CS203767B1 - Celluler carrier for the separation of biologic active compounds and process for preparing thereof - Google Patents

Description

Vynález se týká nosiče na bázi regenerované celulosy pro separaci biologicky aktivních látek, způsobu jeho přípravy a použití k izolaci biologicky aktivních látek obsahujících vazebné místo pro sacharidové molekuly.The invention relates to a carrier based on regenerated cellulose for the separation of biologically active substances, a process for its preparation and use for the isolation of biologically active substances containing a binding site for carbohydrate molecules.

Afinitní chromatografie se v poslední době stává nejdůležitější preparativní metodou užívanou pro izolaci proteinů, například enzymů, protilátek a lektinů. Táto metoda využívá vysoké specifičnosti vazby těchto proteinů na určité nízkomolekulární látky (lígandy) zmobilizované na vhbdném pevném nosiči. Velkou skupinu takových proteinů vážících specifické ligandy tvoří ty, které specificky váží sacharidy. K izolaci takovýchto proteinů se používá různých typů pevných nosičů obsahujících glykosidicky vázané sacharidy. Je známo několik typů takových afinitních nosičů obsahujících vázané sacharidové struktury. První skupinu tvoří přírodní polysacharidy v gelové formě (zesíťované dextranové gely, agarosové gely), druhou skupinu přírodní glykoproteiny bud zesíťované, nebo navázané na gelový nosič. Do třetí skupiny patří syntetické síťované kopolymery při jejichž přípravě se používá jako· jeden monomer polymerizovatelný glykosid daného sacharidu. Čtvrtou a největší skupinu tvoří deriváty různých syn2 tetických nebo přírodních nosičů na které se kovalentně dodatečně naváží sacharidy.Affinity chromatography has recently become the most important preparative method used for the isolation of proteins, such as enzymes, antibodies and lectins. This method utilizes the high specificity of binding of these proteins to certain low molecular weight substances (ligands) mobilized on a suitable solid support. A large group of such specific ligand binding proteins are those that specifically bind carbohydrates. Various types of solid carriers containing glycosidically linked carbohydrates are used to isolate such proteins. Several types of such affinity carriers containing bound carbohydrate structures are known. The first group consists of natural polysaccharides in gel form (cross-linked dextran gels, agarose gels), the second group of natural glycoproteins either cross-linked or bound to a gel carrier. The third group comprises synthetic cross-linked copolymers, the preparation of which uses a polymerizable glycoside of the saccharide as a single monomer. The fourth and largest group consists of derivatives of various synthetic or natural carriers to which carbohydrates are additionally covalently bound.

Nosiče z první skupiny lze použít jěn v několika speciálních případech, nosiče z druhé skupiny bud také postrádají obecnost použití, nebo jsou značně drahé a nelze je používat ve velkém měřítku. Mezi nosiče třetí skupiny patří O-glykosylpolýakrylamidové gely do kterých lze zabudovat jakýkoli cukr a tím docílit značné specifičnosti a obecnosti použití. (V· Hořejší, J. Kocourek: Biochim. Biophys. Acta 297, 346 (1973), čs. autorské osvědčení 163 443). Nevýhodou těchto gelů je nutnost předběžné přípravy sacharidových monomerů (glykosidy polymerizovatelných aglykonů), nepravidelný tvar a velikost gelových částic, který zhoršuje jejich průtokové vlastnosti a v neposlední řadě nemožnost přípravy dostatečně porézních nosičů umožňujících izolaci makromolekul s velmi vysokou molekulovou hmotností. Většina nosičů ze čtvrté skupiny se připravuje synteticky složitými reakcemi a s použitím nákladných reagencií.Carriers of the first group can be used only in a few special cases, carriers of the second group either lack the generality of use or are very expensive and cannot be used on a large scale. Carriers of the third group include O-glycosyl polyacrylamide gels in which any sugar can be incorporated to achieve considerable specificity and generic usage. (V. Horejsi, J. Kocourek: Biochim. Biophys. Acta 297, 346 (1973), Czechoslovak author's certificate 163 443). The disadvantage of these gels is the need for preliminary preparation of carbohydrate monomers (glycosides of polymerizable aglycons), the irregular shape and size of the gel particles, which impairs their flow properties and, last but not least, the inability to prepare sufficiently porous carriers to isolate very high molecular weight macromolecules. Most of the fourth group carriers are prepared by synthetically complex reactions and using expensive reagents.

