CS198108B2 - Method of producing new antibuotic 7 beta-/d-5-amino-5-carboxyvaleramido/-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid - Google Patents
Method of producing new antibuotic 7 beta-/d-5-amino-5-carboxyvaleramido/-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid Download PDFInfo
- Publication number
- CS198108B2 CS198108B2 CS168271A CS168271A CS198108B2 CS 198108 B2 CS198108 B2 CS 198108B2 CS 168271 A CS168271 A CS 168271A CS 168271 A CS168271 A CS 168271A CS 198108 B2 CS198108 B2 CS 198108B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- antibiotic
- culture
- mycelium
- agar
- beige
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby nového antibiotika, kyseliny 7d-(D-5-amino-5-karboxy valeramido) -3-karbamoylOxymeMiyl-7-methoxy-3-cefem-4-karboxylové.The invention relates to a process for the preparation of a novel antibiotic, 7d- (D-5-amino-5-carboxy-valeramido) -3-carbamoyl-oxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid.
Vynález se tedy týká nového druhu antibiotik cefalospoírinového typu, které nesou methoxyskupinu v poloze 7 jádra. Táto antibiotika jsou strukturálně příbuzná známým antibiotikům cefalosporinové řady, avšak na rozdíl od cefalosporinu C, ktrý obsahuje v poloze 7 skupinu D-5-kanboxyvaleramido2 vou, obsahují také methoxyskupinu v poloze 7. Cefaiosporin C je mimoto substituován v poloze 3 skupinou acetoxymethylovou, kdežto sloučeniny podle vynálezu obsahují v této poloze hydroxymethylovou skupinu.The invention therefore relates to a new type of cephalosporin type antibiotics which carry a methoxy group at the 7-position of the nucleus. These antibiotics are structurally related to the known antibiotics of the cephalosporin series, but, unlike cephalosporin C, which contains a D-5-canboxyvaleramido group at position 7, they also contain a methoxy group at position 7. Furthermore, the cephalosporin C is substituted at the 3 position by acetoxymethyl. according to the invention contain a hydroxymethyl group in this position.
Předmětem vynálezu je způsob výroby nového antibiotika, kyseliny 7jS-(D-5-'amino-5-karboxyval·eroamido j-3-karbamOyloxymethyl-7-methoxy-3-cefem-4-karboxyloivé obecného vzorce I,The present invention provides a process for the preparation of a novel antibiotic, 7S- (D-5-amino-5-carboxyvaleramido) -3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid of formula I,
NH,NH,
OO
IIII
OCHOCH
HOOC-CH-ÍCH^-c-NHHOOC-CH-CH3-c-NH
CHZOCNHZ CH Z OCNH Z
COOH (I) vyznačující se tím, že se pěstuje při teplotě 20 až 37 °C a při pH 6,0 až 8,0 ve vodném živném prostředí, které obsahuje 1 až 6 hmotnostních % uhlohydrátů a 0,2 až 6 hmotnostních % dostupného dusíku za aerobních podmínek Streptomyces lactamdurans NRRL 3802, načež se získané antibiotikum izoluje chromatograficky.COOH (I) characterized in that it is grown at a temperature of 20 to 37 ° C and at a pH of 6.0 to 8.0 in an aqueous nutrient medium containing 1 to 6% by weight of carbohydrates and 0.2 to 6% by weight of available of nitrogen under aerobic conditions Streptomyces lactamdurans NRRL 3802, whereupon the obtained antibiotic is isolated by chromatography.
Antibiotikum je produkováno novým kmenem Actinomycet, jehož vzorek byl uložen ve sbírce kultur Merck a Co., Inc., Rahway, New Jersey pod číslem MA-2908, jakož i ve sbírce kultur Northern Utilization Research and Development of Ag,riculture at Peorfa, Illinois pod číslem NRRL 3802. Mimo svou antibiotickou účinnost je produkt vzorce I také meziproduktem, vhodným k výrobě odpovídajících 3-hydroxyderivátů, 3-acyloxyderivátů a karbamoyloxyderivátů. Způsob výroby těchto- sloučenin bude dále popsán.The antibiotic is produced by a new strain of Actinomycet, a sample of which has been deposited with Merck and Co., Inc., Rahway, New Jersey, MA-2908, as well as in the Northern Utilization Research and Development of Ag culture, Peorfa, Illinois. In addition to its antibiotic activity, the product of formula (I) is also an intermediate suitable for the production of the corresponding 3-hydroxy derivatives, 3-acyloxy derivatives and carbamoyloxy derivatives. The process for preparing these compounds will be described below.
Produkt o vzorci I bude dále nazýván antibiotikem 842A.The product of formula I will hereinafter be called antibiotic 842A.
Antibiotikum 842A je charakterizováno zvýšenou účinností proti gramnegativním mikroorganismům. Produkt je účinný in vivo, přičemž jeho účinnost je obecně vyšší než účinnost cefalotinu. Vysokou účinnost má antibiotikum zejména proti Próteus morganii, Escherichia coli, Próteus vulgaris, Próteus mirabilis, Próteus morganii, Salmonella schottmuelleri, Klebsiela pneumoniae AC, Klebsiella penumoniae B a Paracolobactrum arizoniae.Antibiotic 842A is characterized by increased efficacy against gram-negative microorganisms. The product is active in vivo and its activity is generally higher than that of cephalotin. In particular, the antibiotic is highly effective against Proteus morganii, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus morganii, Salmonella schottmuelleri, Klebsiela pneumoniae AC, Klebsiella penumoniae B and Paracolobactrum arizoniae.
Antibiotikum 842A je výhodnou sloučeninou podle vynálezu. Mimo obvykle velmi vysokou účinnost proti gramnegativním mikroorganismům a zvýšenou odolnost proti cefalosporinázám je toto· antibiotikum výhodné i pro svou nízkou toxicitu a snadnost dosažení vysokých hladin antibiotika v krevním oběhu. V průběhu 6 hodin po podání je přibližně 100 % antibiotika vyloučeno močí. Toto antibiotikum, je odolnější vůči enzymům než cefalosporin C, rezistence vůči antibiotiku vzniká velmi pomalu a antibiotikum má i baktericidní účinky. Při perorálním podání je účinné zejména Paracolobactrum arizoniae 3270, Próteus vulgaris 1810 a Salmonella schottmuelleri 3010. V případě podkožního podání je dvakrát až desetkrát účinnější než cěfalotin při stejném použití.Antibiotic 842A is a preferred compound of the invention. In addition to the usually very high activity against gram-negative microorganisms and increased resistance to cephalosporinases, this antibiotic is advantageous for its low toxicity and the ease of achieving high levels of antibiotic in the bloodstream. Approximately 100% of the antibiotic is excreted in the urine within 6 hours after administration. This antibiotic is more resistant to enzymes than cephalosporin C, antibiotic resistance develops very slowly, and the antibiotic also has bactericidal effects. Paracolobactrum arizoniae 3270, Proteus vulgaris 1810 and Salmonella schottmuelleri 3010 are particularly effective when administered orally. It is two to ten times more effective than cephalotin in the same application when administered subcutaneously.
Antibiotikum 842A a mikroorganismus, který je scbJoipný toto antibiotikum produkovatAntibiotic 842A and a microorganism that is capable of producing this antibiotic
Mikroorganismus, který produkuje antibiotikum 842A, je dříve neznámý kmen Actinomycet. Původně byl kmen izolován z půdy na šikmém agaru a byl dále pěstován v prostředí následujícího složení:The microorganism that produces the antibiotic 842A is a previously unknown strain of Actinomycetes. Originally the strain was isolated from the soil on sloping agar and was further grown in the following composition:
Prostředí B:Environment B:
extrakt z kvasinek 10,0 g glukóza 10,0 g fosfátový pufr 2,0 mlyeast extract 10.0 g glucose 10.0 g phosphate buffer 2.0 ml
MgSCU . 7 HaO 0,05 g destilovaná voda pH 6,5 1000,0 ml fosfátoivý pufr:MgSCU. 7 HaO 0.05 g distilled water pH 6.5 1000.0 ml phosphating buffer:
KH2PO4 91,0 gKH2PO4 91.0 g
Na2HPO4 95,0 g destilovaná voda 1000,0 mlNa2HPO4 95.0 g distilled water 1000.0 ml
Po několika dnech růstu nedošlo ke sp.orulaci. Mikroorganismus produkoval antibiotikum, které bylo odlišné od jiných známých antibiotik, jak bylo prokázáno biologickými i chemickými zkouškami. Srovnáni výsledků těchto zkoušek bylo antibiotikum prokázáno jako nové a označeno 842A.No sporulation occurred after several days of growth. The microorganism produced an antibiotic that was different from other known antibiotics as demonstrated by both biological and chemical tests. Comparing the results of these tests, the antibiotic was shown to be new and designated 842A.
Taxonomie mikroorganismu produkujícího antibiotikum 842ATaxonomy of antibiotic-producing microorganism 842A
Mikroorganismus, který produkuje antibiotikum 842A (kultura MA-2908), je novým druhem Actinomycet. K jeho určení bylo užito způsobu, který byl popsán v „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology“, 7. vydání, a v „The Actinomycetes“, sv. 2, „Classification, Identification and Description of Genera and Species“, S. A. Waksman (1961]. Tímto způsobem bylo zjištěno, že kultura patří do rodu Streiptomyces a její vlastnosti jsou podobné vlastnostem známého druhu Streptomyces fradise. Biochemicky je tento kmen zcela ve shodě se svrchu uvedeným mikroorganismem, morfologicky se však od něho liší, například béžové zbarveným myceliem, kdežto Streptomyces fradiae vytváří mycelium růžové. Oba kmeny se rovněž liší tvorbou pigmentu na různých živných prostředích a rozdílem ve sporulaci. Na základě těchto rozdílů byla kultura prohlášena za nbvý druh a nazvána Streptomyces lactamdurans. V tabulce III jsou uvedeny biochemické vlastnosti druhu Streptomyces lactamdurans ve srovnání se známým Streptomyces fradiae. Veškeré údaje v tabulce III byly získány po třítýdenní inkubaci při teplotě 28 C'C, není-li jinak uvedeno.The microorganism that produces the antibiotic 842A (culture MA-2908) is a new species of Actinomycetes. The method was as described in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7th edition, and in "The Actinomycetes", Vol. 2, "Classification, Identification and Description of Genera and Species", SA Waksman (1961), in which the culture was found to belong to the genus Streiptomyces and its properties are similar to those of the known species Streptomyces fradise. the above microorganism, but morphologically different from it, for example beige-colored mycelium, while Streptomyces fradiae forms a mycelium pink, both strains also differ in pigment formation on different nutrient media and in differences in sporulation. The biochemical properties of Streptomyces lactamdurans compared to the known Streptomyces fradiae are shown in Table III.All data in Table III were obtained after incubation at 28 ° C for three weeks unless otherwise indicated.
pH prostředí, které bylo v tomto případě užito, bylo přibližně neutrální v rozmezí pHThe pH of the medium used in this case was approximately neutral in the pH range
6,7 až 7,2. Fyziologické testy byly prováděny na konci sedmého a na konci jedenadvacátého dne.6.7 to 7.2. Physiological tests were performed at the end of the seventh and at the end of the 21st day.
