CN86108459A - 细胞熔合装置 - Google Patents
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Abstract
用于熔合细胞的装置,其中熔合室设有一对分开的电极,它们的相对表面具有适当的垂直尺寸,以防止不均匀电场对细胞的熔合产生不利影响。该电极可包括一对平行板电极或同轴设置的中空圆柱形电极,所述同轴中空圆柱形电极对中,外面的电极具有第一半径的内环形表面,而内电极具有小于第一半径的第二半径的外环形表面,与所述半径的全长相比,第一和第二个半径之差足够地小。
Description
本发明涉及通过施加电激励熔合细胞的装置。
一般地,该装置包括围在一对分开的电极周围的腔室,在上述电极之间置有含两种不同的待熔合细胞的悬浮液,电激励源,通过电极向细胞施加电激励的装置,和用于控制加给细胞的电激励的控制器。
以交流(AC)场和直流(DC)脉冲作为电激励,而用一对线或平面电极作为电极。
为使细胞熔合,首先通过电极向悬浮在置于电极之间的溶液中的细胞施加AC电场以使相邻的细胞表层紧密接触,然后将相当高的电场的DC脉冲加到所述细胞上将它们熔合到一起。
如果使用一对线电极,会遇到如下问题:
(1)在电极间的电场强度不均匀,因此要精确地知道到细胞上的电场的有效强度是困难的。
(2)熔化的细胞附着在电极上,所以当将它们从电极上分开时,它们会被损坏或断开。
(3)发生多重熔合,即,三或更多的细胞象珍珠链似地连着。
我们还已知道使用在一对平行平板电极上施加DC电压以熔合填在电极间的细胞的装置,在这种装置中,除了上面的问题(2)和(3)之外,还存在第三个问题:相邻细胞间的表层接触程度低,所以熔合速度低。
所以,本发明的一个目的是提供用于熔合细胞的装置,它可提供相当均匀的场强,这对细胞熔合是重要因素,所以可以精确知道加到待熔合的细胞上的电场的有效强度,并且在其中细胞不附着到电极上,而在电极间相互紧密接触,由此实现单对细胞的熔合而不至造成在许多细胞熔合在一起的多重熔合。
待熔合细胞悬浮在溶液中,而悬浮液放在熔合室中相对的电极对之间的空间中。如果悬浮液的量较少,如0.05ml,则小电极就可满足,且包围电极的腔室可以为简单的形状和结构,所以操纵腔室就相对容易。
然而,如果细胞悬浮液的量较多,如1ml,则电极间的空间和/或电极的线度必须增加以容纳悬浮液。如果电极间的空间增加,加到电极上的电压必须增加,并导致整个装置尺寸的增加。如果电极的线度增加,为了使有限大小的熔合室容纳增长的电极,该电极必须为复杂的形状。如果用大尺寸电极,腔室必须增大,使装置操作变得困难。
所以,本发明的另一目的是提供小型、并结构简单并能容纳足够含待熔合细胞的悬浮液的熔合室。
通常,当施加电激励熔合细胞时,需要30分钟达到完全熔合。在此过程中,环境温度和所加电场造成细胞悬浮液的温度增高。从而出现蒸发,造成细胞悬浮液的渗透压增加,并引起细胞的破坏。
所以,本发明的又一目的是提供可防止细胞悬浮液过量蒸发和减少的熔合室。
简单地说,本发明的装置包括在其中熔合细胞的熔合室,交流(AC)和直流(DC)电压源,和用于有效地选择加到熔合室中的细胞悬浮液上的AC场和DC脉冲的控制器。
该熔合室包括一对具有相互离开一定距离的相对表面的电极,以及在电极间的空间中放着的细胞悬浮液。针对细胞悬浮液中细胞的大小,电极的相对表面具有适当的垂直线度或高度,以防止主要在相邻电极的上缘处很不均匀的电场对细胞的熔合所起的不利影响。电极间熔合室的表面由适当材料制成或得到抛光以提供平滑的表面。
在本发明的一个实施方案中,电极包括一对相互分开一定距离的平行平板电极。
在本发明的另一个实施方案中,电极包括一对中空柱状电极,它们具有较短的轴长并共轴安置,使外面的电极具有与里面的电极的外表面相对的内表面。两个电极的半径互相接近,以产生象平行平板电极所产生的那样的很均匀的电场。
在本发明另一实施方案中,熔合室具有用来容纳细胞悬浮液的腔和用于容纳不同液体的分离腔,并由顶或盖密封以避免细胞悬浮液的液体组分的过量蒸发。
本发明将参考附图作详细描述。
图1是本发明的一个实施方案的示意图;
图2是图1中所示的熔合室沿线Ⅱ-Ⅱ的纵向剖视图;
图3是取掉顶盖的另一形式的熔合室平面顶视图;
图4是图3中用顶盖密封的熔合室的沿线Ⅳ-Ⅳ的垂直剖视图;
图5是第三种形式的熔合室的透视图;
图6是图5所示熔合室沿线Ⅵ-Ⅵ的垂直剖视图;
图7是图5和图6所示的熔合室的改进形的平面顶视图;
图8是图7所示的熔合室沿线Ⅷ-Ⅷ的垂直剖视图。
需要说明,在图中各组成部分的相对尺寸未精确显示,且为清楚描述而放大了,各部分的尺寸不能在任何意义上用来限制本发明的范围。
