CS207473B2 - Method of decreasing the contents of lipids and nucleus acids in the microbial cell substance - Google Patents

Abstract

The lipid and nucleic acid content in microbial cell masses is decreased by treating the cell masses with an extraction mixture of ammonia or ammonium hydroxide and an organic solvent of the formula I. After the removal of the extraction mixture, the residue of the cell mass is washed with water and the aqueous phase is removed. The residue is then dried - optionally after extraction with an organic solvent of the formula I. The substituents in the formula I have the meanings given in Claim 1. Instead of a compound of the formula I, isopropanol can be used as organic solvent. R1-(CH2)n-OR2 (I)I

Description

Vynález se týká způsobu snížení obsahu lipidů a nukleových kyselin v mikrobiální buněčné, hmotě. Každá buňka obsahuje uhlohydráty, bílkoviny, lipidy a nukleové kyseliny. Použitelnost mikrobiální buněčné hmoty v potravinářství a jako krmivá je nepříznivě ovlivněna obsahem nukleových kyselin a lipidů.The invention relates to a method for reducing the lipid and nucleic acid content of a microbial cell mass. Each cell contains carbohydrates, proteins, lipids, and nucleic acids. The usefulness of microbial cell mass in food and feed is adversely affected by the content of nucleic acids and lipids.

Obsah nukleových kyselin je závadný z· toho· důvodu, že vede k patologickým, stavům jako je dna a močové kameny. Lipidy omezují skladovatelnost, .protože dochází ke žluknutí, a ovlivňují chuť.The nucleic acid content is defective because it leads to pathological conditions such as gout and urinary stones. Lipids reduce shelf life because of rancidity and affect taste.

Vynález si klade za úkol snížit obsah lipidů a nukleových kyselin v mikrobiální buněčné hmotě. Podle známých způsobů se lipidy buněčné stěny a buněčných membrán vymývají rozpouštěním v organickém rozpouštědle nebo· se zmýdelňují vodným roztokem zásad.It is an object of the present invention to reduce the lipid and nucleic acid content of microbial cell mass. According to known methods, cell wall and cell membrane lipids are eluted by dissolution in an organic solvent or saponified with an aqueous base solution.

Známým způsobem· k rozpuštění lipidů v mikroorganismech je vymývání směsí metanolu a chloroformu. Tento· způsob je pracný a může vést ke vzniku toxických produktů. Extrakce lipidů směsí alkoholu a vody, popsaná v DT-OS 2 405 593 nebo DT-OS číslo 2 137 038, je nevhodná pro· použití u bakterií a nákladná technická vybavení.A known method for elimination of lipids in microorganisms is by washing with a mixture of methanol and chloroform. This method is laborious and can lead to toxic products. The extraction of lipids with an alcohol-water mixture as described in DT-OS 2 405 593 or DT-OS number 2 137 038 is unsuitable for use in bacteria and expensive technical equipment.

Další známé postupy pro· zbavení mikrobiální buněčné hmoty většiny nukleových kyselin a lipidů užívají rozklad pomocí zásad při vyšších teplotách. Nepříznivé je v tomto případě uvolnění volných mastných kyselin, vzniklých při hydrolýze, které se pak oddělují současně· s bílkovinou.Other known methods for depleting microbial cell mass of most nucleic acids and lipids utilize alkali decomposition at higher temperatures. Adverse in this case is the release of the free fatty acids resulting from the hydrolysis, which are then separated simultaneously with the protein.

Z US patentového spisu č. 3 931 772 je znám postup, při němž se sušená buněčná hmota například z Candida utilis extrahuje směsí vody a rozpouštědla typu alkoholu, například 60 až 80 objemovými o/o alifatického alkoholu, například ethanolu, načež se suší. Tímto· způsobem je možno· zlepšit chuť a vůni výsledného produktu, avšak obsah nukleových kyselin zůstává beze změny.U.S. Pat. No. 3,931,772 discloses a process in which dried cell mass, for example from Candida utilis, is extracted with a mixture of water and an alcohol type solvent, for example 60 to 80 vol. In this way, the taste and smell of the resulting product can be improved, but the nucleic acid content remains unchanged.

V US patentových spisech č. 3 615 654 a 3 775 393 a v britském patentovém spisu č. 1 400 691 jsou popsány postupy, směřující ke snížení obsahu nukleových kyselin v kvasinkových buňkách. Podle US patentu číslo 3 615 ·654 se postupuje tak, že se buňky několikrát extrahují velkými objemy kapalného· amoniaku při teplotě —45 až —50·. °C, s výhodou po dobu 24 hodin · v Soxletově přístroji. Při tomto postupu, při němž se spotřebuje velké množství energie, je možno snížit · obsah ribonukleové kyseliny z 8,5 na 1,4 '%. Podle US patentu č. 3 775 393 se postupuje tak, že se kvasinkové buňky zpracovávají vodným roztokem amoniaku v autoklávu při teplotě 121 °C. Obsah nukleové kyseliny přitom klesne z 10,5 na 1,3 %. V britském patentu č. 1400 691 se .snižuje obsah nukleové kyseliny ' v kvasinkových buňkách tak, že se v prvním stupni provádí extrakce . směsi vody a alkoholu, například 'směsí isqpropanolu a ' . vody, která je azeotropní při 80 °C, načež se ve druhém stupni 'směis zpracovává roztokem hydroxidu sodného· .při teplotě 60 °C. Tímto· způsobem je možno .snížit obsah nukleové kyseliny z 9 na 2 °/o. Ve spisu se irovněž uvádí, že druhý stupeň postupu je možno provádět při použití amoniaku nebo· hydroxidu amonného. Přesné údaje .se však neuvádí.U.S. Patent Nos. 3,615,654 and 3,775,393 and British Patent No. 1,400,691 disclose methods for reducing nucleic acid content in yeast cells. According to U.S. Patent No. 3,615,654, the cells are extracted several times with large volumes of liquid ammonia at a temperature of -45 to -50 °. ° C, preferably for 24 hours in a Soxlet apparatus. This method, which uses a lot of energy, can reduce the ribonucleic acid content from 8.5% to 1.4%. According to U.S. Patent No. 3,775,393, the yeast cells are treated with an aqueous ammonia solution in an autoclave at 121 ° C. The nucleic acid content decreases from 10.5 to 1.3%. In British Patent No. 1,400,691, the nucleic acid content of yeast cells is reduced by extraction in the first step. mixtures of water and alcohol, for example 'isopropanol mixtures'. water, which is azeotropic at 80 ° C, after which the mixture is treated in the second step with sodium hydroxide solution at 60 ° C. In this way, the nucleic acid content can be reduced from 9 to 2%. It is also stated that the second stage of the process can be carried out using ammonia or ammonium hydroxide. However, accurate data is not given.

