CN205404586U - 手持式菊酯类农药免疫层析试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种手持式菊酯类农药免疫层析试纸条，包括条形PVC底板，其特征在于：条形PVC底板由上而下依次交叠粘贴有金标羊抗小鼠二抗复合物的金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，它们之间交叠区域长度为1mm；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂的免疫原为半抗原与载体蛋白的偶联物，质控线上喷涂兔抗山羊IgG抗体，本实用新型可以同时检测甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯农药残留。其检测结果重现性较传统金标试纸条更好、更稳定；采用手持柄，并去除了样品垫，使结构更简单，操作更安全、快捷，对甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯残留检测灵敏度可达0.5、5.0、5.0、5.0mg/L。

Description

手持式菊酯类农药免疫层析试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种试纸条，尤其是用于对蔬菜水果中菊酯类农药的快速筛选检测的手持式试纸条，属于金标免疫检测领域。

背景技术

菊酯类农药作为一种杀虫、杀螨剂，具有高效、低毒、触杀作用强的特点，在蔬菜、水果、茶叶等农作物生产中得到广泛的使用。但其残留期长，对环境生态***及人类健康存在危害风险。世界卫生组织（WHO）和***粮农组织（FAO）等国际机构对拟除虫菊酯类农药在蔬果上的残留制定了严格限量标准，我国也对该类农药制定了限量标准（GB2763-2014）。

目前报道的菊酯类农药的检测方法，主要包括仪器分析方法、免疫化学等方法。然而，这些检测技术虽然具有较高的检测灵敏度，却耗时长、操作复杂，甚至需要专业的培训，需在实验室内操作，不能满足现场的快速、高通量检测，特别是在对大量样品进行低成本快速筛选时，优势不足。

胶体金免疫层析技术是20世纪80-90年代发展起来的一种快速简易免疫检测技术，具有快速、简便、易判断等优点。其是将特异性的抗原固定在硝酸纤维素膜上，胶体金标记抗体吸附在金标垫上，当待检样液接触到试纸条金标垫端部，通过毛细作用向上移动，检测物与金标垫上的胶体金标记抗体反应结合，再移动至检测带（喷涂固定的免疫原区域），此时固定的免疫原与待检物竞争结合抗体，未与待测物结合的金标抗体与免疫原发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，从而产生颜色变化，当抗体与待测物结合复合物或游离的抗体到达质控带（喷涂固定的第二抗体区域）时，第二抗体与第一抗体发生特异性结合而被截留在检测带上，胶体金聚集呈现红色，随后可通过肉眼观察检测带的颜色变化，进行阳性判断。本实用新型采用胶体金标记羊抗鼠二抗的方法，对传统的胶体金免疫层析技术进行了改进，结构更简单，并提高了检测结果的重现性与稳定性。

实用新型内容

本实用新型提供了一种快速诊断及半定量检测菊酯类农药残留的试纸条制备及应用方法，可满足现场快速筛查的要求。

本实用新型的目的是这样实现的：一种手持式菊酯类农药免疫层析检测试纸条。包括含有胶体金标记的羊抗小鼠二抗的金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫及PVC底板；吸水垫、硝酸纤维素膜、含有金标羊抗小鼠二抗复合物的金标垫由上而下依次交叠粘贴于PVC底板上；硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，其中靠近金标垫的为检测线。本实用新型将传统金标试纸条中的样品垫去除，使结构更为简单实用，且操作更快捷、安全。

本实用新型中，所述金标垫长12mm，宽3.5mm；所述硝酸纤维素膜长25mm，宽3.5mm；所述吸水垫长40mm，宽3.5mm；金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的各交叠区域长度为1mm。

其中，检测线喷涂半抗原与卵清蛋白的偶联物；质控线喷涂兔抗山羊IgG抗体，检测线和质控线的距离为4mm。

本实用新型中的手持菊酯类农药试纸条的原理为竞争抑制法，当待检样品中不含甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯农药时，将菊酯类农药的单克隆抗体加入样品液中混合后，以毛细作用向上迁移溶解金标垫上的胶体金标记的羊抗小鼠二抗，与之结合形成复合物，继续向上迁移到达检测线后，与检测线上包被的免疫原结合，金标二体与菊酯类农药单克隆抗体形成的复合物在检测线上沉积，形成肉眼可见的红色，过量的金标二抗及其与单克隆抗体形成的复合物继续向上迁移，与包被在质控线上的兔抗山羊抗体结合，胶体金沉积形成肉眼可见的红色。此时检测线颜色将等于或深于质控线，检测结果为阴性。

当待检样品中含有菊酯类农药时，加入的菊酯类农药单克隆抗体首先与样品液中的农药特异性结合，阻止了其与检测线上免疫原的结合，因此其与胶体金标记的羊抗鼠二抗结合形成的复合物无法在检测线上形成沉淀，此时样品中菊酯类农药含量越高，检测线颜色越浅甚至无色，随后金标二抗及其复合物继续向上迁移到质控线，与包被在质控线上的兔抗山羊抗体结合，形成肉眼可见的红色。此时检测线颜色浅于质控线或接近无色，检测结果为阳性。

