CN218767558U - 一种基于ld的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学*** - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***，涉及单分子检测免疫分析仪的光学***领域。激光聚焦和荧光收集共用一个透镜，即共聚焦，能够利用更加简单和紧凑的结构达到检测结果CV更小的目的。所述共聚焦光学***包括用于产生激光的激光聚焦光路、用于将前向散射光转换为电信号的前向散射光检测通道以及用于将荧光转换为电信号的荧光检测通道；所述共聚焦光学***还包括消色差透镜及二向色滤光片A；所述二向色滤光片A可以透射激光、反射荧光，或者是透射荧光、反射激光。提高了阳性磁珠的识别率，由25%提高到50%，极大的改善检测结果的CV。

Description

一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***

技术领域

本实用新型涉及单分子检测免疫分析仪的光学***领域。

背景技术

单分子检测，其检测灵敏度可达fg级别，是传统ELISA的1000倍。

检测的生物学原理是经典的免疫反应-双抗夹心法，磁珠上包被超过10*5数量级捕获抗体，捕获抗体捕获待测样本中的抗原，然后与加入的荧光染料标记的检测抗体形成双抗夹心结构，即结合相。因磁珠具有磁性，所以可以方便的利用磁分离的方式将上清液中的杂质去掉。

利用流式细胞术鞘流聚焦的方法进行检测是常用的检测方法之一，检测磁珠的前向散射光信号和抗体上标记的荧光染料被激光激发产生的荧光信号。磁珠的前向散射光信号用来计数，荧光信号用来判定磁珠是否形成了双抗夹心的结合相，形成双抗夹心的结合相即为阳性磁珠，否则为阴性磁珠。

待测样本中的抗原浓度为fg级别时，只有不超过5%的磁珠能捕获到抗原，形成双抗夹心的结合相。利用泊松分布理论计算出阳性磁珠对应的抗原蛋白浓度值，实现数字化fg级别的超高灵敏度检测。

待测样本中的抗原浓度较高时，大部分的磁珠都能捕获到抗原形成双抗夹心的结合相。此时荧光信号的强度和待测物浓度成正相关，从而能建立标准曲线。通过对一定数量的磁珠进行检测，可以对待测抗原浓度进行定量测量。

利用专门开发的磁珠试剂***，在现有的流式细胞仪或流式荧光分析仪上进行检测，其检测灵敏度也有望达到fg级别。如Connie Wu，Tyler J. Dougan，和David R. Walt等人发表的名称为“High-Throughput, High-Multiplex Digital Protein Detection withAttomolar Sensitivity”的文章，在贝克曼库尔特公司生产的型号为CytoFlex LX流式细胞仪上进行检测，灵敏度达到了fg级别，实现了单分子级别的检测灵敏度。

但是流式细胞仪或流式荧光分析仪的光学***，其激光的方向与荧光收集的方向一般是垂直的，几乎所有的流式细胞仪光学***都是这样设计的。原因为流式细胞仪或流式荧光分析仪一般需要多个荧光通道，物镜的NA也要求比较大，NA达到1.2是比较理想的值。待测物以细胞为主，细胞的表面抗原数量很多，大部分细胞也有一定的透光性，所以流式细胞仪的激光方向与荧光收集方向垂直是有利于光学***设计的，而如果是其它方式如平行的话则难度会非常大，多激光流式细胞仪的难度还会再提升一个级别。

这样的光学***在检测磁珠时有如下的缺点：因目前所用的磁珠基本不透光，低浓度时每个磁珠上大概率只会形成一个双抗夹心的结合相，极低的概率可以形成2个，检测抗体上标记的荧光染料被激光照射到的概率为50%，产生的荧光被物镜收集到的概率也为50%，综合下来只有25%的概率会被判定为阳性磁珠（既被激光照射到，同时又被物镜收集到）。其它情形则不能保证一定会被识别为阳性磁珠。

高浓度时（比fg级别高1-2个数量级），每个磁珠上大概率至少形成一个双抗夹心的结合相，可能存在多个，但数量不会太多。此时建立标准曲线的依据是荧光信号的强度和待测物浓度成正相关，结合相多，则荧光强度应该越大，但传统流式细胞仪的光学***还是不能保证激光能荧光强度的均一性。磁珠表面双抗夹心的结合相数量越多，均一性越好。

