CS253589B2

CS253589B2 - Method of sunflower seed lines' high oiliness finding

Info

Publication number: CS253589B2
Application number: CS844461A
Authority: CS
Inventors: Nicholas P Everett
Original assignee: Stauffer Chemical Co
Priority date: 1983-06-15
Filing date: 1984-06-13
Publication date: 1987-11-12
Also published as: PT78746A; BR8402913A; GR82155B; ZA844495B; IT8448397A0; US4552844A; FR2547981A1; TR22284A; FR2547981B1; ES533422A0; PT78746B; CS446184A2; ES8601300A1; RO91650B; IL72095A0; IT1177797B; HUT34542A; RO91650A

Description

Vynález se týká umělého prostředí pro růst rostlin a jeho použití pro suspensní buněčné kultury a zjišťování obsahu oleje.

Zvyšování polního výnosu je časově náročný a značně pracný úkol, který často vyžaduje intensivní vyuuití cenné zemmědlské půdy. Obbykle je u určité plodiny pozorována žádoucí vlastnost, která je bud zkřížena s jnným druhem této plodiny, nebo zdůrazněna nebo zpětně zkřížena s rodičovskou linií a pak zpětně křížena s rodičovskou linií po mnoho geneeací.

Je-li vlastnost, pro kterou je zahájen pěssitelský program, manňfestována pouze v semeni, nebo plodu dospělé ro^t^Uny, pak je doba a pracnost, nutná pro zhodnocení kandidáta pro určitý pěěsitelský program, maaimální. Obsah oleje v plodech slunečnice je vlastnossí, kterou bylo dosud možno stanoovt pouze přímým hodnocením obsahu oleje ve zralém se^e^e^í. zí obsahu oleje u kandidátů pro program produkce slunečnicového oleje tradičními metodami tedy vyžadovalo ááaiááání náklady, pokud jde o čas, pracnost a půdu.

Značné úspory těchto nákladů by bylo možno dosáhnout, kdyby bylo možno stanooit obsah oleje v semáni daného kandidáta před dozráním rostliny. Výhodné by bylo provádět takové stanovení ve velmi časné fázi životního cyklu slunečnice, s nízkými nebo žádnými nároky na půdu a s minimálními nároky na čas.

Nyní bylo nalezeno prostředí pro růst rostlin, které umooňuje pěstovat Heeianthus annuus v suspensní buněčné kultuře. Plody nebo semena H. annuus jsou zdrojem slunečnicového oleje. PPoužtelnost prostředí tedy spočívá v jeho tchoppnoti pěstovat buněčnou kulturu H. annuus, důležité olejniny, a umoonnt m^nni^i^li^c^di s buňkami- za účelem šlechtění druhu.

Bylo rovněž zjišěěno, že p^ssjuL-I^í se buňky slunečnicové tkáně v suspensním prostředí, mohou být růstové chaaaakeeřstiky buněk v kultuře korelovány s vysokým stupněm přesnooti s obsahem oleje v sem^r^í^ch celé rostliny. Konkrétně bylo zjišěěno, že sus^ensni buněčné kultury mohou být vypěstovány z hypokktylových segmentů slunečnicových semenáčů. Navíc mohou bát suspensní buněčné kultury vypěstovány z kalusu odvozeného z prakticky kterékoli slunečnicové tkáně včetně semenáčů a plně vzrostlých rostlin. Popisované prostředí je poulitelné při zkoumání olejnatosti perspeekivních linií slunečnicového osiva bez nároků na pracnost, půdu nebo dobu, obvyklých při polních pokusech. Metoda suspensních buněčných kultur může být pou^ta ke snížení počtu perspeekivních linií slunečnicového, osiva, které ma^í být podrobeny polním pokusům, na mnohem menší skupinu, která má vysokou pravděpodobnost vysoké olejnatosti .

Jak bude zřejmé odborníkům v oboru rosťm^ých tkáňových kultur, ummoňuje výše popsaná metoda suspensní kultivace slunečnicových buněk alteraci, selekci jednoUivých slunečnicových buněk, které byly geneeicky pozměněny různými prostředky včetně fyzikální a chemické mutagenese nebo transOoránce pomocí kyseliny desoxyrobonukleové (DNA) z organismů jnných než slunečnice.

