CN210765350U - 一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,包括单细胞分选层和细胞培养层,单细胞分选层上粘接有细胞培养层,单细胞分选层包括至少一组细胞捕获阵列、细胞悬浮液入口和细胞悬浮液出口,每组细胞捕获阵列包括至少三列微阵列,每列微阵列包括并列排布单细胞捕获单元,单细胞捕获单元包括两个微结构,两个微结构之间形成筛选槽,筛选槽的两端分别形成用于捕获细胞的第一孔隙和第二孔隙,第一孔隙的宽度比第二孔隙的宽度大2μm;细胞培养层开设有培养槽,培养槽与单细胞捕获单元对应。本实用新型的芯片具有操作简单快捷、低消耗的特点,能够广泛应用于多种平行高通量与多重复式单细胞操作与分析应用。
Description
技术领域
本实用新型属于细胞生物学及微流控芯片技术领域,具体涉及一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片。
背景技术
目前,基于单细胞水平的研究和分析被广泛的应用于生物研究以及临床检测中并成长为一门新兴的分析方法和检测平台。微流控芯片技术是本世纪刚刚兴起的一种微型操作与分析方法。其创制之初就显示了极强的单细胞操作和分析潜力。迄今为止,基于微流控芯片的单细胞捕获与操作方法主要包括了:微结构过滤、水流动力学操作、磁操作、光操作、电场操作以及声学操作等。其中,基于微结构过滤方法进行单细胞捕获与长期培养的方法,因其原理简单,操作快捷、能够开展实时高通量且无需辅助其它仪器等优势,得到了广泛的应用和发展。然而,目前基于微结构单元(例如:微坝和微孔) 的芯片由于受到本身原理的限制很难进行长期培养的研究。而基于细胞长期培养的检测(如:干细胞培养、药物筛选等)则被迫无法进行。这样不仅造成了对捕获细胞的浪费,同时在很大程度上也限制了所捕获单细胞的后期试验研究范围。
实用新型内容
本实用新型的目的是提供一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,通过设计一种复杂的微过滤结构实现单个不同大小和变形性单细胞的捕获,进而通过与微孔结构的结合实现被捕获单细胞的长期培养与后续的检测,解决了现有微滤结构的细胞芯片功能单一,无法进行后期细胞培养造成捕获单细胞浪费的问题。
本实用新型所采用的技术方案是,一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,包括单细胞分选层、细胞培养层和嵌入在单细胞分选层中的管路,单细胞分选层上粘接有细胞培养层,单细胞分选层包括至少一组细胞捕获阵列、一个细胞悬浮液入口和多个细胞悬浮液出口,每组细胞捕获阵列通过管路连通细胞悬浮液入口和多个细胞悬浮液出口,每组细胞捕获阵列包括至少三列微阵列,每列微阵列包括并列排布的多个单细胞捕获单元,每个单细胞捕获单元包括两个H型微结构,两个H型微结构之间形成用于细胞筛选的筛选槽,筛选槽的两端分别形成用于捕获细胞的第一孔隙和第二孔隙,第一孔隙的宽度比第二孔隙的宽度大1μm~2μm;
细胞培养层上间隔均匀开设有用于培养细胞的多个相互独立的培养槽,培养槽呈阵列排布,每个培养槽与单细胞捕获单元一一对应。
本实用新型的其他特点还在于,
优选的,相邻两列微阵列的间距为50μm。
优选的,每个H型微结构的截面呈中部径向收缩的矩形,每个H型微结构的长度为200μm~300μm,每个H型微结构的矩形两端宽为120μm,中部收缩处的宽为90μm。
优选的,筛选槽中间宽两边窄,筛选槽的长度为100μm~150μm,中间最宽处的宽度为40μm~60μm,筛选槽的高度与管路的高度相同,筛选槽的高度为18μm~28μm。
优选的,单细胞分选层位于细胞捕获阵列的两侧设置有多个微柱,每个微柱之间的距离为25μm~50μm,用于防止管路塌陷。
优选的,每个培养槽的长度为80μm~120μm,宽度为80μm~120μm,高度为70μm~100μm。
优选的,位于列同一列微阵列的第一孔隙的尺寸和第二孔隙的尺寸恒定不变,位于相邻两列微阵列的第一孔隙的尺寸相差2μm,位于相邻两列微阵列的第二孔隙的尺寸相差2μm。
