CN213652526U - 用于分析乳腺癌患者中的基因表达的盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于分析乳腺癌患者中的基因表达的盒,其包括附接有用于RT‑PCR扩增包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种的一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物的孔,并且其中所述盒被配置用于对每种所述RNA转录物执行RT‑PCR扩增。
Description
技术领域
本申请涉及一种用于分析乳腺癌患者样品中的基因表达的***以及所述***的相关部件(包括包含用于扩增的引物的盒(cartridge))、包含试剂的组合物和试剂盒、以及相关操作方法。
背景技术
乳腺癌患者中某些基因的RNA表达与具有已知临床结果的总体乳腺癌患者群体中的表达水平相比的相对高水平或相对低水平,可以指示该患者与总体群体相比复发风险增加或减小。在一些情况下,高水平的RNA表达与高复发风险相关,而在其他情况下,低水平的RNA 表达与高复发风险相关。在一些情况下,高水平的RNA表达与低复发风险相关,而在其他情况下,低水平的RNA表达与低复发风险相关。用于预测复发风险的一些测试可利用乳腺癌患者中特定基因的 RNA表达水平与复发风险之间的此类关系,并且可以作为预测复发可能性的方式来评定多种基因的RNA表达水平。
发明内容
本公开包括例如用于分析乳腺癌患者中的特定基因的表达的***,所述基因诸如其RNA表达水平可指示良好或较差临床结果的风险(诸如复发无存活的相对风险或总体存活的相对风险)的基因。例如,乳腺癌患者中某些基因的RNA表达与具有已知临床结果的总体乳腺癌患者群体中的表达水平相比的相对高水平或相对低水平,可以指示该患者与总体群体相比复发风险增加或减小。在一些情况下,高水平的RNA表达与高复发风险相关,而在其他情况下,低水平的RNA 表达与高复发风险相关。在一些情况下,高水平的RNA表达与低复发风险相关,而在其他情况下,低水平的RNA表达与低复发风险相关。用于预测复发风险的一些测试可利用乳腺癌患者中特定基因的 RNA表达水平与复发风险之间的此类关系,并且可以作为预测复发可能性的方式来评定多种基因的RNA表达水平。
本公开例如涵盖可用于对乳腺癌患者中的多种特定基因的RNA 表达水平进行此类分析的***。本公开例如涵盖包括孔的盒,其中所述孔包含用于RT-PCR扩增一组潜在预后基因以及至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述参考基因诸如其表达预期不会因患者不同而改变的管家基因。引物可以附接至孔,例如使得引物的扩增可用于例如通过读取特定基因的扩增子(例如聚合酶链反应(PCR)产物) 在所述盒上的孔的限定空间内的水平来确定盒的结构内的RNA表达水平。因此,例如,引物可以定位或限定至盒内的特定孔。
在一些实施方案中,本公开涵盖一种包括孔的盒,其中所述孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物(例如,通过经由逆转录随后进行PCR来扩增由RNA转录物制成的 cDNA)的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、 BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2) 中的每一种,其中每种引物附接至盒的孔,并且其中所述盒被配置用于对每种RNA转录物执行RT-PCR或另一个扩增过程。在一些实施方案中,孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的 RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、 MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、 HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2 (CEGP1)中的每一种。在一些实施方案中,所述一组基因由SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、 CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO或TFRC中的一种或多种。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的每一种。在一些实施方案中,至少一种参考基因选自由GUS、ACTB、GAPDH、 RPLPO和TFRC组成的组。在一些实施方案中,用于RT-PCR扩增一种特定参考基因的RNA转录物的引物被包含在每一个孔中,这允许将每个孔中的特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。例如,用于RT-PCR扩增参考基因诸如GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO或TFRC的RNA转录物的引物可在每一个孔中找到。这允许将来自每个孔的参考RNA转录物的扩增子彼此相比较以使每一个孔中的扩增度归一化。
在一些实施方案中,所述盒包括至少四个孔,其中每个孔包含用于RT-PCR扩增所述一组基因中的至少三种、四种或五种基因以及至少一种参考基因的RNA转录物的引物。使用适当检测试剂,这可允许孔中的每种基因的RNA转录物的扩增子以独特颜色标记,例如每孔使用四种、五种或六种颜色标记。在一些实施方案中,盒包括两个、三个、四个、五个或六个孔,并且每个孔包含用于扩增所述一组基因中的三种、四种或五种基因以及一种或两种参考基因的引物。在一些实施方案中,盒可以被设计来使得在扩增之后,所述一组基因和至少一种参考基因的扩增子用不多于六种不同的颜色标记。在一些实施方案中,盒包括五个孔,每个孔包含用于RT-PCR扩增以下中的三种或四种的RNA转录物的引物:SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、 ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、 Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1),并且每个孔还包含用于RT-PCR扩增一种或两种参考基因的RNA转录物的引物。在一些实施方案中,每个孔包含用于扩增选自GUS、ACTB、 GAPDH、RPLPO和TFRC的一种特定参考基因的RNA转录物的引物,从而允许将每个孔中的特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较,例如以使每个孔中的扩增度归一化。
在一些实施方案中,盒的每个孔还包含以下RT-PCR试剂中的至少一种:(a)dNTP;(b)逆转录酶;以及(c)DNA聚合酶。在一些实施方案中,引物非共价附接至所述孔的表面。例如,引物可以通过一种方法附接至所述孔,所述方法包括使孔的表面与包含引物的溶液接触以及干燥所述溶液。在一些情况下,引物和RT-PCR试剂通过一种方法附接至所述孔,所述方法包括使孔的表面与包含引物和试剂的溶液接触以及干燥所述溶液。在一些实施方案中,盒还包括用于将待通过 RT-PCR分析的包含RNA的样品保持在盒内的腔室。例如,待分析的样品可以引入到该保持腔室中,然后移动以填充该盒的孔,以便与 RT-PCR试剂混合并在所述孔内开始RT-PCR过程。在一些实施方案中,样品从来自乳腺癌患者的固定的蜡包埋肿瘤样品中获得,并且任选地液化并处理以裂解细胞并消化DNA。
本公开还包括用于分析乳腺癌患者中的基因表达的***,所述***包括:(a)包括孔的盒,其中所述孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种,其中每种引物附接至所述盒的孔,并且其中所述盒被配置用于对每种RNA转录物执行 RT-PCR;并且还包括(b)用于检测来自每种RNA转录物的扩增子的检测装置。在一些实施方案中,所述盒的孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、 MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、 CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种。在一些实施方案中,所述一组基因由SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、 PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、 GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、 ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的一种或多种。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括GUS。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的每一种。在一些实施方案中,至少一种参考基因选自由GUS、ACTB、 GAPDH、RPLPO和TFRC组成的组。