¹ Způsob podle vynálezu si klade za úkol zlepšit známé postupy v tom· smyslu, že je možno snížit obsah lipidů a nukleových kyselin v mikrobiální buněčné hmotě až na' méně než 1 % hmotnostní v případě kyseliny nukleové, a to kombinovanou extrakcí při použití .organického rozpouštědla, zejména typu alkoholu a amoniaku .při teplotě místnosti po dobu 0,5 až 2 hodiny, načež se výsledná směs promyje vodou. ' Způsob podle vynálezu je možno. provádět bez použití nízkých i zvýšených 'teplot, takže je možno. uš<^tiřit energii a tím i způsob podle vynálezu provádět v technickém měřítku. ^One method of the invention aims to improve the known processes in that · the sense that it is possible to reduce the content of lipids and nucleic acids in the microbial cell mass to a 'less than 1% by weight in the case of nucleic acid, and the combined extraction using .organického solvents, in particular alcohol and ammonia, at room temperature for 0.5 to 2 hours, then the resulting mixture is washed with water. The process according to the invention is possible. without using low or elevated temperatures, so that it is possible. In order to save energy and thus to carry out the process according to the invention on a technical scale.

Mimoto. při těchto postupech dochází k tomu, že část základních aminokyselin, obsažených v bílkovinách, například část lysinu, přechází do stavu, v němž je organismus nemůže využít.Moreover. in these processes, a portion of the essential amino acids contained in the proteins, such as a portion of lysine, goes into a state in which the organism cannot utilize them.

¹ Předmětem vynálezu je způsob snížení obsahu lipidů a nukleových kyselin v mikrobiální buněčné hmotě, vyznačující se tím, že .se buněčná hmota extrahuje směsí amoniaku nebo hydroxidu amonného v organickém rozpouštědle obecného. vzorce I ¹ The present invention is a process for reducing the content of lipids and nucleic acids in the microbial cell mass, characterized in that a hydroperoxide cell mass extracted with a mixture of ammonia or ammonium hydroxide in an organic solvent general. of formula I

R-(CH₂}_n-OR₂ , (I) kdeR- (CH ₂ ) _n -OR ₂ , (I) wherein

Ri a Ra znamená atom vodíku a n znamená, celé číslo 1, 2 nebo' 3 neboR 1 and R a are hydrogen and n is an integer of 1, 2 or 3 or

Ri znamená hydroxyskupinu aR 1 is hydroxy and

Rz znamená atom. vodíku, methyl, nebo ethyl, a n znamená celé číslo 2 nebo 3, přičemž celkový obsah vody činí 0 až 30 procent hmotnostních' a obsah amoniaku 1 až' 10 % hmotnostních, vztaženo. na celkovou hmotnost rozpouštědla, a po .oddělení buněčné hmoty z extrakční směsi se. buněčná hmota promyje vodou, vodná fáze se oddělí a po případné extrakci organickým rozpouštědlem obecného vzorce I se buněčná hmota usuší.R2 represents an atom. and n is an integer of 2 or 3, the total water content being 0 to 30 percent by weight and the ammonia content 1 to 10 percent by weight. to the total weight of the solvent, and after separation of the cell mass from the extraction mixture, the cell mass is washed with water, the aqueous phase is separated and, if necessary, extracted with an organic solvent of the formula I, the cell mass is dried.

Mikrobiální buněčnou hmotou jsou s výhodou mikroorganismy, které' 'byly získány pěstováními na alkoholu nebo. nasycených uhlovodících s přímým řetězcem za přítomnosti ' vodného živného. prostředí a plynu s obsahem volného kyslíku. S výhodou jsou těmito. organismy bakterie, kvasinky a houby.Preferably, the microbial cell mass is a microorganism which has been obtained by cultivation on alcohol or. straight chain saturated hydrocarbons in the presence of aqueous nutrient. environment and gas containing free oxygen. Preferably these are. organisms bacteria, yeasts and fungi.

Příkladem těchto mikroorganismů mohou být bakterie, využívající methanol, z čeledi Methylomonas, například Methylomona,s clara ATCC 31 226 nebo' kvasinky Candida lipolytica ATCC 20 383, které je možno získat pěstováním na nasycených uhlovodících s přímým řetězcem- za prítpmnosti vodného. živného' roztoku.Examples of these microorganisms are methanol-using bacteria from the family Methylomonas, for example Methylomona, with clara ATCC 31 226 or yeast Candida lipolytica ATCC 20 383, which can be obtained by growing on saturated straight-chain hydrocarbons with the presence of aqueous. a nutrient solution.