本实用新型的有益效果是,一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,通过设计单细胞分选层和细胞培养层,在单细胞分选层中设计了阵列结构的细胞捕获单元,培养层中设计了阵列式的培养槽,各培养槽之间相互独立,实现连续完成单细胞的捕获、培养和后续的检测操作。相对于以往微流控芯片内的微结构捕获单细胞的操作,其可以进行不同大小和变形性单细胞的捕获与长期培养,能够广泛应用于多种平行高通量与多重复式单细胞操作与分析应用。
附图说明
图1是本实用新型的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片的整体结构示意图;
图2本实用新型的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片中细胞捕获阵列的俯视图;
图3是本实用新型的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片中微结构横截面示意图;
图4是本实用新型的微控芯片侧面结构的表述的操作方法流程示意图;
图5是实施例1中在微控芯片中灌入具有不同大小和变形性的肿瘤细胞;其中,图5A为Normal U251细胞在微结构阵列中分布的白光图和荧光图,图5B为Induced U251细胞在微结构阵列中分布的白光图和荧光图;
图6是实施例1中在微控芯片中灌入具有不同大小和变形性的Normal U251细胞和Induced U251细胞在微结构中的分布统计图;其中,图6A为 Normal U251细胞和InducedU251细胞在微结构中的百分比分布统计图;图 6B为Normal U251细胞和Induced U251细胞在微结构中的数量统计图;图中显示微结构尺寸为单细胞分选层细胞捕获微单元第二孔隙的大小;
图7实施例1的不同微结构中单个细胞形成肿瘤球的白光图;其中,图上方的数字代表相邻微结构之间的孔隙中的大小;图7A为Normal U251细胞的白光图;图7B InducedU251细胞的白光图;图中显示微结构尺寸为单细胞分选层细胞捕获微单元第二孔隙的大小;
图8为实施例1中Normal U251细胞和Induced U251细胞在微结构中单细胞源肿瘤球的成球率;
图9为实施例1中Normal U251细胞和Induced U251细胞在微结构中单细胞源肿瘤球的大小;
图10A为不同大小和变形性单个肿瘤在微结构中形成肿瘤球形成的成球率;图中显示微结构尺寸为单细胞分选层细胞捕获微单元第二孔隙的大小;
图10B为不同大小和变形性单个肿瘤在微结构中形成肿瘤球形成的肿瘤球的大小;图中显示微结构尺寸为单细胞分选层细胞捕获微单元第二孔隙的大小。
图中,1.单细胞分选层,2.细胞培养层,3.管路,4.细胞捕获阵列,5.微阵列,6.筛选槽,7.单细胞捕获单元,8.H型微结构,9.培养槽,10.第一孔隙, 11.第二孔隙。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本实用新型进行详细说明。
本实用新型的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,如图1、图2和图3所示,包括单细胞分选层1、细胞培养层2和嵌入在单细胞分选层1中的管路3,单细胞分选层1上粘接有细胞培养层2,单细胞分选层1 包括至少一组细胞捕获阵列4、一个细胞悬浮液入口和多个细胞悬浮液出口,每组细胞捕获阵列4通过管路3连通细胞悬浮液入口和多个细胞悬浮液出口,每组细胞捕获阵列4包括至少三列微阵列5,每列微阵列5包括并列排布的多个单细胞捕获单元7,每个单细胞捕获单元7包括两个H型微结构8,两个H型微结构8之间形成用于细胞筛选的筛选槽6,筛选槽6的两端分别形成用于捕获细胞的第一孔隙10和第二孔隙11,第一孔隙10的宽度比第二孔隙11的宽度大1μm~2μm;
细胞培养层2上间隔均匀开设有用于培养细胞的多个相互独立的培养槽 9,培养槽9呈阵列排布,每个培养槽9与单细胞捕获单元7一一对应。
相邻两列微阵列5的间距为50μm。
每个H型微结构8的截面呈中部径向收缩的矩形,每个H型微结构8 的长度为200μm~300μm,每个H型微结构8的矩形两端宽为120μm,中部收缩处的宽为90μm。
筛选槽6中间宽两边窄,筛选槽6的长度为100μm~150μm,中间最宽处的宽度为40μm~60μm,筛选槽6的高度与管路3的高度相同,筛选槽6 的高度为18μm~28μm。
单细胞分选层1位于细胞捕获阵列的两侧设置有多个微柱,每个微柱之间的距离为25μm~50μm,用于防止管路塌陷。