在一些实施方案中,用于RT-PCR扩增一种特定参考基因的RNA 转录物的引物被包含在每一个孔中,这允许将每个孔中的特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。在一些实施方案中,所述盒包括至少四个孔,其中每个孔包含用于RT-PCR扩增所述一组基因中的至少三种、四种或五种基因以及至少一种参考基因的RNA转录物的引物。在一些实施方案中,***可操作来使得孔中每种基因的RNA转录物的扩增子以独特颜色标记。在一些实施方案中,盒包括四个至六个孔,并且每个孔包含用于扩增所述一组基因中的三种、四种或五种基因以及一种或两种参考基因的引物。在一些实施方案中,所述一组基因和至少一种参考基因的扩增子用不多于六种不同的颜色标记。在一些实施方案中,盒包括五个孔,每个孔包含用于RT-PCR扩增以下中的三种或四种的RNA转录物的引物:SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、 CSL2和SCUBE2(CEGP1),并且每个孔还包含用于扩增一种或两种参考基因的RNA转录物的引物。在一些实施方案中,每个孔包含用于RT-PCR扩增选自GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC的一种特定参考基因的RNA转录物的引物,从而允许将每个孔中的特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。在一些实施方案中,所述***还包括(c)用于定量来自每种RNA转录物的扩增子的水平的软件。在一些实施方案中,软件能够由扩增子确定归一化RNA转录物水平、由归一化RNA转录物水平或扩增子水平计算基因群值、计算定量评分(QS)和/或计算定标的QS。以下详细地描述这些值和评分。
在一些实施方案中,***内的盒的每个孔还包含以下RT-PCR试剂中的至少一种:(a)dNTP;(b)逆转录酶;以及(c)DNA聚合酶。在一些实施方案中,引物非共价附接至所述孔的表面。例如,引物可以通过一种方法附接至所述孔,所述方法包括使孔的表面与包含引物的溶液接触以及干燥所述溶液。在一些情况下,引物和RT-PCR试剂通过一种方法附接至所述孔,所述方法包括使孔的表面与包含引物和试剂的溶液接触以及干燥所述溶液。在一些实施方案中,盒还包括用于将待通过RT-PCR分析的包含RNA的样品保持在盒内的腔室。例如,待分析的样品可以引入到该保持腔室中,然后移动以填充该盒的孔,以便与RT-PCR试剂混合并在所述孔内开始RT-PCR过程。
本公开还涵盖包含本文所述的盒的试剂盒。在一些实施方案中,试剂盒包含本文所述的一个或多个盒以及用于RT-PCR扩增RNA转录物和/或用于制备待在盒中分析的样品的试剂。在一些实施方案中,某些RT-PCR试剂可包含在所述盒内,而在其他实施方案中,某些试剂可以单独包装。在一些实施方案中,用于样品制备的试剂可以与盒分开包装。在一些实施方案中,试剂盒可包含反应缓冲液,其中所述反应缓冲液包含盐和用于保持pH的至少一种缓冲剂。在一些实施方案中,试剂盒可包含用于RT-PCR扩增的试剂,其中所述试剂包含(a) 脱氧核糖核苷酸三磷酸酯dTTP、dATP、dGTP和dCTP和/或(b)用于对引物进行RT-PCR扩增的至少一种反应缓冲液。在一些此类情况下,试剂盒还可包含至少一种逆转录酶和/或至少一种DNA聚合酶。在一些实施方案中,试剂盒可包含至少一种检测试剂。检测试剂可包括用于检测每种RNA转录物的扩增子的一组标记探针,其中对应于给定基因的RNA转录物的探针用一种颜色或荧光标记来标记,所述颜色或荧光标记可与存在于对应于同一孔中扩增的其他基因的RNA 转录物的探针上的标记区分开。因此,在此类实施方案中,对应于给定基因的RNA转录物的探针用一种颜色或荧光标记来标记,所述颜色或荧光标记可与存在于对应于在同一孔中扩增的其他基因的RNA 转录物的探针上的标记区分开。在一些实施方案中,试剂盒包含用于制备样品的试剂,诸如用于例如通过使样品液化并裂解细胞来从固定的蜡包埋的组织样品提取RNA的试剂以及视情况用于DNA消化(即去除)的试剂诸如DNA酶。
本公开还包括包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物的组合物,所述一组基因包括SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种。例如,组合物可添加到空白盒的孔中以制备根据本公开的盒。在一些实施方案中,组合物包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、 BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种。在一些实施方案中,组合物的所述一组基因由SURV(BIRC5)、 CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、 GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和 SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。在一些实施方案中,组合物还包含用于扩增RNA转录物的试剂。在一些实施方案中,试剂包含(a)脱氧核糖核苷酸三磷酸酯dTTP、dATP、dGTP 和dCTP和(b)用于对引物进行RT-PCR扩增的至少一种反应缓冲液。在一些实施方案中,试剂包含核糖核苷酸三磷酸酯rUTP、rATP、rGTP 和rCTP。在一些实施方案中,试剂包含至少一种逆转录酶和/或至少一种DNA聚合酶。在一些实施方案中,试剂包含至少一种检测试剂。在一些实施方案中,至少一种检测试剂包含用于检测每种RNA转录物的扩增子的一组标记探针,其中对应于预期在一个孔中测定的不同基因的探针用不同颜色标记,即允许孔中的每种基因的扩增子彼此区分开。因此,在此类实施方案中,对应于给定基因的RNA转录物的探针用一种颜色或荧光标记来标记,所述颜色或荧光标记可与存在于对应于在同一孔中扩增的其他基因的RNA转录物的探针上的标记区分开。
最后,本公开还包括使用上文所述的盒、***、试剂盒和组合物确定基因的RNA转录物的水平的方法。示例性方法包括确定来自乳腺癌患者的肿瘤样品中的一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的表达水平,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2) 中的每一种,所述方法包括:(a)将样品添加到上文所述的盒中,(b) 在盒中对样品执行RT-PCR以形成基因的每种RNA转录物的扩增子, (c)任选地使用本文所述的***的检测装置和软件检测通过RT-PCR 反应产生的扩增子的水平。在一些实施方案中,肿瘤样品为先前已液化并处理来裂解细胞并消化DNA的固定的蜡包埋的样品。在一些实施方案中,扩增子水平使用检测试剂检测,所述检测试剂包括用于检测每种RNA转录物的扩增子的一组标记探针,其中对应于给定基因的RNA转录物的探针用一种颜色或荧光标记来标记,所述颜色或荧光标记可与存在于对应于盒的同一孔中扩增的其他基因的RNA转录物的探针上的标记区分开
附图说明
图1显示依照本公开的一种例示性盒的示意图。如左上小图所示,例示性盒可包含有一组孔的一部分,所述孔中共价或非共价附接基因引物,例如通过使孔的表面与含有引物和任选地其它RT-PCR试剂的溶液接触,并干燥孔表面上的溶液。在这个例子中,盒的部分包含5个孔。盒还可以包含用于引入待分析样品的腔室和一个或多个可用于样品分析、RT-PCR加工或反应步骤、或其它目的的另外的腔室。这些另外的腔室可以连通,从而容许溶液在盒的各腔室之间流动,包括去往和来自包含附接有引物的孔的腔室。如右上小图所示,在一些实施方案中,可以生成盒,使得它们能***检测***和在不再需要时丢弃。如左下小图所示,在一些实施方案中,可以将用于RT-PCR扩增16种或更多种基因(包含例如SURV、CCNB1、MYBL2、BAG1、 ESR1、PGR、BCL2、MMP11、GRB7、HER2、KI67、STK15、GSTM1、 CD68、CSL2、和SCUBE2)和5种或更多种参照基因(例如包含GUS、 ACTB、GAPDH、RPLPO、和TFRC)的引物分配至例如5个孔,在每个孔中使用5至6种荧光颜色标记以区分各基因。然后可以将孔放置在盒的一部分上,该部分可以具有任何形状,取决于***设计的细节,如右下小图所示,但是该形状容许RT-PCR过程在所有孔中执行,使得每个孔中的每种基因和参照基因反应基于它的颜色标记而彼此可区分。