这样就导致最终检测结果的CV（变异系数）是比较大的，不管是低浓度时还是高浓度时均是如此。

实用新型内容

本实用新型针对以上问题，提出了一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***，激光聚焦和荧光收集共用一个透镜，即共聚焦，能够利用更加简单和紧凑的结构达到检测结果CV更小的目的。

本实用新型的技术方案为：如图1-3所示，所述共聚焦光学***包括用于产生激光的激光聚焦光路、用于将前向散射光转换为电信号的前向散射光检测通道以及用于将荧光转换为电信号的荧光检测通道；

所述共聚焦光学***还包括消色差透镜203以及二向色滤光片A202，所述激光聚焦光路产生的激光经二向色滤光片A202以及消色差透镜203后照射在被测目标上，此后，产生的前向散射光直接进入前向散射光检测通道，并且产生的荧光则再次经过消色差透镜203及二向色滤光片A202后进入荧光检测通道；

所述二向色滤光片A202可以透射激光、反射荧光，或者是透射荧光、反射激光。

二向色滤光片A202为激光光路和荧光光路共用。当其为长波通二向色滤光片，反射激光，透射荧光。当其为短波通二向色滤光片，透射激光，反射荧光。起始响应波长均在激光波长和荧光波长之间。图1和图3中二向色滤光片A为长波通滤光片。

消色差透镜203，激光光路和荧光光路共用，由冕牌玻璃和火石玻璃胶合而成，用来聚焦激光束，同时收集激光激发的荧光信号。消色差透镜203的焦距在10mm-100mm之间，NA在0.05-0.65之间。消色差透镜203也可以用球面单透镜或非球面透镜替代。

流动池（观察室）300，其外部形状为方形或圆形，内部孔道形状为方向或圆形。待测物310从其内部孔道通过，经过激光束时产生前向散射光信号，待测目标，即待测物310上标记的荧光物质也会被激光激发产生荧光。

所述激光聚焦光路包括激光器100以及反射镜201，所述反射镜201设在激光器100和二向色滤光片A202之间，通过反射镜201将激光器100产生的激光反射在二向色滤光片A202上。

LD（激光二极管）101，通电后发出激光，其快轴和慢轴的发散角一般情况下是不同的。

非球面透镜102，用来准直LD发出的激光，LD的发光面中心位于非球面镜的焦点位置。

棱镜对103，共2个棱镜，对水平方向或垂直方向准直后的激光束压缩或扩束。根据压缩或扩束倍数的不同要求，可以设置2组棱镜对（共4个棱镜）。

平板玻璃104，一般45度角放置，镀对应激光波长的减反膜，透过率一般大于99%，小于1%的激光被反射。激光透过平板玻璃后的光束会有一定的偏移量，给后续结构带来麻烦，所以平板玻璃也可以放置2块，相互垂直放置，可以抵消激光透过平板玻璃后的光束偏移。

探测器A（如光电二极管PD）105，接收被平板玻璃反射的激光，用来对激光器的输出功率进行回路控制，当探测器105检测到的功率过低时会增加LD的供电电流，提高输出功率到目标值，同理，当探测器105检测到的功率过高时会减少LD的供电电流，降低输出功率到目标值。

波片106，用来改变激光的偏振方向，根据需求添加。

凹透镜107和凸透镜A108组成望远镜***，对激光束进行扩束或压缩，水平方向和垂直方向同时扩束。

带通滤光片A109，用来过滤激光中心波长之外的杂散光。

反射镜201，用于反射激光，膜层一般为介质膜反射镜，也可以为高反射率的其它膜层，反射镜201固定在反射镜架上，方便对激光指向进行微调，使激光最终聚焦在流动池（观察室）300中间流道的中心位置。

反射镜201也可以没有（不设置），激光直接照射在二向色滤光片A202上，二向色滤光片A202固定在反射镜架上，方便对激光指向进行微调。

所述前向散射光检测通道自待测目标所在的一侧起依次包括同轴设置的挡片210、凸透镜B211、凸透镜C212、探测器B213，所述凸透镜B211和凸透镜C212相对设置。