当质控线没有颜色时，无论检测线是否有颜色，均视为无效结果。

本实用新型的创新之处在于：将传统的金标试纸条的样品垫去除，将金标的抗体喷涂于金标垫上，更容易标准化控制，且金标复合物的迁移更为干净、彻底。

本实用新型所述的手持式菊酯类农药免疫层析试纸条与现有技术相比，具有以下优点：

（1）采用胶体金直接标记羊抗小鼠二抗，利用抗体复合物间接标记农药单克隆抗体的方法，提高了检测的灵敏度、准确率和稳定性。

（2）检测时间只需8-10min，能够满足现场检测的要求。

（3）吸水垫长达40mm，使手持操作更安全。

（4）携带方便，操作简单，无需专业培训均可即时进行检测。

本实用新型所述手持式菊酯类农药免疫层析检测试纸条适用于快速检测多种蔬菜水果中4种菊酯类农药的残留，具有广谱性。

附图说明

图1为本实用新型实施例的结构示意图。

图中，1、金标垫，2、硝酸纤维素膜，3、吸水垫，4、检测线，5、质控线，6、PVC底板，7、金标羊抗小鼠二抗复合物。

具体实施方式

附图非限制性的公开了本实用新型实施例的具体结构及其使用方法，下面结合附图对本实用新型作进一步的描述

实施例1

一种手持式菊酯类农药免疫层析检测试纸条，由图1可见，试纸条大小为75mm×3.5mm，包括含有金标羊抗小鼠二抗复合物7的金标垫1、硝酸纤维素膜2、吸水垫3、PVC底板6。金标垫长12mm，宽3.5mm；硝酸纤维素膜长25mm，宽3.5mm；所述吸水垫长40mm，宽3.5mm；金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的各交叠区域长度为1mm，试纸条成品的实际尺寸为75mm×3.5mm。

检测线4和质控线5与硝酸纤维素膜2测试起点端的距离分别为11mm和15mm，检测线4和质控线5之间的距离为4mm。含有金标羊抗小鼠二抗复合物7的金标垫1和硝酸纤维素膜2由下而上依次交叠与PVC底板6上，硝酸纤维素膜2另一端与吸水垫3交叠。硝酸纤维素膜上检测线4喷涂免疫原（半抗原与载体蛋白的偶联物），浓度为0.3μg/mm，质控线5喷涂兔抗山羊多克隆抗体，浓度为0.06μg/mm。

本实施例中涉及的各材料材质如下：底板为PVC材质（SM31-40），金标垫为玻璃纤维，型号为MilliporeGFCP000800；硝酸纤维素膜型号为Millipore135；吸水垫型号为SX27。金标垫处理：将金标垫浸入金标垫处理液（20mMNa₃PO₄12H₂O，5%BSA，0.25%Tween-20，10%蔗糖）30min后，37℃烘干。

实施例2

手持式菊酯类农药免疫层析检测试纸条的制备方法，其制备步骤如下：

第一步，采用柠檬酸还原法制备胶体金：

（1）将200mL双蒸水加入到500mL广口玻璃瓶中，加入1mL过0.22μm滤膜的2%氯金酸溶液，顺时针方向轻轻晃动至混匀后，放置于微波炉中高火加热5min至沸腾。

（2）取出玻璃瓶，迅速顺时针方向轻轻晃动玻璃瓶，使瓶内溶液旋转后快速加入4.8mL过0.22μm滤膜的1%柠檬酸三钠溶液，沿同一方向继续轻轻晃动玻璃瓶5s，再次放入微波炉中，高火继续加热4min。

（3）取出玻璃瓶，此时瓶内酒红色液体即为所需胶体金溶液；置室温冷却后，用双蒸水重新定容至200mL，混匀后避光4℃保存。

第二步，金标羊抗小鼠抗体的制备：

（1）每毫升纳米金溶液中加入7μL的K₂CO₃（0.1mol/L）溶液调节pH值为8.0，搅拌状态下缓慢加入5μL1mg/mL羊抗小鼠抗体溶液，此时其抗体终浓度为5μg抗体/mL纳米金溶液，搅拌30min；

（2）加入10%BSA溶液使BSA终浓度为1%，继续搅拌30min后，1500rpm离心15min，留取上清，上清液继续以12000rpm离心35min后，弃去上清，加入洗涤保存液（0.01%硼酸，0.2%PEG₂₀₀₀₀，0.02%NaN₃）至原溶液体积；