具体实施方式
定义
除非另外指明,否则本文所用的每个基因名称均对应于对所述基因指定且由Entrez Gene(URL:www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)gov (slash)sites(slash)entrez)提供为本申请的提交日期的Official Symbol。除非另外定义,否则本文使用的技术术语和科学术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。 Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2 版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版,John Wiley& Sons(New York,NY 1992)为本领域技术人员提供本申请中使用的若干术语的一般指导。以下定义另外适用于本申请中的某些术语。
如本文所用,术语“肿瘤样品”是指从癌症患者获得的包含肿瘤物质的样品。所述术语涵盖肿瘤组织样品,例如通过活检获得的组织,例如通过组织芯活检或细针活检获得的组织。生物样品可为新鲜的、冷冻的或固定的蜡包埋组织样品,诸如***固定的石蜡包埋的组织样品。样品还涵盖含有癌细胞的体液,诸如血液、血浆、血清、尿液以及类似物。所述术语还涵盖包含患者肿瘤细胞后代的细胞的样品,例如源自原代肿瘤细胞或循环肿瘤细胞的细胞培养物样品。所述术语还涵盖可包含从体内肿瘤细胞流出的蛋白质或核酸物质的样品,例如骨髓、血液、血浆、血清以及类似物。所述术语还涵盖已富集肿瘤细胞或另外在其获得后操纵的样品和包含从患者肿瘤物质获得的多核苷酸和/或多肽的样品。
如本文所用,术语基因的“表达水平”或“水平”或“转录物水平”在本文中是指基因的RNA转录物或其多肽翻译产物的表达水平。“RNA 转录物水平”或“RNA表达水平”是指基因的RNA转录物的表达水平。如本文所用,术语基因的“归一化水平”或“归一化转录物水平”在本文中是指在针对来自样品的一种或多种参考基因的表达水平进行归一化之后基因的RNA转录物或其多肽翻译产物的表达水平。
如本文所用,术语“RNA转录物”是指基因的RNA转录产物,包括例如信使RNA(mRNA)。mRNA可包括例如未剪接RNA、剪接变体mRNA、微RNA和片段化RNA。RNA转录物可例如使用与RNA 转录物的片段互补的“引物”扩增。
短语“基因的RNA转录物的RT-PCR扩增”和类似短语通常是指使用逆转录酶逆转录RNA转录物以形成cDNA模板并且然后使用 PCR-适合DNA聚合物扩增cDNA的过程。
如本文所用,术语“扩增子”是指已使用扩增技术诸如聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应合成的DNA片段。例如,扩增子可包括通过逆转录RNA转录物并使用附接至本文中的盒的孔的引物扩增所得 cDNA来制成的DNA。因此,扩增子可充当确定制备它们的特定RNA转录物的表达水平的方式。
如本文所讨论的,“参考基因”为患者样品诸如肿瘤样品中的RNA 转录物水平预期未因患者不同而改变的基因。例如,肿瘤样品中参考基因的RNA转录物水平预期不会以任何方式与肿瘤的严重性相关。因此,参考基因为通常以类似水平在癌性和正常乳腺组织细胞中表达的那些基因。参考基因的实例为所谓“管家基因”,诸如GUS、ACTB、 GAPDH、RPLPO和TFRC。
“盒”是指含有用于处理样品的试剂(诸如用于扩增RNA转录物的引物)和/或用于检测来自样品的RNA转录物水平的其他试剂的物理结构。在一些实施方案中,反应诸如热循环和样品处理诸如RNA提取可以在盒内发生。
盒内所包括的“孔”可以是腔室、缺口、特定表面或其他类型的特定区域,其可保持特定试剂诸如用于在盒的限定区域内执行PCR和/ 或其他化学反应的引物和/或探针。盒和孔不需要具有任何特定形状或由任何特定材料制成,而仅充当能够检测样品中的特定基因的 RNA转录物水平的物理结构。
如果分子以一些方式物理地限定于特定孔中,则分子“附接”至本文的孔中。分子诸如引物或探针或检测试剂出于将分子限定在特定孔内的目的可以例如共价(诸如在5’端)或非共价“附接”至孔。例如,分子可以通过多种方式,诸如通过共价接头或者可替代地通过与喷墨印刷中所用的方法类似的点样方法附接。另外,分子可以通过将包含所述分子的溶液点样到孔的表面上并且然后干燥所述溶液来非共价附接至孔,从而使所述分子粘附至所述孔。分子也可以通过直接将分子共价或非共价附接至表面或芯片或其他部件来“附接”至孔,所述其他部件进而本身局限于所述孔中。例如,适用于将DNA附接至阵列或芯片或珠粒的技术可在此用于将DNA或其他分子附接至孔。
扩增子可以使用多种“检测试剂”来检测。检测试剂包括例如允许将来自特定RNA转录物的特定扩增子与来自例如可在盒的同一孔内扩增的其他RNA转录物的其他特定扩增子区分开的试剂。例如,检测试剂可包括使得扩增子具有特定荧光颜色或波长或者涉及其他类型的颜色或磷光染料的试剂。
额外定义被包括在以下部分中。
用于确定RNA转录物的表达水平的方法
基因的RNA转录物的表达水平在本文中可以在盒和***中例如通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,例如定量逆转录PCR (qRT-PCR)来获得。(参见例如美国专利号7,587,279)。例如,本文中的盒、***、试剂盒和组合物可以使用与本文中的基因之一的RNA转录物的靶序列互补的引物并且引物可以被设计来测量全长mRNA 转录物以及来自所讨论的基因的片段化mRNA转录物或未剪接 mRNA转录物。RNA转录物可以用适当的聚合酶逆转录以获得cDNA 产物。
在一些实施方案中,用于RT-PCR扩增的引物可以被设计为对于基因的RNA转录物具有特异性以扩增基因组DNA。例如,引物可以覆盖基因的两个外显子之间的接合部,使得它们包括基因的基因组 DNA中未找到的总体序列。
逆转录PCR(RT-PCR)
通常,mRNA从测试样品中分离,尽管在一些实施方案中盒能够直接应用于尚未分离RNA的样品。用于mRNA提取的一般方法为本领域中已知的并且在分子生物学的标准教科书中公开,包括Ausubel 等人,Current Protocols of Molecular Biology,John Wileyand Sons (1997)。用于从石蜡包埋组织进行RNA提取的方法公开于例如Rupp 和Locker,Lab Invest.56:A67(1987)和De Andrés等人,BioTechniques 18:42044(1995)。特别地,可根据制造商的说明书,使用来自商业制造商的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶来进行RNA分离。例如,总 RNA可以使用Qiagen微型柱来分离。其他可商购获得的 RNA分离试剂盒包含MasterPureTM完全DNA和RNA纯化试剂盒 (Madison,WI)和石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion, Inc.)。来自组织样品的总RNA可以使用RNA Stat-60(Tel-Test)分离。由肿瘤制备的RNA可以例如通过氯化铯密度梯度离心法分离。
然后使含有RNA的样品经历逆转录以由RNA模板产生cDNA,随后在PCR反应中进行指数扩增。两种常用的逆转录酶是avilo成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 (MMLV-RT)或这些分子被工程化用于商业用途的变体。逆转录酶的各种商业制剂也为可用的或者可作为试剂盒的一部分销售。逆转录步骤通常使用特异性引物、随机六聚体或oligo-dT引物引发,这取决于环境和表达谱分析的目标。例如,提取的RNA可使用供应至本文中的盒的引物所位于的孔中的试剂来逆转录。或者,PCR试剂可以使用样品引入,即在样品溶液内。在一些实施方案中,一些RT-PCR试剂可以附接至盒的孔,而其他试剂可以提供有样品溶液,使得酶促反应在样品引入到孔中之前不会发生。试剂组诸如本文中的组合物或来自试剂盒诸如RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer,CA,USA)或另一种商业试剂盒的试剂可在适当时使用。