Předmětem vynálezu je způsob zjišťování vysoké olejnatoski slunečnicových semenných linií, jehož podstata spočívá v tom, že tkáň zkoumaných semenných linií se kultivuje v suspensním prostředí, obsáhniícím základní soU, vitaminy zahhnniící inosškol, thiaáinhyddooClooid, kyselinu nikotinovou a pyridoiinhydroodooid, rostlinné hormony, sacharosu a kokosovou vodu po dobu 14 dní a vyberou se ty slunečnicové semenné linie, které ma^í pětkrát větší naplněný buněčný objem než je objem než je objem původní slunečnicové tkáně.

Základní sdi, obsažené v prostředí používaném při způsobu podle vynálezu, jsou založeny na mediu obsáhnuícím minerální soU (MS medium) podle Murashigeno a Skooga. Toto medium se používá pro rostl^né buněčné kultury a je popsáno v Murashuge T., Skoog, F., Phhysologia plantaTum, 15, 473 až 497 (1962).

Prossřecdí, používané při způsobu podle vynálezu, obsahuje obvykle násseddúící soU: ' heptahydrát sulfátu hořečnatého MgSO₄.VH₂O dihydrát chloridu vápenatého CaCl₂ 2^O nitrát draselný KNO3 nitrát amonný NH^NO^ fosfát draselný KH^gPO₄ tetrahydrát sulfátu mmnganatého №11504.^20 heptahydrát sulfátu zinečnatého ZnSO₄-7H2O pentahydrát sulfátu mědnatého CuSO₄.5H₂O hexahyddát chloridu kobaltnatého CoCl₂.6H20 jodid draselný KI kyselina aoritá н₂ВОз směsný oxid sodíku a molybdenu - dihydrát Na Μ0Ο4.2Η2Ο heptahydrát sulfátu železnatého Fe SO4.7H2O sodná sůl kyseliny etylendiamintetraoctové NaEDTA

Přesná koncentrace přípravy prostředí však solí se obecně může pohybovat v určitých meeích. Pro standardisaci byla zvolena tato koncentrace základních solí:

MJSO4.7H2O	370	mg/1
CaC^ . 2H2O	440	mg/1
KNO₃	1 900	mg/1
NH4NO3	1 650	mg/1
kh₂po₄	170	mg/1
MnSO4.4H₂O	22,3	mg/1
ZnSO4.7H2O	8,6	mg/1

0,025 mg/1

CUSO4.5H2O

CoC1₂.6H2O

KI

0,83 mg/1

H3BO3

6,2 mg/1

Na₂Mo0₄.2H₂0

0,25 mg/1

FeS0₄.7H2O

28,75 mg/1 ^EDTA

37,25 mg/1

K prostředí se přidávají následující vitaminy v uvedeném mnořžsví:

inositol až asi

500 mg/1 thiaminhydrochlorid kyselina nikotinová pyridoxinhydrochlorid

až	asi	40	mg/1
až	asi	0,20 mg/1
až	asi	4	mg/1

mnnřžsví dostatečném k podpoření intensivního růstu se v prostředí pěstuje. Výhodné je složení 100 mg/1

Vitaminy jsou příoomny obecně v suspense slunečnicových buněk, která inositolu, 40 mg/1 thiaminhydrochloridu, 20 mg/1 kyseliny nikotinové a 4 mg/1 pyridoxinhydrochloridu.

Pros Středí obsahuje dále rostlinné hormony. Mezi pouuitelné hormony patří axiny a cytokininy. ·

V prostředí byly použity různé hormony auxinrvélr typu, například ksyelina i naftalenoctová (NAA) , kyselina indolmáselná (IBA), kyselina indoloctová (IAA) a kyselina 2,4-dlcHorfenoxyoctová (2,4-D) Auxiny mohou být požity v různých konccenracích a získané výsledky se obecně pohybuuí v rozmezí koncentrace zkoušených auxidů. Kooncnnrační rozmezí různých auxinU jsou

NAA asi 0,01 až 10 mg/1

IBA asi 1 až 10 mg/1

IAA asi 1 až 4 mg/1

2,4-D asi 0,01 až 1 mg/1

V prostředí byly použity různé hormony cytokininového typu, například benzyladenin (BA) , zeaún (Z , ^kineti.n (K) a NyA^-^o^nt^a^nin (2iP) . Cy^yokininov^é liormony ^bylyrovněž použity v různých konceenracích a výsledky se obecně pohybují v rozm^;^í koncentrace zkoušených cytokininů. Kooncenrační rozm^5^:í různých cytokininů jsou obecně mezi asi 0,1 mg/1 a asi 10 m^/1· Obvykle se dává přednost BA a K.