Sem patří zejména nosiče na bázi agarosových gelů s navázanými deriváty monosacharidů. K jejich přípravě se zpravidla používá různých derivátů monosacharidů obsahujících aminoskupinu připojenou k nim na víceatomárním řetězci (špaceru) např.This includes in particular carriers based on agarose gels with attached monosaccharide derivatives. Generally, various monosaccharide derivatives containing an amino group attached to them on a multi-atomic chain (spacer) e.g.

203787 ·203787 ·

O-glykosidů, N-acylglykosyiaminů, N-acylaminocukrů a thioglykošidů, jejichž synthesa obecně zahrnuje několik reakčních stupňů. Získaný derivát cukru se kovalentně váže na nosič, který se musí · předtím aktivovat např. bromkyanem.O-glycosides, N-acylglycosyamines, N-acylamine sugars and thioglycosides, the synthesis of which generally involves several reaction steps. The sugar derivative obtained is covalently bound to a carrier which must first be activated with, for example, cyanogen bromide.

Jiný způsob přípravy cukry modifikovaných polysacharidů spočívá v reakci např. škrobu s monosacharidem a epichlorhydrinem,v přítomnosti silné báze. Vznikající produkt však nemá zcela optimální fyzikální vlastnosti zaručující vysokou účinnost zejména při sloupcové aplikaci. Dosud nej výhodnějšími afinitními nosiči z této skupiny jsou zřejmě glykosylované deriváty hydroxyalkylmethakrylátových kopolymerů (zn. Spheron). Jednoduchou reakcí lze připravit deriváty Spheronu obsahující potřebný cukr. Tyto· sorbenty mají i velmi dobré mechanické a průtokové vlastnosti. Nevýhodná je poměrně vysoká cena Spheronu a možpost nespecifických a ireversibilních adsoppcí na hydrofobní základní strukturu Spheronu, které zhoršují výtěžek a čistotu získaného preparátu proteinu. Tyto nedostatky se odstraní'při zachování všech ostatních výhod (snadnost přípravy, dobré mechanické a průtokové vlastnosti, chemická stabilita, vysoká kapacita) přípravou glykosylovaných derivátů poresních polysacharidových gelů, zvláště poresní regenerované celulosy ve sférické formě.Another method for preparing sugar-modified polysaccharides involves reacting e.g. starch with a monosaccharide and epichlorohydrin in the presence of a strong base. However, the resulting product does not have completely optimum physical properties guaranteeing high efficiency especially in column application. The most preferred affinity carriers of this type so far are apparently glycosylated derivatives of hydroxyalkyl methacrylate copolymers (Spheron). Spherone derivatives containing the necessary sugar can be prepared in a simple reaction. These sorbents also have very good mechanical and flow properties. Disadvantageous is the relatively high cost of Spheron and the possibility of non-specific and irreversible adsorption on the hydrophobic backbone of Spheron, which impair the yield and purity of the obtained protein preparation. These drawbacks are eliminated while maintaining all other advantages (ease of preparation, good mechanical and flow properties, chemical stability, high capacity) by preparing glycosylated derivatives of porous polysaccharide gels, especially porous regenerated cellulose in spherical form.

Předmětem vynálezu je eelulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek vyznačený tím, že na povrchu obsahuje alfa-glykosidicky kovalentně vázané sacharidy nebo· jejich deriváty vybrané ze skupiny monosacharidů, oligosačharidů, deoxycukrů a aminocukrů, má sférický tvar s velikostí částic 0,02 až 2,00 mm a v prostředí vody vykazuje poresitu P = 90% (celkový objem pórů).The present invention relates to a cellulose carrier for the separation of biologically active substances, characterized in that it contains on the surface alpha-glycosidically covalently bound carbohydrates or derivatives thereof selected from the group of monosaccharides, oligosaccharides, deoxy sugars and amino sugars, spherical in particle size 0.02 to 2. It has a porosity of P = 90% (total pore volume) in a water environment.

