CN88101686A - 增殖植物幼苗的方法 - Google Patents

Abstract

一种增殖植物幼苗的方法，其中组织培养是在向植物的组织片或培养是在向植物的组织片或培养细胞内引进调钙蛋白和/或钙后进行的。因在引进调钙蛋白和/或钙后植物的不定芽、不定胚和鳞茎的分化作用得到了显著的促进，故可以更高的效率大量地培育出高质量的植物体。

Description

本发明涉及一种用特定方法对植物进行组织培养以大量增殖幼苗的方法。

对现有技术的描述：

蔬菜类如圆白菜、蕃茄和黄瓜以及稻是用耒作为食物的。另一方面，园艺植物如郁金香、矢车菊和金花菊（金光菊）可用以观赏。迄今为止这些植物是用幼苗、分开的鳞茎或块茎等来进行增殖的。然而，这样的增殖方法不仅需要大面积的土地和大量劳力，而且会出现由于近年来蔓延的病毒性疾病而降低幼苗的生长率或降低花卉质量的问题。而采用无性繁殖对植物的生长并保证其品质具有极佳的功效。以妥善解决这类问题与提高增殖率为目的而采用植物组织培养法的技术近年耒亦有报导（例：参见日本公开特许昭55-14734）。用组织培养技术的增殖是通过不定芽、不定胚、鳞茎等从其培养组织片或培养组织细胞产生的分化作用来实现的，且可考虑用细胞***素与植物生长素（如植物激素）之间的浓度比例来控制分化作用〔例，参见植物学年鉴（Annals    of    Botany）卷45321-327，1980〕，然而，仅仅在植物激素作用下，植物种群中有许多种类不产生分化作用，即使产生分化作用其分化作用的频率也极低，所以需要建立更为直接有效的方法来诱发分化作用。

基于对上述植物的组织培养方法中所出现的诸问题的重视，本发明人已研究出一种比通常所用的更为有效地增殖植物幼苗的方法。

本发明人从而发现作用于植物的细胞上的促进了植物的不定芽、不定胚和鳞茎的分化作用的这些物质并基于这些发现找到了一种有效地增殖植物幼苗的方法。即，本发明提供了一种将调钙蛋白和/或钙引进植物的组织片或培养细胞中后进行组织培养以有效地增殖植物幼苗的方法。

按照本发明的方法可对植物进行组织培养而并无特别的限制，且该方法可以应用于所有各种植物。

可应用本发明的方法的那些植物包括（例如）：罂粟科、茄科、伞形科、蔷薇科、百合科、菊科、葫芦科和禾本科植物。上述植物的具体例子还包括在由雅那基西（音译，yanagishi）编辑并由柯库琉坎（音译，Kokuryukan）于1974年出版的“植物种群的分类体系“一书的叙述之中。更为具体地说可以指出这些植物：属于罂粟科的如茄子、蕃茄、马铃薯、甘薯和罗勒，属于罂粟科的如罂粟，欧洲油菜、圆白菜、罗卜、大白菜，属于伞形科的如胡罗卜、日本香芹菜（Japanese parsley）和欧芹，属于蔷薇科的如蔷薇、草莓、大豆和樱桃，属于除百合属外的百合科的如洋葱和郁金香，属于菊科的如菊（属）、矢车菊和向日葵，属于 牛儿苗科的植物如天竺葵（属）、

牛儿苗（属）和亚麻，属于葫芦科的如黄瓜和西葫芦，属于禾本科的如稻和玉米。在这些与本发明有关的植物之中，特别地优先选用的植物是蕃茄、烟草、茄子，“特列尼亚”（trenia），胡罗卜、圆白菜、洋葱、大豆、罗勒、矢车菊、金花菊（属）、香石竹、麝香百合、郁金香、石刁柏、亚麻、黄瓜和稻。

在本发明中，植物的组织培养可以用植物的组织片或培养细胞耒进行。组织培养片特别包括制备植物组织片用的子叶、下胚轴、苗尖、茎、叶、鳞片、根或其它组织。这些组织片通常在用次氯酸钠或酒精灭菌之后使用。然而在采用无菌培养的植物的情况下，上述灭菌程序就不需要了。更进一步说，在增殖不带有病害和病毒的植物幼苗的情况下植物生长点附近的组织及从植物生长点附近的组织处获得的组织片可用作培养材料。在本发明中，可用于植物组织培养的培养细胞是包括用已知的方法对组织片进行组织培养所获得的愈合组织在内的未分化的无定形细胞。