TABULKA lilTABLE lil
842A — biochemické srovnání842A - biochemical comparison
Test Streptomyces lactamdurans Streptomyceš fradiaeTest Streptomyces lactamdurans Streptomyces fradiae
Morfologie kmente produkujícího antibiotikum 842AMorphology of 842A-producing cment
V případě, že kmen byl pěstován na svrchu uvedených prostředích, nebyla pozorována tvorba sporoforů ani po 8 týdnech. Byla však pozorována tvorba dlouhých vláken, která byla segmentována na zlomky různých rozměrů, od 0,9 do 1,7 mikronů.If the strain was grown in the above media, sporophor formation was not observed even after 8 weeks. However, the formation of long fibers was observed, which was segmented into fractions of different dimensions, from 0.9 to 1.7 microns.
Mycelium je málo větvené, na vzduchu má přibližně stejný rozměr jako vegetativní mycelium, uniformní je zvláště šířka, která se pohybuje okolo hodnoty 0,9 μ. Mycelium je lehké, má poprášený vzhled a dá se snadno odloučit. Je grampozitivní, v některých případech zanořené do agarové plotny. Byla pozorována fregmentace na tyčinky v případě, že kultura byla pěstována v třepáních lahvích. Mycelium z lahví, které třepány nehyly, vytvářely krátké, poměrně silné segmenty, které však nehyly početné a jejichž význam není znám.The mycelium is little branched, it has approximately the same size in the air as the vegetative mycelium, with a uniform width of around 0.9 μ. Mycelium is lightweight, dusty in appearance and easy to separate. It is gram-positive, in some cases immersed in an agar plate. Freignation into rods was observed when the culture was grown in shaking flasks. The mycelium of the bottles that were not shaken did form short, relatively strong segments, but they were not numerous and whose significance was unknown.
Agar s rajským protlakem a ovesnou moukou:Tomato puree and oat flour agar:
Kultura zvrásněná, suchého vzhledu, plochá, na zadní straně oranžová.Culture wrinkled, dry in appearance, flat, orange on the back.
Mycelium na vzduchu poměrně chudé, béžové;Mycelium in air relatively poor, beige;
Nevytváří se žádný rozpustný pigment. Czapek-Doxův agar:No soluble pigment is formed. Czapek-Dox agar:
Kultura plochá, béžové barvy.Culture flat, beige colors.
Mycelium na vzduchu poprášeného vzhledu, béžovobílé.Mycelium airborne appearance, beige-white.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Agar s glycerolem a asparaginem:Agar with glycerol and asparagine:
Kultura plochá, na zadní straně zlatožlutá až oranžová.Culture flat, golden yellow to orange on the back.
Mycelium na vzduchu poprášeného vzhledu, béžové se slabě broskvovým nádechem.Mycelium airborne appearance, beige with a peach-like tinge.
Rozpustný pigment je zlatohnědý.The soluble pigment is golden brown.
Agar s vaječným albuminem:Egg albumin agar:
Kultura plochá, béžová až žlutá.Culture flat, beige to yellow.
Mycelium na vzduchu poprášeného vzhledu, béžové.Mycelium airborne appearance, beige.
Rozpustný pigment se nevytváří.Soluble pigment is not formed.
Agar s maleinanem vápenatým:Calcium maleate agar:
Kuultura plochá, na zadní straně žlutá s oranžovými okraji.Kuultura flat, yellow on the back with orange edges.
Mycelium na vzduchu poprášeného vzhledu, bílé až béžové s broskvovými okraji. Rozpustný pigment se nevytváří.Mycelium airborne appearance, white to beige with peach edges. Soluble pigment is not formed.
Živný agar s tyrosinem:Tyrosine nutrient agar:
Kultura plochá, oranžová,Culture flat, orange,
Mycelium na vzduchu béžovobílé.Mycelium in air beige-white.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Krystalky tyroslnu jsou rozkládány.The tyrosine crystals are decomposed.
Agar s melasou a extraktem z kvasinek:Molasses and yeast extract agar:
Kultura plochá, na zadní straně oranžová.Culture flat, orange on the back.
Mycelium na vzduchu poprášeného vzhledu, béžovobílé.Mycelium airborne appearance, beige-white.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Živný agar:Nutrient agar:
Kultura plochá, zlatožlutá.Flat, golden yellow culture.
Mycelium na vzduchu .poprášeného vzhledu, béžové barvy.Mycelium in air .Dusted appearance, beige colors.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Lakmusové mléko:Litmus milk:
Vytváří se prstenec, který značí velmi chudý vegetativní růst, bez mycelia na vzduchu.A ring is formed to indicate very poor vegetative growth, without mycelium in the air.
Peptonizace se uskutečňuje při alkalické reakci.The peptization is carried out in an alkaline reaction.
pH 7,3 až 7,4 (u kontrol pH 6,7). Odstředěné mléko:pH 7.3 to 7.4 (pH 6.7 controls). Skimmed milk:
Vytváří se prstenec, znamenající slabý růst, barvy šedé až oranžové.A ring is formed, indicating poor growth, in gray to orange colors.
Mycelium na vzduchu se netvoří.Mycelium does not form in the air.
Tvoří se světle šedý rozpustný pigment. K peptonizaci dochází při alkalické reakci.A light gray soluble pigment is formed. Peptonization occurs in an alkaline reaction.
ipH 7,2 (pH kontrol 6,6).ipH 7.2 (pH controls 6.6).
Agar s odstředěným mlékem:Skimmed milk agar:
Kultura plochá, oranžová.Culture flat, orange.
Mycelium na vzduchu slabě vyvinuté, béžové až slabě korálové růžové.Mycelium weakly developed in air, beige to slightly coral pink.
Rozpustný pigment slabě šedorůžový. Kasein je hydrolyzován.Soluble pigment, slightly gray-pink. Casein is hydrolyzed.
Želatinové bloky:Gelatin blocks:
Kultura béžová až oranžová.Culture beige to orange.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Dochází k úplnému zkapalnění.Complete liquefaction occurs.
Živný agar s želatinou:Gelatin nutrient agar:
Kultura plochá, oranžová.Culture flat, orange.
Mycelium chudé, poprášeného vzhledu, béžové.Mycelium poor, dusty appearance, beige.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Dochází k úplném zkapalnění želatiny. Živný agar se škrobem:The gelatin is completely liquefied. Starch nutrient agar:
Kultura plochá, oranžová.Culture flat, orange.
Mycelium chudé, poprášeného vzhledu, béžové barvy.Mycelium poor, dusty appearance, beige color.
Rozpustný škrob je slabě hydrolyzován. Syntetický agar se škrobem:Soluble starch is poorly hydrolyzed. Synthetic starch agar:
Kultura plochá, na zadní straně béžová, s oranžovými okraji.Culture flat, beige on the back, with orange edges.
Mycelium na vzduchu poprášeného- vzhledu, broskvové barvy.Mycelium air-dusted appearance, peach color.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Dochází k mírné hydrolýze škrobu.There is a slight hydrolysis of the starch.
Loefflerův -agar s krevním sérem:Loeffler -agar with blood serum:
Kultura béžová až oranžová.Culture beige to orange.
Mycelium na vzduchu se netvoří.Mycelium does not form in the air.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Nedochází ke zkapalnění.No liquefaction.
Agar s peptonem, železem a extraktem z kvasnic:Agar with peptone, iron and yeast extract:
Kultura béžová.Culture beige.
Mycelium chudé, bělavé.Mycelium poor, whitish.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Mikroaerofilní růst:Microaerophilic growth:
K této zkoušce bylo užito dextrózových čepů s extraktem z kvasnic, přičemž hloubka čepu byla 40 mm. Byl pozorován dobrý růst na povrchu čepu a podél horní čtvrtiny rozhraní.Dextrose pins with yeast extract were used for this test, with a pin depth of 40 mm. Good growth was observed on the pin surface and along the upper quarter of the interface.
Zkouška na růst při různých teplotách:Growth test at various temperatures:
Ke zkoušce bylo užito šikmého agaru s dextrózou a extraktem z kvasnic. Kultura rostla dobře při 28C'C, slabě při 37 °C, vůbec nerostla při 50%.Inclined agar with dextrose and yeast extract was used for the assay. The culture grew well at 28 ° C, weakly at 37 ° C, did not grow at 50% at all.
Agar s dextrózou a extraktem z kvasnic:Agar with dextrose and yeast extract:
Kultura plochá, zlatožlutá.Flat, golden yellow culture.
Mycellum na vzduchu poprášeného vzhledu, béžojvé až slabě fialové.Mycellum airborne appearance, beige to light purple.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Bramborový blok:Potato block:
Kultura plochá, béžové až oranžové barvy, suchého vzhledu.Culture of flat, beige to orange color, dry appearance.
Mycelium chudé, béžové.Mycelium poor, beige.
Rozpustný pigment se netvoří.Soluble pigment is not formed.
Redukce dusičnanů na dusitany byla negativní. Veškerá odečítání prováděna po třítýdenní inkubaci při teplotě 28 °C, ne,ní-li jinak uvedeno. Fyziologické testy byly prováděny 7. a 21. den.The reduction of nitrates to nitrites was negative. All readings are made after incubation at 28 ° C for three weeks, unless otherwise stated. Physiological tests were performed on days 7 and 21.
Morfologické rozdíly mezi Streptomyces lactamdurans a Streptomyces fradiae jsou uvedeny v tabulce IV. Pozorování byla prováděna na prostředích uvedených v této tabulce po týdnu pěstování, po 3 týdnech a 8 týdnech. Mycelium na vzduchu vytvářené kmenem Streptomyces lactamdurans je krátké a přímé, se slabým větvením. Je téměř stejného rozměru jako vegetativní mycelium, má šířku 0,9 μ. Je světlé, poprášeného vzhledu a dá se snadno seškrábat.The morphological differences between Streptomyces lactamdurans and Streptomyces fradiae are shown in Table IV. Observations were performed in the environments listed in this table after a week of cultivation, after 3 weeks and 8 weeks. The airborne mycelium produced by Streptomyces lactamdurans is short and straight, with slight branching. It is almost the same size as the vegetative mycelium, with a width of 0.9 μ. It has a bright, dusty appearance and is easy to scrape.