Celulosové nosiče. pro separaci biologicky aktivních látek se podle vynálezu připravuje tak,. že, se sférická celulosa promyje bezvodým organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou, promíchává se s roztokem bezvodého· cukru o koncentraci 0,5-až 5 % hmotnostních v témže rozpouštědle za přítomnosti kyselého katalysátoru při teplotě 15 až 70 °G po dobu 1 až 20 hodin, načež se promyje vodou o teplotě +4 až +10· °C a fosfátovým pufrem pH 7.Cellulose carriers. according to the invention, for the separation of biologically active substances, The composition of claim 1, wherein the spherical cellulose is washed with an anhydrous water-miscible organic solvent, mixed with an anhydrous sugar solution having a concentration of 0.5-5% by weight in the same solvent in the presence of an acid catalyst at 15 to 70 ° C for 1 to 20 hours. and then washed with water at +4 to + 10 ° C and phosphate buffer pH 7.

Podstata způsobu výroby nových derivátů podle vynálezu spočívá v tom, že se sférická celulosa míchá s příslušným bezvodým cukrem v bezvodém, (nebo téměř bezvodém) prostředí za přítomnosti kyselého katalysátoru. Po skončení reakce se vzniklé glykosylované deriváty polysacharidových gelů promyjí vodným roztokem pufru a jsou připraveny k afinitní chromatografíi.The essence of the process for the preparation of the novel derivatives according to the invention consists in mixing the spherical cellulose with the corresponding anhydrous sugar in an anhydrous (or almost anhydrous) medium in the presence of an acid catalyst. After completion of the reaction, the resulting glycosylated derivatives of polysaccharide gels are washed with an aqueous buffer solution and are ready for affinity chromatography.

Při provádění způsobu podle vynálezu se jako bezvódé rozpouštědlo používá dioxan, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, jako kyselý katalysátor fluorid boritý, chlorovodík nebo jejich směs. Biologicky aktivní látky obsahují vazebné místo pro sacharidy se adsorbují na glykosylovaný derivát buď na sloupci nebo· vsádkově, načež se balastní látky oddělí vymytím roztokem pufru a aktivní látky se uvolní roztokem příslušného lígandu nebo vhodným pufrem. Takto se v jediném isolačním kroku zisků čistý preparát bez neaktivních příměsí, jehož biologický účinek je desetkrát až tisíckrát vyšší než je aktivita aplikované surové směsi bílkovin nebo surového extraktu.In the process according to the invention, the anhydrous solvent used is dioxane, dimethylsulfoxide, dimethylformamide, as the acid catalyst, boron trifluoride, hydrogen chloride or a mixture thereof. The biologically active substances contain a saccharide binding site are adsorbed onto the glycosylated derivative either on a column or batch, after which the ballast substances are separated by washing with a buffer solution and the active substances are released with the appropriate ligand solution or a suitable buffer. Thus, in a single isolation step, a pure preparation without inactive ingredients is obtained whose biological effect is 10 to 1000 times higher than the activity of the applied crude protein mixture or crude extract.

Vynález je blíže objasněn v příkladech konkrétního provedení:The invention is illustrated by the following examples:

PřikladlHe did

Do 30 ml suchého dioxanu (obsah vody v rozmezí do 5% v/v přípustný) obsahujícího 6% w/v suchého chlorovodíku se přidá 1,5 gramů suché D-glukosy a 3 ml sférické celulosy .(průměr částic 0,1 až 0,3 mm) v suchém dioxanu. Suspense se třepe v uzavřené nádobě 8 hodin při 35 °C, potom se na fritě rychlé promyje studenou vodou a nakonec 0,lM fosfátovým pufrem pH 7,0 tak dlouho, až eluát poskytuje negativní reakci na sacharidy. Získají se 3 ml celulosového nosiče, který obsahuje 15,5 % hmot. navázané D-glukosy (vztaženo na suchou váhu celulosy) (zjištěno z pokusu v němž bylo použito ¹⁴C značené D-glukosy).To 30 ml dry dioxane (water content up to 5% v / v permissible) containing 6% w / v dry hydrogen chloride is added 1.5 grams of dry D-glucose and 3 ml of spherical cellulose (particle diameter 0.1 to 0). , 3 mm) in dry dioxane. The suspension was shaken in a sealed vessel at 35 ° C for 8 hours, then washed quickly with cold water on the frit and finally with 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 until the eluate gave a negative reaction to the carbohydrates. 3 ml of cellulose carrier are obtained which contains 15.5 wt. bound D-glucose (based on cellulose dry weight) (determined from an experiment using ¹⁴ C-labeled D-glucose).