在本发明中特别采用下述方法耒对用来形成幼苗的植物的组织片或培养细胞进行组织培养以获得植物的幼苗。

本发明所采用的组织培养的方法是：组织培养在向组织片的细胞或培养细胞中引进调钙蛋白和/或钙后进行。

本发明中所述的调钙蛋白是一种蛋白质，可以由红血球薄膜中的腺苷三磷酸酶或具激活功能的脑中的磷酸二酯酶与二价钙离子结合而成，而在传导电泳过程中由于钙的存在其迁移率下降。调钙蛋白可从（例如）麝香百合的鳞茎中，牛的大脑中、鼠类的精囊中（等等）析出并提纯。

本发明的在把调钙蛋白和/或钙引进细胞之后进行组织培养的方法将特别进行详述。

（1）本发明的组织培养法提供了一种在向植物的组织片细胞或培养细胞之中引进一种称之为调钙蛋白的特殊蛋白质后进行组织培养的方法。

按本发明的引进调钙蛋白的方法可包括（例如）下列方法，其引进调钙蛋白的处理过程是这样实现的：把用于组织培养的植物的组织培养片或培养细胞置于电极间并在其中加入含调钙蛋白的溶液，在30伏/厘米至2.5千伏/厘米的电场强度下施加30微秒至1毫秒的电脉冲。此时浓度从3微克/毫升至1毫克/毫升的调钙蛋白溶液是合乎需要的。除了上述的电注入过程外，还可以描述出多种方式，如在显微镜观察下用玻璃制微量移液管把含有调钙蛋白的溶液注入到细胞之内的方法，一种用激光束脉冲照射放在含调钙蛋白溶液中的细胞以在其上穿出亚微米级直径的细小孔洞以通过小洞向细胞内部引进调钙蛋白的由日本专利文件昭62-7838建议应用的向活细胞内部输送物质的方法，或者是如近来报道的用钨钢坯把大量分子引入到植物细胞内部的方法，等等。在本发明的上述方法中，引进细胞内部的调钙蛋白的数量，能用以荧光染料对调钙蛋白作出标记并在引进细胞后测定荧光强度来确定，其数量级通常在1微克/毫升到300微克/毫升的范围内，最好是从10微克/毫升到100微克/毫升。

按照本发明的在引进调钙蛋白到植物的组织片细胞或培养细胞内部以后采用组织培养的方法，在引进调钙蛋白以后，尽管可以使用后文中所述的引入调钙蛋白后使用的培养基，但使用一般大于1毫摩尔的含钙离子的培养基来进行组织培养则更佳，因其可以更进一步地促进不定芽、不定胚及鳞茎的分化作用。此时使用例如本发明人在日本专利文件昭61-308539中所建议的含钙离子载体的培养基A23187耒进行组织培养是很合适的，其浓度范围通常为10^-8至10^-4摩尔数量级，如在10^-7至10^-5摩尔之间则更佳，这时的分化作用很显著。进一步地说，在使用例如浓度范围为10^-8至10^-4摩尔的含钙离子载体的培养基A23187后再引入调钙蛋白进行组织培养在本发明中是更佳的，因其可进一步促进分化作用。

（2）按本发明所提供的方法，在将钙引进植物的组织片或培养细胞之后进行组织培养。

本发明的引进钙的方法与引进调钙蛋白时的方法相同。如在进行电注入时，培养细胞的组织放在电极之间，加入含钙溶液后施加电脉冲把钙引入细胞内部。

此时，含钙溶液中钙的浓度通常在100微摩尔至30毫摩尔的范围内。含钙溶液可以包括（特别是）含有钙化合物如氯化钙、硝酸钙和碳酸钙的水溶液。在本发明中按上述方法引进到细胞内部的钙的数量，如用与表示调钙蛋白数量同样的方式耒表示时，其浓度通常在10^-8摩尔至10^-5摩尔的范围内，而在10^-6摩尔至10^-5摩尔的范围内更佳。