基于PCR的方法使用用于扩增cDNA的热稳定性DNA依赖性 DNA聚合酶,诸如TaqDNA聚合酶。例如,PCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5'-核酸酶活性来水解与其靶扩增子结合的杂交探针,但也可使用具有等效5'核酸酶活性的任何酶。使用两种寡核苷酸引物(例如附接至本文中的盒的孔的引物)来生成PCR反应产物所特有的扩增子。第三寡核苷酸或探针可以被设计来便于检测位于两个PCR引物的杂交位点之间的扩增子的核苷酸序列。探针可以在PCR 之前或期间添加到孔中,并且可以作为检测试剂包括在内。例如,探针可以例如用报告基因染料可检测地标记,并且可以进一步提供有荧光染料和淬灭剂荧光染料,与在Taqman探针配置中一样。在孔内,用于待扩增的每种RNA转录物的不同探针可以例如使用用于每种转录物序列的独特探针可检测地标记,每种转录物序列使用其本身可区分的染料诸如荧光染料标记。当在扩增反应期间使用Taqman探针时, Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式裂解探针。所得到的探针片段在溶液中解离,并且来自释放的报告染料的信号免于第二荧光团的淬灭作用。对于合成的每个新分子,释放一个报告染料分子,并且未淬灭的报告染料的检测为数据的定量解释提供了基础。
对于检测,5'-核酸酶测定数据通常最初表示为阈值循环(“Ct”)。在每个循环期间记录荧光值并且荧光值代表扩增反应中至那个点的扩增的产物的量。阈值循环(Ct)通常被描述为当荧光信号首先记录为统计学显著的时的时间点。或者,数据可以表示为交叉点(“Cp”)或直接由Cp值计算的值。Cp值通过确定整个qPCR扩增曲线的二阶导数及其最大值来计算。Cp值表示荧光的增加最高时和PCR的对数期开始时的循环。
为了使错误和样品间差异的影响最小化,通常使用内部标准进行 RT-PCR。在一些实施方案中,使用至少一种参考基因的RNA转录物水平作为内部标准。预期本文中的理想参考基因在相同来源的癌性和非癌性组织中以相对恒定的水平(即,在正常和癌性组织中并未显著不同的水平)表达,并且未受到抗癌治疗的显著影响(即,未在相关组织中由于暴露于化学疗法而表现出表达水平的显著差异),并且在从不同患者获得的相同类型的组织样品中以相对恒定的水平表达。例如,适用于本文所公开的盒和***中的参考基因不应从一种癌症患者样品至另一种癌症患者样品表现出显著不同的表达水平。示例性参考基因包括以下基因中的一种或多种:GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO 和TFRC。参考基因可允许对使用特定样品观察到的RNA转录物表达水平进行归一化,使得归一化患者样品中的RNA转录物水平可以与来自其他患者,诸如临床结果已经知道的参考患者的样品中发现的那些水平相比较。归一化可以解释不同样品之间RNA的量以及RNA 的品质的差异,诸如RNA转录物片段化或降解的程度。基因表达测量可以相对于一种或多种(例如2、3、4、5或更多种)参考基因的平均值归一化。参考归一化表达测量的范围可为2至15,其中一个单位的增加通常反映了RNA量的2倍增加。
在一些实施方案中,用于RT-PCR扩增至少一种特定参考基因的 RNA转录物的引物被包括在盒的多个孔中,诸如盒的每个孔中。这允许对同一盒的不同孔之间的RT-PCR反应进行进一步内部归一化,以解释孔与孔之间的反应条件或扩增程度的差异。因此,此进一步归一化解释了扩增来自相同初始患者样品的RNA转录物的孔之间的差异。
本公开的盒和***可使用固定的石蜡包埋的组织样品作为可以提取RNA的RNA来源。例如,可以根据本领域中可用的方法进行 mRNA分离、纯化、引物延长和扩增。(参见例如Godfrey等人J.Molec. Diagnostics 2:84-91(2000);Specht等人,Am.J.Pathol.158:419-29 (2001))。简言之,代表性方法以切割约10μm厚的石蜡包埋的肿瘤组织样品的切片开始。然后通过裂解细胞并使用蛋白酶和DNA酶消耗来自含有RNA的样品的蛋白质和DNA来提取RNA。然后还可以过滤样品以去除微粒,并且任选地将其与适用于后续RT-PCR分析的缓冲溶液混合。因此,可以通过去除微粒、裂解细胞并添加缓冲溶液的方法来使样品液化。任选地,确定RNA浓度。
PCR引物和检测试剂
PCR引物可以基于存在于目标基因的RNA转录物中的外显子或内含子序列来设计。引物设计可以使用可公开获得的软件来进行,诸如由Kent,W.J.,Genome Res.12(4):656-64(2002)开发的DNA BLAT软件或包括其变型的BLAST软件。
在必要或需要时,可以遮蔽靶序列的重复序列以减少非特异性信号。完成此遮蔽的示例性工具包括通过美国贝勒医学院(Baylor College of Medicine)在线可用的Repeat Masker程序,其针对重复元件文库筛选DNA序列并且返回遮蔽重复序列的查询序列。然后可以使用遮蔽的内含子序列来使用任何可商购获得或以其他方式公开获得的引物/探针设计包来设计引物和探针序列,所述引物/探针设计包诸如用于一般使用者和用于生物学家程序员的Primer Express(Applied Biosystems);MGB assay-by-design(Applied Biosystems);Primer3 (Steve Rozen和Helen J.Skaletsky(2000)Primer3 onthe WWW。参见 S.Rawetz,S.Misener,Bioinformatics Methods and Protocols:Methodsin Molecular Biology,第365-386页(Humana Press)。
可影响PCR引物设计的其他因素包括引物长度、熔化温度(Tm) 以及G/C含量、特异性、互补引物序列和3'端序列。一般而言,最佳PCR引物通常为17-30个碱基长度,并且含有约20-80%,诸如约 50-60%G+C碱基,并且表现出在50℃与80℃之间,例如约50℃至 70℃的Tm。
关于用于PCR引物设计的其他指导方针,参见例如Dieffenbach, CW.等人,“General Concepts for PCR Primer Design”in:PCR Primer,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,.New York, 1995,第133-155页;Innis和Gelfand,“Optimization of PCRs”in:PCR Protocols,A Guide to Methods andApplications,CRC Press,London, 1994,第5-11页;和Plasterer,T.N.Primerselect:Primer and probe design.Methods MoI.Biol.70:520-527(1997),所述文献的完整公开内容明确以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中,与目标RNA转录物(或其cDNA)互补的寡核苷酸可以作为检测试剂包括在内。此寡核苷酸在本文中称为“探针”以将其与引物区分开。因此,探针可用作特定基因的检测试剂,例如,在用特定颜色标记来标记时,使得探针在扩增期间并入到基因的RNA转录物的扩增子中。因此,对于一种基因具有特异性的探针将仅并入到该基因的PCR扩增产物中。通过延长,可以用不同的对比颜色,诸如使用荧光染料标记用于每种RNA转录物(意指每种不同基因的RNA转录物)的探针,使得其cDNA在盒的孔中扩增的不同RNA 转录物可以彼此区分开。PCR方法中使用的其他多颜色标记方法也可与本发明兼容。
盒和***
本公开涵盖可用于分析乳腺癌患者中的一组基因(诸如来自乳腺癌组织样品)的RNA转录物的表达水平的盒。盒为包括包含用于确定所述一组基因的RNA转录物水平的一种或多种引物的至少一个孔 (其可构成通道、腔室、区域或表面)的物理结构。在一些实施方案中,一个盒可含有例如三个、四个、五个、六个或更多个不同的孔。所述孔可以分布在盒中,使得每个孔形成可以发生特定化学反应而试剂不会显著溢出孔并溢出到盒的不同孔或不同部分中的位置、空间、腔室或其他区域。因此,孔为允许独立的化学反应或一组化学反应发生的位置。在一些实施方案中,含有多个孔的盒可允许不同反应同时或几乎同时在不同孔中发生,而无反应之间的交叉污染。例如,在一些实施方案中,盒可被配置为允许不同RNA转录物的RT-PCR热循环在盒中同时发生。