Vegetativní mycelium je grampozitivní, lne k živnému prostředí, do některých živných prostředí se zanoruje. Lze pozorovat fragmentaci do tyčinek, je-li kultura pěstována v trepacích lahvích. Vegetativní mycelium z těchto lahví při pěstování 4 až 6 dní při 28 QC vytvářelo krátké, silné segmenty, které .však nebyly příliš četné. Všechna odečítání v tabulce IV byla prováděna po· 3 týdnech inkubace. pH prostředí byto vždy přibližně neutrální, 6,8 až 7,2. Barvy užité v pokuse jsou v souhlase s návrhem publikace „Color Harmony Manual“, 4. vydání, 1958, Container Corporation of America. Využití uhlohydrátůThe vegetative mycelium is gram-positive, adheres to the culture medium, and is immersed in some culture media. Fragmentation into rods is observed when the culture is grown in shake flasks. The vegetative mycelium of these bottles when grown 4-6 days at 28 Q C created a short, strong segments .však not too numerous. All readings in Table IV were performed after · 3 weeks incubation. The pH of the medium should always be approximately neutral, 6.8 to 7.2. The colors used in the experiment are in accordance with the draft "Color Harmony Manual", 4th edition, 1958, Container Corporation of America. Utilization of carbohydrates
Kultura Streptomyces lactamdurans MA-2908 byla zkoumána i na svou schopnost využít různé uhlohydráty při pěstování na základním syntetickém prostředí (T. G. Pridham and D. Gottlieb, 1948), které obsahovalo 1 % uhlohydrátu, a to při teplotě 28 °C 3 týdny. V tabulce V je uvedeno využití těchto uhlohydrátových zdrojů uvedenou kulturou.The culture of Streptomyces lactamdurans MA-2908 was also examined for its ability to utilize various carbohydrates when grown on a basic synthetic medium (T. G. Pridham and D. Gottlieb, 1948) containing 1% carbohydrate at 28 ° C for 3 weeks. Table V shows the use of these carbohydrate sources by the culture.
V tabulce V znamená:In Table V it means:
+ dobrý růst ± slabý růst — žádný růst na uvedeném uhlohydrátu+ good growth ± weak growth - no growth on the indicated carbohydrate
TABULKA IVTABLE IV
842A: Morfologické srovnání Streptomyces lactamdurans a Streptomyces fradiae Prostředí Streptomyces lactamdurans Streptomyces fradiae842A: Morphological comparison of Streptomyces lactamdurans and Streptomyces fradiae Streptomyces lactamdurans environment Streptomyces fradiae
1&81081 & 8108
Charakteristik uvedených v tabulkách III, IV a V bylo užito· k zařazení kultury Streptomyces lactamdurans MA-2908 pomocí klíče uvedeného v „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology“, 7. vydání, str. 694 až 829 (1957), a v „The Actinomyces“, s,v. 2, str. 61 až 292 (1961). Srovnáním těchto charakteristik s charakteristikami známých druhů ukázalo, že kultura je biochemicky podobná Streptomyces fradiae. Mezi oběma kulturami jsou však podstatné morfologické rozdíly, například ve zbarvení mycelia Strepmyces fradiae, které má na vzduchu barvu obdobnou fialové barvě mořských škeblí, kdežto .kultura Streptomyces lactamdurans má barvu béžovou. Vegetativní kultury tohoto mikroorganismu vykazují ' rozdíly ve tvorbě pigmentu na různých prostředích, přičemž nebyla zjištěna žádná sporulace. Na základě těchto rozdílů a na základě charakteristik popsaných v tabulkách byl mikroorganismus produkující antibiotikum 842A, kulturu MA-2908, zařazen jako nový druh, Streptomyces lactamdurans.The characteristics listed in Tables III, IV and V were used to classify Streptomyces lactamdurans MA-2908 culture using the key given in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7th edition, pp. 694-829 (1957), and in "The Actinomyces" ", St. 2, pp. 61-292 (1961). Comparison of these characteristics to those of known species has shown that the culture is biochemically similar to Streptomyces fradiae. However, there are substantial morphological differences between the two cultures, for example in the coloration of the Strepmyces fradiae mycelium, which has a color similar to the purple color of sea clams in air, whereas the Streptomyces lactamdurans culture is beige. Vegetative cultures of this microorganism show differences in pigment formation in different media and no sporulation was found. Based on these differences and based on the characteristics described in the tables, the 842A antibiotic producing MA-2908 culture was classified as a new species, Streptomyces lactamdurans.
Tento popis mikroorganismu, který je schopen produkce antibiotika 842A, uvádíme jenom p,ro lepší znázornění typu kmene, kterého je možno použít. Je však zřejmé, že vynález nemůže být omezen na použití organismu, který splňuje tyto zvláštní podmínky. Do vynálezu je nutno zahrnout i použití jakéhokoliv jiného organismu, jakož i kmenů získaných mutací pomocí libovolného činidla schopného mutace vyvolat.This description of a microorganism capable of producing antibiotic 842A provides only a better representation of the type of strain that can be used. It will be understood, however, that the invention cannot be limited to the use of an organism which satisfies these particular conditions. The use of any other organism, as well as strains obtained by mutation using any agent capable of causing mutation, should be included in the invention.
Výroba antibiotika 842A fermentacíProduction of antibiotic 842A by fermentation
Antibiotikum 842A lze vyrobit aerobní fermentací ve vhodném živném prostředí za řízených podmínek pomocí mikroorganismu Streptomyces lactamdurans. K produkci antibiotika je možno obecně užít velkého množství živných prostředí, která obsahují zdroje uhlíku a dusíku. Příkladem těchto prostředí mohou být prostředí, uvedená v souvislosti s produkcí antibiotika 810A. Přesné množství uhlohydrátu a zdrojů dusíku závisí na ostatních složkách živného prostředí, obecně však je mnžoství uhlohydrátů v rozmezí 1 až 6 váhových % prostředí a obsah asymilovatelných zdrojů dusíku 0,2 až 6 váhových % prostředí. Dále uvádíme několik prostředí, která jsou zvláště vhodná k výrobě antibiotika 842A. JdeAntibiotic 842A can be produced by aerobic fermentation in a suitable nutrient medium under controlled conditions with Streptomyces lactamdurans. Generally, a large number of nutrient media containing carbon and nitrogen sources can be used to produce the antibiotic. Examples of such media are those reported in connection with the production of antibiotic 810A. The exact amount of carbohydrate and nitrogen sources depends on the other media, but generally the amount of carbohydrates is in the range of 1 to 6% by weight of the environment and the content of asylable nitrogen sources is 0.2 to 6% by weight of the environment. The following are a few environments that are particularly suitable for the production of antibiotic 842A. Going
19810Q19810Q
CaCOj 10,0 g destilovaná voda 1000,0 .ml pH 7,0CaCO3 10.0 g distilled water 1000.0 ml pH 7.0
Prostředí XI:Environment XI:
extrakt z kvasinek 10,0 g lihovarnické výpalky 20,0 g destilovaná voda 1000,0 ml pH 7,0yeast extract 10.0 g distillery stillage 20.0 g distilled water 1000.0 ml pH 7.0
Fermentace se provádí při teplotě 20 až 37 °C, optimálních výsledků lze dosáhnout při teplotách 24 až 32 'C. Živné prostředí má mít p-H 6,0 až 8,0.The fermentation is carried out at a temperature of 20 to 37 ° C, optimum results can be obtained at temperatures of 24 to 32 ° C. The culture medium should have a p-H of 6.0 to 8.0.
V malém měřítku se produkce antibiotika 842A provádí tak, že se naočkuje vhodné živné prostředí kulturou schopnou produkovat antibiotikum, načež se nechá fermentace probíhat při stálé teplotě 28 °C za stálého třepání několik dní. Na konci inkubace se mycelium odstraní a supernatant se zkouší na koncentraci antibiotika.On a small scale, production of antibiotic 842A is performed by inoculating a suitable culture medium with a culture capable of producing the antibiotic, then allowing the fermentation to proceed at a constant temperature of 28 ° C with shaking for several days. At the end of the incubation, the mycelium is removed and the supernatant is assayed for antibiotic concentration.
Fermentace se provádí ve sterilizovaných nádobách v jednom až čtyřech stupních. Živné prostředí pro očkovací kulturu může být voleno například z prostředí 9 až 11. Láhev, v níž se mikroorganismus pěstuje, se umístí na třepacím zařízení při konstantní teplotě 28 °C na 1 až 3 dny, výsledná kultura se pak užije k naočkování druhého stupně očkovací kultury. Užije-li se mezistupňů při výrobě očkovací kultury, provádí se pěstování v mezistupních za týchž podmínek jako pěstování v prvním stupni. Obsah lahví se na konci inkubace odstřeďuje k odstranění mycela. Supernatant se pak koncentruje a čistí, čímž se získá antibiotikum 842A v čistém stavu.The fermentation is carried out in sterilized containers in one to four stages. The culture medium for the inoculum culture may be selected, for example, from 9 to 11. The flask in which the microorganism is grown is placed on a shaker at a constant temperature of 28 ° C for 1 to 3 days, then used to inoculate the second inoculation stage. culture. If intermediate stages are used in the production of a vaccine culture, cultivation is carried out in intermediate stages under the same conditions as the first stage cultivation. The contents of the bottles are centrifuged at the end of the incubation to remove the mycelium. The supernatant is then concentrated and purified to give antibiotic 842A in a pure state.
Ve větším měřítku se s výhodou fermentace provádí v nádržích, které jsou opatřeny míóhadlem a provzdušňovacím zařízením. Žiívné prostředí se mísí přímo v nádrži a v ní se také sterilizuje při teplotách až 120 °C. Po chlazení se sterilizované prostředí očkuje produkční kulturou a fermentace se nechá probíhat několik dní, například 2 až 4 dny, za stálého míchání a/nebo- provzdušňování živného prostředí při stálé teplotě přibližně 28 ^C. Změnami v množství očkovacího materiálu a změnami ve složení živného prostředí je možno upravit podmínky při pěstování tak, aby bylo dosaženo vysokých výtěžků a vysoké účinnosti antibiotika.Preferably, on a larger scale, the fermentation is carried out in tanks equipped with a agitator and an aeration device. The living medium is mixed directly in the tank and sterilized at temperatures up to 120 ° C. After cooling, the sterilized medium is inoculated with the production culture and the fermentation is allowed to proceed for several days, for example 2 to 4 days, while stirring and / or aerating the culture medium at a constant temperature of about 28 ° C. By varying the amount of inoculum and the composition of the culture medium, the growing conditions can be adjusted to achieve high yields and high antibiotic efficacy.
Stanovení účimiíosti antibiotika s poiužitím Vibrio pUrcolansDetermination of antibiotic efficacy using Vibrio pUrcolans
Testy byly prováděny na plotnách při použití filtračního papíru v discích průměruTests were performed on plates using filter paper in diameter discs
1,2 cm. Plotny byly připraveny ze živného agaru s 2,0 g extraktu z kvasnic na litr agaru, na jednu plotnu bylo užito 10 ml této směsi. Zkoumaný organismus byl pěstován v bujónu přes noc, načež byly buňky mikroorganismu ředěny roztokem kuchyňské soli na suspenzi -o 40% propustnosti pro světlo při vlnové délce 660 nm. Tato suspenze byla přidána v množství 20 ml/ml do živného prostředí před odléváním ploten.1,2 cm. Plates were prepared from nutrient agar with 2.0 g yeast extract per liter agar, 10 ml of this mixture was used per plate. The test organism was grown in a broth overnight, then the cells of the microorganism were diluted to a 40% light transmission suspension at a wavelength of 660 nm with a sodium salt solution. This suspension was added in an amount of 20 ml / ml to the culture medium before casting the plates.