（3）按本发明所提供的方法，在将调钙蛋白和钙引进植物的组织片细胞或培养细胞之后进行组织培养。

在本发明中上述特别适用，因其与方法（1）、（2）相比，对植物的不定芽与不定胚的分化作用有显著促进。其中调钙蛋白和钙可象在与上述（1）和（2）中所述同样程序引进细胞内部并实现引进，例如将植物的组织片或培养细胞置于电极之间，并在加入含有调钙蛋白的含钙溶液之后按前述同样方式在相同的电场强度下施加脉冲。此时溶液中的调钙蛋白与钙离子的浓度范围亦与上述（2）与（3）中所述范围相同。进一步说，引进细胞内部的调钙蛋白与钙离子的数量也在上述（1）与（2）中所述的范围之内。

在本发明中将调钙蛋白和钙引进细胞内部的方法，通常以采用上述的含调钙蛋白的含钙溶液来同时引进钙离子与调钙蛋白为宜，但亦可用前述方法根据需要分别将钙与调钙蛋白引入细胞内部，等等。然后进行组织培养。

适用于在引入调钙蛋白和/或钙后进行组织培养的培养基可以包括（例如）后面将作专门描述的那些培养基。

在本发明中使用的培养基是一种含无机成分及碳源作为其基本组成的培养基，其中加入植物激素和维生素并根据需要加入氨基酸。培养基的无机成分可以是含下列元素如氮、磷、钾、钠、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、钼、氯、碘和钴的那些无机盐，其中特别值得一提的有（例如）：硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、氯化钾、氯化钙、磷酸氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、钼酸钠、三氧化钼、碘化钾、硫酸锌、硼酸和氯化钴。

培养介质的碳源可包括（例如）：碳水化合物及其衍生物如蔗糖、有机酸如脂肪酸、初级醇如乙醇。

用于培养基的植物激素可包括（例如）：植物生长素如萘乙酸（NAA），乙酸碘咯（（IAA）、氯苯氧基乙酸磷、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）、丁酸碘咯（IBA）及其衍生物、细胞***素如苄（基）腺嘌呤（BA）、激动素、玉米素等。

用于培养基的维生素可包括（例如）：生物素、硫胺素（维生素B₁）、吡哆醇（维生素B₆）、吡哆醛、吡哆胺、泛酸钙、抗坏血酸（维生素C）、肌醇、烟酸、烟酰胺和核黄素（维生素B₂）。

用于培养基的氨基酸可包括（例如）：甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸。

本发明的培养基通常适用下列组份：约0.1微摩尔至100毫摩尔的无机成分。从约1克/升至100克/升的碳源、从约0.01毫克/升至约10毫克/升的植物激素，从约0.1毫克/升至约150毫克/升的维生素和从0至约1000毫克/升的氨基酸。

本发明的用于组织培养的培养基特别的可以包括那些已知的用于组织培养的培养基，例如：“木拉西盖与斯柯克”（Murashige    &    Skoog）培养基（’62），“林斯迈尔与斯柯克”（Linsmaier    &    Skoog）培养基（RM-1965）、“怀特”（White）培养基（’63）、“冈波克”（Gamborg）B-5培养基、“米次依”（Mitsui）M-9培养基、“尼次与尼次”（Nitch    &    Nitch）培养基、等等。它们亦可根据需要按前面所叙述的加入碳源和植物激素，进一步地还可加入维生素与氨基酸。其中用“尼次与尼次”、“林斯迈尔与斯柯克”或“木拉西盖-斯柯克”培养基制备的组织培养基是更佳的。本发明中也可使用前面所述的日本专利文件昭61-308539所建议的加入钙离子载体、环腺苷酸和多胺而制得的培养基。上面提到的已知的培养基的成分，可在（例如）塔凯鸟齐（音译，Takeuchi）、纳卡基码（音译，Nakajima）、富鲁雅（音译，Furnya）著并由阿萨库拉一索腾（音译，ASakura    Shoten）在1979年出版的“新植物组织培养法”（New    Plant    Tissue    Culture）一书中第386至391页中找到。

在本发明中适用的培养基是一种液体培养基或通常含有0.1%至2%的胶凝剂如琼脂或类凝胶的固体培养基。

在本发明中，可以用与本申请人在日本专利文件昭60-128348中所述的方式相同的方式用充入含氧气体的液体培养基对上述的植物的组织片或培养细胞进行组织培养。

按本发明的方法可高效率地从植物的组织片或培养细胞中获得大量的不定芽、不定胚、小鳞茎等等。更值得注意的是，按本发明的方法获得的不定芽能扎根于植物体内，然后将不定芽切成组织片（小鳞茎也切片）并且进一步按上述本发明的培养方法进行组织培养即能大量地增殖植物幼苗。进一步说，按本发明获得的植株能长入由通常的栽培法培育的具有稳定性状的完整无损的植物体内。