位于列同一列微阵列5的第一孔隙10的尺寸和第二孔隙11的尺寸恒定不变,位于相邻两列微阵列5的第一孔隙10的尺寸相差2μm,位于相邻两列微阵列的第二孔隙11的尺寸相差2μm。
每个培养槽9的长度为80μm~120μm,宽度为80μm~120μm,高度为 70μm~100μm,细胞培养层2中的培养槽9为独立的结构,相互之间没有管道联通,保证被捕获单细胞培养的独立性。
本实用新型的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片的工作原理如下:单细胞分选层的单细胞捕获单元主要是捕获不同大小和变形性的单细胞,培养槽是将被捕获的单细胞进行长期培养,阵列结构有利于单细胞的捕获和长期培养。本实用新型的单细胞分选层的结构避免细胞损伤和提高单细胞的分离效率。每组细胞捕获阵列中的每个微结截面呈中部径向收缩的矩形,相邻的两个微结构构成了一个单细胞捕获单元,具有两个用于细胞捕获的孔隙:第一孔隙和第二孔隙,其中第一孔隙比第二孔隙宽2μm。整个单细胞分选层的管道高度为18-28μm,该尺寸包括了绝大多数的哺乳动物细胞大小。微结构呈中部径向收缩的矩形使流速在通过微结构的两个最小截面积(第一孔隙和第二孔隙)处流速达到峰值,而在培养槽的中部的速度逐渐下降,为细胞的捕获或通过提供了一个可控的流体环境,避免了潜在的堵塞风险和由于细胞和捕获单元过长时间接触所导致的细胞损伤。
单细胞分选层主要进行不同大小和变形性单细胞的捕获,细胞培养层中的培养槽的作用是将被捕获的单细胞进行培养。
本实用新型单细胞分选层和细胞培养层的材料均为PDMS聚合物,通过将不同比例的PDMS聚合物进行不可逆封接,保证芯片中单细胞捕获微管道和细胞培养微单元的一致性和独立性。
本实用新型的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片的制备方法,具体包括如下步骤:
步骤1,制备单细胞分选层:
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂,同时,使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan,TMCS)蒸汽处理单细胞分选层模具5min~10min,将PDMS基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的单细胞分选层模具上,抽真空脱气并置于80℃~100℃烘箱中加热固化0.5h~1h,将固化后的PDMS从模具上剥离,并按照需要进行裁剪,并打孔制备筛选槽,清洗干净备用,其中,固化剂采购自美国道康宁公司,编号:SYLGARD 184。
步骤2,制备细胞培养层:
按照质量比15:1混合PDMS基质和固化剂,同时使用TMCS蒸汽处理细胞培养层模具5min,将PDMS基质和固化剂倒入TMCS处理后的细胞培养层模具中,抽真空脱气80℃~100℃烘箱中加热固化1h~2h,将固化后的PDMS从模具上剥离,并按照需要进行裁剪,并打孔制备培养槽,清洗干净备用;
步骤3,将步骤1得到的单细胞分选层和步骤2得到的细胞培养层粘接键合:
由于微孔芯片的对齐误差不能超过10μm,因此采用精度较高的倒置荧光显微镜进行对齐,具体是将单细胞分选层或细胞培养层放置在倒置荧光显微镜的视野里,然后将另一层对齐后用透明胶带固定并将其置于80℃~ 100℃烘箱中,加热键合50h~100h后得到微控芯片,将微控芯片取出,取掉透明胶带,沿着微控芯片的侧面的缝隙处用胶水进行涂抹封闭微控芯片待用。
步骤3中微控芯片的侧面的缝隙封闭还可以通过将PDMS基质和固化剂按照质量比8~15:1混合后涂抹到微控芯片侧面的缝隙处,置于80℃~100℃烘箱中,加热键合50h~100h使其牢固键合。
本实用新型的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片的操作方法,如图4所示,具体操作包括如下步骤:
步骤1,微流控芯片使用前先使用紫外照射2h以增加PDMS表面的亲水性。然后灌入医用酒精进行消毒,最后灌入表面活性剂F127以使细胞无法黏附到PDMS表面从而使细胞悬浮生长。
在一定流速下,将细胞悬液由单细胞分选层的细胞悬浮液入口灌注进入多个微结构中,细胞悬浮液通过微结构,大细胞或变形性差的细胞通过第一孔隙,被第二孔隙卡住捕获,小细胞或者变形性强的细胞均通过第一孔隙和第二孔隙而不被捕获,从而进行到后面孔隙更小的微结构的筛选槽中;
