CN204779609U - 体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种组织三维培养的装置和方法。该生物反应器包括体外灌流循环***、压力负反馈调节***和灌流量控制模块、肝组织培养模块。体外灌流循环***包括封闭的管道***、组织灌注发生器及灌流液混悬更新装置。压力负反馈调节***包括管道内压力监测***、电脑控制模块和***受电脑控制调节的灌流装置。肝组织培养模块包括无菌培养室和组织培养三维支架的构建。本实用新型可模拟体内环境，为体外培养组织工程器官提供了一种装置，为三维条件下干细胞分化和细胞生长的研究提供一种工具。
Description
技术领域
本实用新型属于组织工程和生物制造领域，涉及(但不局限于)肝脏组织三维培养构建组织工程肝脏的生物反应器。可以实现组织工程肝脏体外培养过程中细胞种植、组织培养阶段的灌流和体外循环，模拟生理条件下的血流循环，主要参数可以调节。
背景技术
肝脏是人体重要的解毒和消化器官，肝炎、肝硬化、重症肝衰竭等终末期肝病已严重影响了人们的生存质量，成为全世界死亡率最高的疾病之一。目前，肝移植是公认的唯一有效的治疗方法。仅中国，约有30万终末期肝病患者等待肝移植手术，而能够接受肝移植手术治疗的患者仅占45％。全球范围内供肝短缺形势严峻，绝大部分患者因无法等到供肝而死亡。体外构建组织工程肝脏成为解决供肝缺乏的途径之一。
组织工程学是合运用生物学和工程学的基本原理、基本理论、基本技术和方法，研究如何在体外条件下构建有生物活性的组织器官，用以替代病损的组织器官的学科。组织工程肝脏是该领域的研究热点之一。构建理想的组织工程化人工肝脏，需要研究三个关键性的问题：理想的种子细胞来源、支架材料和能够为细胞支架复合物提供接近生理环境的生物反应器。
肝组织生物反应器的发展过程中，先后出现了平板型生物反应器、旋转瓶型生物反应器、中空纤维型生物反应器、灌流床支架型生物反应器(BasakE.Uygun,GavriellePrice,NimaSaeidi,Maria-LouisaIzamis,TimBerendsen,MartinYarmush,KorkutUygun.DecellularizationandRecellularizationofWholeLivers.J.Vis.Exp.2011,(48):e2394)、肝细胞包裹/悬浮型生物反应器。由于上述生物反应器都没有解决供氧和细胞在三维支架内生长的问题，使它们的使用受到限制。目前这些生物反应器可以短时间内部分替代衰竭肝脏，但它不能完全替代肝脏功能，也不能培养出真正的组织工程肝脏(YuCB,PanXP,LiLJ.2009.Progressinbioreactorsofbioartificiallivers.HepatobiliaryPancreatDisInt8:134-140.)。
因此，在体外构建组织工程人工肝生物反应器时，应考虑到：灌流效果足够保证细胞在三维支架中的种植深度，提供模拟体内条件的持续灌流，并给细胞提供模拟体内的生物、力学环境和足够的营养交换。
本实用新型提供了模拟生理条件下的组织培养环境，并给细胞实施可调节的静水压力。
实用新型内容
本实用新型的目的是设计可以三维培养肝脏组织构建组织工程肝脏的生物反应器，用于干细胞分化的体外研究、组织工程肝脏的体外构建，以实现生物人工肝替代人体供肝的理想状态。
本实用新型提供的生物反应器，包括：
培养液储槽，所述培养液储槽内设有灌流培养液；
管道***，所述管道***包括入口管和出口管；
无菌培养室，所述无菌培养室内设有三维支架；所述三维支架包括支架流入口和支架流出口，所述支架流入口与入口管的一端连接，所述支架流出口与出口管的一端连接，所述入口管的另一端和所述出口管的另一端均与所述培养液储槽连接；
灌流装置，所述灌流装置设置于所述入口管和所述出口管上。
其中，所述灌流装置包括第一蠕动泵和第二蠕动泵。
其中，该生物反应器包括压力负反馈调节***，所述压力负反馈调节***包括管道内压力监测***、电脑中控***以及受电脑中控***控制调节的灌流装置。
其中，所述管道内压力监测***为压力传感器。
其中，所述压力传感器将管道***内的压力信号实时传入电脑中控***，电脑中控***根据所述压力信号自动调节所述第一蠕动泵和第二蠕动泵，从而控制灌流速度和灌流量。
其中，还包括灌流液混悬更新装置，所述灌流液混悬更新装置包括混悬摇床、三通管。
其中，所述无菌培养室由无菌的生物相容性材料制作。
其中，细胞生长在供培养肝组织的所述三维支架内部，该三维支架具有模拟肝局部解剖结构的脉管***。
其中，所述三维支架是弹性材料。
其中，所述培养液储槽和所述无菌培养室放置于二氧化碳培养箱内。
该生物反应器包括：体外循环灌流***，含封闭的体外循环管道***、组织灌流发生器、灌流液混悬更新装置；管道内压力负反馈调节***，含压力负反馈调节***包括管道内压力监测***、电脑控制模块、受电脑控制调节的灌流装置(蠕动泵)；肝脏组织培养体系，含肝组织培养的无菌培养室、供培养肝组织的三维支架。