在一些实施方案中,盒的孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种。在一些实施方案中,所述盒的孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的 RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、 MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、 HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2 (CEGP1)中的每一种。在一些实施方案中,所述一组基因由SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、 CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、 RPLPO和TFRC中的一种或多种。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括GUS。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括ACTB。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括 GADPH。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括RPLPO。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括TFRC。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和 TFRC中的每一种。在一些实施方案中,至少一种参考基因选自由 GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC组成的组。在一些实施方案中,盒的每个孔包含一种或多种参考基因。
在一些实施方案中,用于RT-PCR扩增RNA转录物的引物附接至盒中的一个或多个孔。例如,它们可以任选地经由接头分子共价附接至孔的表面,诸如在5’端处,或者以其他方式与孔的表面非共价缔合。例如,它们可以诸如通过喷墨技术或类似方法点样在孔的表面上。它们也可以通过共价或非共价附接至本身局限于特定孔的表面(诸如板、芯片或珠粒)来附接至孔。或者,它们可以通过将含有它们的溶液点样到孔的表面上并且然后干燥所述溶液以留下包含引物的残余物来简单非共价粘附至孔。其他溶剂可以类似方式非共价附接至孔。
在一些实施方案中,每个孔可包含用于两种、三种、四种、五种或六种不同基因的引物。从单个孔中分析的基因的RNA转录物的数目可以例如通过在来自可容易通过检测装置区分的每个RNA转录物的扩增子上的不同颜色标记的数目来确定。例如,检测装置可能够区分两种、三种、四种、五种或六种颜色或波长与不同颜色标记。在一些实施方案中,至少一个孔包含用于确定一种或多种参考基因的 RNA转录物水平的至少一种引物。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的一种或多种。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括GUS。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括ACTB。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括GADPH。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括RPLPO。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括TFRC。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、 ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的每一种。在一些实施方案中,至少一种参考基因选自由GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC 组成的组。
在一些实施方案中,盒还包含扩增试剂,诸如缓冲液、核苷酸三磷酸酯(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP;或者rATP、rCTP、rGTP 和rUTP)、逆转录酶、DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。在一些实施方案中,试剂诸如dNTP和酶可以非共价附接至孔或者在样品分析程序期间加入孔中,或者作为样品溶液的一部分添加。在一些实施方案中,盒还包含其他溶剂,诸如缓冲液和检测试剂。在一些实施方案中,PCR 试剂、缓冲液和检测试剂诸如用于经由PCR检测扩增子的有色探针 (例如经由将有色探针并入扩增子)可以在样品分析程序期间添加到盒孔中或者作为样品溶液的一部分添加。或者,它们可以非共价附接至孔。
在一些实施方案中,盒为包括将来自样品的RNA以及不同试剂引入到盒的孔中的一种或多种部件的***的一部分。在一些实施方案中,从样品中提取RNA并且将所提取的RNA应用至所述盒。在一些实施方案中,在盒外部进行提取和洗涤并且然后将处理的RNA应用至盒。在其他实施方案中,不需要提取步骤并且样品直接应用于盒。样品盒结构和包括盒的相关检测装置和***描述于国际公布号 WO2006/136990及其相关美国专利号9,568,424中。
在一些实施方案中,盒包括包含发生热循环的引物的孔以及用于预处理和/或引入样品,例如用于保持待分布到孔中的样品和/或用于执行裂解、微粒过滤或蛋白质和DNA从样品中去除和/或将样品置于用于RT-PCR的适当缓冲溶液中的一个或多个额外孔或腔室。在一些实施方案中,总体盒结构还包括泵、阀门、处理孔以及流体和废物储器,这允许进行样品处理和RT-PCR反应以及RNA转录物水平在盒中的相关检测。
本发明还包括有包括本文所述的盒和适用于检测对应于待分析的每种基因的RNA转录物水平(即扩增子水平)的检测装置的***。检测装置包括能够例如由检测扩增反应期间来自RNA转录物的扩增子的荧光强度或其他颜色强度来确定标记的RNA转录物的表达水平的任何类型的机械装置。因此,检测装置可以检测扩增子并区分不同的颜色或荧光标记,以便区分正在盒的孔内扩增的不同RNA转录物 (即来自不同基因)。
在一些***中,盒和检测***可以被设计来使得盒的适当孔中的扩增子水平直接由检测装置“读取”。在一些实施方案中,***还可涵盖用于在盒内进行RT-PCR反应、洗涤步骤和/或样品处理步骤并且诸如通过自动化程序由检测器读取扩增子水平的自动化装置。因此,***可被设计来最小化使用者的手动步骤或甚至消除使用者的手动步骤。
检测装置可以连接至基于计算机的***或包括所述***的一部分,所述***例如为检测来自每种RNA转录物的标记的扩增子并且任选地还在盒中控制并进行RT-PCR反应、洗涤步骤和/或样品处理步骤。基于计算机的***通常包括用于分析信息的硬件、软件和数据存储介质(诸如中央处理单元(CPU))以及用于数据输入、数据输出(例如显示器)和数据存储的硬件。
在一些实施方案中,***还包括能够确定基因的不同RNA转录物的扩增子水平并且任选地使用参考基因确定所述一组基因的归一化扩增子水平以及任选地将盒中一个孔至其他孔的扩增子水平归一化并且进一步任选地由那些水平计算任何相关数学评分或结果,诸如基于所测得基因的特定子组的RNA转录物水平的基因群值或基于所有RNA转录物的表达数据的定量评分(QS)的***。在一些实施方案中,***进一步能够比较给定患者样品的数学评分或值与从具有一系列先前已知结果的乳腺癌患者获得的样品的数学评分或值,以例如基于潜在基因表达水平来确定受试者的复发风险和/或预防对治疗诸如化学疗法反应的可能性。在一些实施方案中,***还能够创建相关报告,其可用于通知受试者和受试者的临床医师复发风险和对治疗诸如化学疗法反应的可能性。在一些实施方案中,例如乳腺癌患者的QS 或一个或多个基因群值提供了关于患者癌症复发可能性和/或患者对治疗诸如化学疗法反应的可能性的信息。
在一些实施方案中,***包括能够基于所有测得的RNA转录物的水平确定乳腺癌患者的定量评分以及分析的RNA转录物的子组的特定基因群值的***。例如,本文中的***可能够确定乳腺癌患者的基因群值和总体定量评分(QS),如S.Paik等人,NewEngl.J.Med.351: 2817-26(2004)所述(参见Paik等人的图1)。