参考图1和2,在此显示了用来熔合细胞的装置,它包括熔合室10,和电源12及控制器14。
熔合室10包括腔16,其中提供了一对平行平板电极18a和18b并互相分开。两个电极18a和18b之间的距离根据源电压确定并尽可能地大,只要能获得细胞熔合所需的电场强度。电极18a和18b的高度越大,必须放到电极间的细胞悬浮液就越多。相反,如果电极的高度做得太小,在电极上缘附近产生的不均匀电场会对晶粒产生不利的影响。因此,根据细胞大小电极具有适当的高度,以避免任何不均匀电场对细胞的熔合过程产生不利影响。电极带有用于与源12连接的一对接头20a和20b。
腔16具有介于两个电极18a和18b之间的底板16a。底板16a是适当材料制成,以提供平滑的上表面。
包含待熔合细胞24的悬浮液22放在电极18a和18b之间的腔中。
源12包括AC源26和DC源28,它们分别通过开关S1和S2与接头20a和20b相连,使AC和DC电压交替加到熔合室10中的电极18a和18b上。
悬浮液22中的细胞24沉积在腔16的底板16a上。通过闭合开关S1,具有预定频率(在50KHz)到5MHz范围内)的AC电压通过接头20a和20b被加到电极18a和18b上,以在其间产生AC电场,从而使在腔16的底板表面16a上的细胞24沿电场方向排列起来,直至相邻的细胞相互之间实现紧密的表层接触。然后断开开关S1并合上开关S2,将DC电场加到细胞上,以使各对相邻的细胞熔合成一个细胞。
因为电极18a和18b是平行平板电极,所以在电极之间加到细胞上的AC电场的强度是基本均匀的。另外,因为AC场造成熔合室10的腔16的底板表面上的细胞沿垂于电极18a和18b排列,即与电场方向相同,场强基本与计算值相符,所以可以精确知道加到细胞上的电场强度。
因为熔合室10的腔16的底板表面是平滑的,所以当加上AC场时,在该表面上的细胞可容易地移动。
根据本发明,由于AC场被加到已沉积到腔16的底板表面上的细胞上,所以电极18a和18b可以有比其它方案更小的高度,而且为了容纳尽可能的悬浮液,电极相互之间分开的距离也尽可能地大。
为实现单对细胞熔合,悬浮液中的细胞的密度或数量应最好调整在104/ml到105/ml的范围内。
采用本发明的装置,可以:
(1)精确地知道使细胞熔合的有效电场强度;
(2)通过施加AC电场,使细胞相互间达到紧密的表层接触,从而提高熔合效率,
(3)细胞的熔合在电极之间完成,从而可从熔合室中取出熔合的细胞,而没有被损坏的危险;
(4)获得成对熔合的细胞。
再看图3和4,其中与图1和2中相同的参考数字代表相应的组成部分,在此显示了熔合室10,它包括横截面为圆形且开口向上的浅容器32,和用于气密地关住容器的顶或盖34。
一对中空的圆柱形电极36a和36b在容器中互相分开地同轴安置,并分别具有内和外环形表面38a和38b,从而在它们之间限定了环形空间40。电极36a和36b带有一对露在容器32外面的接头20a和20b。象在图1和2的实施方案中那样,所述电极有根据待熔合细胞确定的高度或轴长,以避免任何不均匀电场对细胞对形成产生不利影响。
细胞悬浮液22放在环形空间40中,顶或盖34紧密地封闭容器32。首先,在电场36a和36b之间产生AC电场以形成互相紧密接触的两个细胞组成的细胞对,然后给细胞施加DC脉冲以使每个细胞对熔合。
填满电极36a和36b间的环形空间40的细胞悬浮液22的最大数量由l×d×h给出,即环形空间40的长度l(=2πrs),电极间的距离(d)和该空间的深度(h)的乘积。
一对平行电极的场强E(V/cm)由E=V0/d给出,其中V0为加到两个电极之间的电压,d为电极之间的距离。场强E是均匀的。
在中空圆柱状电极36a和36b中,邻接外电极36a和内电极36b的电场强度E1和E2分别由下式给出,
E1=K/r1和
E2=K/r2
其中K为常数,r1为外电极36a的内环形表面的半径,而r2是内电极36b的外环形表面38b的半径。
这样,E1/E2=r2/r1。如果r1≈r2,E1≈E2,则在两个电极36a和36b之间产生的电场的强度变得与两个平行电极之间产生的电场近似相等。半径r1和r2之间的差与半径相比是很小的。例如,r1为50mm,r2为52mm,所以这个差值,即上面提到的距离d是2mm。
因为本发明的中空圆柱状电极36a和36b具有互相接近的半径,所以它们有如下优点:
(1)它们具有与平行电极基本相同的电学特性,并使细胞熔合有基本相同的熔合效率。
(2)环形的电极和其同轴分布能够简化熔合室的结构,特别是电极的结构。