Kromě uvedených kompooent obsahuje prostředí podle vynálezu sacharosu. Kooncnnrace sacharosy se může měnnt, ale obvykle je obsaženo takové mnnožtví, aby umoonélo podpořen! růstu buněk. Kooncenrace sacharosy je tedy obvykle 30 mg/1,

Popisované prostředí rovněž obsahuje kokosovou vodu (GibCo) v mnnoství až asi 20 % objemových. Ootiimální koncentrace je asi 10 % objemových.

Formulace prostředí podle vynálezu jsou dále otw^1tleey na příkladech provedení, které však nijak nnomenzží rozsah vynálezu.

V příkladech byla po^ušta slunečnicová semena 100 experimentálních genotypů. Expoeimeenální genotypy vycházely z různého genetického pozadí a prošly alespoň 5 generacemi pěstění a opakované selekce.

Pro pozorování bylo vybráno několik individuálních fenotyoických rysů, které jsou klasifioovány v dále uvedené tabulce I.

Krřteria pigmentace rostliny a semenáče jsou uvedena v tabulce. Olejnatost semen je vysvětlena v dále uvedeném příkladu 2. Indukce kalusu se stanovuje visuálním porovnáním nxperimeenálníeh linií s kontrolními liniemi slunečnicových semen SS 405B a 89B. Růst sžspensní kultury je blíže vysvětlen v příkladu 2. Indukce tumoru se zjišťuje po dobu 7 dní na klíčících semenech každého výpěstku, načež se semenáče LnjLižjí kulturami AA/obacterium tumefaciens km^i^e 15 955, A208 a C58, získanými přes noc. Inokulované semenáče se pěstují 7 dní pod Ag/roltes a tumory nesoucí hypokoty 1 se vyříznou a pěstují na agarovém mediu. Po 7 dnech inkubace na světle se zaznamenává velikost tumoru. Odrůdy slunečnice, vykaazíící dobrý růst tumoru, mají rychle rostoucí tumory indukované všemi třemi kulturami A. tumenaciens. Odrůdy se špatným růstem tumoru maaí tumory indukované jednou nebo žádnou kulturou A. tumefjeinnt. Odrůdy vykáazuící střední růst maaí pomalu rostoucí tumory indukované všemi třemi kulturami A. tumefaciens nebo rychlo rostoucí tumory indukované dvěma ze tří kultur A. tžmefjeinnt.

Tvorba nahodilých výhonků se stanovuje knut^vací čtyř vrcholů výhonků semenáčů u každé ze 100 odrůd slunečnic na mediu pro výhonků pod A^gr^oi^-tes po dobu tří týdnu.

Tvorba 5 nebo více nahodilých výhonků se zaznamenává jako dobrá tvorba výhonků. 1 až 5 nahodilých výhonků je střední tvorba výhonků, žádné výhonky odpooldaaí špatné tvorbě výhonků.

Tabulka I

Relativní proporce experimentálních výpěstků s dobrými (A), středními (B) a špatnými (C) vlastnostmi v polní nebo tkáňové kultuře

Počet jedinců ve třídě

Rys	A	B	c
vý^ška rostliny*	28	54	15
XX olejnata^ semen	48	28	21
^pi^gmentace semenáte^	65	17	15
indukce kalusu	26	45	26
růst suspensní kultury	30	30	37
indukce tumoru	10	23	64
regenerace výhonků	7	44	46

x) A = trpasličí nebo polotrpasličí, B = střední, C = vysoká xx) A = vysoká více než 40 %, B = střední 35 až 40 %,

C = méně než 35 % xxx) A = nachový hypokktyl, B = růžový hypokktyl, C = zelený hypokotyl

Přikladl .