例如,本文中的***可包括能够由以下等式确定QS和相关基因群值的软件(参见Paik图1),其中每个基因名称为相关基因的归一化 RNA转录物水平(例如归一化扩增子水平)。归一化RNA转录物水平通过针对一种或多种参考基因的RNA转录物水平调节目标基因的 RNA转录物水平来获得。任选地,RNA转录物水平可针对RT-PCR 扩增中孔与孔的差异进行进一步归一化。此类孔与孔的差异可通过在每个孔中包括用于特定一种或多种参考基因的引物并且然后使用所得RNA转录物水平作为调节其他基因的RNA转录物水平的基础来确定。
在一些实施方案中,QS和基因群值可通过将某些基因聚集在一起并确定基因群评分来获得。某些基因可以例如基于类似功能或共有生物途径或共表达以及在针对一种或多种参考基因表达水平归一化之后获得的总体表达水平来聚集在一起。通常,基因群评分被计算为每种基因的表达水平之和乘以系数。系数可以反映例如每种基因对癌症复发的相对共享。在一些情况下,可使用阈值,使得在实际评分小于或等于特定值或者大于或等于该特定值等时基因群评分设定在该特定值下。(关于示例性基因群和基因群评分的进一步描述,参见例如WO2005/008213和S.Paik等人,New Engl.J.Med.351:2817-26 (2004)。)
例如,基因GRB7和HER2(ERBB2)可以聚集在一起并且在施用参考基因中的一种或多种作为标准进行归一化之后获得其总体表达水平。基因ER、PGR、BCL2和SCUBE2(CEGP1)或那些基因的子组也可以聚集在一起以确定基因群评分。基因SURV(BIRC5)、Ki67、 MYBL2、CCNB1和STK15或那些基因的子组可以聚集在一起。基因CTSL2和MMP11(STMY3或STY3)也可以聚集在一起。然后可以合并来自两个或更多个基因群的评分以基于***中评定的基因产生定量评分(QS)。基因群评分和定量评分也可以定标,例如以1-10或 1-100或0-10或0-100的标度,以便使其更容易被患者和医生使用。使用定标或未定标评分,患者也可以例如基于其评分来分成关于癌症复发风险的某些类别(例如低风险、中等风险、高风险等)。
因此,在一些实施方案中,本文中的***包括能够给予RNA表达水平数据确定患者样品的基因群评分和/或定量评分的软件。在一些实施方案中,软件还能够基于数据生成包括患者的适当评分和/或风险组的报告。
因此可以使用本文中的***、由使用所述***生成的报告以及相关产品诸如试剂盒来例如确定乳腺癌患者的复发风险和/或预防对治疗诸如化学疗法诸如辅助和/或非辅助化学疗法反应的可能性。例如,由本文中的***确定的低QS或定标QS可以指示乳腺癌患者可以使用手术治疗且在手术后无需辅助化学疗法。相比之下,高QS或定标 QS可以指示乳腺癌患者应在手术后接受辅助化学疗法。
本公开的盒和***可以为医院基于所述基因对乳腺癌患者进行测试提供大大增强的便利性,因为医院可以在自己的地点运行测试,而不必将样品运送至外部实验室,例如在另一个城市或国家,并等待结果。
与使用传统RT-PCR设备和方案的不同测试地点相比,使用本公开的盒和***可以改善总体灵敏度和不同测试地点之间的结果一致性,因为能精确地制造盒,使得例如盒具有大致相同的尺寸和大致相同的试剂和引物附接水平,而且能设计***,从而为反应和检测运行相同的软件程序。
试剂盒和组合物
本公开在本文中还涵盖可与以上盒和***结合使用的试剂盒。试剂盒可包括盒和用于由乳腺癌患者样品扩增RNA的试剂和/或用于制备用以本文所述的盒和***中的样品的试剂。
例如,本文中的试剂盒可包括一个或多个盒以及用于对基因进行 RT-PCR的一种或多种试剂,诸如核糖核苷酸三磷酸酯(rATP、rUTP、 rGTP和rCTP)、脱氧核糖核酸三磷酸酯(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)、反应缓冲液以及类似物。在一些实施方案中,试剂盒还可包括用于进行RT-PCR的一种或多种酶,例如逆转录酶和DNA聚合酶。在一些实施方案中,试剂盒可包括适用于检测来自盒的孔中进行的PCR反应的RNA转录物水平(即扩增子水平)的检测试剂,在所述孔中与不同基因相关的扩增序列被标记以便可彼此区分,诸如用不同颜色或波长标记来标记。在一些实施方案中,检测试剂为任选地并入到RNA 转录物的扩增子中的标记探针寡核苷酸。或者,在一些实施方案中,以上RT-PCR试剂或检测试剂中的一种或多种可已经包括在盒内,使得不必将它单独供应在试剂盒内。
在其他示例性实施方案中,试剂盒可包括一个或多个如本文所述的盒加上用于制备引入到盒中的样品的试剂。例如,试剂盒可包含用于裂解细胞的试剂和/或消化蛋白质和/或DNA以便从组织样品提取RNA的酶。在一些情况下,试剂可包括溶解处理的样品的缓冲液,其与待在盒中进行的RT-PCR反应相容。例如,缓冲液可在用于反应发生的适当pH下并且可包含其他必要的RT-PCR试剂,诸如dNTP 或酶。
本公开还包括包含用于RT-PCR扩增来自本文中的几组基因以及参考基因的RNA转录物的引物的组合物。在一些实施方案中,组合物包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、 BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2) 中的每一种。在一些实施方案中,组合物包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括 SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、 MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、 CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种。在一些实施方案中,所述一组基因由SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、 PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、 GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的一种或多种。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括GUS。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括ACTB。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括GADPH。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括RPLPO。在一些实施方案中,所述至少一种参考基因包括TFRC。在一些实施方案中,至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的每一种。在一些实施方案中,至少一种参考基因选自由GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC组成的组。
本文中的组合物可以用于例如制备用于对本文中的基因的RNA 转录物水平进行分析的盒。例如,来自组合物的用于一种或多种基因 (诸如两种、三种、四种、五种或六种基因)的引物可以在使用盒之前附接至盒的孔。在一些实施方案中,本文中的组合物还可包含用于进行RT-PCR的一种或多种酶,例如逆转录酶和DNA聚合酶。在一些实施方案中,组合物可包含适用于检测来自盒的孔中进行的PCR反应的RNA转录物水平(即扩增子水平)的检测试剂,在所述孔中与不同基因相关的扩增序列被标记以便可彼此区分,诸如用不同颜色或波长标记来标记。在一些实施方案中,检测试剂为任选地并入到RNA 转录物的扩增子中的标记探针寡核苷酸。
本公开涉及下述实施方案。
1.一种包括孔的盒,其中所述孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括 SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、 MMP11(STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种,其中每种引物附接至所述盒的孔,并且其中所述盒被配置用于对每种所述RNA 转录物执行RT-PCR扩增。
2.如实施方案1所述的盒,其中所述孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、 MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、 CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种。