Příklad2Example2

Do 30i ml suchého dioxanu (obsah vody v rozmezí do 3% v/v přípustný) obsahujícího 6% w/v suchého chlorovodíku se přidá 1,5 gramů suché D-glukosy a 3 ml sférické celulosy (průměr částic 0,1 až 0,3 mm) v suchém dioxanu. Suspense se třepe v uzavřené nádobě 24 hodA při 60 °C, potom se na fritě rychle promyje studenou vodou a nakonec 0,ÍM fosfátovým pufrem pH 7,0 tak dlouho, až eluát poskytuje negativní reakci na sacharidy. Získají se 3 ml celulosového nosiče, který obsahuje. 29% hmot. navázané D-glukosy (vztaženo na suchou váhu celulosy) (zjištěno z pokusu v němž bylo použito ¹⁴C značené D-glukosy).To 30 ml of dry dioxane (water content up to 3% v / v permissible) containing 6% w / v dry hydrogen chloride is added 1.5 grams of dry D-glucose and 3 ml of spherical cellulose (particle diameter 0.1 to 0, 3 mm) in dry dioxane. The suspension was shaken in a sealed vessel for 24 hours at 60 ° C, then washed quickly on the frit with cold water and finally with 0.1M phosphate buffer pH 7.0 until the eluate gave a negative reaction to the carbohydrates. 3 ml of cellulose carrier are obtained which it contains. 29% wt. bound D-glucose (based on cellulose dry weight) (determined from an experiment using ¹⁴ C-labeled D-glucose).

Příklad 3Example 3

Do 30 ml suchého dioxanu (obsah vody v rozmezí do 3% v/v přípustný) obsahujícího θ% w/v suchého chlorovodíku se přidá 0,15 g suché D-glukosy a 3 ml sférické celulosy (průměr částic 0,1 až 0,3 mm) v suchém dioxanu,, Suspense se třepe v uzavřené nádobě 8 hodin při 35 °C, potom se na fritě rychle promyje studenou vodou a nakonec 0,lM fosfátovým pufrem pH, 7,0 tak dlouho, až eluát poskytuje negativní reakci na sacharidy. Získají se 3 ml celulosového nosiče, který obsahuje 7,2 % hmot· navázané D-glukosy (vztaženo na suchou váhu celulosy) (zjištěno z.pokusu v němž bylo použito ¹⁴C značené D-glukosy).To 30 ml of dry dioxane (water content within 3% v / v permissible) containing θ% w / v dry hydrogen chloride is added 0.15 g of dry D-glucose and 3 ml of spherical cellulose (particle diameter 0.1 to 0, 3 mm) in dry dioxane. The suspension is shaken in a sealed vessel for 8 hours at 35 ° C, then washed quickly on the frit with cold water and finally 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 until the eluate gives a negative reaction to carbohydrates. 3 ml of cellulose carrier are obtained which contains 7.2% by weight of bound D-glucose (based on the dry weight of cellulose) (as determined from an experiment using ¹⁴ C-labeled D-glucose).

PřikládáHe attaches

Záměnou D-glukosy v reakční směsi za jiné cukry se získávají při zachování ostatních podmínek jako· v příkladu 1 analogické produkty obsahující jiné cukerné jednotky. Navázané hmotnostní množství při použití D-mannosy je 17%, Ď-galaktosy 14,3%, L-arabinosy 12,3%, L-f úkosy 14%, L-rhamnosy 15,5%, maltosy 9,5%, N-acetyl-D-glukosaminu 16,5%, N-acetyl-D-galaktosaminu 13,51%.By substituting D-glucose in the reaction mixture for other sugars, analogous products containing other sugar units are obtained under the other conditions as in Example 1. The bound amount by weight with D-mannose is 17%, D-galactose 14.3%, L-arabinose 12.3%, Lf bevels 14%, L-rhamnose 15.5%, maltose 9.5%, N-acetyl -D-glucosamine 16.5%, N-acetyl-D-galactosamine 13.51%.