Semena 100 experimeenálních linií slunečnice se'nechatí klíčit následujícím způsobem:

Z plodů slunečnice se odstraní okvěěí nebo slupka. Z plodů se odáděl semena a 15 mkn se - steeilují ve 30% bělicím roztoku s 1 až 2 kapkami prostředku na nádobí. Po vypláchnutí ^епШ destiOovanou vodou se semena zasadí po dvou do zkumavek v prostředí 0,5 % sacharosy, 1 % agaru a následujících solí v uvedeném mnnOství:

MgSO₄.7H₂O

CaCl₂.2H₂O

KN0₃

NH4NO3 kh₂po₄

4

370 mg/1

440 mg/1

900 mg/1

650 mg/1

170 mg/1

Semena klíčí ve tmě 4 až 5 dní a pak 1 až 2 dny na svěěle. HyppOokylkvé segmenty naklččených semenáčů o velikosti 2 mm se umíssí do násled^ícího prostředí:

MgSO₄.7H₂O

CaCl₂.2H₂O

KNO3

NH4NO3 kh₂po₄

MnSO..4H2O

ZnSO..7H2O

CuSO₄.5H2O

Na₂MoO..2H20

42

CoCl₂.6H₂0

FeSO4.7H₂O

Na₂EDTA knosi-tol thiamin Hl

370 mg/1

440 mg/1

900 mg/1

650 mg/1

170 mg/1

22,3 mg/1

8,6 mg/1

0,025 mg/1

0,25 mg/1

0,025 mg/1

28,75 mg/1

37,25-mm/l

100 mg/1 mg/1 nikotinová kyselina 22 mg/1 pyridoxin.MC1 1 mg/1 alfanaftalenoctová :

kyselina 1mg/1 benzyladinin 1mg/1 sacharosa 331g/1

H2O destilovaná do 1 000 ml pH6,3 agar6,0 g

Segmenty se kultivují vi tmě po 2 týdny. Drobivý kalus se odstraní a subkultivuji na stejném m^n^íu. Drobivý kalus ji možno uchovat na stinném meliu pro poolití jako suspen'sní buněčná kultura.

Suspensní buněčné kultury sn pěstuií z každého kalusu takto: 1,5 ai 2,0 g čirstvé hmc^t^nosti kalusu sn umíSÍ do sterilní 50 ml kaňky obssahuící 15 ml prostředí o složení .

MgSO₄.7H2O

CaCC₂.2H2O

KNO₃

NH₄NO₃ к^Н2₽о₄

MnSO₄.4H2O ZnSO4.7H2O CuS0₄.5H₂0 CoC1₂.6H₂0 KI

H5BO3

NaMo04>2H20 ‘

2

FnSO₄.7H₂O

NI2EDTA došito!

thiamin.HC1 nikotinová kyselina pyridoxin.HC1 alfanaftaienoctová

370	mg/1
440	mg/1
1 900	mg/1
1 650	mg/1
170	mg/1
22,3	mg/1
8,6	mg/1

0,025 mg/1

0,83 mg/1

6,2 mg g/1

0,25 mg/1

28,75 mg/1

37,27 mg/1

100 mg/1 mg/1 mg/1 íí/1 kyselina kinzyladinin kokosová voda sacharosa

H2O destilovaná pH agar mg/1 mg/1

100 ml/1 g/1 do 1 000 ml koničného objemu

6,3

6,0 g

Kuutury si ο^^^ί 14 dní na rotační třepačci za slabého osvvsiiní (500 ai 1 000 lux) při asi 24 ^ai 28 ^OC. Růst suspensní .^bun^ěčn^é toltury sn měří metodou na^pon^ěn^ého ^bun^ěčn^ého objemu (PVC) tímto způsobem:

Přibližně 15 ml buněčné suspinzi бп umístí do kalblorované clntrilu/ační zkumavky a min odstrkuji při 500násokUu tíhového zrychlení na klinické centrtuuzn s výkyvným rotoiem o poloměru 14,5 cm při rychhosti otáčení 1 800 min ¹ . PVC sn stanoví přímo z ilntrilu/ačnS zkumavky.

Příklad 2

Olejnatr!it slunečnicových snm^n, získaných z jedinců, vypěstovaných na pon ze tlunečnico7 vých linií, zkoumaných v příkladu 1, se podrobí analýze za účelem korelace s charakteristikami buněk v kultuře.

růstovými

Polní testy semen se provádějí v lokalitě Fresno v ΚΙΙϋοηύι. Roosliny v květnu 1981 a sklizeny v srpnu 1981. Řádky byly od sebe vzdáleny 76,2 cm a ^byly o^d se^be vzďáleny ^22,9 cm. ^po s^i-zen:! se semena sušrí ve vz^duchové su^šárn^ě p^ři 49 obsahu vlhkooti méně než 6 %, načež se měěí spektroskooii.

byly zasazeny rostliny v řádku °C do obsah oleje nukleárně magnetickou resonanční se analýzuje pomocí NMR přístroje Newpor Analyzer vzorky slunečnic se používá vzorkovací zařízení