Stejně dobře je možno užít sušené mycelium hub. Tento buněčný materiál je možno získat při výrobě antibiotik, například při fermentaci penicilinu po extrakci antibiotika.Dried mycelium fungi can be used as well. This cellular material can be obtained in the manufacture of antibiotics, for example in the fermentation of penicillin after extraction of the antibiotic.

Jako .rozpouštědlo obecného. vzorce I je možno. užít alkoholy jako methanol, ethanol, n-propanol a isopropanol. Výhodné jsou methanol ' a ethanol, zvláště výhodný je methanol.As a general solvent. of formula I is possible. use alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol and isopropanol. Methanol and ethanol are preferred, methanol is particularly preferred.

Kromě alkoholů je možno užít také glykoly .a jejich monoethery vzorce I, jmenovitě glykol a monomethylglykol.In addition to alcohols, it is also possible to use glycols and their monoethers of the formula I, namely glycol and monomethyl glycol.

Amoniak je možno k uvedeným rozpouštědlům přidat v plynné formě . (NHj) nebo ve formě koncentrovaného vodného roztoku (ΝΗ4ΟΉ). Volba typu amoniaku závisí . na obsahu vody v sušině buněčného materiálu a na množtví a obsahu vody ' v .použitém rozpouštědle. Vodný roztok amoniaku je vhodný při použití buněčné hmoty s malým obsahem vody (0' až 15 %], plynný amoniak je vhodnější při použití buněčné hmoty s vyšším obsahem vody . (10 až 30 ' %].Ammonia can be added to the solvents in gaseous form. (NHj) or as a concentrated aqueous solution (ΝΗ4ΟΉ). The choice of ammonia type depends. the water content in the dry matter of the cellular material and the amount and water content of the solvent used. An aqueous ammonia solution is suitable when using a cell mass with a low water content (0 to 15%), and ammonia gas is more suitable when using a cell mass with a higher water content (10 to 30%).

Podíl lipidů, které je možno odstranit extrakcí amoniakem a rozpouštědlem, závisí na .celkovém· obsahu vody v % hmotnostních, vztaženo- na celkové množství použitého rozpouštědla a na koncentraci plynného amoniaku v hmotnostních %, vztaženo na množství užitého rozpouštědla.The proportion of lipids that can be removed by extraction with ammonia and solvent depends on the total water content in% by weight based on the total amount of solvent used and on the concentration of ammonia gas in weight% by weight on the amount of solvent used.

Zvláště dobrých pokusných výsledků je možno dosáhnout při hmotnostním ' poměru buněčné hmoty .a rozpouštědla v .rozmezí 1:3 až 1:6. při použití methanolu a . ethanolu a v rozmezí 1:8 až 1: 12 při .použití propanolu, glykolu a monoglykoletherů. Koncentrace amoniaku, vztaženo. na množství rozpouštědla, je 1 až' 10 % ' hmotnostních, s výhodou 1 ' až 5 o/₀ hmotnostních. Celkové množství vody .přítomné v buněčné hmotě, rozpouštědle a popřípadě . ve vodném, roztoku amoniaku . je 0 až 30, s výhodou. 0 až 20, zvláště 0 až 10 '% hmotnostních, vztaženo na celkové ' množství užitého rozpouštědla.Particularly good experimental results can be obtained at a cell mass / solvent ratio ranging from 1: 3 to 1: 6. using methanol and. ethanol and in the range of 1: 8 to 1: 12 using propanol, glycol and monoglycol ethers. Ammonia concentration, based on. on the amount of solvent is from 1 to '10%' by weight, preferably 1 'to 5 o / ₀ by weight. The total amount of water present in the cell mass, solvent and optionally. in aqueous ammonia solution. is 0 to 30, preferably. 0 to 20% by weight, in particular 0 to 10% by weight, based on the total amount of solvent used.

Při provádění postupu v technickém měřítku je možno upustit od sušení buněk po fermentaci až na malý zbytkový obsah vody 4 % nebo nižší. Stačí usušit buněčnou hmotu ' tak, aby celkový obsah vody se pohyboval po ' přidání nutného množství rozpouštědla v optimálním rozmezí, popřípadě se k rozpouštědlu přidá amoniak v plynné formě.On a technical scale, cell drying after fermentation to a small residual water content of 4% or less can be dispensed with. It is sufficient to dry the cell mass so that the total water content is in the optimum range after addition of the necessary amount of solvent, or ammonia in gaseous form is added to the solvent.

.Rozpuštění tuků z mikrobiální buněčné hmoty se provádí tak, že se buněčný materiál uvede v suspenzi v organickém rozpoúšdle obecného. vzorce I a nechá se procházet plynný amoniak nebo se přidá roztok amo207473 niaku. Je účelné suspenzi míchat. Teplota při zpracování se pohybuje v rozmezí —20 až +60 °C, při výhodném rozmezí 25 až +50 °C, zvláště +10 až +30 ^QC. Postup trvá 5 až 120 minut, s výhodou 25 až 35 minut. Zpracování se obvykle provádí při atmosférickém tlaku.The fat is dissolved from the microbial cell mass by suspending the cell material in an organic solvent. of formula I and ammonia gas is passed through or a solution of ammonia amo207473 is added. It is expedient to stir the suspension. Processing temperature ranges from -20 to +60 ° C, preferably between 25 to 50 ° C, especially +10 to 30 ^Q C. The procedure takes from 5 to 120 minutes, preferably 25-35 minutes. The treatment is usually carried out at atmospheric pressure.