(3)熔合室做得紧凑,所以可容易地在显微镜下或净化台中操作。
现在看图5和6,在此显示了熔合室10,它包括向上开口的容器32和用于气密地封闭容器32的顶或盖34。容器32和顶34都是有方形的截面。在容器32的内下表面上制作有中心槽或腔42,并在中心腔42的相对的外侧有一对侧槽或腔44a和44b。
一对分开的平行板电极18a和18b安在中心腔42中。象在前面的实施方案中那样,电极所具有适当的高度以防止不均匀电场对细胞对的形成有不利的影响。
细胞悬浮液22放在中心腔42中,同时,液体46(如水)放在侧腔44a和44b中。
当盖34放在容器32上时,盖34的向下的内表面36与容器32的侧壁32a和32b的上缘表面紧密接触,从而将腔42中的细胞悬浮液22和腔44a和44b中的水气密地封闭在熔合室10中的同一空间中。
在这个条件下,AC电压通过接头20a和20b加到电极18a和18b上,在其间产生AC电场以构成细胞对,再将DC脉冲加到细胞对上以将各个细胞对熔合成单个细胞。
在此过程中,细胞悬浮液22的温度随环境温度和所加AC电场而升高,所以悬浮液22的液体成份开始蒸发。然而,盖34阻止蒸气渗出腔室10,所以蒸气压升高阻止了悬浮液22的进一步蒸发。同时在侧腔44a和44b中的水46的蒸发也帮助阻止悬浮液22的蒸发。
因为细胞悬浮液22的蒸发被抑制到最小程度,所以可以使细胞熔合的过程比在其它情况下持续更长的时间,而不会对悬浮液中的细胞有不利的影响。
图7和图8显示了图5和图6显示的熔合室的改进形式。用与图5和6的相同的参考数字代表相应的部分。容器32为圆形的,并设有中心矩形腔42和位腔42的相对侧的一对圆形槽48a和48b。一对平行板电极18a和18b安置在腔42中,同时有一对接头20a和20b用于连接到未显示的AC和DC电压源上。
在本发明的任一前述实施方案中,熔合室的底板(至少在两电极间)可用透明材料制造,所以向晶粒上施加电场使细胞熔合的过程可通过透明底板用倒置的显微镜观察。在这种情况下,顶盖必须为透光材料的,以利照明。
Claims (16)
1、用于熔合细胞的装置,包括:
包括一对电极的熔合室,该对电极互相分开预定距离以在其间确定放置细胞悬浮液的空间的相对表面,所述相对表面具有根据在所述细胞悬浮液中的细胞大小而确定的高度,以防止任何可能的不均匀电场对细胞熔合过程产生不利影响。
用于产生交流电压的装置;
用于产生直流电压的装置;
用于有选择地把所述AC和DC电压加到所述电极上的装置。
2、权利要求1的装置,其中所述电极是一对平行板电极。
3、权利要求1的装置,其中所述电极包括具有第一半径的内环形表面的外中空柱形电极,和具有小于所述第一半径的第二半径的外环形表面并与所述外电极同轴设置的内中空柱形电极,所述第一和第二个半径之差相对所述半径的全长足够地小。
4、权利要求1的装置,其中所述熔合室的底板在所述电极之间具有平整而光滑的表面。
5、权利要求1的装置,其中所述熔合室的底板至少在所述电极之间是透明的。
6、权利要求1的装置,其中所述熔合室设置有用于气密地封闭所述熔合室的可取下顶盖。
7、权利要求5的装置,其中所述熔合室设置有用于气密地封闭所述熔合室的可取下顶盖,所述顶盖用透光材料制成以用于照明。
8、权利要求6的装置,其中所述熔合室安有用于容纳所述电极对和其间的所述细胞悬浮液的腔和至少一个用于容纳不同液体的附加的腔。
9、用于在细胞熔合装置中使用的熔合室,包括:
在其底板上安有用于容纳细胞悬浮液的腔的容器;
设置在所述腔中的一对电极,该对电极具有相对的表面,该表面的高度根据在所述细胞悬浮液中的细胞大小确定,以防止任何可能的不均匀电场对细胞的熔合过程起不利影响。
10、权利要求9的熔合室,其中所述电极是一对平行板电极。
11、权利要求9的熔合室,其中所述电极包括具有第一个半径的内环形表面的外中空柱状电极,和具有比所述第一个半径小的第二个半径的外环形表面并与所述外电极同轴的内中空柱状电极,所述第一个和第二个半径之差相对所述半径的全长足够地小。
12、权利要求9的熔合室,其中所述熔合室的底板在所述电极之间具有平整且光滑的表面。
13、权利要求9的熔合室,其中所述熔合室的底板至少在所述电极之间是透明的。
14、权利要求9的熔合室,进一步包括用于气密地封闭所述容器的可取下的顶盖。
15、权利要求13的熔合室,进一步包括用于气密地封闭所述容器的可取下的顶盖,所述顶盖用透光材料制成以用于照明。
16、权利要求14的熔合室,其中所述容器的底壁上设置有至少一个用于容纳不同液体的附加腔。
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