前向散射光信号用于对待测物进行计数。

凸透镜B211，收集前向散射光信号并将光束准直。

挡片210位于凸透镜B211与流动池（观察室）300之间，用于遮挡未被待测物散射的激光本底信号。

凸透镜C212，用于将凸透镜B211准直后的前向散射光汇聚到探测器B213上。

凸透镜B211和凸透镜C212也可以用一个凸透镜来替代，可以达到类似的效果。

探测器B213（如光电二极管PD），将前向散射光信号转化为电信号，输出给电子***。

所述共聚焦光学***包括一个激光聚焦光路、一个前向散射光检测通道以及多个荧光检测通道，在消色差透镜和多个荧光检测通道之间设有用于分路的二向色滤光片。荧光通道理论上没有上限，根据实际需要进行设置，最低设置1个荧光检测通道。如图1和图3上，共画出了6个荧光通道及对应的探测器。

所述共聚焦光学***包括六个荧光检测通道，所述荧光检测通道包括依次同轴设置的带通滤光片、凸透镜D600以及探测器C700，通过带通滤光片滤出单一种荧光；

六路荧光检测通道中的带通滤光片分别为带通滤光片B501、带通滤光片C502、带通滤光片D503、带通滤光片E504、带通滤光片F505、带通滤光片G506；通过二向色滤光片B401、二向色滤光片C402、二向色滤光片D403、二向色滤光片E404、二向色滤光片F405进行分路；

所述二向色滤光片B401设于二向色滤光片A202和带通滤光片B501之间，并且带通滤光片B501处在二向色滤光片B401的透射侧；

所述二向色滤光片C402设于二向色滤光片B401的反射侧，并且带通滤光片C502设于二向色滤光片C402的透射侧；

所述二向色滤光片D403设于二向色滤光片C402的反射侧，并且带通滤光片D503设于二向色滤光片D403的透射侧；

所述二向色滤光片E404设于二向色滤光片D403的反射侧，并且带通滤光片E504设于二向色滤光片E404的透射侧；

所述二向色滤光片F405设于二向色滤光片E404的反射侧，并且带通滤光片F505设于二向色滤光片F405的透射侧，所述带通滤光片G506则设于二向色滤光片F405的反射侧。

待测物310上标记的荧光物质被激光激发产生的荧光会向360度立体空间发射，部分荧光被消色差透镜203收集并准直，荧光会透过二向色滤光片A202。

用于分路的二向色滤光片B401、二向色滤光片C402、二向色滤光片D403、二向色滤光片E404、二向色滤光片F405可以为长波通二向色滤光片，也可以为短波通二向色滤光片。

当二向色滤光片B401、二向色滤光片C402、二向色滤光片D403、二向色滤光片E404、二向色滤光片F405为长波通二向色滤光片，中心波长由高到低依次为带通滤光片B501、带通滤光片C502、带通滤光片D503、带通滤光片E504、带通滤光片F505、带通滤光片G506。

当二向色滤光片B401、二向色滤光片C402、二向色滤光片D403、二向色滤光片E404、二向色滤光片F405为短波通二向色滤光片，中心波长由低到高依次为带通滤光片B501、带通滤光片C502、带通滤光片D503、带通滤光片E504、带通滤光片F505、带通滤光片G506。

带通滤光片B501、带通滤光片C502、带通滤光片D503、带通滤光片E504、带通滤光片F505、带通滤光片G506根据预期使用的荧光染料来定义其中心波长和半波宽。

凸透镜D600可以为普通球面透镜，也可以为非球面透镜。

当探测器C700感光区面积较大，使用普通球面透镜即可将光束聚焦尺寸小于探测器感光区面积时，一般选择价格更低的普通球面透镜。

当探测器C700感光区面积较小，只有使用非球面透镜才能将光束聚焦尺寸小于探测器感光区面积时，一般选择非球面透镜。

探测器C700用于将荧光信号转换为电信号，输出给电子***。探测器C700和凸透镜D600之间也可以使用光纤进行连接，产生这种情况一般的原因主要是感光区面积较小，而探测器本身的体积较大，不利于结构布局。

