravku umožnilo navodit po 24 hodinách tvorbu sérového lymfokinu typu MIF - LIF. Toto navození je odvislé od dávky. ’A second experiment conducted in 25 patients showed that a single oral administration of different doses of the product allowed the induction of serum lymphokine type MIF - LIF after 24 hours. This induction is dose dependent. ’

Několik pokusů umožnilo prokázat stimulaci tvorby IFN lymfocyty a monocyty lidskými získanými separcí buněk.Several attempts made it possible to demonstrate the stimulation of IFN production by lymphocytes and monocytes by human cell separation.

IFN* jehož tvorba byla navozena přípravkem.* byl charakterizován za použití antisera anti-IFN * nebo . Jeho tvorba je závislá od použité dávky.IFN * whose production was induced by. * Was characterized using anti-IFN * antisera or. Its production is dose-dependent.

Oále je popsáno několik klinických pokusů jako příklady.Several clinical trials are described below as examples.

Prevence a léčení chronických nebo recidivujících infekcí dýchacích cest.Prevention and treatment of chronic or recurrent respiratory tract infections.

Dvě skupiny po 25 pacientech postižených chronickými nebo recidivujícími bakterlálníní infekcemi v oblasti bronchopulmonární byly léčeny perorálním podáním v jedné skupině 15 ml přípravku vyrobeného způsobem podle vynálezu, a to 20 dnů za měsíc po‘dobu šesti měsíců, v druhé skupině klasicky antibiotiky. Snížení počtu vážných infekčních příhod během šesti měsíců trvání pokusu je podstatně větší u skupiny léčené přípravkem vyrobeným způsobem podle vynálezu než u skupiny léčené klasicky antibiotiky.Two groups of 25 patients affected by chronic or recurrent bacterial bronchopulmonary infections were treated by oral administration in one group of 15 ml of the preparation according to the invention for 20 days per month for six months, in the other group of classical antibiotics. The reduction in the number of serious infectious events over the six months duration of the experiment is considerably greater in the group treated with the preparation of the invention than in the group treated with classical antibiotics.

Prevence pooperačních infekcíPrevention of postoperative infections

Perorální aplikace 20 ml přípravku umožnila snížit významným způsobem infekční pooperační komplikace u 106 pacientů ve srovnání se snížením u 72 jiných nemocných léčených klasicky.Oral administration of 20 ml of the formulation made it possible to significantly reduce infectious postoperative complications in 106 patients, compared with a reduction in 72 other patients treated with classical therapy.

Prevence a léčení infekcí močových cestPrevention and treatment of urinary tract infections

Čtyři autoři sledovali v klinickém rozsahu účinek shora uvedeného přípravku u pacientů postižených chronickou nebo recidivující infekcí močových cest. Perorální podání 15 ml za den* po 20 dnů za měsíc během tří měsíců umožnilo významně snížit frekvenci a délku infekčních příhod jakož! spotřebu protiinfekčních léčiv během šesti měsíců pozorování ve srovnání se šesti měsíci předcházejícími léčení.Four authors studied the effect of the above preparation in patients affected by chronic or recurrent urinary tract infection to a clinical extent. Oral administration of 15 ml per day * for 20 days per month within three months allowed a significant reduction in the frequency and duration of infectious events as well as! consumption of anti-infective drugs during the six months of observation compared to the six months prior to treatment.

CS 270 410 B2CS 270 410 B2

Při všech pokusech byla tolerance přípravku považována za vynikající, a to jak lékařen, tak pacientem (dobrovolníkem nebo nemocným).In all experiments, the tolerance of the product was considered excellent, both by the physician and by the patient (volunteer or ill).

Claims (2)

PŇEDMÉT VYNÁLEZUSUBJECT OF THE INVENTION 1. /půuub výroby biologicky aktivní látky в lmunostlmulačním účinkem, která jo vytvofonu produkty lýze nebo frakcí těchto produktů lýze bakterií pomocí bakteriofágů, přičemž použitá bakterie jsou rodu Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus nebo jiné, vyznačující se tím, Že se provede prvé naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho ze shora uvedených rodů, během fáze růstu se bakterie uvedeného rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, pak se přistoupí ks druhému naočkování kultivační půdy inokulem bakterií jednoho z uvedených rodů, během fáze růstu bakterií druhé rodu se bakterie tohoto druhého rodu infikují četností infekce 0,01 až 0,1 vnesením jejich příslušných fágů, sleduje se vývoj lýze těchto bakterií druhého rodu až do stanoveného stupně, který činí 10 až 1 000 bakterií na mililitr, nakonec se odstraní nelyžované bakterie a odebere se filtrát lýze získaný od obou rodů bakterií.(1) a method of producing a biologically active substance in an immunostimulating effect which produces lysis products or fractions of these lysis products by bacteria using bacteriophages, the bacteria being of the genera Escherichia, Streptococcus, Klebsiella, Staphylococcus or other, characterized in that the first inoculation is carried out culture broths by inoculating bacteria of one of the genera mentioned above, during the growth phase, the bacteria of that genus are infected with an infection rate of 0.01 to 0.1 by introducing their respective phages, and the lysis development is monitored up to a predetermined degree of 10 to 1,000 bacteria per milliliter , then proceed to the second inoculation of culture broth with an inoculum of bacteria of one genus, during the growth phase of the bacteria of the second genus, the bacteria of that second genus are infected with an infection rate of 0.01 to 0.1 by introducing their respective phages; up to set In this step, 10 to 1000 bacteria per milliliter are finally removed, and the lysate filtrate obtained from both genera of bacteria is removed. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, Že lýzi působením příslušných bakteriofágů se podrobí bakterie rodů Klebsiella a Escherichia.2. A method according to claim 1, characterized in that the bacteria of the genera Klebsiella and Escherichia are subjected to lysis by the respective bacteriophages.