使用本发明的在引进调钙蛋白和/或钙到植物的组织片细胞或培养细胞内部后进行组织培养的方法，由于显著地促进了植物的不定芽、不定胚和鳞茎的分化作用，故由此可增殖出大量的幼苗。把本发明的方法与传统的采用植物的组织片或培养细胞的相应方法比较，可以效率更高地培养出大量高质量的植物体，故可用于大量地增殖幼苗。更进一步说，按本发明的方法，分化出的不定芽的直径增加了，因此获得了良好的幼苗。基于新颖的发现的本发明的方法是一种新颖的组织培养方法。

实施例：

本发明的内容及其有益效果将参照实施例来进行解释。

例    1：

将麝香百合的鳞茎用70%的酒精和次氯酸钠的水溶液（有效氯含量I%）灭菌以后，将其切成2毫米宽，放在电极之间，在其中加入含有含量为100微克/毫升的从麝香百合的鳞茎中析出和提纯的调钙蛋白的3毫摩尔浓度的氯化钙溶液，再施加电脉冲：其电场强度为500伏/厘米，200微秒施加3次。然后制备出无菌的“木拉西盖与斯柯克”固体培养基（1962）（类凝胶浓度0.2%），其PH值为6.0，含有4%的蔗糖，0.01毫克/升的萘乙酸与0.02毫克/升的苄（基）腺嘌呤。将10片上述的麝香百合鳞茎的鳞片置入培养基内，在温度25℃时置于光亮处3个星期，结果得到的鳞茎片数见表1，与对照例1的情况相比较，在所有处理过的样品中分化出的鳞茎数量增加了。

对照例    1

除了用蒸馏水代替例1中的调钙蛋白的氯化钙水溶液外，按例1的程序对麝香百合鳞片的切片进行培养。

例    2-3：

用与例1相同的程序对麝香百合进行组织培养，但例1中所述的培养物中的麝香百合叶子的切片被替换成麝香百合的愈合组织细胞，所得到的结果如表1所示。与在对照例2-3中的情况相比，在所有经处理的样品中分化出的鳞茎的数目都增加了。

对照例    2-3：

用与例2-3相同的程序对麝香百合叶子的切片与麝香百合的愈合组织细胞进行培养，但用蒸馏水代替例2-3中的含有调钙蛋白的氯化钙溶液，其结果如表1所示。

例    4-5

对麝香百合的愈合组织细胞用与例2-3相同的程序进行组织培养，但用从牛的大脑或鼠类的精囊中析出并提纯的调钙蛋白作为在本例中作引进用的调钙蛋白。其结果如表1所示。

例    6-14：

以与例1相同的程序进行组织培养，但使用下述培养物：蕃茄叶的切片、蕃茄的愈合组织细胞、茄子叶的切片、茄子的愈合组织细胞、烟草叶的切片、“特列尼亚”茎的切片、香石竹茎的切片、圆白菜下胚轴的切片和洋葱鳞茎片的切片。结果如表2所示。与其在比较例4-12中的情况相比，在所有处理过的样品中经分化产生的不定芽的数目增加了。

对照例    4-12：

对蕃茄叶的切片、蕃茄的愈合组织细胞、茄子叶的切片、茄子的愈合组织细胞、烟草叶的切片、“特列尼亚”茎的切片、香石竹茎的切片，圆白菜下胚轴的切片和洋葱鳞茎片的切片进行组织培养，但以蒸馏水代替各例中的含调钙蛋白的氯化钙溶液。其结果如表2所示。

例    15-20

以与例1所述相同的程序进行组织培养，但培养物分别替换成：罗勒叶的切片、矢车菊子叶的切片、金花菊叶子的切片、郁金香鳞片的切片、亚麻茎的切片与石刁柏茎的切片。结果如表3所示。

对照例    13-18：

以蒸馏水取代例15-20中的含调钙蛋白的氯化钙溶液对罗勒叶的切片、矢车菊子叶的切片、金花菊叶子的切片、郁金香鳞片的切片、亚麻茎的切片与石刁柏茎的切片进行组织培养，其结果如表3所示。