本实用新型的有益效果为：

一、结构简单紧凑，共聚焦设计，激光聚焦透镜与荧光收集透镜共用。

二、可设置1个或多个荧光检测通道。

三、提高了阳性磁珠的识别率，由25%提高到50%，极大的改善检测结果的CV。

附图说明

图1是本案的结构示意图，

图2是图1中前向散射光检测通道及激光器的结构示意图，

图3是图1中6个荧光检测通道的结构示意图，

图4是本案实施例的结构示意图。

图中100，激光器，内部光学元件由101-109组成；

101，LD（激光二极管）；102，非球面透镜；103，棱镜对；104，平板玻璃；105，探测器A；106，波片；107，凹透镜；108，凸透镜A；109，带通滤光片A；

201，反射镜；202，二向色滤光片A；203，消色差透镜；

300，流动池（观察室）；310，待测物；

210，挡片；211，凸透镜B；212，凸透镜C；213，探测器B；

401，二向色滤光片B；402，二向色滤光片C；403，二向色滤光片D；404，二向色滤光片E；405，二向色滤光片F；501，带通滤光片B；502，带通滤光片C；503，带通滤光片D；504，带通滤光片E；505，带通滤光片F；506，带通滤光片G；600，凸透镜D；700，探测器C。

具体实施方式

为能清楚说明本专利的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本专利进行详细阐述。

如图4所示，本实用新型的实施例提供了一种基于LD的超敏流式荧光免疫分析仪共聚焦光学***。包含激光器及内部光路，激光聚焦光路，前向散射光收集光路和荧光收集光路。其激光波长为488nm，拥有2个荧光检测通道，可以检测的荧光染料为硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）。消色差透镜203为激光聚焦和荧光收集共用，为共聚焦。二向色滤光片A202共用，为长波通滤光片，反射激光，透射荧光，起始响应波长在激光波长和荧光波长之间。

LD（激光二极管）101的型号为OSRAM PLT5 488，中心波长488nm，快轴发散角典型值为23度（@FWHM），慢轴发散角典型值为6度（@FWHM）。

LD（激光二极管）101的安装方向，快轴方向为垂直方向，慢轴方向为水平方向。

非球面透镜102型号为 Lightpath 357757，焦距4mm，NA0.6，外径6.325mm。

LD（激光二极管）101发光面位置与非球面透镜102的焦点位置重合。

棱镜对103中的每个棱镜均为直角棱镜，其中一个锐角为30度。

平板玻璃104厚度为1mm，镀488nm减反膜，透过率大于99%。

探测器A105用于接收被平板玻璃104反射的激光信号，用于激光器功率控制。

波片106用于改变激光器的偏振方向，使偏振方向为垂直方向。

凹透镜107的焦距为-35mm和凸透镜A108的焦距为45mm，两者组成的望远镜***。根据实施例一的具体需求，需要对光束进行压缩而非扩束，所以激光先透射凸透镜A108，再投射凹透镜107。

带通滤光片A109的中心波长为488nm，半波宽10nm，用于过滤LD（激光二极管）101发出的中心波长之外的杂光。

反射镜201为488nm介质膜反射镜，反射率＞99%@488nm，其固定在反射镜架上，方便对激光指向进行微调，使激光最终聚焦在流动池（观察室）300中间流道的中心位置。

二向色滤光片A202为长波通，型号为Edmund 86385，起始响应波长为503nm，反射波长473-491nm，透射波长515-647nm，用于反射488nm的激光，透射激光产生的荧光信号，如FITC和PE的荧光信号。

消色差透镜203，焦距为20mm，外径为10mm，用于聚焦激光和收集流动池（观察室）300中产生的荧光信号。

流动池（观察室）300为方形，外部尺寸为4mm*4mm，长度17mm，内部流动形状为方形，尺寸为0.2mm*0.2mm，待测样本在鞘流的包裹下使其能够稳定的从流动池（观察室）300的内部流道的中心通过。在激光聚焦的地方被激光照射，产生前向散射光信号和荧光信号，其中荧光信号被消色差透镜203收集。

凸透镜B211，焦距38.1mm，外径25.4mm，用于收集前向散射光信号，将其准直为平行光束，凸透镜B211的收光角度为±10度。

挡片210位于凸透镜B211与流动池（观察室）300之间，用于遮挡未被待测物散射的激光本底信号。

凸透镜C212，焦距38.1mm，外径25.4mm，与凸透镜B211规格一样，用于将凸透镜B211准直后的前向散射光汇聚到探测器B213上，产生电信号，输入到电子***。