Po ukončeném zpracování směsí rozpouštědla a amoniaku se získaný buněčný materiál (bílkoviny) oddělí libovolným způsobem, například odstředěním, filtrací nebo usazením z rozpouštědla.After treatment with the solvent / ammonia mixture, the cellular material (proteins) obtained is separated in any manner, for example by centrifugation, filtration or settling from the solvent.

Výhodným způsobem je filtrace. Získaný pevný buněčný materiál je možno stejným způsobem zpracovat při použití uvedeného organického rozpouštědla ještě jednou, aby •byly lipidy pokud možno úplně odstraněny.The preferred method is filtration. The solid cell material obtained can be treated in the same manner again using the organic solvent to remove the lipids as completely as possible.

Získaný materiál se pak suší к odstranění zbytků rozpouštědla a amoniaku. Sušení se s výhodou provádí za sníženého tlaku, s výhodou 1064 až 1995 Pa a vyšší teplotě, s výhodou 40 až 50 °C. Produkt zbavený tuku je po usušení bez zápachu.The resulting material is then dried to remove solvent and ammonia residues. The drying is preferably carried out under reduced pressure, preferably 1064 to 1995 Pa and a higher temperature, preferably 40 to 50 ° C. The fat-free product is odorless after drying.

Vodná fáze, získaná svrchu uvedeným postupem a oddělená od pevného buněčného materiálu, obsahuje amoniak a rozpuštěné lipidy. Užité rozpouštědlo je možno oddělit od tuků vakuovou destilací a znovu použít.The aqueous phase obtained as described above and separated from the solid cell material comprises ammonia and dissolved lipids. The solvent used can be separated from the fats by vacuum distillation and reused.

Nakonec se buněčná hmota zbavená tuků a popřípadě usušená smísí s vodou. Výhodné je užití takového množství vody, aby poměr vody к buněčné hmotě byl v rozmezí 1:1 až 1 : 30, zvláště 1:5 až 1 : 15. Množství vody má být alespoň takové, aby bylo možno suspenzi míchat.Finally, the fat-free and optionally dried cell mass is mixed with water. It is preferred to use an amount of water such that the ratio of water to cell mass is in the range of 1: 1 to 1: 30, especially 1: 5 to 1: 15. The amount of water should be at least such that the suspension can be stirred.

Hodnota pH se má při zpracování vodou pohybovat v rozmezí 5 až 8,5, s výhodou 6 až 7,5 a popřípadě je nutno ji na toto rozmezí upravit. To je důležité zejména v tom případě, kdy se užívá neúplně usušené buněčné hmoty z prvního stupně, která může obsahovat ještě zbytky amoniaku, což vede к vysokým hodnotám pH.The pH of the water treatment should be in the range of 5 to 8.5, preferably 6 to 7.5 and, if necessary, adjusted to this range. This is particularly important when incomplete dried cell mass from the first stage is used, which may still contain ammonia residues, leading to high pH values.

Tato extrakce .nukleových kyselin, solí, polysacharidů a ve vodě rozpustných sekundárních metabolitů vodou se obvykle provádí v teplotním rozmezí 30 až 95 ^0,C při atmosférickém tlaku. Výhodné jsou teploty 40 až 70 °C, zvláště 50 až 60 ^C. Doba extrakční teploty a množství vody 5 až 120 minut, dobrých výsledků se dosahuje při extrakční době 25 až 45 minut. К oddělení pevných a kapalných .součástí se suspenze odstředí s výhodou při teplotě 10 až 30 °υ. Dalším vhodným dělicím postupem je usazování a filtrace.This extraction of nucleic acids, salts, polysaccharides and water-soluble secondary metabolites with water is usually carried out at a temperature range of 30 to 95 ^° C at atmospheric pressure. Temperatures of 40 to 70 ° C, especially 50 to 60 ° C, are preferred. Extraction time and water quantity 5 to 120 minutes, good results are obtained with an extraction time of 25 to 45 minutes. To separate the solid and liquid components, the suspension is preferably centrifuged at a temperature of 10 to 30 ° C. Another suitable separation process is settling and filtration.

К jednoduchému oddělení buněčné hmoty se s výhodou přidá к vodě ve druhém stupni až 20 % hmotnostních, s výhodou 5 až 15 % hmotnostních nižšího alkoholu jako ethanolu nebo methanolu, s výhodou methanolu.Preferably, up to 20% by weight, preferably 5 to 15% by weight, of a lower alcohol such as ethanol or methanol, preferably methanol, is added to the water in the second stage for simple cell mass separation.

Pevná fáze se pak uvolní běžnými postupy jako jsou lyofilizace, sušení rozprašováním nebo sušením ve vakuu od kapalných zbytků. Produkt má příjemnou vůní, světlejší barvu než výchozí materiál a dobrou schopnost vázat vodu. Po svrchu uvedeném odstranění lipidů a nukleových kyselin je produkt vhodný к výrobě potravinářských výrobků .a krmív.The solid phase is then released by conventional methods such as lyophilization, spray drying or vacuum drying from liquid residues. The product has a pleasant fragrance, a lighter color than the starting material and good water-binding capacity. After the removal of lipids and nucleic acids as described above, the product is suitable for the manufacture of food products and feedstuffs.