Plotny byly uchovávány při 4 C'C do použití, maximálně 5 dní. Po aplikaci papírových disků sycených roztokem antibiotika byly plotny inkubovány při 28 °C 8 až 24 hodiny. Pak byly odečítány zóny inhitoice. v mm průměru. Tato čísla byla pak užita ke stanovení relativní účinnosti, popřípadě ke stanovení účinnosti v ^g/ml, byly-li výsledky srovnány s čištěným standardem. Provádí-li se tyto zkoušky kvantitativně, lze zjistit 1 až 2 μξ antibiotika na ml.Plates were stored at 4 ° C until use, maximum 5 days. After application of the paper discs saturated with the antibiotic solution, the plates were incubated at 28 ° C for 8 to 24 hours. The inhitoice zones were then subtracted. in mm diameter. These numbers were then used to determine the relative potency, or to determine the potency in µg / ml when the results were compared to the purified standard. If these tests are carried out quantitatively, 1 to 2 μξ antibiotics per ml can be detected.
Bakteriální inaktivace antibiotika 842A: Odolnost antibiotika 842A k inaktivaci bakteriemi byla stanovena in vitro ve srovnání s odolností cephalosporlnu C, cephalosporidinu a cephalotinu. Pokusy ukázaly, že antibiotikum 842A je proti účinku mikroorganismů odolnější než ostatní svrchu uvedená antibiotika.Bacterial inactivation of 842A: The resistance of 842A to bacterial inactivation was determined in vitro compared to that of cephalosporin C, cephalosporidine and cephalotin. Experiments have shown that antibiotic 842A is more resistant to the action of microorganisms than the other antibiotics listed above.
K degradaci bylo užito- dvou mikroorganismů, které úplně inaktivují cěphalosporin C, a t-o Alcaligenes faecolis (BM-9) a Alcaligenes viscoSus (MB-12).Two microorganisms that completely inactivate cephalosporin C and t-o Alcaligenes faecolis (BM-9) and Alcaligenes viscoSus (MB-12) were used for degradation.
a) Příprava bakteriálních buněka) Preparation of bacterial cells
Buňky Alcaligenes faecolis (MB-9) a Alcaligenes viscosus (MB-12) byly připraveny takto:Alcaligenes faecolis (MB-9) and Alcaligenes viscosus (MB-12) cells were prepared as follows:
Obsah L-zkumavky byl smíšen s několika mililitry živného prostředí s obsahem 0,2 % extraktu z kvasnic. Tato suspenze byla nanesena kličkou na povrch šikmého- živného agaru, který byl pak inkubován 18 hodin při 37 °C. Všechny zkumavky šikmého agaru byly pak skladovány při 5 °C do použití, nejvýše však týden. Kultura s povrchu· jedné ze zkumavek byla pak vždy asepticky přenesena kličkou do 50 ml bujónu s 0,2 % extraktu z kvasnic, bujón byl pak umístěn ha třepacím zařízení a inkubován 18 hodin při 28 °C. Pak byla kultura 10 minut o-dstředována při 4000 otáčkách za minutu. Supernatant byl slit a buňky byly dvakrát promyty sterilním fosfátovým pufrem -o koncentraci 0,1 M a pH 7,5 (pufr obsahuje 6,8 g kyselého fosforečnanu draselného a 7,1 g středního fosforečnanu sodného na 1 litr destilované vody). Pro-myté buňky byly pak znovu uvedeny v suspenzi v koncentraci 4 mg/ml roztoku antibiotika v 0,1 N fosforečnanového pufru. Testovaná směs byla pak inkubována bez třepání na vodní lázni při 37 aC 4 hodiny, načež bylo prostředí odstředěno 10 minut při 2000 otáčkách za minutu a čirý supernataht byl slit do- sterilních zkumavek a okamžitě zmrazen v suchém ledu až do- použití, nejvýše však 3 hodiny. Kontroly byly inkubovány stejným způsobem, až na nepřítomnost buněk.The contents of the L-tube were mixed with several milliliters of culture medium containing 0.2% yeast extract. This suspension was applied with a loop to the surface of sloped nutrient agar, which was then incubated for 18 hours at 37 ° C. All slant agar tubes were then stored at 5 ° C until use, but for a maximum of one week. The culture of the surface of one of the tubes was then aseptically transferred through a loop into 50 ml of broth with 0.2% yeast extract, the broth was then placed on a shaker and incubated for 18 hours at 28 ° C. Then, the culture was centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes. The supernatant was decanted and the cells were washed twice with sterile 0.1 M phosphate buffer and pH 7.5 (buffer containing 6.8 g of potassium potassium phosphate and 7.1 g of medium sodium phosphate per liter of distilled water). The washed cells were then resuspended in a concentration of 4 mg / ml antibiotic solution in 0.1 N phosphate buffer. The test mixture was then incubated without shaking in a water bath at 37 and C for 4 hours, after which the medium was centrifuged for 10 minutes at 2000 rpm and the clear supernatant was discarded in sterile tubes and immediately frozen in dry ice until use, but at most 3 hours. Controls were incubated in the same manner except for the absence of cells.
b) Inaktivace antibiotika 842Ab) Inactivation of antibiotic 842A
Supernatanty byly zkoumány na svou an198108 ťrbakteriální účinnost následujícím způsobem:Supernatants were assayed for their bactericidal activity as follows:
Papííové kotouče průměru 0,65 cm byly nasyceny supernatantem a umístěny na povrch ploten z živného agaru s 0,2 % extraktu z kvasnic, do nichž byl předem přimíšen příslušný mikroorganismus. Plotny, obsahující B. subtilis (MB-964), byly vyrobeny následujícím způsobem: 5. ml suspenze promytých spor v 0,91% roztoku NaCl bylo přidáno ke 150 ml živného agaru s 2 % extraktu z kvasnic při 45 QC, 5 ml této směsi bylo pak užito k odlití ploten, z nichž každá měla rozměr 15 x 100 mm. Plotny byly uloženy při teplotě 5 °C do použití, nejvýše však 3 dny. Pak byly plotny inkuhovány pres noc při 25 °C před měřením zóny inhibice okolo disků.Paper discs of 0.65 cm in diameter were saturated with the supernatant and placed on the surface of nutrient agar plates with 0.2% yeast extract to which the respective microorganism had been premixed. Plates containing the B. subtilis (MB-964) were prepared as follows: 5. ml spore suspension washed in 0.9% NaCl solution 1 were added to 150 ml nutrient agar containing 2% yeast extract at 45 Q C, 5 ml of this mixture was then used to cast plates of 15 x 100 mm each. Plates were stored at 5 ° C until use, but no longer than 3 days. The plates were then incubated overnight at 25 ° C before measuring the zone of inhibition around the disks.
Bezbuněčné roztoky antibiotika byly ředěny v poměrech 1: 1, 1 : 2, 1 : 4, i : 8, 1: 16 a 1:32, čímž byla získána standardní křivka. Různé roztoky antibiotik byly pak zkoumány po inkubaci za přítomnosti promytých bakteriálních buněk. Všechny zkoušky byly prováděny třikrát.Cell free antibiotic solutions were diluted 1: 1, 1: 2, 1: 4, i: 8, 1: 16 and 1:32 to give a standard curve. Various antibiotic solutions were then examined after incubation in the presence of washed bacterial cells. All tests were performed in triplicate.
c) Výsledky(c) Results
Procenta inaktivace byla propočítávána tak, že byl nejprve vypočítán průměr tří inhibičních zón ze tří souběžných zkoušek, načež bylo stanoveno množství antibiotika, které zbylo v testovacím roztoku ve srovnání se standardní křivkou. Tato hodnota byla odečtena od výchozí koncentrace 4 mg/ /ml a zbytek byl dělen výchozí koncentrací a násoben stem, čímž bylo- získáno procento inaktivace. V tabulce XVI je uvedena Inaktivace Cephalosporinu C a antibiotika 842A za svrchu uvedených podmínek.The percentage of inactivation was calculated by first calculating the average of the three inhibition zones from the three concurrent tests, and then determining the amount of antibiotic remaining in the test solution compared to the standard curve. This value was subtracted from the starting concentration of 4 mg / / ml and the residue was divided by the starting concentration and multiplied by 100 to give a percentage of inactivation. Table XVI shows the inactivation of Cephalosporin C and antibiotic 842A under the above conditions.
TABULKA XVITABLE XVI
Procento- inaktivace po inkubaci s promytými bakteriálními buňkamiPercentage-inactivation after incubation with washed bacterial cells
Desky s obsahem B. subtilis (MB-964)Plates containing B. subtilis (MB-964)
Degradující organismus Čtyřhodinová inkubaceDegrading organism Four hour incubation
Cephalosporin C Antibiotikum 842ACephalosporin C Antibiotic 842A
Alcaligenes faecalis MB-9 99+Alcaligenes faecalis MB-9 99+
A. viscosus MB-12 99+A. viscosus MB-12 99+
54,454.4
Schopnost antibiotika 842Á a Cephalosporinu C odolávat degradačnímu účinku různých mikroorganismů byla zkoumána ještě na následujících kulturách: Escherichia coli 236, Próteus morganii 251, Próteus morganii 356 a Próteus mirabilis 241. Tyto- mikroorganismy jsou gramnegativní a odolné proti Cephalosporinu C. Při provádění těchto zkoušek byl vždy smíšen mikroorganismus s některým z antibiotik a po 4 hodinách byla stanovena zbytková účinnost antibiotika. Zkoušky byly prováděny stejným způsobem jako při použití Alcaligenes faecalis MB-9 a A. viscosus MB-12. V následující tabulce je uvedeno procento- inhlbice Cephalosporinu C a antibiotika 842A při použití B. subtilis (MB-964) svrchu uvedenou metodou.The ability of antibiotic 842A and Cephalosporin C to resist the degradation effect of various microorganisms was investigated in the following cultures: Escherichia coli 236, Proteus morganii 251, Proteus morganii 356 and Proteus mirabilis 241. These microorganisms were gram-negative and resistant to Cephalosporin C. the microorganism was always mixed with one of the antibiotics and after 4 hours the residual activity of the antibiotic was determined. The tests were performed in the same manner as Alcaligenes faecalis MB-9 and A. viscosus MB-12. The following table shows the percentage of Cephalosporin C and antibiotic 842A using B. subtilis (MB-964) as described above.
KulturaCulture
TABULKA XVIITABLE XVII
Cephalosporin C Antibiotikum 842ACephalosporin C Antibiotic 842A
Z těchto údajů je zřejmé, že antibiotikum 842A je daleko odolnější než Cephalosporin C k inaktivaci mikroorganismy A. faecalis, A. viscosus, Escherichia coli 23-6, Próteus morganii 251, Próteus morganii 23-6 a Próteus mirabilis 241.From these data, it is clear that antibiotic 842A is far more resistant than Cephalosporin C to inactivate microorganisms A. faecalis, A. viscosus, Escherichia coli 23-6, Proteus morganii 251, Proteus morganii 23-6 and Proteus mirabilis 241.
Antibiotikum 842A, které se získá svrchu uvedeným fermentačním způsobem, je amfoterní sloučeninou s izoelektrickým bodem při pH 3,5. Nad pil 9,0 je nestálé, je však poměrně stálé při pH 1,5.The antibiotic 842A obtained by the above fermentation method is an amphoteric compound having an isoelectric point at pH 3.5. Above the pH of 9.0 it is unstable, but is relatively stable at pH 1.5.
