CN217639110U - 高灵敏度免疫层析检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及高灵敏度免疫层析检测试剂盒，包括抗体检测液盛放装置和试纸条，其中所述抗体检测液盛放装置中含有相应的抗体检测液；所述由反应垫、样品垫、吸水垫在底板上依次交错地组装而成，反应垫一端连接样品垫，另一端与吸水垫相连，反应垫预包被有相互分离的检测线和质控线，其特征在于：在试纸条和标记物上均结合有生物桥。通过本实用新型的试剂盒进行免疫层析测试，提高了检测灵敏度，降低了抗体用量。

Description

高灵敏度免疫层析检测试剂盒

技术领域

本实用新型属于免疫学检测领域，具体而言，本实用新型涉及一种高灵敏度免疫层析检测试剂盒。

背景技术

免疫层析技术，或称侧向流层析技术，因其检测快速、操作简便、成本低廉的优点而广泛应用于食品安全、临床医学检验等领域。根据待测物质分子量大小的差异，免疫层析技术的检测模式分为适用于小分子物质的竞争法和适用于分子量大的物质的双抗夹心法。

现有的免疫层析技术存在检测灵敏度不高，抗体利用率低的问题，主要原因如下：1、标记物与抗体的连接有关，标记物与抗体的连接存在无序性，即标记物既可以连接抗体的恒定区，使可变区(与抗原结合的局域)充分暴露；也可以连接抗体的可变区，使抗体失效或效果降低；2、标记物与抗体直接连接，由于二者之间的距离过近，形成空间位阻，降低抗体与抗原的结合效率；3、在层析过程中，由于流速较快，在检测线位置抗体抗原结合的不够充分。

为了解决以上问题，本实用新型提供了一种高灵敏度的试剂盒，在标记物与检测线位置设有“生物桥”，利用所述试剂盒的免疫层析测试，提高了检测灵敏度，降低了抗体用量。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种高灵敏度免疫层析检测试剂盒，包括试纸条和抗体检测液盛放装置，其中所述装置中含有相应的抗体检测液；所述试纸条由反应垫、样品垫、吸水垫在底板上依次交错地组装而成，所述反应垫预包被有相互分离的检测线和质控线，其特征在于：在试纸条和抗体检测液中均结合有生物桥。

所述生物桥可以有多个，例如两个、三个，其一位于试纸条的反应垫上，结合在检测线位置，其它生物桥位于抗体检测液中，与标记物结合。

所述试纸条的反应垫一端连接样品垫，另一端与吸水垫相连；反应垫、样品垫、吸水垫例如可以相互交错1.5-2.5mm，例如2mm。

所述“生物桥”为可特异结合抗体恒定区的生物制品，且具有高亲和力。所述生物桥为能与抗体特异性结合的抗抗体、蛋白A、蛋白G等分子。生物桥保证至少一个功能区是特异性结合检测抗体的恒定区段。

所述抗体检测液包括抗体1、抗体2和标记物偶联的生物桥1。

所述抗体1和抗体2可以为单克隆抗体，或多克隆抗体，或单链抗体，优选为单克隆抗体；所述抗体1与抗体2为不同种属的抗体。

所述标记物可以是乳胶颗粒、也可以是胶体金、胶体碳、胶体硒、超顺磁性颗粒、荧光颗粒、上转换发光颗粒等标记物。

所述生物桥1为能与抗体1的恒定区特异性结合的抗抗体、蛋白A、蛋白G等分子。

在标记物和抗体1之间具有生物桥1，生物桥1可特异结合抗体1恒定区，且具有高亲和力，可提高抗体1的利用率。可使抗体1的可变区充分暴露，且使抗体1远离标记物，一定程度降低空间位阻，从而提高检测灵敏度。

所述试纸条的检测线含有生物桥2。所述生物桥2为能与抗体2的恒定区特异性结合的抗抗体、蛋白A、蛋白G等分子；所述质控线含有能与所述生物桥1特异性结合的抗体3。

所述抗体3可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，优选为多克隆抗体。

在一个实施方案中，本实用新型的试剂盒为双抗体夹心模式。在此模式下，共有两个生物桥，所述两个生物桥分别特异性结合双抗夹心中的两个抗体，即：一个生物桥连在标记物上，一个生物桥连接在试纸条检测线上。

在待测物加入试纸条层析前，先与抗体1、抗体2和标记物偶联的生物桥1混合，反应充分；并且，在层析过程中，检测线位置有可以与抗体2特异性结合的生物桥，与抗体2的结合力高。