V produktu podle vynálezu jsou odstraněny lipidy až .na zbytkový obsah 0,5 až 3,5 procenta hmotnostních, nukleové kyseliny až na zbytkový obsah 0,5 až 4,5 % hmotnostních.In the product according to the invention, lipids up to a residual content of 0.5 to 3.5 percent by weight of nucleic acid up to a residual content of 0.5 to 4.5 percent by weight are removed.

Způsob podle vynálezu odstraňuje nevýhody známých postupů jako je užití rozpouštědel .nebo štěpení zásadami. Není nutné užít chlorovaných uhlovodíků. Odstranění tuků pomocí směsí .rozpouštědel a amoniaku je zvláště u bakterií úplnější než při zpracování buněčné hmoty směsí rozpouštědla a vody. Přitom není zapotřebí užít extrémních teplot a hodnot pH, které snižují použitelnost produktu. Energetický náklad je nižší než při štěpení zásadami. К obohacení bílkovinami dochází bez úbytku těchto látek a bez použití velkých množství neutralizačních solí.The process of the invention eliminates the disadvantages of known processes such as the use of solvents or base cleavage. It is not necessary to use chlorinated hydrocarbons. Removal of fats with mixtures of solvents and ammonia, especially in bacteria, is more complete than in the treatment of cell mass with a mixture of solvent and water. There is no need to use extreme temperatures and pH values that reduce the usefulness of the product. The energy cost is lower than that of alkali cleavage. Protein enrichment occurs without loss of these substances and without the use of large amounts of neutralizing salts.

Vodná fáze, oddělená od pevného buněčného materiálu, obsahuje kromě jiných ve vodě rozpustných součástí nukleové kyseliny, které je možno získat známými postupy, například srážením v kyselém· prostředí, ultrafiltrací, dialýzou nebo enzymatickým zpracováním.The aqueous phase separated from the solid cellular material contains, among other things, water-soluble nucleic acid components obtainable by known methods, for example by acid precipitation, ultrafiltration, dialysis, or enzymatic processing.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady:The invention will be illustrated by the following examples:

PřikladlHe did

Methylomonas clara ATCC 31 226 se pěstuje v živném prostředí s obsahem methanolu jako jediného zdroje uhlíku, amoniaku jako jediného zdroje dusíku, fosfátů a solí železa _ta hořčíku a dalších běžných stopových prvků za aerobních podmínek. Takto získaná bakteriální buněčná hmota se z roztoku oddělí a suší se rozprašováním.Methylomonas clara ATCC 31 226 is cultivated in a nutrient medium containing methanol as the sole carbon source, ammonia as the sole nitrogen, phosphate and iron _t -magnesium salts and other common trace elements under aerobic conditions. The bacterial cell mass thus obtained is separated from the solution and spray dried.

100 g této buněčné hmoty se smísí se 300 gramy methanolu. Za stálého míchání suspenze se přivádí a rozpustí 10 g plynného amoniaku. Za přívodu amoniaku se udržuje chlazením teplota 25 až 35 ^CC. Směs methanolu, amoniaku a buněčné hmoty se pak míchá 30 minut při 20 °C.100 g of this cell mass was mixed with 300 grams of methanol. 10 g of ammonia gas are introduced and dissolved while stirring the suspension. A temperature of 25-35 ^° C is maintained by cooling with ammonia. The mixture of methanol, ammonia and cell mass is then stirred at 20 ° C for 30 minutes.

К oddělení pevné a kapalné fáze se směs zfiltruje a pevný podíl se promyje 300 ml methanolu. Po nové filtraci se oba filtráty slijí. Tento hnědý roztok obsahuje lipidy výchozího materiálu. Methanol a amoniak se odstraní vakuovou destilací při tlaku 1330 Pa a teplotě 40 °C. Zbytek, který obsahuje 9,5 % hmotnostních výchozího buněčného materiálu, je tmavě hnědá páchnoucí pasta, sestávající z volných mastných kyselin, glyceridů, fosfolipidů a sekundárních metabolitů.To separate the solid and liquid phases, the mixture was filtered and the solid was washed with 300 ml of methanol. After re-filtration, the two filtrates are combined. This brown solution contains lipids of the starting material. Methanol and ammonia are removed by vacuum distillation at a pressure of 1330 Pa and a temperature of 40 ° C. The residue, which contains 9.5% by weight of the starting cellular material, is a dark brown odorous paste, consisting of free fatty acids, glycerides, phospholipids and secondary metabolites.

Pevný podíl extrahované buněčné hmoty získaný filtrací se suší 5 hodin za sníženého -tlaku 1330 Pa a při teplotě 40 ^c€. Získá se 90 g tuku prosté buněčné hmoty bez zá207473 pachu, světlé barvy, světlejší než výchozí materiál.The solids of the extracted cell mass obtained by filtration are dried for 5 hours at a reduced pressure of 1330 Pa and at a temperature of 40 ° ^C. 90 g of fat-free cell mass are obtained without odor, light color, lighter than the starting material.

Ke snížení obsahu nukleových kyselin se tato buněčná -hmota uvede v ’ suspenzi v 900 ml vody. Hodnota - pH homogenizované míchané suspenze je 6,9.To reduce the nucleic acid content, this cell mass is suspended in 900 ml of water. The pH of the homogenized stirred suspension is 6.9.

Po zvýšení teploty na 55 °C se směs míchá ještě 20 minut, pak se zchladí na 30 °C a odstředěním rozdělí na pevnou a kapalnou fázi. Získaný sediment se - znovu smísí s 900 mil vody a míchá se 10 minut při 20 °C. Pak se směs znovu odstředí a sediment se usuší za sníženého tlaku.After raising the temperature to 55 ° C, the mixture was stirred for another 20 minutes, then cooled to 30 ° C and separated by centrifugation into a solid and a liquid phase. The sediment obtained is again mixed with 900 ml of water and stirred for 10 minutes at 20 ° C. The mixture is centrifuged again and the sediment is dried under reduced pressure.