培养液储槽中的培养液通过封闭的管道***，经第一蠕动泵进入肝脏培养三维支架，为三维支架内细胞提供营养物质，三维支架及其内部的细胞在无菌培养室中培养。培养液在三维支架内循环后，经支架流出口进入封闭的管道***，在第二蠕动泵的控制下进入培养液储槽。封闭的管道***内有压力监测***可实时监测管道***内压力，并将压力信息传入电脑中控***，电脑中控***根据该压力信息和预先设定的压力需求，调节两个蠕动泵的速度，从而维持整个管道***内的静水压。
培养液储槽另有无菌进液口、气体进口(氧气、二氧化碳等气体可以通过气体进口进入培养液储槽中)和气体过滤装置，以满足培养液加氧、加二氧化碳、更换培养液以及消除管道***内气泡的需求。
上述方案中，整个管道***为密闭***，管道***包括流入管和流出管，流入管和流出管均采用无菌的生物相容性材料。无菌培养室也采用无菌生物相容性材料。
本实用新型另一技术特征是，管道***内有实时压力传感器，蠕动泵的泵速流量均实时通过电脑中控***监控调节。
本实用新型与已存在的肝脏生物反应器相比具有以下优点：
第一，通过培养液在整个三维支架内完全循环，可以将细胞悬液带到整个三维支架的各个角落，从而提高三维支架上细胞的种植密度，模拟真实肝脏内细胞的分布。
第二，通过培养液在整个三维支架内完全循环，可为三维支架内所有细胞提供有效的营养供给、气体交换，提供支架内部细胞的存活率。
第三，通过蠕动泵实现脉动刺激，模拟体内血流。
第四，通过管道内压力监测***、电脑中控***、蠕动泵负反馈调节，有效实现模拟生理条件下肝脏内静水压。以及静水压的调节，利于体外肝再生的机制研究。
第五，电脑中控***可通过软件调节，适应不同的研究需求和组织构建需求。
附图说明
图1为体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器的原理结构简图。
附图标记：
1-培养液储槽；2-气体进口；
3-管道***；5-第一蠕动泵；
6-第二蠕动泵；7-压力监测***；
8-电脑中控***；9-无菌培养室；
10-三维支架11-支架流入口；
12-支架流出口。
具体实施方式
本实用新型从支架材料细胞化和组织培养两个阶段，为体外构建组织工程肝脏提供技术方案。
本实用新型提供的生物反应器，包括：
培养液储槽1，所述培养液储槽1内设有灌流培养液；
管道***3，所述管道***3包括入口管和出口管；
无菌培养室9，所述无菌培养室9内设有三维支架10；所述三维支架10包括支架流入口11和支架流出口12，所述支架流入口11与入口管的一端连接，所述支架流出口12与出口管的一端连接，所述入口管的另一端和所述出口管的另一端均与所述培养液储槽1连接，
灌流装置，所述灌流装置设置于所述入口管和所述出口管上。
其中，所述灌流装置包括第一蠕动泵5和第二蠕动泵6。
其中，该生物反应器包括压力负反馈调节***，所述压力负反馈调节***包括管道内压力监测***7、电脑中控***8以及受电脑中控***8控制调节的灌流装置。
其中，所述管道内压力监测***7为压力传感器。
其中，所述压力传感器将管道***3内的压力信号实时传入电脑中控***8，电脑中控***8根据所述压力信号自动调节所述第一蠕动泵5和第二蠕动泵6，从而控制灌流速度和灌流量。
其中，还包括灌流液混悬更新装置，所述灌流液混悬更新装置包括混悬摇床、三通管。
其中，所述无菌培养室9由无菌的生物相容性材料制作。
其中，细胞生长在供培养肝组织的所述三维支架10内部，该三维支架10具有模拟肝局部解剖结构的脉管***。
其中，所述三维支架10是弹性材料。
其中，所述培养液储槽1和所述无菌培养室9放置于二氧化碳培养箱内。
培养液储槽1另有无菌进液口、气体进口2(氧气、二氧化碳等气体可以通过气体进口进入培养液储槽1中)和气体过滤装置，以满足培养液加氧、加二氧化碳、更换培养液以及消除管道***3内气泡的需求。
支架材料细胞化的阶段，即细胞种植阶段。将培养液储槽1和无菌培养室9置于二氧化碳培养箱中，培养液储槽1中的细胞悬液通过持续灌流，或两个管道交替流向输入，使细胞得以分布到三维支架10的各个部位，提高细胞在三维支架10材料上的附着率。细胞灌注时间及浓度可视需要而定。静置培养一段时间后，可进行组织灌流培养。
在组织培养阶段，如附图1所示，培养液储槽1和无菌培养室9亦置于二氧化碳培养箱中。细胞培养液储槽1中的培养液通过封闭的管道***3，经第一蠕动泵5进入肝脏培养三维支架10，为三维支架10内细胞提供营养物质，三维支架10及其内部的细胞在无菌培养室9中培养。培养液在三维支架10内循环后，经支架流出口12进入封闭的管道***3，在第二蠕动泵6的控制下进入培养液储槽1。封闭的管道***3内有压力监测***7可实时监测管道***3内压力，并将压力信息传入电脑中控***8，电脑中控***8根据压力和预先设定的压力需求，调节两个蠕动泵的速度，从而维持整个管道***3内的静水压。
实施例1：干细胞在全肝脱细胞支架培养