Protože antibiotikum 842A a jeho- soli účinně inhibují růst různých druhů Salmonella, je možno jich užít k desinfekci v různých případech v dothácnostech i průmyslu. Antibiotika i soli jsou účinné i proti Salmonella schotťmuelleri a S. gallinarum, antibiotikum 842A je pak účinné zejména proti Salmonella schottmuelleri 3010, S. gallinarum a S. typhosa.Because the antibiotic 842A and its salts effectively inhibit the growth of various Salmonella species, they can be used for disinfection in various cases in the home and industry. Antibiotics and salts are also effective against Salmonella schottmuelleri and S. gallinarum, while antibiotic 842A is particularly effective against Salmonella schottmuelleri 3010, S. gallinarum and S. typhosa.
Antibiotikum 842A:Antibiotic 842A:
Antibiotikum 842A lze čistit a-dsorpcí na iontoměniči, například na pryskyřici obsahující kvartérní amoniový iont nebo kyselinu sulfonovou. Absorbované antibiotikum se vymývá vodnými roztoky nebo směsí vody a alkoholu, které obsahují vh-odnu sůl, například chlorid amonný, chlorid sodný apod. Vhodnými iontoměničovými pryskyřicemi, kterých je možno použít, jsou například polystyrénové pryskyřice obsahující kyselinu sulfonovo-u (45 % nebo- 53 % vody) neboAntibiotic 842A can be purified by adsorption on an ion exchanger, for example on a resin containing a quaternary ammonium ion or sulfonic acid. The absorbed antibiotic is eluted with aqueous solutions or mixtures of water and alcohol containing a salt such as ammonium chloride, sodium chloride, and the like. Suitable ion exchange resins which may be used are, for example, polystyrene resins containing sulfonic acid (45% or 45% by weight). 53% water) or
810 8 polystyrénové trimethylbenzylamoniové pryskyřice (43 % vody), známé pod názvy Dowex 50 a Dowex 1. Je-li to žádoucí, Je možno takto získaný eluát dále čistit novou chromatografií a elucí. Eluáty se pak slijí a koncentrují, čímž se získá čištěné antibiotikum 842R.Polystyrene trimethylbenzylammonium resins (43% water) known as Dowex 50 and Dowex 1. If desired, the eluate thus obtained can be further purified by new chromatography and elution. The eluates are then combined and concentrated to give purified antibiotic 842R.
Přípravky:Preparations:
Antibiotikum 842A jé možno užít samostatně nebo ve směsi jako účinnou složku celé řady farmaceutických přípravků. Antibiotikum a jeho soli je možno použít ve formě kapslí nebo tablet, v prášku nebo v roztocích, suspenzích nebo elixírech. Lze jej aplikovat peřorálně, nitrožilně nebo nitrosvalově. Zároveň je možno antibiotikum užít spolu s vhodným nosičem, například manitolem, sacharózou, glukózou nebo se sterilními kapalinami, jako s vodou, fyziologickým roztokem, glykoly a oleji, spolu se živočišnými nebo rostlinnými, popřípadě se syntetickými oleji apod. Mimo nosič mohou přípravky obsahovat ještě další složky, například stabilizační prostředky, pojidla, antioxidancie, konzervační prostředky, mazací prostředky, prostředky pro úpravu viskozity, vonné látky apod. Mimoto může přípravek obsahovat ještě další účinnou složku, áby bylo dosaženo širšího spektra antibakteriální účinnosti přípravků.Antibiotic 842A can be used alone or in admixture as an active ingredient in a variety of pharmaceutical compositions. The antibiotic and its salts can be used in the form of capsules or tablets, in powder or in solutions, suspensions or elixirs. It can be administered orally, intravenously or intramuscularly. At the same time, the antibiotic may be used together with a suitable carrier, for example mannitol, sucrose, glucose or sterile liquids such as water, saline, glycols and oils, together with animal or vegetable or synthetic oils and the like. other ingredients such as stabilizers, binders, antioxidants, preservatives, lubricants, viscosity adjusters, fragrances and the like. In addition, the formulation may contain an additional active ingredient to provide a broader spectrum of antibacterial efficacy.
Dávkování závisí do velké míry na váze pacienta. Přednost se dává parenterálnímu podání u generalizovaných Infekcí a perorálním podáním u infekcí střevních. Obvykle se pohybuje denní dávka v rozmezí 15 až 175 mg aktivní složky na kg živé váhy, tato dávka je pak rozdělena na několik jednotlivých dávek během dne. Denní dávka antibiotika 842A je v rozmezí 40 až 80 mg účinné složky na kg váhy.The dosage depends largely on the weight of the patient. Parenteral administration is preferred for generalized infections and oral administration for intestinal infections. Usually the daily dose is in the range of 15 to 175 mg of active ingredient per kg body weight, which is then divided into several individual doses throughout the day. The daily dose of antibiotic 842A is in the range of 40 to 80 mg of active ingredient per kg of weight.
Přípravky mohou být podávány v různých formách jednotlivých dávek, například v kapalných nebo pevných perorálně požitelných dávkách. Tyto jednotlivé předem. připravené dávky obsahují obvykle 15 až 700' mg účinné složky, s výhodou 80 až 320 mg. Při parenterálním podání má být podávána obvykle čistá látka ve sterilním vodném roztoku nebo může být přípravek dodáván jako ve vodě rozpustný prášek, ručený k injekcím.The compositions may be administered in various unit dosage forms, for example, in liquid or solid oral doses. These individual beforehand. the prepared doses usually contain 15 to 700 mg of active ingredient, preferably 80 to 320 mg. For parenteral administration, the pure substance should normally be administered in a sterile aqueous solution or the formulation may be presented as a water-soluble powder, injectable.
Užije-li se 100 mg antibiotika 842A a 40 miligramů laktózy, získá se kapsle o váze 145 mg, která je vhodná k perorálnímu podání.When 100 mg of antibiotic 842A and 40 milligrams of lactose are taken, a 145 mg capsule is suitable for oral administration.
Tablety s obsahem kyseliny 7/3-(D-5-amino-5-karboxy valer amido )-3-( kar bamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cef em-4-karboxylové:Tablets containing 7 / 3- (D-5-amino-5-carboxylic acid amido) -3- (carboyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid:
na 1 kapsli kyselina 7β- (D-5-amino-5-karboxy valer amido J -3- (karbamoy loxymethylJ-7-methoxy-3-cefem-4-karboxylová 125 mg kukuřičný škrob 6 mg střední fosforečnan vápenatý 192 mg láktóza 190 mgper capsule 7β- (D-5-amino-5-carboxy valeramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid 125 mg corn starch 6 mg medium calcium phosphate 192 mg lactose 190 mg
Aktivní složka se smísí se středním fosforečnanem vápenatým, laktózou a polovinou kukuřičného škrobu. Směs se pak granuluje s 15 % pasty z kukuřičného škrobu (6 mg) a protlačí se hrubým sítem. Granulát se usuší při teplotě 45 QC, načež se protlačí sítem č. 16. Pak se přidá zbytek kukuřičného škrobu a stearan hořečnatý a směs se lisuje v tablety o průměru přibližně 1,2 centimetru a o váze 800 mg.The active ingredient is mixed with middle calcium phosphate, lactose and half of the corn starch. The mixture is then granulated with 15% corn starch paste (6 mg) and passed through a coarse sieve. The granules are dried at 45 Q C and passed through a No. 16. Then, the remainder of the corn starch and magnesium stearate mixture is compressed into tablets with a diameter of approximately 1.2 cm and weighing 800 mg.
Užije-li se v injekčním přípravku 500 mg kyseliny 7β- (D-5-amino-5-karboxyvaleramido )-3-( karbamoyloxymethyl )-7-,methoxy-3-cefem-4-karboxylové ve 2 ml vody, určené k injekcím, získá se přípravek vhodný pro parenterální podání.When 500 mg of 7β- (D-5-amino-5-carboxyvaleramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-, methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid is used in 2 ml of water for injection to obtain a formulation suitable for parenteral administration.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.The invention will be illustrated by the following examples.
PřikladlHe did
Antibiotikum 842AAntibiotic 842A
Stupeň A: Způsob výroby antibiotika v třepacích lahvíchStep A: Method of making antibiotic in shake bottles
Lyoifilizovaný obsah zkumavky Streptomyces lactamdurans, kultura MA-2908, byl asepticky otevřen a pak užit k naočkování Erlenmeyerových baněk o. obsahu 250 ml, z nichž každá obsahovala 50 ml živného prostředí V, a to tak, že zkumavka byla rozlomena za sterilních podmínek a obsah vsypán do. baňky. Živné prostředí V mělo toto složení:The lyo-sterilized content of the Streptomyces lactamdurans tube, culture MA-2908, was aseptically opened and then used to inoculate 250 ml Erlenmeyer flasks each containing 50 ml of medium V, by breaking the tube under sterile conditions and poured into. flask. The medium V had the following composition:
Prostředí V:Environment V:
autolyzát kvasinek 10,0 g glukóza 10,0 g fosfátový pufr + 2,0 mlyeast autolysate 10.0 g glucose 10.0 g phosphate buffer + 2.0 ml
MgSO4.7Ή2Ο 0,05 g destilovaná voda do 1000,0 ml pH 6,5 + fosfátový pufrMgSO4.7Ή2Ο 0.05 g distilled water to 1000.0 ml pH 6.5 + phosphate buffer
KH2PO4 91,0 gKH2PO4 91.0 g
NazHPOd 95,0 g destilovaná voda do 1000,,0 mlNaHPOd 95.0 g distilled water to 1000.0 ml
Baňka byla třepána při teplotě 28 °C a pří 220' otáčkách za minutu na rotační třepačce s výkyvem 5 cm 3 dny. Podíly o velikosti 5 ml byly pak přeneseny sterilními pipetami do 4 dalších baněk téhož rozměru s obsahem téhož živného prostředí, tyto baňky pak byly inkubovány stejným způsobem. Obsah těchto baněk byl pak asepticky slit do jedné baňky a užit k naočkování 11 Erlenmeyerových baněk o obsahu 2 litrů, z nichž každá obsahovala 350 ml prostředí IX, a to 2 až 3 % očkovacího materiálu s použitím sterilních pipet. Živné prostředí IX mělo toto složení:The flask was shaken at 28 ° C and at 220 rpm on a rotary shaker with a pivot of 5 cm 3 days. The 5 ml aliquots were then transferred with sterile pipettes to 4 other flasks of the same size containing the same culture medium and incubated in the same manner. The contents of these flasks were then aseptically poured into one flask and used to inoculate 11 2L Erlenmeyer flasks each containing 350 ml of medium IX, 2-3% of the inoculum material using sterile pipettes. IX had the following composition:
Prostředí IX:Environment IX:
hydrolyzát kvasinek 10,0 g lihovarnické výpalky 20,0 g dextróza 10,0 g destilovaná voda do 1000,0 ml pH 7,0yeast hydrolyzate 10.0 g distillery stillage 20.0 g dextrose 10.0 g distilled water to 1000.0 ml pH 7.0
Produkční baňky byly pak třepány při teplotě 28 °C na rotační třepačce s výkyvem 5 cm při 145 otáčkách za minutu 4 dny. Na konci této doby byl obsah 10 baněk slit a směs byla odstředěna k odstranění mycelia.The production flasks were then shaken at 28 ° C on a rotary shaker with a 5 cm swing at 145 rpm for 4 days. At the end of this time, the contents of 10 flasks were decanted and the mixture was centrifuged to remove mycelium.