3.如实施方案2所述的盒,其中所述一组基因由SURV(BIRC5)、 CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、 GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和 SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。
4.如实施方案1-3中任一项所述的盒,其中所述至少一种参考基因包括GUS。
5.如实施方案1-3中任一项所述的盒,其中所述至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的一种或多种。
6.如实施方案5所述的盒,其中所述至少一种参考基因选自由 GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC组成的组。
7.如实施方案1-6中任一项所述的盒,其中用于RT-PCR扩增一种特定参考基因的RNA转录物的引物被包含在每一个所述孔中,这允许将每个孔中的所述特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。
8.如实施方案1-7中任一项所述的盒,其中所述盒包括至少四个孔,其中每个孔包含用于RT-PCR扩增所述一组基因中的至少三种、四种或五种基因以及至少一种参考基因的RNA转录物的引物。
9.如实施方案8所述的盒,其中所述盒包括四个或五个孔,并且每个孔包含用于RT-PCR扩增所述一组基因中的三种、四种或五种基因以及一种或两种参考基因的RNA转录物的引物。
10.如实施方案8或9所述的盒,其中所述一组基因和至少一种参考基因的扩增子用不多于六种不同的颜色标记。
11.如实施方案2-10中任一项所述的盒,其中所述盒包括五个孔,每个孔包含用于RT-PCR扩增以下中的三种或四种的RNA转录物的引物:SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、 BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、 GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1),并且每个孔还包含用于扩增一种或两种参考基因的RNA转录物的引物。
12.如实施方案11所述的盒,其中每个孔包含用于RT-PCR扩增选自GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC的至少一种特定参考基因的RNA转录物的引物,从而允许将每个孔中的所述特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。
13.如实施方案1-12中任一项所述的盒,其中每个孔还包含以下 RT-PCR试剂中的至少一种:(a)dNTP;(b)逆转录酶;以及(c)DNA聚合酶。
14.如实施方案1-13中任一项所述的盒,其中所述引物非共价附接至所述孔的表面。
15.如实施方案14所述的盒,其中所述引物通过一种方法附接至所述孔,所述方法包括使所述孔的表面与包含所述引物的溶液接触以及干燥所述溶液。
16.如实施方案15所述的盒,其中所述引物和RT-PCR试剂通过一种方法附接至所述孔,所述方法包括使所述孔的表面与包含所述引物和试剂的溶液接触以及干燥所述溶液。
17.如实施方案1-16中任一项所述的盒,其中所述盒还包括用于将待通过RT-PCR分析的包含RNA的样品保持在所述盒内的腔室。
18.一种用于分析乳腺癌患者中的基因表达的***,所述***包括:(a)包括孔的盒,其中所述孔包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种,其中每种引物附接至所述盒的孔,并且其中所述盒被配置用于对每种所述RNA转录物执行RT-PCR扩增;并且还包括(b)用于检测来自每种RNA转录物的扩增子的检测装置。
19.如实施方案18所述的***,其中所述盒的所述孔包含用于 RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、 PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、 GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种。
20.如实施方案18所述的***,其中所述一组基因由SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、 CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。
21.如实施方案18-20中任一项所述的***,其中所述至少一种参考基因包括GUS。
22.如实施方案18-20中任一项所述的***,其中所述至少一种参考基因包括GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的一种或多种。
23.如实施方案22所述的***,其中所述至少一种参考基因选自由GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC组成的组。
24.如实施方案18-23中任一项所述的***,其中用于RT-PCR 扩增一种特定参考基因的RNA转录物的引物被包含在每一个所述孔中,这允许将每个孔中的所述特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。
25.如实施方案18-24中任一项所述的***,其中所述盒包括至少四个孔,其中每个孔包含用于RT-PCR扩增所述一组基因中的至少三种、四种或五种基因以及至少一种参考基因的RNA转录物的引物。
26.如实施方案25所述的***,其中所述盒包括四个或五个孔,并且每个孔包含用于RT-PCR扩增所述一组基因中的三种、四种或五种基因以及一种或两种参考基因的RNA转录物的引物。
27.如实施方案25或26所述的***,其中所述一组基因和至少一种参考基因的所述扩增子用不多于六种不同的颜色标记。
28.如实施方案18-27中任一项所述的***,其中所述盒包括五个孔,每个孔包含用于RT-PCR扩增以下中的三种或四种的RNA转录物的引物:SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、 GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1),并且每个孔还包含用于扩增一种或两种参考基因的RNA转录物的引物。
29.如实施方案18-28中任一项所述的***,其中每个孔包含用于RT-PCR扩增选自GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC的一种特定参考基因的RNA转录物的引物,从而允许将每个孔中的所述特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。
30.如实施方案18-29中任一项所述的***,其中所述盒的每个孔还包含以下RT-PCR试剂中的至少一种:(a)dNTP;(b)逆转录酶;以及(c)DNA聚合酶。
31.如实施方案18-30中任一项所述的***,其中所述引物非共价附接至所述盒的所述孔的表面。
32.如实施方案31所述的***,其中所述引物通过一种方法附接至所述盒的所述孔,所述方法包括使所述孔的表面与包含所述引物的溶液接触以及干燥所述溶液。
33.如实施方案32所述的***,其中所述引物和RT-PCR试剂通过一种方法附接至所述盒的所述孔,所述方法包括使所述孔的表面与包含所述引物和试剂的溶液接触以及干燥所述溶液。
34.如实施方案18-33中任一项所述的***,其中所述盒还包括用于将待通过RT-PCR分析的包含RNA的样品保持在所述盒内的腔室。
35.如实施方案18-34中任一项所述的***,其中所述***还包括(c)用于定量来自每种RNA转录物的扩增子水平的软件。
36.如实施方案35所述的***,其中所述软件能够由扩增子确定归一化RNA转录物水平、计算基因群值、计算定量评分(QS)和/ 或计算定标的QS。
37.一种试剂盒,其包含如实施方案1-17中任一项所述的盒并且还包含用于RT-PCR扩增所述RNA转录物和/或用于制备待在所述盒中分析的样品的试剂。
38.如实施方案37所述的试剂盒,其包含反应缓冲液,其中所述反应缓冲液包含盐和用于保持pH的至少一种缓冲剂。
39.如实施方案37所述的试剂盒,其包含用于RT-PCR扩增的试剂,其中所述试剂包含(a)脱氧核糖核苷酸三磷酸酯dTTP、dATP、 dGTP和dCTP和/或(b)用于对所述引物进行RT-PCR扩增的至少一种反应缓冲液。