Obsah oleje ve slunečnicových semenech

Mark IIA postupem stanoveným výrobcem. Pro o objemu 6,5 ml. Vzorky se analýzují za teploty místnooti při hladině RF o^dppoV^dělící 225 uA a into^ač^ do^{bě 32} s. Ší^a pouHté ^bran^ky o^dpovíd^á 10 ⁴ T. NM^R analyzátor ^byl standardisován pomx^ií zapečetěného standardu slunečnicového osiva FGIS. Byly použity vzorky o proměnné hmoonnoti (hmoonost se zapisovala na nejbližší 0,01 g). Olejnatost vzorků semen bylá počítána pomocí těchto vzorců:

NMR čtení kalibračního standardu tonst^^ - (hmmonost semena) x ⁽o^bsah oleje u standardu) % oleje =

NMR čtení vzorku semena (hmoonost vzorků) x (konstanta)

Pro všechny vzorky byla použita konstanta 0,2 562.

Pro účely korelční analýzy byly údaje olejnatosti rozděleny do tří kategoorí: vysoká olejnatost (nad 40 % hmooriooti oleje z hmotnos! - celého sem^r^n^) , střední olejnatost (35 až 40 % hmoSnostoích) a nízká olejnatost (pod 35 % hmotnostnch) . Růst buněk v suspensi byl podobně klasifikován ve třech kategoriích: vysoký rů^t > 10 ml PVC, stř^edrní rů^t 6 až 10 ml PVC a nízký růst < 6 ml PVC. Olejnatost byla analýzována na korelaci s růstem buněk v suspensi a indukcí kalusu pomocí čtvercové analýzy CHI po sestrojení kontioneočních tabulek 3x3.

Byla zajištěna významná korelace (0,1 % hladiny pravděpodobnooti P) mezi vysokým růstem buněk v suspensi a vysokou olejnatosti. Na základě těchto výsledků bylo sestaveno schéma olejnatosti s použitím těchto kriterií: Dobrrý růst buněk byl definován jako pětinásobný vzrůst velikosti buněk po 2 týdnech pěstování v suspensní kultuře za podmínek uvedených v příkladu 1. 1,5 až 2,0 n původního kalusového inikula obecně poskytlo 1,5 až 2,0 ml počátečního PVC. Buněčné kultury, vyk^nuící z původních 1,5 až 2,0 g kalusových inokul po 14 dnech pěstování PVC 7,5 ml, byly klasií^ovány jako dobře rostoucí.

Byla rovněž zjištěna významná korelace (0,1 % P) mezi dobrou indukcí kalusu a dobrým růstem suspe^^ní buněčné kultury. Dále byla zjištěna nižší, ale významná korelace mezi dobrou indukcí kalusu a olejnatosti. Z celkové populace zkušebních semenných linií 48 % poskytlo semena s obsahem oleje 40 % nebo vyšším. Be^li se za základ populace semen, která měla dobrou indukci kalusu, tj. čerstvou hmoonost kalusu větší než 2 g, pak obsah oleje 40 % nebo vyšší vykazovalo 63 % odrůd. Beereli se za základ populace těch semenných linií, které měly dobrý r^st suspensní buněčné kultury, tj. asi 5x větší PVC oproti objemu počátečního kalusového inokula, pak obsah oleje 40 % nebo vyšší vykazovalo 81 % linií.

Za účelem zjištění, zda korelace mezi dobrým růstem buněk a vysokou olejnatosti a mezi dobrou indukcí kalusu a vysokou olejnatosti jsou korelacemi s přímou vazbou nebo spíše nepřímými asociacemi přes třetí znak, například výšku rostliny, byly shromážděné údaje pro růst suspense, indukci kalusu, výšku rostliny, obsah oleje, tvorbu výhonků, indukci tumoru a pigmeenaci semenáče zrpacovány stat^i^sriik^s^u mmtodou, známou jako analýza pomocí dráhových koeficientu, popsanou v Path Annlysšs, C. C. Li, Boxwood Press, Paaific Grove Ca. Pomocí této sraristicie metody je možno korelace zkoumaných ihalalitri.stii na korelace přímo a nepřímo vázané na olejcatsst sem^n.