Výtěžek je 65 g. Obsah nukleových kyselin byl snížen z původních 11,2 % -na 1,5 procenta. Produkt v sušeném stavu je bez zápachu, po zvlhčení vodou - má příjemnou Vůni..The yield is 65 g. The nucleic acid content was reduced from the original 11.2% to 1.5 percent. The product in the dried state is odorless, after moistening with water - has a pleasant smell ..

Příklad 2Example 2

Výchozím- materiálem -byla tatáž bakteriální buněčná hmota jako v příkladu 1. Tato hmota byla zpracována stejným- postupem a za stejných podmínek s tím rozdílem, že místo plynného - amoniaku bylo užito- 30 ml koncentrovaného NHrOH (33 %).The starting material was the same bacterial cell mass as in Example 1. This mass was treated in the same manner and under the same conditions except that 30 ml of concentrated NHrOH (33%) was used instead of gaseous ammonia.

Příklad 3Example 3

Postup byl prováděn stejně jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že bylo užito 60 ml koncentrovaného NHdOH (33 °/o).The procedure was carried out as in Example 2 except 60 ml of concentrated NH 4 OH (33%) was used.

Příklad 4Example 4

Postup byl prováděn stejně jako v příkladu 2 -s -tím rozdílem, že jako rozpouštědlo byl užit místo methanolu ethanol.The procedure was carried out as in Example 2 except that ethanol was used instead of methanol as the solvent.

Příklad 5Example 5

Postup byl prováděn stejným způsobem jako v příkladu 3 s -tím- rozdílem, že jako rozpouštědlo byl místo methanolu užit glykolmonomethylether.The procedure was carried out in the same manner as in Example 3 except that glycol monomethyl ether was used as the solvent instead of methanol.

Příklad 6Example 6

Postup - byl prováděn stejným· způsobem jako v příkladu 2 -s tím· rozdílem, že jako rozpouštědla byl místo methanolu užit isopropanol.The procedure was carried out in the same manner as in Example 2 except that isopropanol was used as the solvent instead of methanol.

P říklad 7Example 7

Jako výchozí materiál byla užita buněčná hmota z Meth-olomonas - olara jako- v -příkladu 1. 100 g produktu sušeného rozstřikováním se stejně jako v příkladu 1 štěpí a zbaví tuku při použití 15 g plynného amoniaku. Takto získaný produkt se však úplně nesuší, kdežto důkladně odsátý filtrační koláč -s obsahem plynných látek 85 -% se uvede v suspenzi v 900 ml vody. Hodnota pH je 8,9 vzhledem k tomu, že vlhká biologická hmota -obsahovala ještě amoniak.Meth-olomonas-olara cell mass was used as starting material as in Example 1. 100 g of the spray-dried product was digested as in Example 1 and de-fatted using 15 g of ammonia gas. However, the product thus obtained is not completely dried, whereas a thoroughly aspirated filter cake with a gaseous content of 85% is suspended in 900 ml of water. The pH is 8.9 because the wet biological matter still contained ammonia.

Teplota suspenze se za stálého míchání zvýší na 65 °C ,a po 5 minutách se hodnota pH upraví přidáním kyseliny -chlorovodíkové na 7,2. Směs -se míchá ještě 15 minut při teplotě 65 ^CC, pak se zchladí -na 40 ’°C a odstředí. Získaný sediment se usuší.The temperature of the suspension is raised to 65 ° C with stirring, and after 5 minutes the pH is adjusted to 7.2 by addition of hydrochloric acid. The mixture was stirred at 65 ^° C for 15 minutes, then cooled to 40 ° C and centrifuged. The sediment obtained is dried.

Příklad 8Example 8

Kmen kvasinek Candida lipolytica ATCC 20 383 schopný využívat uhlovodíky se pěstuje na nasycených uhlovodících -s přímým řetězcem -za přítomnosti vodného živného prostředí a plynu s obsahem kyslíku. Kvasinková hmota -se od živného roztoku oddělí a usuší.A Candida lipolytica ATCC 20 383 yeast strain capable of utilizing hydrocarbons is grown on saturated straight chain hydrocarbons in the presence of an aqueous nutrient medium and an oxygen-containing gas. The yeast mass is separated from the nutrient solution and dried.

100 g sušených kvasinkových buněk se uvede v -suspenzi při teplotě místnosti a za atmosférického tlaku ve 300 g -methanolu a do této směsi se v průběhu 15 minut přivede 10 g plynného amoniaku. Při přidávání se udržuje teplota suspenze chlazením na -15 °C. Po přívodu -plynu se směs ještě 20 minut míchá při teplotě 22 °C a pak se zfiltruje na -odsávací fritě. Filtrační koláč se na fritě promyje 300 ml methanolu a směs se znovu zfiltruje za -odsávání. - Oba filtráty se slijí. Roztok je žlutý a obsahuje lipidy původního buněčného materiálu. Methanol a plynný amoniak se odstraní za sníženého tlaku 186,2 Pa.100 g of dried yeast cells are suspended in suspension at room temperature and atmospheric pressure in 300 g of methanol and 10 g of ammonia gas are introduced into the mixture over 15 minutes. During the addition, the suspension temperature was maintained by cooling to -15 ° C. After gassing, the mixture was stirred at 22 ° C for 20 min and then filtered on a suction frit. The filter cake is washed on the frit with 300 ml of methanol and the mixture is filtered again with suction. - Combine both filtrates. The solution is yellow and contains lipids of the original cellular material. Methanol and ammonia gas are removed under reduced pressure.