步骤2,待捕获细胞稳定的分布在捕获单元中,将微控芯片翻转、静止使被捕获细胞在重力作用,从单细胞捕获层进行入到细胞培养层的培养槽中,然后将以慢流速将细胞培养液、临床药物、检测试剂通过细胞悬浮液入口进行灌注,进行细胞培养。
实施例1
本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,如图2所示, A和B分别表示单细胞分选层中微结构的宽度和长度,分别取值为120μm 和200μm,中部收缩处的宽度为90μm,C表示微阵列之间的距离,取值为 50μm,D和E代表相邻两个微结构之间的第一个孔隙和第二个孔隙尺寸同一列捕获单元中一样的,但其尺寸在不同的微阵列的捕获单元中依次减少2 μm(即该实施例中第一个孔隙的尺寸为16到8μm,第二个孔隙的尺寸为 14到6μm),如图3所示,相邻两个微结构之间形成的筛选槽长度为100μm,中间最宽处的宽度为40μm,单细胞分选层1的筛选槽的高度L1为18μm,细胞培养层2的培养槽长宽均为80μm,高度L2为70μm,这些培养槽与单细胞分选层的微结构一一对应。
微控芯片的制备过程如下:
步骤1,制备单细胞分选层:
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂,同时,使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan,TMCS)蒸汽处理单细胞分选层模具5min,将PDMS 基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的单细胞分选层模具上,抽真空脱气并置于80℃烘箱中加热固化0.5h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪打孔制备,清洗干净备用,其中,PDMS基质和固化剂采购自美国道康宁公司,编号:SYLGARD 184。
步骤2,制备细胞培养层:
按照质量比15:1混合PDMS基质和固化剂,同时使用TMCS蒸汽处理细胞培养层模具5min,将PDMS基质和固化剂倒入TMCS处理后的细胞培养层模具中,抽真空脱气80℃烘箱中加热固化1h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪,打孔清洗干净备用;
步骤3,将单细胞分选层或细胞培养层放置在倒置荧光显微镜的视野里,然后将另一层对齐后用透明胶带固定并将其置于80℃烘箱中,加热键合50h 后得到微控芯片,将微控芯片取出,取掉透明胶带,沿着微控芯片的侧面的缝隙处用胶水进行涂抹封闭微控芯片即可。
一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片的培养细胞的操作方法如图4所示,采用的肿瘤细胞为人神经胶质瘤细胞(U251)从中科院上海研究所获得,两种不同的肿瘤细胞(Normal U251细胞和Induced U251细胞) 分别为采用DMEM/F12+10%FBS(胎牛血清)的方法进行培养的普通型 U251(Normal U251细胞),以及采用DMEM/F12中加入B27(1×)、重组人表皮生长因子(20ng/mL)、碱性成纤维细胞生长因子(20ng/mL)、白血病抑制因子(10ng/mL)进行培养的诱导型U251细胞(Induced U251);
在驱动流速为40μl/min,将细胞样品(Normal U251细胞和Induced U251 细胞)中细胞密度为10 000cells/mL的条件下,将细胞样品由单细胞分选层的细胞悬浮液入口灌入微控芯片中,20s使细胞样品通过均匀分布的管道,分别灌注进入多个微结构中;在100μl/min下通过微结构阵列以便细胞样品通过微结构阵列根据不同的大小和变形性进行单细胞的捕获和分离。大或者变形性差的细胞能够通过前端缝隙而被后端缝隙卡住,而小或者变形性强的细胞能够通过两个缝隙而不被捕获,从而进行到后面缝隙更小的微结构阵列中去;然后,待捕获细胞稳定的分布在微结构阵列中,将微控芯片翻转、静止使被捕获的细胞通过重力作用,从单细胞捕获层进行入到细胞培养层的微培养槽形成肿瘤球,随后以一个慢流速10μl/min将细胞培养液、临床药物、检测试剂等通过入口进行灌注。