与直接在反应垫上包被抗体2的传统方法相比，本实用新型的技术方案中对于抗体2利用率更高，检测灵敏度更高。

在本实用新型中，在标记物与“生物桥”连接后，再通过生物桥特异性结合抗体恒定区，可使抗体的可变区充分暴露，且使抗体远离标记物，一定程度降低空间位阻。检测线的位置固定有“生物桥”，由于“生物桥”与抗体的结合亲和力更高，在层析时“生物桥”与抗体的结合效率更高，从而提高了检测灵敏度。在层析过程中，检测线位置有可以与抗体特异性结合的“生物桥”，与抗体的结合力高，可提高抗体利用率和检测灵敏度。本实用新型具有所述优点的原因在于，在抗体所具有的两端中，一端是结合区，即：发挥作用的区域，另一端是恒定区，不发挥作用。传统的化学偶联法将抗体和标记物偶联时，存在的问题是抗体的结合区有可能偶联到标记物上而导致该抗体浪费；也可能有的抗体的中段偶联到标记物上，由此导致抗体的结合力变弱。本实用新型中添加的生物桥能够定向结合抗体的恒定区，让结合区充分暴露于反应体系中，因此，生物桥的加入可以降低抗体的用量，提升测试灵敏度。

附图说明

图1为根据本实用新型的试剂盒的试纸条。

图2为本实用新型用于双抗体夹心模式测试的试剂盒的示意图，其包括I：抗体检测液盛放装置(其中装有相应的抗体检测液)和II：试纸条。

附图标记说明：

1—抗体1；2—抗体2；3—生物桥1；4—标记物；5—样品垫；6—检测线；7—生物桥2； 8—质控线；9—反应垫；10—吸水垫；11—底板；I-抗体检测液盛放装置；II-试纸条。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本实用新型做进一步详细的说明，但是本实用新型的范围不限制于此。本实用新型实施例中使用的试剂均可市场购得，并且如无特殊说明，所有操作方法均为常规操作方法。

实施例1：人脑啡肽检测

脑啡肽抗体检测液的制备：

(1)将2.5mg粒径为200nm的超顺磁性复合粒子(美国Quantum Design公司，产品号100001)、0.96mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，美国Thermo公司，产品号22980)、1.15mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS，美国Thermo公司，产品号24500)和1mL浓度为0.1M pH＝4.7的2-(N-***啉)乙磺酸(MES，美国Sigma-Aldrich公司，产品号M3671)缓冲液(称取1.066g MES，0.45g NaCl溶于50mL纯水，调pH至4.7)混匀，37℃反应30min，得到活化后超顺磁性复合粒子；

(2)用磁铁吸附磁微粒，弃上层清液，并用上述MES缓冲液洗涤两次；将步骤(1)得到的活化的超顺磁性复合粒子、0.08mg“生物桥1”(此实施例中为羊抗鼠IgG Fc段抗体)和浓度为50mM pH＝8.5的硼酸缓冲液混匀，37℃反应3h，得到偶联后标记物反应液；

(3)向步骤(2)中的反应液加入含有BSA(美国Sigma-Aldrich公司，产品号A4612)的50mM pH＝8.5的硼酸缓冲液，使BSA终浓度为5％，37℃反应30min，得到含有封闭后的磁性粒子的反应液；用磁铁吸附磁微粒，弃上层清液，并用0.8mLpH8.5的硼酸缓冲液洗涤两次；最后加入0.5mL含有1％BSA，0.5％Tween-20，1％蔗糖的pH8.5的磷酸盐缓冲液，得到超顺磁性复合粒子标记溶液。向该溶液再加入0.01mg抗脑啡肽单克隆抗体和0.05mg抗脑啡肽兔多克隆抗体后，即为脑啡肽抗体检测液。

脑啡肽试纸条的制备：

(1)反应垫的处理：用包被缓冲液(含2％BSA的0.01M PBS溶液，pH为7.2，过0.22μm滤膜)将“生物桥2”(羊抗兔IgG抗体)调节浓度至1mg/mL(作检测线)，鼠IgG抗体调节浓度至1mg/mL(作质控线)，按照1μL/cm的量将二者以5mm的间隔喷涂于硝酸纤维素膜上， 37℃晾干后，加入干燥剂封存备用。

(2)试纸板的组装：将反应垫，吸水垫，样品垫，依次相互交错2mm粘贴在底板上，组成试纸板。

(3)试纸条的裁切：使用切条机将上述试纸板切成3mm宽的试纸条。

脑啡肽的检测：

取10μL血清与90μL脑啡肽抗体检测液于0.5mL离心管中混合后，将脑啡肽试纸条***离心管中(样品垫在下)，室温下层析10min。

经系列调试，该方法的检出限位5μg/mL。当检测线和质控线同时出现褐色时，证明样本中含有的脑啡肽高于检出限；当检测线没有颜色，而质控线出现褐色时，证明样本中含有的脑啡肽低于检出限；当检测线和质控线均没有颜色时试纸条无效。

Claims (2)

1.一种高灵敏度免疫层析检测试剂盒，包括抗体检测液盛放装置（I）和试纸条（II），其中所述抗体检测液盛放装置中含有相应的抗体检测液；所述试纸条由反应垫（9）、样品垫（5）、吸水垫（10）在底板（11）上依次交错地组装而成，反应垫（9）一端连接样品垫（5），另一端与吸水垫（10）相连，反应垫（9）预包被有相互分离的检测线（6）和质控线（8），其特征在于：在试纸条和抗体检测液中均结合有生物桥。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为双抗体夹心模式。

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