P ř í k 1 a d 5Example 1 a d 5

Glukosylovaný derivát sférické celulosy se připraví analogicky jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že místo dioxanu se použije dimethylsulfoxidu. Vzniklý glukosylovaný derivát obsahuje 1,1 % vázané D-glukosy.The glucosylated spherical cellulose derivative was prepared analogously to Example 1 except that dimethylsulfoxide was used instead of dioxane. The resulting glucosylated derivative contains 1.1% bound D-glucose.

P ř í k 1 a d 6Example 1 a d 6

Do 30 ml suchého dioxanu obsahujícího 3% hmot. BF3 se přidají 3 ml sférické celulosy v suchém dioxanu a 1,5 g suché D-glukosy. Suspense se třepe 6 hodin v uzavřené nádobě při 35 °C, potom se na frltě promyje vodou a pufrem pH 7,0. Získají se 3 ml glukosylovaného derivátu obsahujícího 10,5 % navázané D-glukosy.To 30 ml dry dioxane containing 3 wt. BF3 was added with 3 ml of spherical cellulose in dry dioxane and 1.5 g of dry D-glucose. The suspension was shaken for 6 hours in a sealed vessel at 35 ° C, then washed on the filter with water and pH 7.0 buffer. 3 ml of a glucosylated derivative containing 10.5% bound D-glucose are obtained.

P ř í k 1 a d 7Example 1 a d 7

Glykosylovaný derivát sférické celulosy se připraví analogicky jako v příkladu 3 s tím rozdílem, že jako kyselý katalyzátor se použije dioixanového roztoku obsahujícího 3% hmot. BF3 a 3% hmot. HC1. Vzniklý glukosylovaný derivát obsahuje 20,5% vázané D-glukosy.A glycosylated spherical cellulose derivative was prepared analogously to Example 3 except that a dioixane solution containing 3 wt. % BF3 and 3 wt. HCl. The resulting glucosylated derivative contains 20.5% bound D-glucose.

Příklad 8Example 8

Erythroaglutinačně aktivní frakce bílkovin získání srážením extraktu ze semen trojkýlu mečovitého (Canavalia ensiformls) síranem amonným do 80% nasycení se po odcentrifugování rozpustí v desetinásobném množství vody a nanese na sloupec D-glukosyl- nebo D-manosyl derivátu sférické celulosy. Po naneséní aktivní frakce se sloupec promyje 0,5 M roztokem chloridu sodného a specificky adsorbovaný konkanavalin A se vymyje 0,1 M roztokem D-glukosy v 0,5 M NaCl· Eluci konkanavalinu A je možno alternativně docílit kyselým pufrem (pH 3] nebo borátovým pufrem. Frakce obsahující bílkovinu se epojí₍ dialyzují a lyofilisují. Takto· získaný preparát je eiektroforeticky čistý konkanavalin A, jehož hemaglutinační aktivita je 64 krát vyšší než aktivita aplikované hrubé frakce. Kapacita D-glukósyl derivátu celulosy, který obsahuje 15,3% navázané D-glukosy (viz příklad lj je 36 mg konkanavalinu A/ml, takže k izolaci veškerého lektinu obsaženého v extraktu ze 100 g semen postačí kolona gefu o objemu 100 ml. (Pracuje-li se při 4°C, je kapacita 70 mg/ml)The erythroagglutinatively active protein fraction obtained by precipitating the extract from the seeds of the bovine tract (Canavalia ensiformls) with ammonium sulfate to 80% saturation, after centrifugation, dissolve in ten times the amount of water and apply to a D-glucosyl or D-mannosyl spherical cellulose derivative column. After loading the active fraction, the column is washed with 0.5 M sodium chloride solution and the specifically adsorbed concanavalin A is eluted with 0.1 M D-glucose solution in 0.5 M NaCl. Elution of concanavalin A can alternatively be achieved with an acid buffer (pH 3) or The protein-containing fractions are epilated ₍ dialyzed and lyophilized.) The preparation thus obtained is eectrophoretically pure concanavalin A, whose haemagglutination activity is 64 times higher than that of the applied coarse fraction. The capacity of D-glucosyl cellulose derivative containing 15.3% bound D-glucose (see Example 1j is 36 mg concanavalin A / ml, so a 100 ml gef column is sufficient to isolate all the lectin contained in the 100 g seed extract. (Working at 4 ° C, the capacity is 70 mg / ml). ml)

Kapacita D-glukosyl derivátu, který obsahuje 3,5% navázané D-glukosy je 9 mg konkanavalinu A/ml.The capacity of the D-glucosyl derivative, which contains 3.5% bound D-glucose, is 9 mg concanavalin A / ml.