Přítomnost antibiotika 842A, tj. přítomnost kyseliny 7/3-(D-5-amino-5-karboxývale,ramido )-3-( karbamoy loxymethy 1) -7-methoxy-3-ce|phem-4-karboxylové v živném prostředí byla prokázána diskovou metodou s disky o průměru 1,2 cm, sycenými živným prostředím a umístěnými na agarové plotny s obsahem 10 ml živného agaru s 0,2 % extraktu z kvasnic a s bakteriálním očkovacím materiálem. Zóny inhibice byly měřeny po> dvanáctlhodinové inkubaci při teplotě 28 °C, vzorky živnéiho prostředí, získanéhoPresence of antibiotic 842A, ie presence of 7 / 3- (D-5-amino-5-carboxylic acid, ramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid in the nutrient medium was determined by a disk method with 1.2 cm diameter discs, saturated with nutrient medium and plated on agar plates containing 10 ml nutrient agar with 0.2% yeast extract and with bacterial inoculum. Inhibition zones were measured after> 12 hours incubation at 28 ° C, culture samples obtained from
Zfiltrované prostředí ředění rozměr zónyFiltered environment dilution zone dimension
Promývací voda frakce rozměr zónyWash water fraction dimension zone
čita pryskyřice stačí pouze na dvě frakce, tzu. na desetinásobek objemu sloupce živného prostředí. Frakce eluátu 1 až 4 byly slity a koncentrovány, frakce získané promýváním 3 až 6 byly rovněž slity, čímž bylo získáno 1960 ml roztoku. 1860 ml tohoto roztoku bylo upraveno- na pH 7,2 až 8,0 zředěným roztokem hydroxidu sodného, načež byl roztok nanesen na vrstvu silně zásadité aniont-oměničové pryskyřice se styrendivinylibenzeno-vou základní sítí v množství 100 mililitrů (Dowex 1 x 2 v chloridovém cykluj, rychlostí 14 ml za minutu. Protékající prostředí bylo zachycováno ve 4 stejně velikých frakcích a testy, prováděné na těchto frakcích ukázaly, že toto prostředí obsahuje ještě 5 % celkové účinnosti. Sloupec byl pak promyt vodou a vymýván 5% vodným roztokem chloridu sodného. Eluát byl pak shromažďován ve frakcích o objemu 50 ml a zkoumán na biologickou účinnost. Tyto testy ukázaly, že 90 % účinnosti je přítomno ve frakcích 3 až 16, které pak byly slity.pure resin is sufficient for only two fractions, tzu. 10 times the volume of the medium. Fractions of eluate 1-4 were pooled and concentrated, fractions obtained by washing 3-6 were also pooled, yielding 1960 mL of solution. 1860 ml of this solution was adjusted to pH 7.2 to 8.0 with dilute sodium hydroxide solution, and then the solution was applied to a layer of a strongly basic anion-exchange resin with 100 ml of styrendivinylibenzene base network (Dowex 1 x 2 in chloride). The medium was collected in 4 equally sized fractions and tests carried out on these fractions showed that the medium still contained 5% overall efficiency, and the column was washed with water and eluted with 5% aqueous sodium chloride. The eluate was then collected in 50 ml fractions and examined for biological activity, which showed that 90% of the activity was present in fractions 3-16 which were then pooled.
čtyřdenním pěstováním produkčního kmene, měly inhibiční zónu o průměru 31,5 mm na deskách obsahujících Vibrio percolans (MB-1272).by 4 day cultivation of the production strain, had an inhibition zone of 31.5 mm in diameter on plates containing Vibrio percolans (MB-1272).
Stupeň B: Adsorpee na aniontoměničovou pryskyřiciStep B: Adsorption on anion exchange resin
Zfiltrované živné prostředí v množství 2900 ml bylo, kyselinou solnou upraveno na pH 7,0„ načež bylo naneseno na vrstvu obsahující 100 ml silně zásadité aniontoměničové pryskyřice se styrendivinylbenzenovou základní sítí Dowex 1 x 2 v chloridovém cyklu ,při rychlosti průtoku 10 ml za minutu. Byly zachycovány frakce o velikosti 500 mililitrů. Sloupec pryskyřice byl promýván vodou, načež byl vymýván 3% roztokem chloridu amonného v 90% roztoku methanolu ve vodě. Byly shromažďovány frakce veliké 100 ml.The filtered broth (2900 ml) was adjusted to pH 7.0 with hydrochloric acid and then applied to a layer containing 100 ml of a strongly basic anion exchange resin with Dowex 1 x 2 styrene divinylbenzene backbone in a chloride cycle at a flow rate of 10 ml per minute. Fractions of 500 ml were collected. The resin column was washed with water and eluted with 3% ammonium chloride solution in 90% methanol in water. Fractions of 100 ml were collected.
Na všech těchto frakcích byl prováděn biologický test při použití diskové metody na kmeni Vibrio percolans MB-1272. Bylo dosaženo těchto výsledků:A bioassay was performed on all of these fractions using the Vibrio percolans MB-1272 disc method. The following results were achieved:
Frakce eluátu frakce rozměr zónyFraction eluate fraction dimension zone
Stupeň C: Absorpce na kationtoměníčovou pryskyřici ml koncentrátu připraveného ve stupni B bylo zředěno na 500 ml, pH bylo upraveno na 2,0 z původní hodnoty 8,8 zředěnou kyselinou solnou, načež byl materiál adsorbován na 25 ml silně kyselé pryskyřice sulfonátového typu se styrendivinylbenzenovou základní sítí (Dowex 50 x 2 ve vodíkovém cykluj při průtoku 2,5 ml za minutu. Sloupec byl promyt 25 ml vody, načež byl vymýván 2% roztokem pyridinu tak dlouho, až pH eluátu bylo rovno 7,0. Celkově bylo spotřebováno 54 ml 2% roztoku pyridinu. Při zkoumání živného prostředí, které prošlo sloupcem, a eluátu bylo- zjištěno, že 90 % účinnosti je obsaženo v eluátu, kdežto 9 % účinnosti v živném prostředí, které prošlo vrstvou iontoměniče. Eluát obsahoval pyridiniovou sůl antibiotika 842A.Step C: Absorption on cation exchange resin ml of the concentrate prepared in Step B was diluted to 500 ml, the pH was adjusted to 2.0 from its original value of 8.8 with dilute hydrochloric acid, then the material was adsorbed onto 25 ml of a strongly acidic sulfonate type styrene divinylbenzene Dowex 50 x 2 in a hydrogen cycle at a flow rate of 2.5 mL per minute. The column was washed with 25 mL of water and then eluted with a 2% pyridine solution until the pH of the eluate was 7.0. A total of 54 mL was consumed. Examination of the column-passed nutrient medium and eluate revealed that 90% of the efficacy was contained in the eluate, while 9% of the efficacy in the culture medium passed through the ion exchanger layer.The eluate contained the pyridine salt of antibiotic 842A.
Antibiotikum 842A je amfotermní s izoelektrickým bodem při p-H 3,5. Produkt je nestálý při pH vyšším než 7, ale stálý při pH 1,5. Eluát byl upraven na pH 8,0 zředěným roztokem hydroxidu sodného, načež byl koncentrován ve vakuu k odstranění py198108 ridinu. Takto získaný produkt byl identifikován jako monosodná sůl antibiotika 842A. Molekulová váha 468 je založena na empirickém vzorci.Antibiotic 842A is amphothermic with an isoelectric point at p-H of 3.5. The product is unstable at a pH greater than 7, but stable at a pH of 1.5. The eluate was adjusted to pH 8.0 with dilute sodium hydroxide solution and then concentrated in vacuo to remove py198108 ridine. The product thus obtained was identified as the monosodium salt of antibiotic 842A. Molecular weight 468 is based on an empirical formula.
Analýza pro CieH2iN4SO9Na:Analysis for C 18 H 21 N 4 SO 9 Na:
vypočteno:calculated:
C 41,0 %, H 4,5 %, N 12,0 %, S 6,8 %C 41.0%, H 4.5%, N 12.0%, S 6.8%
O 30,8 %, Na 4,9 %;30.8%, Na 4.9%;
nalezeno:found:
C 39,31 «/o, H 4,76 %, N 11,16 %, S 6,46 %, O 34,12 O/o, Na 4,19 %.C 39.31%, H 4.76%, N 11.16%, S 6.46%, O 34.12%, Na 4.19%.
Při testech provedených in vitro inhibovalo antibiotikum 842A růst těchto gramnegativních bakterií; Escherichia coli, Próteus vulgaris, Alcaligenes faecalis, Brucella bronchíseptica, Salmonella gallinarum, Vibrio percolans a Xanthomonas vesicatoria.In in vitro assays, antibiotic 842A inhibited the growth of these Gram-negative bacteria; Escherichia coli, Proteus vulgaris, Alcaligenes faecalis, Brucella bronchisseptica, Salmonella gallinarum, Vibrio percolans and Xanthomonas vesicatoria.
Produkt rovněž inhibuje růst grampozitivních bakterií, a to kmenů Staphylococcus aureus, Sarcina lutea a Bacillus substilis.The product also inhibits the growth of Gram-positive bacteria, namely Staphylococcus aureus, Sarcina lutea and Bacillus substilis.
In vivo má antibiotikum 842A při podkožních injekcích účinnost, která je uvedena v následující tabulce. Po podkožním podání a po skončení pokusného období, které trvalo obvykle 7 dní po podání, bylo stanoveno množství antibiotika, které je schopno chránit 50 % myší proti infekci uvedeným kmenem; byla tedy stanovena EDso.In vivo, antibiotic 842A has efficacy in subcutaneous injections as shown in the following table. After subcutaneous administration and at the end of the experimental period, which usually lasted 7 days after administration, the amount of antibiotic capable of protecting 50% of the mice against infection by said strain was determined; thus, the ED 50 was determined.
Infekční mikroorganismus: Antibiotikum:Infectious microorganism: Antibiotic:
Próteus morganii 356 Próteus morganii 356 Próteus morganii 356Proteus morganii 356 Proteus morganii 356 Proteus morganii 356
842A842A
CephalotinCephalotin
CephaloridinCephaloridine
*) V případě tohoto mikroorganismu neposkytovala antibiotika Cephaloridin a Cephalotin ochranu ani v dávce 4000' mg, podané nadvakrát.*) In the case of this microorganism, the antibiotics Cephaloridine and Cephalotin did not provide protection even at a dose of 4000 mg, given twice.