如图5所示,在100μl/min,细胞样品中细胞浓度为10000cells/mL进行灌注后两种不同大小和变形性肿瘤细胞(Normal U251细胞和Induced U251细胞)在微结构阵列中的分布,从图中可以看出两种细胞的分布明显不同。
如图6所示,在100μl/min,细胞样品中细胞浓度为10000cells/mL进行灌注后两种不同大小和变形性肿瘤细胞(Normal U251细胞和Induced U251细胞)在微结构阵列中的分布,从图中可以看出Normal U251细胞(A) 和Induced U251细胞(B)的分布明显不同。
如图7所示,待Normal U251细胞(A)和Induced U251细胞(B)不同的肿瘤细胞在微结构阵列中分布稳定后,以10μl/min将细胞培养液 (DMEM/F12+FBS10%)进行灌注培养细胞,待一定时间(0天、5天和 10天)进行观察和拍照。从图从可以看出随着培养时间的增长,单个肿瘤细胞在微培养槽中逐渐增殖形成肿瘤球,培养到第10天,几乎全部都形成肿瘤球。
如图8和图9所示,从结果可以看到Induced U251细胞的成瘤率要高于 NormalU251细胞;看到单个Induced U251细胞所形成的肿瘤球要大于单个 Normal U251细胞。
如图10所示,通过比对表明小细胞或/和变形性大的细胞的成球率和形成肿瘤球的大小均高于大细胞或/和变形性弱的细胞。
实施例2
本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,如图2所示, A和B分别表示单细胞分选层中微结构的宽度和长度,分别取值为120μm 和250μm,中部收缩处的宽度为90μm,C表示微阵列之间的距离,取值为 50μm,D和E代表相邻两个微结构之间的第一个孔隙和第二个孔隙尺寸同一列捕获单元中一样的,但其尺寸在不同的微阵列的捕获单元中依次减少2 μm(即该实施例中第一个孔隙的尺寸为16到8μm,第二个孔隙的尺寸为 14到6μm),如图3所示,相邻两个微结构之间形成的筛选槽长度为120μm,中间最宽处的宽度为50μm,单细胞分选层1的筛选槽的高度L1为25μm,细胞培养层2的培养槽长宽均为100μm,高度L2为75μm,这些培养槽与单细胞分选层的微结构一一对应。
步骤1,制备单细胞分选层:
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂,同时,使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan,TMCS)蒸汽处理单细胞分选层模具7min,将PDMS 基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的单细胞分选层模具上,抽真空脱气并置于90℃烘箱中加热固化0.7h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪打孔制备,清洗干净备用,其中,固化剂采购自美国道康宁公司,编号:SYLGARD 184。
步骤2,制备细胞培养层:
按照质量比15:1混合PDMS基质和固化剂,同时使用TMCS蒸汽处理细胞培养层模具5min,将PDMS基质和固化剂倒入TMCS处理后的细胞培养层模具中,抽真空脱气90℃烘箱中加热固化1.5h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪,打孔清洗干净备用;
步骤3,将单细胞分选层或细胞培养层放置在倒置荧光显微镜的视野里,然后将另一层对齐后用透明胶带固定并将其置于90℃烘箱中,加热键合80h 后得到微控芯片,将微控芯片取出,取掉透明胶带,沿着微控芯片的侧面的缝隙处用胶水进行涂抹封闭微控芯片即可。
实施例3
本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,如图2所示,A和B分别表示单细胞分选层中微结构的宽度和长度,分别取值为120μm和300μm,中部收缩处的宽度为90μm,C表示微阵列之间的距离,取值为50μm,D和E代表相邻两个微结构之间的第一个孔隙和第二个孔隙尺寸同一列捕获单元中一样的,但其尺寸在不同的微阵列的捕获单元中依次减少2μm(即该实施例中第一个孔隙的尺寸为16到8μm,第二个孔隙的尺寸为14到6μm),如图3所示,相邻两个微结构之间形成的筛选槽长度为150μm,中间最宽处的宽度为60μm,单细胞分选层1的筛选槽的高度L1为28μm,细胞培养层2的培养槽长宽均为120μm,高度L2为100μm,这些培养槽与单细胞分选层的微结构一一对应。