消色差透镜203将收集到的荧光信号准直，经过二向色滤光片A202时，荧光信号会透过二向色滤光片A202。

二向色滤光片B401，起始响应波长为550nm，可以反射450nm-545nm波长的光，可以透射555nm-650nm波长的光，用于透射PE的荧光，反射FITC荧光。

带通滤光片C502的中心波长为530nm，半波宽为30nm，FITC荧光的峰值波长会透过，带宽范围以外的光不能透过此带通滤光片。

带通滤光片B501的中心波长为575nm，半波宽为25nm，PE荧光的峰值波长会透过，带宽范围以外的光不能透过此带通滤光片。

凸透镜600为非球面透镜，型号为Lightpath 354058，直径6.325mm，焦距12mm，NA0.22，可以将透过带通滤光片B501的荧光汇聚到直径小于100um的尺寸。

探测器700为单光子计数器，APD探测器的感光面积小于200um，用于将微弱的光信号转化为电信号。

本实用新型具体实施途径很多，以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本实用新型的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***，其特征在于，所述共聚焦光学***包括用于产生激光的激光聚焦光路、用于将前向散射光转换为电信号的前向散射光检测通道以及用于将荧光转换为电信号的荧光检测通道；

所述共聚焦光学***还包括消色差透镜（203）以及二向色滤光片A（202），所述激光聚焦光路产生的激光经二向色滤光片A（202）以及消色差透镜（203）后照射在被测目标上，此后，产生的前向散射光直接进入前向散射光检测通道，并且产生的荧光则再次经过消色差透镜（203）及二向色滤光片A（202）后进入荧光检测通道；

所述二向色滤光片A（202）可以透射激光、反射荧光，或者是透射荧光、反射激光。

2.根据权利要求1所述的一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***，其特征在于，所述激光聚焦光路包括激光器（100）以及反射镜（201），所述反射镜（201）设在激光器（100）和二向色滤光片A（202）之间，通过反射镜（201）将激光器（100）产生的激光反射在二向色滤光片A（202）上。

3.根据权利要求1所述的一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***，其特征在于，所述前向散射光检测通道自待测目标所在的一侧起依次包括同轴设置的挡片（210）、凸透镜B（211）、凸透镜C（212）、探测器B（213），所述凸透镜B（211）和凸透镜C（212）相对设置。

4.根据权利要求1所述的一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***，其特征在于，所述共聚焦光学***包括一个激光聚焦光路、一个前向散射光检测通道以及多个荧光检测通道，在消色差透镜和多个荧光检测通道之间设有用于分路的二向色滤光片。

5.根据权利要求4所述的一种基于LD的单分子检测免疫分析仪的共聚焦光学***，其特征在于，所述共聚焦光学***包括六个荧光检测通道，所述荧光检测通道包括依次同轴设置的带通滤光片、凸透镜D（600）以及探测器C（700），通过带通滤光片滤出单一种荧光；

六路荧光检测通道中的带通滤光片分别为带通滤光片B（501）、带通滤光片C（502）、带通滤光片D（503）、带通滤光片E（504）、带通滤光片F（505）、带通滤光片G（506）；通过二向色滤光片B（401）、二向色滤光片C（402）、二向色滤光片D（403）、二向色滤光片E（404）、二向色滤光片F（405）进行分路；

所述二向色滤光片B（401）设于二向色滤光片A（202）和带通滤光片B（501）之间，并且带通滤光片B（501）处在二向色滤光片B（401）的透射侧；

所述二向色滤光片C（402）设于二向色滤光片B（401）的反射侧，并且带通滤光片C（502）设于二向色滤光片C（402）的透射侧；

所述二向色滤光片D（403）设于二向色滤光片C（402）的反射侧，并且带通滤光片D（503）设于二向色滤光片D（403）的透射侧；

所述二向色滤光片E（404）设于二向色滤光片D（403）的反射侧，并且带通滤光片E（504）设于二向色滤光片E（404）的透射侧；

所述二向色滤光片F（405）设于二向色滤光片E（404）的反射侧，并且带通滤光片F（505）设于二向色滤光片F（405）的透射侧，所述带通滤光片G（506）则设于二向色滤光片F（405）的反射侧。

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