40.如实施方案39所述的试剂盒,其还包含至少一种逆转录酶和/或至少一种DNA聚合酶。
41.如实施方案37-40中任一项所述的试剂盒,其还包括至少一种检测试剂。
42.如实施方案41所述的试剂盒,其中所述至少一种检测试剂包括用于检测每种RNA转录物的扩增子的一组标记探针,其中对应于给定基因的RNA转录物的探针用一种颜色或荧光标记来标记,所述颜色或荧光标记可与存在于对应于同一孔中扩增的其他基因的RNA转录物的探针上的标记区分开。
43.如实施方案37-42中任一项所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含用于制备样品的试剂。
44.如实施方案43所述的试剂盒,其包含用于从固定的蜡包埋的组织样品提取RNA的试剂。
45.如实施方案44所述的试剂盒,其包含用于细胞裂解和DNA 去除的试剂。
46.一种组合物,其包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、 CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、 GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种。
47.一种组合物,其包含用于RT-PCR扩增一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物,所述一组基因包括SURV(BIRC5)、 CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、 GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和 SCUBE2(CEGP1)中的每一种。
48.如实施方案47所述的组合物,其中所述一组基因由SURV (BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11 (STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、 CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种以及至少一种参考基因组成。
49.如实施方案46-48中任一项所述的组合物,其还包含用于 RT-PCR扩增所述RNA转录物的试剂。
50.如实施方案49所述的组合物,其中所述试剂包含(a)脱氧核糖核苷酸三磷酸酯dTTP、dATP、dGTP和dCTP和/或(b)用于对所述引物进行RT-PCR扩增的至少一种反应缓冲液。
51.如实施方案46-50中任一项所述的组合物,其还包含至少一种逆转录酶和/或至少一种DNA聚合酶。
52.如实施方案46-51中任一项所述的组合物,其还包含至少一种检测试剂。
53.如实施方案52所述的组合物,其中所述至少一种检测试剂包括用于检测每种RNA转录物的扩增子的一组标记探针,其中对应于给定基因的RNA转录物的探针用一种颜色或荧光标记来标记,所述颜色或荧光标记可与存在于对应于预期在盒的同一孔中扩增的其他基因的RNA转录物的探针上的标记区分开。
54.一种确定来自乳腺癌患者的肿瘤样品中的一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的表达水平的方法,所述一组基因包括 SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、 MMP11(STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种,所述方法包括:(a)将所述样品添加到根据实施方案1-17中任一项所述的盒中, (b)在所述盒中对所述样品执行RT-PCR以形成所述基因的每种所述 RNA转录物的扩增子,(c)检测通过所述RT-PCR反应产生的所述扩增子的水平。
55.如实施方案54所述的方法,其中所述方法在如实施方案 18-36中任一项所述的***中进行。
56.如实施方案54或55所述的方法,其中所述肿瘤样品为先前已液化并处理来裂解细胞并消化DNA的固定的蜡包埋的样品。
57.如实施方案54-56中任一项所述的方法,其中所述扩增子水平使用检测试剂检测,所述检测试剂包括用于检测每种RNA转录物的扩增子的一组标记探针,其中对应于给定基因的RNA转录物的探针用一种颜色或荧光标记来标记,所述颜色或荧光标记可与存在于对应于所述盒的同一孔中扩增的其他基因的RNA转录物的探针上的标记区分开。
Claims (17)
1.一种用于分析乳腺癌患者中的基因表达的盒,其包括附接有用于RT-PCR扩增包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7和HER2(ERBB2)中的每一种的一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物的孔,并且其中所述盒被配置用于对每种所述RNA转录物执行RT-PCR扩增。
2.如权利要求1所述的盒,其包括附接有用于RT-PCR扩增包括SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种的一组基因和至少一种参考基因的RNA转录物的引物的孔。
3.如权利要求2所述的盒,其包括附接有用于RT-PCR扩增由SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的每一种组成的所述一组基因以及至少一种参考基因的RNA转录物的引物的孔。
4.如权利要求1所述的盒,其包括附接有用于RT-PCR扩增所述至少一种参考基因所包括的GUS的RNA转录物的引物的孔。
5.如权利要求1所述的盒,其包括附接有用于RT-PCR扩增所述至少一种参考基因所包括的GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC中的一种或多种的RNA转录物的引物的孔。
6.如权利要求5所述的盒,其包括附接有用于RT-PCR扩增选自由GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC组成的组的所述至少一种参考基因的RNA转录物的引物的孔。
7.如权利要求1所述的盒,其包括每一个均附接有用于RT-PCR扩增一种特定参考基因的RNA转录物的引物的所述孔,这允许将每个孔中的所述特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。
8.如权利要求1所述的盒,其中所述盒包括至少四个,其中每个附接有用于RT-PCR扩增所述一组基因中的至少三种、四种或五种基因以及至少一种参考基因的RNA转录物的引物的孔。
9.如权利要求8所述的盒,其中所述盒包括四个或五个,其中每个附接有用于RT-PCR扩增所述一组基因中的三种、四种或五种基因以及一种或两种参考基因的RNA转录物的引物的孔。
10.如权利要求8所述的盒,其中所述盒还包括用于将包含针对所述一组基因和至少一种参考基因的扩增子、用不多于六种不同的颜色标记的探针的溶液保持在所述盒内的腔室。
11.如权利要求2所述的盒,其中所述盒包括五个,每个附接有用于RT-PCR扩增SURV(BIRC5)、CCNB1、MYBL2、BAG1、ESR1、PGR、BCL2、MMP11(STMY3)、GRB7、HER2(ERBB2)、Ki67、STK15、GSTM1、CD68、CSL2和SCUBE2(CEGP1)中的三种或四种的RNA转录物的引物,并且每个还附接有用于扩增一种或两种参考基因的RNA转录物的引物的孔。
12.如权利要求11所述的盒,其包括每个均附接有用于RT-PCR扩增选自GUS、ACTB、GAPDH、RPLPO和TFRC的至少一种特定参考基因的RNA转录物的引物的孔,从而允许将每个孔中的所述特定参考基因的扩增子的水平与每个其他孔中的扩增子的水平相比较。
13.如权利要求1所述的盒,其包括每个还附接有(a)dNTP;(b)逆转录酶;以及(c)DNA聚合酶中的至少一种的孔。
14.如权利要求1所述的盒,其包括所述引物非共价附接至所述孔的表面的所述孔。
15.如权利要求14所述的盒,其中所述盒还包括用于将包含所述引物的溶液保持在所述盒内的腔室及连通所述孔与所述腔室的通道,容许使所述孔的表面与包含所述引物的溶液接触。
16.如权利要求15所述的盒,其中所述盒还包括用于将包含所述引物和RT-PCR试剂的溶液保持在所述盒内的腔室及连通所述孔与所述腔室的通道,容许使所述孔的表面与包含所述引物和试剂的溶液接触。
17.如权利要求1所述的盒,其中所述盒还包括用于将待通过RT-PCR分析的包含RNA的样品保持在所述盒内的腔室。
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