CN204608020U - 淋巴细胞微核实验用的微量培养装置及淋巴细胞微核实验用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供淋巴细胞微核实验用的微量培养装置和淋巴细胞微核实验用试剂盒。所述微量培养装置(1)的特征在于，包含透明瓶体(2)、弹性密封塞、位于弹性密封塞外侧并与瓶口锁扣的硬质外盖(3)、以及装在透明瓶体内的2～4ml的微核实验用培养基(5)，所述透明瓶体(2)为长圆柱状且瓶体高度与底面直径比为4～8∶1，所述硬质外盖(3)的上表面中心处具有能够去除的脱离部(4)，所述培养基填充至瓶体高度的3/4以下；所述淋巴细胞微核实验用试剂盒包含所述微量培养装置。

Description

淋巴细胞微核实验用的微量培养装置及淋巴细胞微核实验用试剂盒

技术领域

本实用新型属于生物技术领域，具体而言，涉及淋巴细胞微核实验用的微量培养装置及淋巴细胞微核实验用试剂盒。

背景技术

微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体，主要由外界损害因素(辐射或化学致癌物等)作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成1个或数个小核。它是由染色体、染色单体的无着丝粒断片或纺锤体损伤后造成滞后染色体，在细胞***中未包被于主核中而形成的。它通常被认为是染色体断裂和丢失的标志，因此常被用于评估接触射线或致癌物后的遗传损伤改变和致癌的风险性评估。

具体而言，微核检测的意义在于：(1)监测致癌物或放射性物质暴露人群的染色体损伤状态；(2)提供个体染色体损伤的程度，评估致癌物暴露人群的健康风险，为早期就诊提供依据；(3)完善肿瘤或者血液***疾病患者的治疗前评估的指标；(4)肿瘤患者的临床治疗效果的评价；(5)致癌物或化学污染物暴露人群健康状况的动态观察。

人体外周血中的淋巴细胞一般处在G0期，不具备***能力，但在体外培养过程中加入植物凝集素(PHA)后，PHA会刺激淋巴细胞增殖，从而进入有丝***阶段。经过一段时间培养后，加入细胞松弛素B，经过低渗和固定处理就可以获得淋巴细胞微核涂片。

微核实验的数据分析一般需要计数1000～2000个双核细胞进行评估，而人外周血中的淋巴细胞数目为1000～2500个/μL，并且在体外培养过程中细胞还会经过一个指数生长阶段，所以理论上仅需要微量的外周血即可以达到实验室微核的检测分析目的。但是，目前实验室中多应用装有5ml培养基的培养瓶(见图2A)进行淋巴细胞培养，而这样的培养瓶通常需要接种0.4～0.5ml的全血量，以2～3张微核玻片计算，至少每张玻片中的双核细 胞数目为5000～7000个，但在计数分析阶段，并不会计数超出的细胞数目，从而造成多用的血液量的无端浪费。因此，需要开发出适用于更少量全血接种量的微核实验用的培养装置。

另外，细胞培养需要无微生物污染环境，即需要对所需细胞进行无菌的隔离培养，以避免环境例如空气中的各种微生物进入细胞培养体系，导致微生物污染。在疾病控制的现场工作环境中，由于条件简陋而通常很难通过外部设备保证无菌的条件。但是，现有技术中的培养瓶通常采用铝制的一体外壳(见图2B)，其在使用时不易去除，而且在去除过程中可能会影响内部橡胶塞的密封，从而导致瓶口附近的污染，并且由于高度/直径比较小，因此在培养过程中晃动时，培养液极易接触到瓶口，从而影响淋巴细胞的培养。为此，还需要能够简单、有效的能够保证无微生物污染的微核实验用的培养装置。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本实用新型的发明者们进行了反复研究，结果发现当采用瓶体高度与底面直径比为3～8∶1的长圆柱状的微量培养瓶时，不仅能够以微量的全血量进行淋巴细胞培养，而且能够保证淋巴细胞更好地无污染生长，从而完成了本实用新型。

具体而言，本实用新型涉及下述的技术方案。

(1)一种淋巴细胞微核实验用的微量培养装置，其特征在于，包含透明瓶体、弹性密封塞、位于弹性密封塞外侧并与瓶口锁扣的硬质外盖、以及装在透明瓶体内的2～4ml的微核实验用培养基，所述透明瓶体为长圆柱状且瓶体高度(H)与底面直径(D)比即H/D为3～8∶1，所述硬质外盖的上表面中心处具有能够去除的脱离部，所述培养基填充至瓶体高度的2/5～3/4。