Kapacita' D-mannosyl derivátu, který obsahuje 7% D-mannosy je 44 mg con A/ml.The capacity of the D-mannosyl derivative containing 7% D-mannose is 44 mg con A / ml.

Alternativně je možno aglutinačně aktivní hrubou frakci bílkovin získanou srážením síranem amonným rozpustit, dialyzovat a lyofilizovat a na sloupec aplikovat rozpuštěnou lyoflllsovanou aktivní frakci.Alternatively, the agglutinatively active coarse fraction of proteins obtained by ammonium sulfate precipitation can be dissolved, dialyzed and lyophilized and the dissolved lyophilized active fraction applied to the column.

Příklad 9Example 9

Aglutinačně aktivní frakce bílkovin získaná srážením extraktu ze semen hrachu (Pisum sativum) síranem amonným do 55,% nasycení se po odcentrifugování rozpustí v desetinásobném objemu vody a»nanese na sloupec D-glukosyl nebo D-mánnosyl derivátu sférické celulosy. Potom sé sloupec promyje 0,5 M roztokem NaCl a vázaný lektin se vymyje 0,1 M roztokem D-glukosy v 0,5 M NaCl. Frakce obsahující bílkovinu se spojí, dialyzují a lyofilisují. Takto získaný preparát je eiektroforeticky čistý lektin ze semen hrachu, jehož aglutinační aktivita je 128krát vyšší než aktivita původní aplikované aktivní frakce. Kapacita D-glukosyl derivátu celulosy (15,5% vázané D-glukosy je 25 mg lektinu/ml.The agglutinating protein fraction obtained by precipitation of pea seed extract (Pisum sativum) with ammonium sulphate to 55% saturation after centrifugation was dissolved in ten times the volume of water and applied to a D-glucosyl or D-mannosyl spherical cellulose derivative column. The column was then washed with 0.5 M NaCl solution and the bound lectin was eluted with 0.1 M D-glucose solution in 0.5 M NaCl. The protein-containing fractions were pooled, dialyzed and lyophilized. The preparation thus obtained is an electrophoretically pure lectin from pea seeds whose agglutination activity is 128 times higher than that of the originally applied active fraction. The capacity of the D-glucosyl cellulose derivative (15.5% bound D-glucose is 25 mg lectin / ml).

2071720717

Příklad Semena Akt. frakce Použitý derivát Obsah cukru Eluce Kapacita Zvýšení (% (řJHá]2 so<} '(·'%·)·· (mg/iuJj aktivityExample Seeds Act. fraction Used derivative Sugar content Eluce Capacity Increase (% (HJá) 2 so <} '(·'% ·) ·· (mg / iJJj activity

Hlodáš .evropský - 40 L-Fuc 0.1M 25 512 (Ulex euro- L-Fuc paeus)Rodent. European - 40 L-Fuc 0.1M 25 512 (Ulex euro-L-Fuc paeus)

CM ca· s«3 τΗ φ· oQ co l£rCM ca · s 3 3 τΗ φ · oQ co l £ r

CM vrt ca oCM hole ca o

5? \-t 55? \ -t 5

SgSj afl o OSgSj afl o

QQ

CMCM

CM ea^z caCM ea ^from ca

COWHAT

CM & ® .S 3 · o . Q«cmCM & ® .S 3 · o. Q «cm

3g%3g%

O <O <

Sz r-l _o o3 aSz rl and _the o3

o. O. CJ CJ o O ₎. _{1 )} . ₁ < < < < < < (ΰ (ΰ 3 3 2: 2: z. of. Z OF O O O O 3 3 i-*l 3 i- * l 3 0 r·* 0 r · * ώ: ώ: ώ ώ 0 t 0 t a 1 and 1 0' 1 0 ' 1

Cl· oCl · o

CO.WHAT.

o. in 03’ . ΙΛin 03 ’. ΙΛ

O ca«Μ V o .00 W Γ? « rt .. O &04.JAbout ca Μ V o .00 W Γ? «Rt .. O & 04

3 Π3 Π

Z £)3.From £) 3.