Mimo· tyto pokusy byl ještě in vivo proveden poku,s na myších svrchu uvedeným způsobem, při němž bylo užito kmene Próteus morganii 356, izolovaného :z klinických případů, který byl odolný proti Cephalosporinům a schopný rozkládat Cephalosporin C. Při tomto pokuse byly hodnoty EDso tyto:In addition to these experiments, an experiment was conducted in vivo using the Proteus morganii 356 strain isolated from mice from clinical cases that were resistant to Cephalosporins and capable of decomposing Cephalosporin C. In this experiment, the ED 50 values were these:
EDso při podkožním podání ve dvou dávkách — průměr ze dvou zkoušekED 50 for subcutaneous administration in two doses - average of two tests
273 ,ug 20 000 ,ng273, µg 20,000, ng
270 ,ug270, ug
Příklad 2Example 2
Antibiotikum 842AAntibiotic 842A
Výroba očkovacího· materiálu v lahvích:Production of vaccine material in bottles:
Očkovací materiál byl připraven způsobem podle příkladu 1. Obsah dvou lahví, pěstovaných v druhém stupni, byl slit a užit k naočkování 62 Erlenmeyerových baněk o obsahu 2:50 ml, z nichž každá obsahovala 50 ml živného prostředí X. K naočkováni každé z baněk bylo užito 1 ml materiálu. Prostředí X mělo toto složení:The inoculum material was prepared as in Example 1. The contents of the two bottles grown in the second stage were discarded and used to inoculate 62 Erlenmeyer flasks of 2:50 ml each containing 50 ml of medium X. To inoculate each flask, 1 ml of material was used. Environment X had the following composition:
Prostředí X:Environment X:
rotační třepačce při 220 otáčkách za minutu s výkyvem 5 cm. 5 dní. Na konci této doby byl obsah 60 baněk slit a odstředěn, čímž bylo odděleno mycelium od živného prostředí.rotary shaker at 220 rpm with a 5 cm swing. Five days. At the end of this time, the contents of 60 flasks were decanted and centrifuged to separate the mycelium from the culture medium.
Přítomnost antibiotika 842A byla stanovena způsobem popsaným v příkladu 1. Bylo užito agarových ploten a disků o průměru 1,2 cm. Po čtyřdenní inkubaci byla získána inhibiční zóna 33 mm proti Vibrio percolans (MB-1272).The presence of antibiotic 842A was determined as described in Example 1. Agar plates and discs of 1.2 cm diameter were used. After a 4-day incubation, a 33 mm inhibition zone against Vibrio percolans (MB-1272) was obtained.
Příklad 3Example 3
Antibiotikum 842AAntibiotic 842A
FermentaceFermentation
Stupeň 1:Stage 1:
Lyofilizovaný obsah zkumavky Streptomyces lactamdurans, kultura MA-2908, byl užit k naočkování 50 ml sterilního prostředí V v Erlenmeyerově baňce o obsahu 200 ml.The lyophilized contents of a Streptomyces lactamdurans tube, culture MA-2908, were used to inoculate 50 ml of sterile medium V in a 200 ml Erlenmeyer flask.
Prostředí V:Environment V:
autolyzát kvasinek 10,0 g glukóza 10,0 g fosfátový pu-fr 2 mlyeast autolysate 10.0 g glucose 10.0 g phosphate buffer 2 ml
MgSOá. 7HaO 0,05 g destilovaná voda do 1000,0 ml pH — bylo upraveno na 0,5 užitím NaOH * fosfátový pufr:MgSO 3. 7HaO 0.05 g distilled water to 1000.0 ml pH - was adjusted to 0.5 using NaOH * phosphate buffer:
KH2PO4 01,0 gKH2PO4 01.0 g
NazHPOd 95,0 g destilovaná voda 1000,0 ml ilnokulovaná láhev byla umístěna na rotační třepačce s výkyvem 5 cm a inkubována při 220 otáčkách za minutu 72 hodin při teplotě 28 °C.NaHPOd 95.0 g distilled water A 1000.0 ml iloculated bottle was placed on a rotary shaker with a 5 cm swing and incubated at 220 rpm for 72 hours at 28 ° C.
Stupeň 2:Stage 2:
10,0 ml očkovacího materiálu tohoto- původu bylo pak užito k naočkování dvoulitrové Erlenmeyerovy baňky, obsahující 50 ml svrchu popsaného sterilizovaného prostředí V. Naočkovaná baňka byla pak umístěna na rotační třepačce a inkubována při 220 otáčkách za minutu 48 hodin při teplotě 28 C.10.0 ml of inoculum of this origin was then used to inoculate a 2 liter Erlenmeyer flask containing 50 ml of the above-described sterilized medium V. The inoculated flask was then placed on a rotary shaker and incubated at 220 rpm for 48 hours at 28 ° C.
Stupeň 3:Stage 3:
Obsah této baňky byl pak užit k -naočkování f-ermentoru z nerezové oceli o obsahu 50 galonů, který obsahoval 160 litrů prostředí V. Prostředí pak bylo- inkubováno- při 28 °C 48 hodin za stálého míchání při provzdušňování 3 cfm. V průběhu fermentace bylo postupně přidáváno vždy malé množství Polyglykolu 2000 k zamezení pěnění. Stupeň 4:The contents of this flask were then used to inoculate a 50-gallon stainless steel f-ermentor containing 160 liters of V medium. The medium was then incubated at 28 ° C for 48 hours with stirring under aeration of 3 cfm. During the fermentation, a small amount of Polyglycol 2000 was added gradually to prevent foaming. Stage 4:
litrů výsledného očkovacího materiálu ze stupně 3 bylo pak uži-to k naočkování fermen-to-ru o obsahu 200 galonů, který obsahoval 467 litrů sterilního prostředí XI, následujícího složení.liters of the resulting seeding material from step 3 was then used to inoculate a 200 gallon fermenter containing 467 liters of sterile medium XI, of the following composition.
Prostředí XI:Environment XI:
Amber Yeast 300 10,0 g lihovarnické výpalky 20,0 g destilovaná voda do 1000,0 ml pH 7,0Amber Yeast 300 10.0 g distillery stillage 20.0 g distilled water to 1000.0 ml pH 7.0
Fermentace probíhala při teplotě 28 °C za stálého míchání a při provzdušňování 10 cfm 72 hodin. V průběhu fermentace bylo v malých množstvích přidáváno pro-tipěnivé činidlo polyglykol 2000. Po skonče-ní fermentace byla stanov-ena účinnost na agarových plotnách s použitím disků. Živné prostředí bylo pak zfiltrováno vrstvou infuzoriové hlinky při pH 7,8 a takto získaný proúuKt byl způsobem podle příkladu 1 identifikován jako antibiotikum 842A. Při pokusech na agarových plotnách při zředění 1:10 byla získána inhibiční zóna 21,5 mm pro Vibrio percolans MB-1272.The fermentation was carried out at 28 ° C with stirring and aeration for 10 hours for 72 hours. During the fermentation, the polyglycol 2000 antifoaming agent was added in small amounts. After the fermentation was completed, activity was determined on agar plates using discs. The broth was then filtered through diatomaceous earth bed at pH 7.8 and the product thus obtained was identified as antibiotic 842A by the method of Example 1. In experiments on agar plates at a dilution of 1:10, an inhibition zone of 21.5 mm was obtained for Vibrio percolans MB-1272.
Příklad 4Example 4
Čištěni; monosodná sůl kyseliny 7β- (D-5-amino-5-karboxy valeramido) -3- (karbamoyloxy methyl)-7-methoxy-3-cephem-4-karbo-xylovéCleaning; 7β- (D-5-amino-5-carboxy-valeramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid, monosodium salt
Absorpce na aktivní uhlí:Absorption on activated carbon:
dávky živného prostředí získaného způsobem podle' příkladu 1 byly adsorbováný každá na 1-00 ml silně zásadité aniontoměničové pryskyřice se styrendivinylbe-nzenovou základní sítí (Dowex 1 x 2 v chloridovém -cykluj, načež bylo antibiotikum vymýváno 1% vodným roztokem chloridu sodného. Eluát byl shromažďován ve frakcích o v-elikosti 50 ml a zkoumán na obsah antibiotika. Frakce byly shromažďovány ze všech čtyř dávek, jejich p-H bylo upraveno na hodnotu 5,0 zředěnou kyselinou solnou, načež byly frakce slity, čímž bylo získánocelkem 4300 ml roztoku. 4200 ml tohoto roztoku bylo· mícháno- se 42 g aktivního uhlí (Darco G-60) 1/2 hodiny. Aktivní uhlí bylo shromážděno filtrací a promyto vodou. Filtrát a promývacl voda byly prosté účinnosti. Filtrační -koláč byl pak dvakrát vymýván, pokaždé jedním litrem 60% vodného roztoku acetonu, přičemž byla směs vždy 1/2 hodiny míchána a zfiltrována. Eluáty byly koncentrovány ve vakuu na obsah 108 ml a 100 ml. Pokusy ukázaly, že v prvním eluá-tu bylo obsaženo 76 % celkové účinnosti, tzn. že tento eluát byl 18 x účinnější než výchozí materiál, v druhém eluátu bylo obsaženo- 17 % celkové účinnosti, tento eluát byl tedy 14x účinnější než výchozí materiál. Oba koncentráty byly slity a dále koncentrovány na obsah 61 ml, pH tohoto roztoku bylo upraveno z původní hodnoty 4,0 na hodnotu 5,0 zředěným vodným roztokem hydroxidu so-dného. Tento koncentrát obsahoval 40 mg sušiny na 1 ml a při jeho užití byla získána inhibiční zóna o průměru 25 mm proti kmenu MB-1272 při zředění 1:100, tzn. 400 /zg/ml. Produkt byl identifikován jako monosodná sůl kyseliny 7β- (D-5-amino-5-karbox.y valeramido j-3-(karbamoylO'xymethylj-7-inethoxy-3-cephem-4-karboxylové.The batches of broth obtained by the method of Example 1 were adsorbed each to 1-00 ml of a strongly basic anion exchange resin with styrene divinylbenzene backbone (Dowex 1 x 2 in chloride cycle), after which the antibiotic was eluted with 1% aqueous sodium chloride solution. The fractions were collected from all four batches, adjusted to pH 5.0 with dilute hydrochloric acid, and the fractions were pooled to give a total of 4300 mL of solution. of this solution was stirred with 42 g of activated carbon (Darco G-60) for 1/2 hour, the activated carbon was collected by filtration and washed with water, and the filtrate and washings were free of efficacy, and the filter cake was washed twice with 1 liter each. 60% aqueous acetone solution, the mixture was stirred for 1/2 hour each time and filtered The experiments showed that 76% of the total efficiency was contained in the first eluate. This eluate was 18 times more potent than the starting material, the second eluate contained 17% of the total potency, so this eluate was 14 times more potent than the starting material. The two concentrates were decanted and further concentrated to a content of 61 ml, the pH of this solution being adjusted from the original value of 4.0 to 5.0 with dilute aqueous sodium hydroxide solution. This concentrate contained 40 mg dry matter per ml and, when used, an inhibition zone of 25 mm diameter against the MB-1272 strain was obtained at a 1: 100 dilution, i.e. 1: 100. 400 µg / ml. The product was identified as 7β- (D-5-amino-5-carboxyl valeramido) -3- (carbamoyl-oxymethyl) -7-inethoxy-3-cephem-4-carboxylic acid monosodium salt.