例    21-28及对照例19：

把在例1中所用的麝香百合鳞茎的鳞片切成约2毫米宽后将其置于电极之间，在其中加入浓度如表4所示的从麝香百合鳞茎中析出并提纯的含有调钙蛋白的溶液以及其浓度亦如表4所示的氯化钙溶液。然后在与例1中所述的条件相同的条件下施加电脉冲，再按与例1中所述的程序相同的程序对麝香百合鳞片的切片进行培养，其结果如表4所示。

在例27中用引进处理方法引进细胞内部的调钙蛋白浓度约为33微克/毫升，而细胞内部的二价钙离子浓度从10^-7摩尔增至6×10^-5摩尔。

例    29-37：

在例10、11与14中以浓度如表5所示的氯化钙溶液以与例1相同的程序进行组织培养，结果如表5所示。

例    38-40：

在例3、11和14中在含有10^-6摩尔的A23187的培养基内培养组织片或培养细胞3-7天，然后对所用的100微克/毫升的调钙蛋白溶液施加电脉冲，再继续进行组织培养。结果如表6所示。

例    41-43：

在例3、11、14中，按照与例1相同的程序用100微克/毫升的调钙蛋白溶液进行调钙蛋白的导入后，使用含10^-6摩尔A23187的培养基进行组织培养。结果如表6所示。

例    44-49：

除培养物替换成胡罗卜下胚轴切片，大豆的愈合组织细胞、黄瓜的愈合组织细胞、稻的愈合组织细胞、金鱼草的愈合组织细胞、石刁柏的愈合组织细胞以外，采用与例1相同的程序进行组织培养，其结果如表7所示。在与对照例20-25作相应比较时可以看出在所有经处理的样品中经分化作用而获得的不定胚的数量增加了。

对照例    20-25：

除了以蒸馏水代替在例44-49中所用的含调钙蛋白的氯化钙溶液外，按与例1相同的程序对胡罗卜下胚轴切片、大豆愈合组织细胞，黄瓜愈合组织细胞、稻愈合组织细胞、金鱼草愈合组织细胞、石刁柏愈合组织细胞进行培养。

例    50-52

在例20中采用浓度如表8所示的含调钙蛋白的溶液和浓度亦如表8所示的氯化钙溶液进行石刁柏茎的愈合组织片的组织培养，其结果如表8所示。与其在对照例26中的情况相比较，可以看出在所有经处理的样品中。由分化作用得到的不定芽的数目增加，而且茎杆的直径也增大。

对照例26

用与例50-52相同的程序对石刁柏的茎的切片进行培养，但其中以蒸馏水代替含调钙蛋白的氯化钙溶液。

例53：

除培养物代之以从小型玫瑰（miniature    rose）的变种“玛丽·安东纳特（Marie    Antoinette）”的茎与叶的切片诱发出的愈合组织细胞外，按与例1所述相同的程序进行组织培养，结果如表9所示。与对照例27相比较，经处理后的不定芽的数量增加了。

对照例27：

除了用蒸馏水代替例53中的含调钙蛋白的氯化钙溶液外，小型玫瑰的愈合组织细胞被与例53中所述相同的程序进行培养。

Claims (8)

1、一种增殖植物幼苗的方法，其中组织培养在向植物的组织片细胞或培养细胞内引进调钙蛋白和/或钙后进行。

2、按权利要求1所限定的方法，其中引进细胞内的调钙蛋白在溶液中的浓度为3微克/毫升至1毫克/毫升。

3、按权利要求1所限定的方法，其中用向其施加电脉冲的方法将含有调钙蛋白的溶液引进细胞内。

4、按权利要求1所限定的方法，其中用微量移液管注入的方法将含有调钙蛋白的溶液引进细胞内。

5、按权利要求1所限定的方法，其中用激光束照射的方法把含有调钙蛋白的溶液引进细胞内。

6、按权利要求1所述限定的方法，其中的一种培养基含钙量为100微摩尔至30毫摩尔。

7、按权利要求1所限定的方法，其中所用的一种培养基中钙离子载体的含量在10^-8至10^-4摩尔数量级范围之内。

8、按权利要求1所限定的方法，其中调钙蛋白是从麝香百合的鳞茎，牛的大脑和鼠类的精囊中析出并提纯而得的。