（3）再次以12000rpm离心35min后，弃去上清，加入洗涤保存液溶解沉淀至体积为原溶液体积的1/10，即得金标羊抗小鼠溶液，4℃避光保存。

第三步，胶体金试纸膜的制备：

用Bio-dotXYZ-3050三维喷点仪中的Arijet喷膜，将免疫原和兔抗山羊IgG抗体分别喷涂包被于NC膜上，作为检测线和质控线；金标抗体复合物按0.002μg/mm喷于已处理好的金标垫上；37℃干燥2h后，28℃保存于干燥皿中。

第四步，试纸条的组装：

将NC膜贴于PVC底板的中部，金标垫贴于NC膜检测线一端，吸水垫贴于质控线一端，彼此重叠1mm并压紧。用切条机将组装好的试纸板切成3.5mm的试纸条，保存于28℃的干燥皿中。

实施例3

检测方法：

用甲醇溶液配制100μg/mL的菊酯类农药溶液，再用含20%甲醇的PBS溶液分别将其稀释至20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1μg/mL，同时设立含有20%甲醇的PBS溶液作为对照组，向微孔中分别加入100μL上述浓度菊酯类农药标样溶液和对照缓冲液，再加入0.5μL菊酯类农药单克隆抗体（1mg/mL），将试纸条的金标垫端***微孔中，8-10min观察结果。

结果判断：

阳性结果：检测线4不显色或颜色明显浅于质控线5的颜色，若不显色则甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯农药的残留浓度分别大于等于0.5、5.0、5.0、5.0mg/kg，若检测线颜色较质控线变浅则表明样品仍为阳性，农药的残留浓度则分别小于0.5、5.0、5.0、5.0mg/kg；阴性结果：检测线4颜色与质控线5颜色基本一致或深于质控线5；当质控线5不显色时，则试纸条失效。

实施例4

样品基质对试纸条的影响

测试样品：洋葱、葱、生姜、大蒜、韭菜、大白菜、小青菜、辣椒、胡萝卜、番茄、黄瓜、苹果、西瓜。

样品前处理：称取10g粉碎(匀浆或者切碎)样品，加入10mL乙腈震荡30min，过滤，滤液倒入加有1gNaCl和4g无水MgSO₄的离心管中，震荡1min后，取1mL上清氮气吹干，用1mL20%甲醇-PBS复溶后用于试纸条检测。

检测：分别取13种样品的处理液，同时设立含有20%甲醇的PBS溶液作为对照组，向微孔中分别加入100μL上述样品处理液和对照，再加入0.5μL菊酯类农药单克隆抗体，将试纸条的金标垫端***微孔中，静置8-10min观察结果。

结果判断：

（1）阳性结果：检测线4不显色或颜色明显浅于质控线5的颜色；阴性结果：检测线4颜色与质控线5颜色基本一致或深于质控线5的颜色；当质控线5不显色时，则试纸条失效。

（2）在本实施案例中，洋葱、葱、生姜、大蒜、韭菜、大白菜、小青菜、胡萝卜、番茄、黄瓜、苹果、西瓜12种蔬菜水果样品液和含有20%甲醇的PBS溶液作为对照组的检测结果均为阴性，基质干扰作用少；辣椒的样品液检测结果为假阳性，基质干扰强，本试纸条不适用于辣椒样品的检测。

实施例5

试纸条对阳性样品检测效果的验证

利用试纸条检测除辣椒外的12种蔬菜水果中菊酯类农药残留：在12种蔬菜水果中分别加入50μL、100μL菊酯类农药标样（100μg/mL），使添加浓度分别为0.5μg/mg、5μg/mg，进行同实施例4的样品处理过程后，分别取2mL有机相氮气吹干，其中1mL用正己烷复溶后于气相色谱检测，另1mL用20%甲醇-PBS复溶于试纸条检测，设多次重复。

验证结果：

以韭菜样品为例：添加浓度为0.5μg/mg、5μg/mg，气相色谱检测结果:甲氰菊酯为0.49μg/mg、5.02μg/mg，氯氰菊酯为0.52μg/mg、5.05μg/mg，溴氰菊酯为0.48μg/mg、5.09μg/mg，三氟氯氰菊酯为0.51μg/mg、5.10μg/mg；试纸条检测结果均为阳性，与气相色谱检测结果一致。对12种蔬菜水果的检测获得一致结果。

Claims (3)

1.一种手持式菊酯类农药免疫层析试纸条，包括条形PVC底板，其特征在于：条形PVC底板由上而下依次交叠粘贴有金标羊抗小鼠二抗复合物的金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，它们之间交叠区域长度为1mm；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，其中，检测线上喷涂免疫原为半抗原与载体蛋白的偶联物，质控线上喷涂兔抗山羊IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的手持式菊酯类农药免疫层析试纸条，其特征在于：条形PVC底板的宽度为3.5mm，与条形PVC底板等宽金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫分别长12mm、25mm和40mm。

3.根据权利要求1或2所述的手持式菊酯类农药免疫层析试纸条，其特征在于：硝酸纤维素膜上的检测线与质控线之间的距离为4mm。