Kolerační koeficienty byly vypočteny s použitím programu Proč Corr ze statistického analytického systému (SAS) a násobná lineární regrese byla provedena s použitím programu Proč GLM SAS. Oba tyto programy poskytuje počítač Digital MINC 23. Hlavní kroky dráhové analýzy jsou:

Σ x

a) normaltsace údajů vyjádřením každého údaje jako odchylky od průměru (tj. X - —----)

b) ponuití normalisovaných údajů k výpočtu korelačních koeeicientů (r) meei všemi kombnacemi proměnných

c) získání konkrétních (nestandardisovaných) regresních (b) z násobné lineární regresní analýzy

d) výpočet dráhových kooficientů (p) mezi dvojicemi proměnných z konkrétního regresního koeficientu a standardních odchylek (o) proměnných pomooí vztahu

e) výpočet nepřímých vlivů třetích znaků, například ^p(olej^---ka^s přes sus^pensi ) ~ Holejf---suspense)^x x í r kalus/suspense)

f) kontrola, zda součet přímých a nepřímých vlivů je roven korelačnímu nap^d-ad %1 + p_o2^ri2 + ^po3^r13 + p_o4r₁₄ = r_Q1 = korelace rnaei proměnnými 0,1.

Popsaným způsobem byly vypočteny dráhové ^o^^enty, ukaazjící přímý vliv jednooiivýoh znaků na olejnatost, a byly pobity k sestrojení jednoduchého dráhového diagramu, znázorněného na přiooenném obr. 1, kde jsou korelace s obsahem oleje nahrazeny dráhovými koeficienty. Hodnoty těchto dráhových ΙωθΗ^π^ ukalzU2Í,_I oe vlastnostmi, které maj statisticky významný přímý vliv na obsah oleje, jsou růst suspenení kultury a výška rostliny. Významné korelace meei indukcí kalusu, pigmentací semenáče a obsahem oleje tedy musseí být důsledkem nepřímých vlivů. Růst slunečnicových buněk v suspensoř kultuře proto může být podšit k odhadu olejnatosti slunečnicových ro^t^lj^n a je výnamnou pomůckou pro výrobu vysoce olejnatých slunečnicových jedinců.

Příklad 3 ,

Tři slunečnicové semenné linie, mající opakovaně vysoký, střední a nízký obsah slunečnicového oleje, se zCouušjí na korelaci růstu ssuřensní buněčné kultury s obsahem oleje.

Semena se nechaaí klíčit jako v příkladu 1. Z naklíčených semenáčů se sterinně získaáí hypokotylové segmeety. Přibližně 1,5 až 2,0 g hypokotylového segmentu z každé semenné linie se ř^ouSije jako tnoCuSum k založení sus^není buněčné kultury místo kalusu. V ostatních ohledech jsou kultury ošetřovány stejně jako v příkladu 1. V každém případě očekávaný vzrůst buněk každé semenné linie po 14 dnech koreloval se známým obsahem oleje v semenné linii.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1 výkres

0.3208

1. Způsob zjišťování vysoké olejnatosti slunečnicových se^^i^i^ých linií, vyznačující se tím, že tkáň zkoumanných semeaaých linií se kultivuje v suspeasaím prostředí, obsahujícím základním soli, vitaminy zahrnující inositol, thičmiahydrocClorid, kyselinu nikotinovou č pyridoxiulyddochlorid, rostlinné hormony, sacharosu č kokosovou vodu po dobu 14 dní č vyberou se ty slunečnicové semenné linie, které mají pětkrát větší naplněný buněčný objem než je objem původní slunečnicové tkáně.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že jako tkáň se použije kalus.

3. Způsob podle bodu 1 vyznnčující se tím, že jako tkáň se p^i^žíž-je hypokotylový segment slunečnicového semenáče.

4. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že tkáň se kultivuje na rotační třepačce při osvětlení 500 až 1 000 lux, načež se zbytky tkáně ze suspensní buněčné kultury odstraní a stanoví se naplněný objem buněk v suspensní kultuře.

5. Způsob podle bodu 4 vyznnččuící se tím, že jako tkáň se pouuije kalus.

6. Způsob podle bodu 4 vyznnčužjcí se tím, že jako tkáň se pouuije hypokotylový segment slunečnicového semenáče.

4------ 0.2523 7 4 0.3051 4 -0.2870 4 4 0.3389 4 4 -0.1141 4 4 4 0.0313 - 0.1470 4 4 4 4 0.3000 - 0.0210 4 44 4 0.5159 -0.0711 -0.0990 -0.0210 0.4786 4 44 44 ' 44 44 4