Po druhé filtraci se produkt, sestávající z rozrušených a tuku zbavených buněk mikroorganismu suší ve vakuové -sušičce při teplotě 40 °C a tlaku 1330 Pa 5 hodin. Takto’ získaný produkt má -světlejší barvu než původní kvasinková hmota a je bez zápachu.After a second filtration, the product consisting of the disrupted and fat-free microorganism cells was dried in a vacuum oven at 40 ° C and 1330 Pa for 5 hours. The product thus obtained has a lighter color than the original yeast mass and is odorless.

Ke snížení obsahu nukleových kyselin z původních 7,5 % hmotnostních, vztaženo na výchozí materiál, se 100 g tuku zbavených a sušených kvasinek uvede v suspenzi v roztoku 1 litru destilované vody a 1000 ml methanolu. Za stálého míchání -se nastaví pH směsi z původního pH na hodnotu 6,8 a během 15 min. se zahřeje na - 50 °C, načež se rozdělí -odstředěním na sediment, který -obsahuje kvasinkovou bílkovinu -a na kapalnou fázi, - která obsahuje rozpustné nukleové kyseliny. Sediment -se ipo- několikanásobném promytí při teplotě místnosti lyofilizuje.To reduce the nucleic acid content from the original 7.5% by weight, based on the starting material, 100 g of defatted and dried yeast are suspended in a solution of 1 liter of distilled water and 1000 ml of methanol. While stirring, the pH of the mixture is adjusted from the original pH to 6.8 and within 15 min. The mixture is heated to -50 DEG C. and then separated by centrifugation into a sediment which contains yeast protein and into a liquid phase containing soluble nucleic acids. The sediment is lyophilized after washing several times at room temperature.

Obsah nukleových kyselin v sušeném materiálu byl snížen z původní hodnoty 7,5 % hmotnostních na 0,4 % hmotnostního.The nucleic acid content of the dried material was reduced from an initial value of 7.5% by weight to 0.4% by weight.

Příklad 9Example 9

Postupuje ss stejně jako- v příkladu 8 s tím rozdílem, že se místo methanolu užije ethanol a místo- 10 g plynného- amoniaku se užije 60 ml 33% roztoku amoniaku.The procedure was as in Example 8 except that ethanol was used instead of methanol and 60 ml of a 33% ammonia solution was used instead of 10 g of ammonia gas.

P říklad 10Example 10

Penicillium chrysogenum ATCC 10 238 se pěstuje v živném roztoku s obsahem laktózy, kapalného kukuřičného výluhu, fosfátu, uhličitanu a síranu horečnatého běžným způsobem, za aerobních podmínek. Po oddělení vzniklého penicilinu zbývá mycelium, které je po usušení výchozí látkou.Penicillium chrysogenum ATCC 10 238 is grown in a nutrient solution containing lactose, liquid corn steep liquor, phosphate, carbonate and magnesium sulphate in a conventional manner under aerobic conditions. After the penicillin formed, the mycelium remains, which is the starting material after drying.

Zpracování výchozího materiálu se provádí způsobem podle příkladu 8, s tím rozdílem, , že se místo plynného amoniaku užije 33% roztok amoniaku. Sušené mycelium zbavené tuku se promyje vodou při 30 °C.The starting material was worked up as in Example 8, except that a 33% ammonia solution was used instead of ammonia gas. The dried, dehydrated mycelium was washed with water at 30 ° C.

příklad 11Example 11

Výchozí látkou je stejná buněčná směs jako· v příkladu 10. Postup se provádí stejným způsobem, místo methanolu se · však užije ethanol a při extrakci vodou se teplota zvýší .na 85 °C a na této · teplotě se udržuje 15 minut.The starting material is the same cell mixture as in Example 10. The procedure is carried out in the same manner, but instead of methanol, ethanol is used and the temperature is raised to 85 ° C during water extraction and maintained at this temperature for 15 minutes.

Výsledky z příkladů 1 až 11 jsou uvedeny v následujících tabulkách 1 a 2.The results of Examples 1-11 are shown in Tables 1 and 2 below.