步骤1,制备单细胞分选层:
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂,同时,使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan,TMCS)蒸汽处理单细胞分选层模具10min,将PDMS 基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的单细胞分选层模具上,抽真空脱气并置于100℃烘箱中加热固化1h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪打孔制备,清洗干净备用,其中,PDMS基质和固化剂采购自美国道康宁公司,编号:SYLGARD 184。
步骤2,制备细胞培养层:
按照质量比15:1混合PDMS基质和固化剂,同时使用TMCS蒸汽处理细胞培养层模具5min,将PDMS基质和固化剂倒入TMCS处理后的细胞培养层模具中,抽真空脱气100℃烘箱中加热固化2h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪,打孔清洗干净备用;
步骤3,将单细胞分选层或细胞培养层放置在倒置荧光显微镜的视野里,然后将另一层对齐后用透明胶带固定并将其置于100℃烘箱中,加热键合 100h后得到微控芯片,将微控芯片取出,取掉透明胶带,沿着微控芯片的侧面的缝隙处用胶水进行涂抹封闭微控芯片即可。
实施例4
本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,如图2所示,A和B分别表示单细胞分选层中微结构的宽度和长度,分别取值为120μm和300μm,中部收缩处的宽度为90μm,C表示微阵列之间的距离,取值为50μm,D和E代表相邻两个微结构之间的第一个孔隙和第二个孔隙尺寸同一列捕获单元中一样的,但其尺寸在不同的微阵列的捕获单元中依次减少2μm(即该实施例中第一个孔隙的尺寸为16到8μm,第二个孔隙的尺寸为14到6μm),如图3所示,相邻两个微结构之间形成的筛选槽长度为150μm,中间最宽处的宽度为60μm,单细胞分选层1的筛选槽的高度L1为28μm,细胞培养层2 的培养槽长宽均为120μm,高度L2为100μm,这些培养槽与单细胞分选层的微结构一一对应。
步骤1,制备单细胞分选层:
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂,同时,使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan,TMCS)蒸汽处理单细胞分选层模具10min,将PDMS 基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的单细胞分选层模具上,抽真空脱气并置于100℃烘箱中加热固化1h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪打孔制备,清洗干净备用,其中,PDMS基质和固化剂采购自美国道康宁公司,编号:SYLGARD 184。
步骤2,制备细胞培养层:
按照质量比15:1混合PDMS基质和固化剂,同时使用TMCS蒸汽处理细胞培养层模具5min,将PDMS基质和固化剂倒入TMCS处理后的细胞培养层模具中,抽真空脱气100℃烘箱中加热固化2h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪,打孔清洗干净备用;
步骤3,将单细胞分选层或细胞培养层放置在倒置荧光显微镜的视野里,然后将另一层对齐后用透明胶带固定并将其置于100℃烘箱中,加热键合100h后得到微控芯片,将微控芯片取出,取掉透明胶带,将PDMS基质和固化剂按照质量比8:1混合后涂抹到微控芯片侧面的缝隙处,置于80℃烘箱中,加热键合50h使其牢固键合。
实施例5