^wco4 ^wco 4

£ x. * 3 gS/ŠS 6«? 2 'a «·£ x. * 3 gS / SS 6 «? 2 'a «·

tn , 20 3 7tn, 20 3 7

P ř í k 1 a ů 1 6Example 1 6

LyGřilisované, upráškované jikry okouna (Perca fluviatilis) se extrahují mícháním s lOx objemem 0,9% NaCl 16 hodin, extrakt se potom centrifuguje. K supernatantu ,(100 ml) se přidá 10 ml D-glukosylderivátu sférické celulosy alternativně též D-mannosyl nebo L-fukoisyl (obsah navázaného cukru 15,5% a suspense se třepe 8 hodin při 10 °C.The lyophilized, powdered perch roe (Perca fluviatilis) is extracted by mixing with a 10x volume of 0.9% NaCl for 16 hours, then the extract is centrifuged. To the supernatant, (100 ml), 10 ml of spherical cellulose D-glucosyl derivative, alternatively also D-mannosyl or L-fucoisyl (bound sugar content of 15.5%) is added and the suspension is shaken for 8 hours at 10 ° C.

Gel se odfiltruje, promyje na sloupci 0,9% NaCl a specificky adsorbovaný lektin se uvolní 0,1 M roztokem D-glukosy v 0,9% NaCl· Získaný protein se dialyzuje a lyofilisuje. Získá se 210 mg elektroforeticky čistého, lektinu, jehož specifická aktivita je 64krát vyšší než aktivita jiker. Kapacita D-glukosyl derivátu celulofey je v tomto vsádkovém uspořádání 21 mg/ml. . .The gel is filtered off, washed on a 0.9% NaCl column and the specifically adsorbed lectin is released with a 0.1 M solution of D-glucose in 0.9% NaCl. The protein obtained is dialyzed and lyophilized. 210 mg of electrophoretically pure lectin are obtained, whose specific activity is 64 times higher than that of eggs. The capacity of the D-glucosyl cellulose derivative in this batch arrangement is 21 mg / ml. . .

Claims (4)

1. Celulosový nosič pro separaci biologicky aktivních látek vyznačený tím, že na povrchu obsahuje alfa-glýkosidicky kovalentně vázané sacharidy nebo jejich deriváty vybrané ze skupiny monosacharidů, oligosacharidů, deoxycukrů a aminocukrů, má sférický tvar s velikostí částic 0,02 až 2,00 mm a v prostředí vody vykazuje porezitu až 90 procent.A cellulosic carrier for the separation of biologically active substances, characterized in that it contains alpha-glycosidically covalently bound carbohydrates or derivatives thereof selected from the group of monosaccharides, oligosaccharides, deoxy sugars and amino sugars on the surface, having a spherical shape with a particle size of 0.02 to 2.00 mm and has a porosity of up to 90 percent in a water environment. 2. Způsob výroby celulosového nosiče pro separaci biologicky aktivních látek podle bodu 1 vyznačený tím, že se sférická celulosa promyje bezvodým organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou, promíchává se2. A process for the production of a cellulosic carrier for the separation of biologically active substances according to claim 1, characterized in that the spherical cellulose is washed with an anhydrous water-miscible organic solvent, mixed VYNALEZU s roztokem bezvodého cukru o koncentraci 0,5 až 5 % hmotnostních v témže rozpouštědle za přítomnosti kyselého katalysáto. ru při teplotě 15 až 70 °C po dobu 1 až 20 hodin, načež se .promyje vodou o teplotě +4 až -f-10°C a fosfátovým pufrem pH 7.OF THE INVENTION with an anhydrous sugar solution at a concentration of 0.5 to 5% by weight in the same solvent in the presence of an acidic catalysate. The mixture was washed at 15 to 70 ° C for 1 to 20 hours and then washed with water at +4 to -10 ° C and phosphate buffer pH 7. 3. Způsob výroby podle bodu 2, vyznačený tím, že jako bezvodé rozpouštědlo se použije dioxan, dimethylsulfoxid, dimethylformamid.3. A process according to claim 2 wherein the anhydrous solvent is dioxane, dimethylsulfoxide, dimethylformamide. 4. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že jako kyselý katalysátor se používá fluorid boritý, chlorovodík nebo jejich směs.4. The process of claim 2 wherein the acid catalyst is boron trifluoride, hydrogen chloride, or a mixture thereof.