TABULKA 1TABLE 1

Odstranění lipidůRemoval of lipids

100· g buněčné hmoty 100 · g cell mass Nukleové Nucleic Rozpouštědlo Solvent NH3 [g] nebo- NH3 [g] or- Příklad Example Druh Species Tuky Fats kyseliny acid 300 · g 300 · g 33% NH4OH [ml] 33% NH4OH [ml] % himot. % himot. % hmot. % wt. 1 1 Methylomonas Methylomonas 7 7 11,2 11.2 methanol methanol NH3 NH3 10 10 2 2 Methyl omonas Methyl omonas 7 7 11,2 11.2 methanol methanol NHdOH NHdOH 30 30 3 3 Methylomonas Methylomonas 7 7 11,2 11.2 methanol methanol NHáOH NH? OH 60 60 4 4 Methylomonas Methylomonas 7 7 11,2 11.2 ethanol ethanol NHíOH NH 4 OH 30 30 5 5 Methylomonas Methylomonas 7 7 11,2 11.2 glykolmonomethyl- glycolmonomethyl- NHáOH NH? OH 60 60 ether ether 6 6 Methylomonas Methylomonas 7 7 11,2 11.2 i-propanol i-propanol ΝΉ4ΟΗ ΝΉ4ΟΗ 30 30 7 7 Methylomonas Methylomonas 9,6 9.6 15,4 15.4 methanol methanol NH3 NH3 15 15 Dec 8 8 Candida lipolytica Candida lipolytica 8,2 8.2 7,5 7.5 methanol methanol NH3 NH3 10 10 9 9 Candida lipolytica Candida lipolytica 8,2 8.2 7,5 7.5 ethanol ethanol NHúOH NH4OH 60 60 10 10 sušené mycelium dried mycelium 3,5 3.5 2,6 2.6 methanol methanol NHéOH NHeOH 30 30 11 11 sušené mycelium dried mycelium 3,5 3.5 2,6 2.6 ethanol ethanol NHíOH NH 4 OH 30 30 TABULKA 2 TABLE 2 Příklad Example Promývací voda Washing water Získaná buněčná hmota Obtained cell mass množství amount jpH jpH teplota temperature množství amount tuky fats nukleové nuclear kyše- kyše- (litr) (liter) (°C) (° C) i(g) (% hmot.) liny (% hmot.) i (g) (% w / w) liner (% w / w) 1 1 0,9 0.9 6,9 6.9 55 55 68 68 0,8 0.8 1,5 1.5 2 2 0,9 0.9 6,9 6.9 60 60 67 67 1,3 1.3 1,2 1,2 3 3 0,9 0.9 7,0 7.0 65 65 63 63 2,0 2,0 1,1 1.1 4 4 0,9 0.9 6,9 6.9 50 50 67 67 2,2 2.2 1,5 1.5 5 5 0,9 0.9 7,1 7.1 55 55 63 63 2,8 2.8 2,3 2.3 6 6 0,9 0.9 7,0 7.0 60 60 64 64 3,4 3.4 4,0 4.0 7 7 0,9 0.9 7,2 7.2 65 65 62 62 1,2 1,2 1,4 1.4 8 8 0,8 0.8 6,8 6.8 50 50 68 68 1,4 1.4 0,4 0.4 9 9 0,8 0.8 6,5 6.5 45 45 67 67 1,8 1,8 0,7 0.7 10 10 0,9 0.9 6,5 6.5 30 30 78 78 1,1 1.1 0,5 0.5 11 11 0,9 0.9 6,5 6.5 85 85 79 79 1,3 1.3 0,8 0.8

Claims (5)

PŘEDMĚT vynálezuOBJECT OF THE INVENTION 1. Způsob · snížení obsahu lipidů a nukleových kyselin v mikrobiální buněčné hmotě, vyznaaující .se tím, že se buněčná hmota extrahuje směsí amoniaku nebo hydroxidu amonného v organickém·· rozpouštědle obecného· vnoirce I1. A method for reducing the lipid and nucleic acid content of a microbial cell mass, characterized in that the cell mass is extracted with a mixture of ammonia or ammonium hydroxide in an organic solvent of general formula I. R!-(CH2)n-OR2 , (I) kdeR 1 - (CH 2) n -OR 2, (I) wherein Ri a Rž znamená atom vodíku a n znamená celé číslo 1, 2 nebo· 3 neboR 1 and R 2 are hydrogen and n is an integer of 1, 2 or 3 or R.i znamená hydroxyskupinu aR 1 is hydroxy and Rž znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl, a n znamená celé číslo 2 nebo 3, přičemž celkový obsah vody činí ·0 až 30 % hmotnostních a obsah amoniaku 1 až 10 % hmotnostních, . vztaženo na · celkovou hmotnost rozpouštědla, a · po oddělení buněčné hmoty z extrakční směsi se buněčná hmota promyje vodou, vodná fáze se oddělí a po případné extrakci · organickým . · rozpouště dlem obecného vzorce I se buněčná hmota usuší.R @ 2 is hydrogen, methyl or ethyl, and n is an integer of 2 or 3, the total water content being from 0 to 30% by weight and the ammonia content from 1 to 10% by weight,. based on the total weight of the solvent, and after separating the cell mass from the extraction mixture, the cell mass is washed with water, the aqueous phase is separated and, if necessary, organic. · Drying the cell mass with a solvent of formula (I). 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že celkový obsah vody v průběhu štěpení je 0 až 20 % hmotnostních, zejména 0 až 10 % hmotnostních, vztaženo· na množství užitého rozpouštědla.Process according to claim 1, characterized in that the total water content during the digestion is 0 to 20% by weight, in particular 0 to 10% by weight, based on the amount of solvent used. 3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že obsah plynného· amoniaku v průběhu štěpení je ·2 až 8 o/_o hmotnostních, zvláště 3 až 5 '% · hmotnostních, vztaženo na množství užitého rozpouštědla.Process according to Claims 1 and 2, characterized in that the ammonia gas content during the digestion is 2 to 8% _by weight, in particular 3 to 5% by weight, based on the amount of solvent used. 4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako organické rozpouštědlo užije methanol, ethanol, glyko^monomethylether nebo· isopropanol.4. A process according to claim 1, wherein the organic solvent is methanol, ethanol, glycol monomethyl ether or isopropanol. 5. Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující se tím, že se užije hmotnostního · poměru buněčné hmoty a rozpouštědla v rozmezí 1:3 až 1:6 při použití methanolu nebo ethanolu a v rozmezí 1:8 až 1:12 při použití propanolu, glykolu a monoglykoletheru.5. A process according to any one of claims 1 to 4, wherein the weight ratio of cell mass to solvent is in the range 1: 3 to 1: 6 using methanol or ethanol and in the range 1: 8 to 1:12 using propanol. , glycol and monoglycol ether.