本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,如图2所示,A和B分别表示单细胞分选层中微结构的宽度和长度,分别取值为120μm和200μm,中部收缩处的宽度为90μm,C表示微阵列之间的距离,取值为50μm,D和E代表相邻两个微结构之间的第一个孔隙和第二个孔隙尺寸同一列捕获单元中一样的,但其尺寸在不同的微阵列的捕获单元中依次减少2μm(即该实施例中第一个孔隙的尺寸为16到8μm,第二个孔隙的尺寸为14到6μm),如图3所示,相邻两个微结构之间形成的筛选槽长度为150μm,中间最宽处的宽度为60μm,单细胞分选层1的筛选槽的高度L1为25μm,细胞培养层2 的培养槽长宽均为120μm,高度L2为75μm,这些培养槽与单细胞分选层的微结构一一对应。
步骤1,制备单细胞分选层:
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂,同时,使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan,TMCS)蒸汽处理单细胞分选层模具10min,将PDMS 基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的单细胞分选层模具上,抽真空脱气并置于100℃烘箱中加热固化1h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪打孔制备,清洗干净备用,其中,PDMS基质和固化剂采购自美国道康宁公司,编号:SYLGARD 184。
步骤2,制备细胞培养层:
按照质量比15:1混合PDMS基质和固化剂,同时使用TMCS蒸汽处理细胞培养层模具5min,将PDMS基质和固化剂倒入TMCS处理后的细胞培养层模具中,抽真空脱气100℃烘箱中加热固化2h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪,打孔清洗干净备用;
步骤3,将单细胞分选层或细胞培养层放置在倒置荧光显微镜的视野里,然后将另一层对齐后用透明胶带固定并将其置于100℃烘箱中,加热键合 100h后得到微控芯片,将微控芯片取出,取掉透明胶带,将PDMS基质和固化剂按照质量比10:1混合后涂抹到微控芯片侧面的缝隙处,置于90℃烘箱中,加热键合100h使其牢固键合。
实施例6
本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,本实用新型的申请人实验室设计微控芯片的结构和尺寸,如图2所示,A和B分别表示单细胞分选层中微结构的宽度和长度,分别取值为120μm和200μm,中部收缩处的宽度为90μm,C表示微阵列之间的距离,取值为50μm,D和E代表相邻两个微结构之间的第一个孔隙和第二个孔隙尺寸同一列捕获单元中一样的,但其尺寸在不同的微阵列的捕获单元中依次减少2μm(即该实施例中第一个孔隙的尺寸为16到8μm,第二个孔隙的尺寸为14到6μm),如图3所示,相邻两个微结构之间形成的筛选槽长度为120μm,中间最宽处的宽度为50μm,单细胞分选层1的筛选槽的高度L1为28μm,细胞培养层2 的培养槽长宽均为100μm,高度L2为100μm,这些培养槽与单细胞分选层的微结构一一对应。
步骤1,制备单细胞分选层:
按质量比5:1混合PDMS基质和固化剂,同时,使用三甲基氯硅烷(Trimethylchlorosilan,TMCS)蒸汽处理单细胞分选层模具10min,将PDMS 基质和固化剂混合物倒入三甲基氯硅烷处理后的单细胞分选层模具上,抽真空脱气并置于100℃烘箱中加热固化1h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪打孔制备,清洗干净备用,其中,PDMS基质和固化剂采购自美国道康宁公司,编号:SYLGARD 184。
步骤2,制备细胞培养层:
按照质量比15:1混合PDMS基质和固化剂,同时使用TMCS蒸汽处理细胞培养层模具5min,将PDMS基质和固化剂倒入TMCS处理后的细胞培养层模具中,抽真空脱气100℃烘箱中加热固化2h,将固化后的PDMS从模具上剥离进行裁剪,打孔清洗干净备用;
步骤3,将单细胞分选层或细胞培养层放置在倒置荧光显微镜的视野里,然后将另一层对齐后用透明胶带固定并将其置于100℃烘箱中,加热键合 100h后得到微控芯片,将微控芯片取出,取掉透明胶带,将PDMS基质和固化剂按照质量比15:1混合后涂抹到微控芯片侧面的缝隙处,置于100℃烘箱中,加热键合85h使其牢固键合。