无菌条件下将，大鼠全肝脱细胞后，得到具有肝脏网络结构及脉管***的生物三维支架。支架流入口11为肝门静脉，支架流出口12为肝静脉，将支架流入口11和支架流出口12分别连接于生物反应器的入口管和出口管。将生物反应器的入口管和出口管的另一端与培养液储槽1连接，培养液储槽1中在无菌条件下预置106/ml干细胞悬液。将培养液储槽1、培养液混悬器和无菌培养室9置于二氧化碳培养箱内，通过蠕动泵将细胞悬液缓慢泵入全肝脱细胞支架内，灌注1个循环。静置一天后，将培养液储槽1内液体更换为组织培养液，进行持续灌流培养。一周后，观察培养效果。
实施例2：培养液对肝脏生长的影响
无菌条件下切除大鼠肝，将表面及管道内红细胞冲洗干净、测量肝脏体积大小后，置于无菌培养室9内，将肝门静脉连接生物反应器的入口管，肝静脉连接出口管，将生物反应器的入口管和出口管的另一端与培养液储槽1连接。将培养液储槽1、培养液混悬器和肝无菌培养室9置于二氧化碳培养箱内，通过蠕动泵将肝脏培养液持续灌流入大鼠肝内，维持肝门静脉入口处压力为10cm水柱(约为生理状态压力)，养两周后测量肝脏大小，观察培养液对肝脏生长的影响。
实施例3：不同静水压力对肝再生的影响
无菌条件下切除大鼠肝，将表面及管道内红细胞冲洗干净、测量肝脏体积大小后，置于无菌培养室9内，将肝门静脉连接生物反应器的入口管，肝静脉连接出口管，将生物反应器的入口管和出口管的另一端与培养液储槽1连接。将培养液储槽1、培养液混悬器和无菌培养室9置于二氧化碳培养箱内，通过蠕动泵将肝脏培养液持续灌流入大鼠肝内，维持肝门静脉入口处压力为15cm水柱培养(高于生理状态)，培养两周后测量肝脏大小，观察高静水压对肝脏生长的影响。
持续灌流循环是调控细胞生长和功能的关键因素。本实用新型共培养装置的特点是可为三维支架10内培养的细胞提供持续的模拟生理条件的体外循环，实现对细胞生长提供营养、气体交换的作用，为细胞共培养提供一种可调节的生长环境，为探索组织培养技术提供一种方法。
以上所述仅为本实用新型优选实例，并不用于限制本实用新型，对于本领域的技术人员来说，本实用新型可以有各种更改和变化。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，包括：
培养液储槽，所述培养液储槽内设有灌流培养液；
管道***，所述管道***包括入口管和出口管；
无菌培养室，所述无菌培养室内设有三维支架；所述三维支架包括支架流入口和支架流出口，所述支架流入口与入口管的一端连接，所述支架流出口与出口管的一端连接，所述入口管的另一端和所述出口管的另一端均与所述培养液储槽连接；
灌流装置，所述灌流装置设置于所述入口管和所述出口管上。
2.如权利要求1所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，所述灌流装置包括第一蠕动泵和第二蠕动泵。
3.如权利要求2所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，该生物反应器包括压力负反馈调节***，所述压力负反馈调节***包括管道内压力监测***、电脑中控***以及受电脑中控***控制调节的灌流装置。
4.如权利要求3所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，所述管道内压力监测***为压力传感器。
5.如权利要求4所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，所述压力传感器将管道***内的压力信号实时传入电脑中控***，电脑中控***根据所述压力信号自动调节所述第一蠕动泵和第二蠕动泵，从而控制灌流速度和灌流量。
6.如权利要求1-5中任一项所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，还包括灌流液混悬更新装置，所述灌流液混悬更新装置包括混悬摇床、三通管。
7.如权利要求1-5中任一项所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，所述无菌培养室由无菌的生物相容性材料制作。
8.如权利要求1-5中任一项所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，细胞生长在供培养肝组织的所述三维支架内部，该三维支架具有模拟肝局部解剖结构的脉管***。
9.如权利要求1-5中任一项所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，所述三维支架是弹性材料。
10.如权利要求1-5中任一项所述的体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器，其特征在于，所述培养液储槽和所述无菌培养室放置于二氧化碳培养箱内。
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