P ř í k 1 a d 5Example 1 a d 5
Čištění; monosodná sůl kyseliny 7/3-(0-5-amtao-5-karboxy valeramido j-3- (karbamoyloxymethyl j-7-methoxy-3-cephem-4-karboxylovéCleaning; 7 / 3- (O-5-Atao-5-carboxy-valeramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid, monosodium salt
Adsorpce na gel:Adsorption to gel:
mi eluátu získaného způsobem podle příkladu 1 ve stupni B bylo upraveno- na pH 7,0 zředěným hydroxidem sodným a podrobeno chromatografii na sloupci, který obsahoval 388 ml přípravku BioGel P-2. Sloupec byl vymýván vodou a eluát byl po průchodu diferenciálním refraktometrem shromažďován po frakcích velikosti 5 ml automatickým způsobem, načež byl zkoumán na svou biologickou účinnost. Biologická účinnost byla nejvyšší ve frakcích 47 až 63, kdežto chlorid sodný byl obsažen ve frakcích 62 až 73. Frakce 50 až 60 byly slity, znovu chromatografovány a pak koncentrovány do sucha, čímž bylo získáno 10,8 gramu látky, která byla identifikována jako monosodná sůl kyseliny 7jS-(D-5-amino-5-karboxyvaleramldo j-3-(karbamoyloxymethyl ) -7-methoxy-3-cephem-4-karboxylové.The eluate obtained in Step B of Example 1 was adjusted to pH 7.0 with dilute sodium hydroxide and chromatographed on a column containing 388 ml of BioGel P-2. The column was eluted with water, and the eluate was collected in 5 ml fractions in an automatic manner after passing through a differential refractometer, after which it was examined for its biological activity. The biological activity was highest in fractions 47-63, while sodium chloride was contained in fractions 62-73. Fractions 50-60 were pooled, re-chromatographed, and then concentrated to dryness to give 10.8 g of the substance identified as monosodium. 7S- (D-5-amino-5-carboxyvaleramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid salt.
Při testu s Vibrio percolans byla získána inhibiční zóna o průměru 25 mm při koncentraci 8 ^tg/ml.In the Vibrio percolans assay, a 25 mm diameter inhibition zone was obtained at a concentration of 8 µg / ml.
Příklad 6Example 6
Kyselina 7j3-(D-5-amino-5-karhoxyvaleramido) -3-j karbamoyloxymethyl j -7-methoxy-3-cephem-4-karboxylová7β- (D-5-amino-5-carboxyvaleramido) -3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid
Modifikovaný způsob fermentaceModified fermentation method
Stupeň A: Šikmý agarStage A: Sloping agar
Lyofilizovaný obsah zkumavky Streptomyces lactamdurans, kultura MA-2908, byl asepticky užit k naočkování prostředí o následujícím složení:The lyophilized content of the Streptomyces lactamdurans tube, culture MA-2908, was aseptically used to inoculate an environment of the following composition:
Prostředí XII:Environment XII:
melasa 1 % pivovarské kvasnice 1 % agar o pH 7,0 2,5 % voda na žádaný objemmolasses 1% brewer's yeast 1% agar pH 7.0 2.5% water per desired volume
Z tohoto materiálu se vytvoří šikmý agar, který se inkubuje 7 dní při teplotě 28 °C. Skladuje-li se pak šikmý agar ve zkumavkách v chladnu, je stálý po dobu delší než 13 týdnů.From this material, sloping agar is formed and incubated for 7 days at 28 ° C. If the sloped agar is then stored in the tubes in the cold, it is stable for more than 13 weeks.
Stupeň B: Produkce očkovacího materiálu ve 2 stupníchStage B: Production of vaccine material in 2 stages
První stupeň: Jako první stupeň se užije očkovací materiál přímo sejmutý ze živného agaru, vyrobeného postupem podle stupně A. Tento materiál se přenese do 40 ml 1% roztoku extraktu z kvasnic o pH 7,0, který se pak vnese do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 250 ml. Tyto· baňky se pak uloží na rotační třepačku s výkyvem 5 cm a inkubují se při teplotě 28 °C a při 220 otáčkách za minutu 2 až 3 dny.Stage 1: The first step is a seeding material directly removed from the nutrient agar produced by the step A procedure. This material is transferred to a 40 ml 1% yeast extract solution, pH 7.0, which is then placed in an Erlenmeyer flask containing 250 ml. These flasks were then placed on a rotary shaker with a 5 cm swing and incubated at 28 ° C and 220 rpm for 2-3 days.
Druhý stupeň: 2,5% očkovací materiál z prvního stupně se uvede do baňky, která obsahuje 2% autolyzát kvasinek o pH 7,0. V tomto stupni se inkubace provádí nejvýše 48 hodin.Second stage: 2.5% of the first stage seed material is placed in a flask containing 2% yeast autolysate, pH 7.0. At this stage, incubation is performed for a maximum of 48 hours.
Stupeň C: Produkční prostředíStage C: Production environment
Produkční prostředí obsahuje 30 g lihovarnických výpalků, 7,5 g sušených kvasnic a 0,25 % protipěnivého činidla na 1 litr destilované vody. Pomocí malého množství koncentrovaného hydroxidu sodného se pH prostředí upraví na hodnotu 7,0, načež se prostředí rozdělí do Erlenmeyerových baněk a sterilizuje se v autoklávu 15 až 20 minut při teplotě 121 °C. Po zchlazení se prostředí naočkuje 2,5 % očkovacího materiálu ze stupně B. Inkubační doba se pohybuje v rozmezí 50 až 100 hodin, s výhodou 72 hodin. Obsah prostředí v jednotlivé baňce se může pohybovat mezi 30 až 50 ml, s výhodou činí 40 ml. Množství očkovacího materiálu je v rozmezí 1 až 5 %, s výhodouThe production medium contains 30 g of distillery stillage, 7.5 g of dried yeast and 0.25% anti-foaming agent per liter of distilled water. The pH of the medium is adjusted to 7.0 with a small amount of concentrated sodium hydroxide, then the medium is dispensed into Erlenmeyer flasks and autoclaved at 121 ° C for 15-20 minutes. After cooling, the medium is inoculated with 2.5% of the inoculum material of step B. The incubation time is between 50 and 100 hours, preferably 72 hours. The medium content of the individual flask may be between 30 and 50 ml, preferably 40 ml. The amount of seed material is in the range of 1 to 5%, preferably
2,5 %.2.5%.
Stupeň D: TestyStep D: Tests
Po skončení fermentace se buněčný materiál odstraní odstředěním a živné prostředí se upraví fosforečnanovým pufrem na pH 7,0. Pak se stanoví standardním biologickým způsobem koncentrace kyseliny 7·β- (D-5-amino-5-karboxy valer amido) -3- (karbamoyloxymethylj-7-methoxy-3-cephem-4-karboxylové. Užitým organismem je Vibrio percolans (ATCÍC 8461). Disky filtračního papíru se nasytí živným prostředím a umístí na povrch agarových ploten, které byly očkovány uvedeným mikroorganismem. Na tyto plotny jsou rovněž uloženy disky sycené standardním roztokem antibiotika 842A, jehož koncentrace je známá. Plotny se Inkubují přes noc při 28 °C, načež se změří průměry inhibičních zón. Koncentrace antibiotika 842A se stanoví interpolací podle standardní křivky, nanesené podle výsledků se známými koncentracemi antibiotik. Tímto způsobem bylo zjištěno, že Streptomyces lactamdurans MB-2908 produkovalAfter fermentation, the cell material is removed by centrifugation and the broth is adjusted to pH 7.0 with phosphate buffer. The concentration of 7β- (D-5-amino-5-carboxy-valeramido) -3- (carbamoyloxymethyl) -7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid is then determined by a standard biological method using Vibrio percolans (ATCÍC). The filter paper discs are saturated with nutrient media and placed on the surface of agar plates that have been inoculated with the microorganism, and the discs are saturated with a standard solution of antibiotic 842A, the concentration of which is known, and incubated overnight at 28 ° C. Concentration of antibiotic 842A was determined by interpolation according to a standard curve, plotted against results with known antibiotic concentrations, to determine that Streptomyces lactamdurans MB-2908 produced
78,6 ^g/ml antibiotika 842A při modifikovaném fermentačním způsobu.78.6 µg / ml antibiotic 842A in a modified fermentation process.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/115,779 US4302578A (en) | 1970-12-09 | 1971-02-16 | Cephalosporin antibiotics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS198108B2 true CS198108B2 (en) | 1980-05-30 |
Family
ID=22363341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS168271A CS198108B2 (en) | 1971-02-16 | 1971-03-05 | Method of producing new antibuotic 7 beta-/d-5-amino-5-carboxyvaleramido/-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS198108B2 (en) |
| PL (1) | PL90209B1 (en) |
-
1971
- 1971-03-05 CS CS168271A patent/CS198108B2/en unknown
- 1971-03-12 PL PL15255871A patent/PL90209B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL90209B1 (en) | 1977-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stapley et al. | Cephamycins, a new family of β-lactam antibiotics I. Production by Actinomycetes, including Streptomyces lactamdurans sp. n | |
| US2653899A (en) | Erythromycin, its salts, and method of preparation | |
| Reynolds et al. | Grisein, an antibiotic produced by certain strains of Streptomyces griseus | |
| EP0196042A2 (en) | Antibiotic prepared from lysobacter sp. SC 14,067 | |
| US4024251A (en) | Antibiotic FR-02A and therapeutic compositions thereof | |
| HU188684B (en) | Process for producing a2, and simultaneously produced a1 and a3 components of antibioticum a/16686 | |
| US3691279A (en) | Antibiotic nebramycin and preparation thereof | |
| US3928569A (en) | Two substances inhibiting beta-lactamase and their production | |
| US3914231A (en) | ({31 )(Cis-1,2-epoxypropyl)-phosphonic acid and salts thereof | |
| US3914157A (en) | Preparation of antibiotics by fermentation | |
| EP0345735A2 (en) | Glycoside antibiotics BU-3608D and BU-3608E | |
| US3914158A (en) | Antibiotic production | |
| US3985742A (en) | Process for preparing 3-hydroxymethyl cephalosporins | |
| US3049534A (en) | Antibiotic and process of producing the same | |
| NO134219B (en) | ||
| US3907771A (en) | Antibiotic 66-40 | |
| US3592925A (en) | Antibiotics ah272alpha2 and ah272beta2 and process for producing same | |
| US3832287A (en) | Dipeptide antibiotic and method for the production thereof | |
| US4036696A (en) | Preparation of antibiotics by fermentation | |
| CS198108B2 (en) | Method of producing new antibuotic 7 beta-/d-5-amino-5-carboxyvaleramido/-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylic acid | |
| US3853709A (en) | Process for preparing nebramycin factors ii and vii | |
| US4302578A (en) | Cephalosporin antibiotics | |
| US4282322A (en) | Process for enzymatic deacylation of antibiotics | |
| GB1561108A (en) | Desacetyl antibiatics 890a1 and 890a3 | |
| US4267274A (en) | Streptomyces mediterranei mutant capable of production of rifamycin B |