Claims (7)
1.一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,其特征在于,包括单细胞分选层(1)、细胞培养层(2)和嵌入在所述单细胞分选层(1)中的管路(3),所述单细胞分选层(1)上粘接有细胞培养层(2),所述单细胞分选层包括至少一组细胞捕获阵列(4)、一个细胞悬浮液入口和多个细胞悬浮液出口,每组所述细胞捕获阵列(4)通过所述管路(3)连通所述细胞悬浮液入口和多个所述细胞悬浮液出口,每组所述细胞捕获阵列(4)包括至少三列微阵列(5),每列所述微阵列(5)包括并列排布的多个单细胞捕获单元(7),每个单细胞捕获单元(7)包括两个H型微结构(8),两个所述H型微结构(8)之间形成用于细胞筛选的筛选槽(6),所述筛选槽(6)的两端分别形成用于捕获细胞的第一孔隙(10)和第二孔隙(11),所述第一孔隙(10)的宽度比所述第二孔隙(11)的宽度大1μm~2μm;
所述细胞培养层(2)上间隔均匀开设有用于培养细胞的多个相互独立的培养槽(9),所述培养槽(9)呈阵列排布,每个所述培养槽(9)与所述单细胞捕获单元(7)一一对应。
2.如权利要求1所述的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,其特征在于,相邻两列所述微阵列(5)的间距为50μm。
3.如权利要求1所述的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,其特征在于,每个所述H型微结构(8)的截面呈中部径向收缩的矩形,每个所述H型微结构(8)的长度为200μm~300μm,每个所述H型微结构的矩形两端宽为120μm,中部收缩处的宽为90 μm。
4.如权利要求1所述的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,其特征在于,所述筛选槽(6)中间宽两边窄,所述筛选槽(6)的长度为100μm~150μm,所述中间最宽处的宽度为40μm~60μm,所述筛选槽(6)的高度与所述管路(3)的高度相同,所述筛选槽(6)的高度为18μm~28μm。
5.如权利要求1所述的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,其特征在于,所述单细胞分选层(1)位于所述细胞捕获阵列的两侧设置有多个微柱,每个微柱之间的距离为25μm~50μm,用于防止所述管路(3)塌陷。
6.如权利要求1所述的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,其特征在于,每个所述培养槽(9)的长度为80μm~120μm,宽度为80μm~120μm,高度为70μm~100μm。
7.如权利要求1所述的一种单细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化微控芯片,其特征在于,位于同一列所述微阵列(5)的第一孔隙(10)的尺寸和第二孔隙(11)的尺寸恒定不变,位于相邻两列所述微阵列(5)的第一孔隙(10)的尺寸相差2μm,位于相邻两列所述微阵列的第二孔隙(11)的尺寸相差2μm。
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CN111774110A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-10-16 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种可实现细胞捕获与固定的生物分析芯片 |
CN113088447A (zh) * | 2021-03-11 | 2021-07-09 | 温州医科大学 | 一种悬空阵列微流控芯片及其制备方法和应用 |
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2019
- 2019-05-31 CN CN201920811902.1U patent/CN210765350U/zh active Active
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