(2)根据上述(1)所述的培养装置，其中，所述H/D为4～7∶1。

(3)根据上述(2)所述的培养装置，其中，所述H/D为5～6∶1。

(4)根据上述(1)所述的培养装置，其中，所述培养基为3ml。

(5)根据上述(1)所述的培养装置，其中，所述培养基填充至瓶体高度的1/2～2/3。

(6)根据上述(1)所述的培养装置，其中，所述培养基含有培养液、 胎牛血清或小牛血清、植物血凝素、抗生素和pH缓冲液。

(7)一种淋巴细胞微核实验用试剂盒，其特征在于，包含上述(1)～(5)中任一项所述的微量培养装置、装有细胞松弛素-B的试剂瓶和装有氯化钾的试剂瓶。

(8)根据上述(7)所述的淋巴细胞微核实验用试剂盒，其进一步包含装有固定液的试剂瓶、载玻片和/或注射器。

(9)根据上述(8)所述的淋巴细胞微核实验用试剂盒，所述固定液为甲醇或甲醇与冰醋酸的混合溶液。

根据本实用新型，能够提供可节约全血样本(仅需100～200微升)、并且使用安全，操作过程无溶液接触污染、淋巴细胞生长状态良好的淋巴细胞微核实验用的微量培养装置以及包含该微量培养装置的试剂盒。

附图说明

图1A为示意性表示本实用新型的微量培养装置的侧视图。

图1B为示意性表示本实用新型的微量培养装置的塑料外盖的结构的俯视图。

图2A为示意性表示现有技术的淋巴细胞培养装置的侧视图。

图2B为示意性表示现有技术的淋巴细胞培养装置的铝外盖的俯视图。

符号说明

1  微量培养装置 

2  透明瓶体

3  硬质外盖

4  脱离部

5  微核实验用培养基

6  牵拉部

7  脱离线

具体实施方式

下面参照附图对本实用新型进行说明，但是该附图仅仅是用于示意，本实用新型的内容并不受其限制。

本实用新型的淋巴细胞微核实验用的微量培养装置1的特征在于，包 含透明瓶体2、弹性密封塞、位于弹性密封塞外侧并与瓶口锁扣的硬质外盖3、以及装在透明瓶体内的2～4ml的微核实验用培养基5，所述透明瓶体2为长圆柱状且瓶体高度(H)与底面直径比(D)即H/D为3～8∶1，所述硬质外盖3的上表面中心处具有能够去除的脱离部4，所述培养基5填充至瓶体高度的2/5～3/4。

本实用新型中的透明瓶体1的材质没有特别限定，可以由任何透明的材质制成，但优选玻璃、塑料等。

所述透明瓶体2为长圆柱状且瓶体高度与底面直径比H/D为3～8∶1，优选为3.5～7∶1，更优选为4～6.5∶1，更优选为5～6∶1，最优选为5∶1。

由于从形状而言，本实用新型的微量培养装置与现有技术的培养瓶相比，同样高度时直径更小，因此能够在使用中节省空间，更加方便于携带和操作。

本实用新型中的弹性密封塞(未图示)将瓶口密封，并被硬质外盖所包覆，其材质也没有特别限定，只要是在注射器穿过注入全血样品后能够弹性回复而将针孔密封的弹性材料即可，可以为橡胶、硅胶等。通过具有该弹性密封塞，本实用新型的微量培养装置在全血样品注入中后仍能够保持密封的无菌状态，从而避免外部环境的污染。

本实用新型中的硬质外盖3位于弹性密封塞外侧并与瓶口锁扣，其上表面中心处具有能够去除的脱离部4，脱离部4上可具有牵拉部6，在使用时，可以通过着力于牵拉部而将脱离部4沿脱离线7除去，而不必将该硬质外盖3整个除去，从而使用方便、避免污染。其中，脱离线7可以是硬质外盖3的材质非连续连接而形成的(如附图1B所示)，也可以是经过机械压制而使其厚度变薄而形成的，其具体形成方式没有特别限制，只要在脱离线处脱离部在外力作用下能够脱离即可。

本实用新型的微量培养装置1还包含装在透明瓶体2内部的微核实验用培养基5，对于该培养基5的组成并没有特别限定，可以使用现有技术中的微核实验用液体培养基等。例如，该液态培养基中可含有1640培养液、胎牛血清或小牛血清、植物血凝素PHA、抗生素和pH缓冲液；

所述培养液优选采用1640固体培养基用HEPES缓冲液按其说明书所示的比例配置而成的液体培养基；

所述抗生素可以为青霉素、链霉素等，可以单独使用一种抗生素，也 可以将两种或两种以上的抗生素并用；

所述pH缓冲液只要能够将培养基的pH调节至7.2～7.4即可，没有特别限定，例如可以是HEPES缓冲液、碳酸氢钠缓冲液等，优选碳酸氢钠缓冲液。

作为一个例子，可以使用下述表1所示配方的培养基。

表1

本实用新型的微量培养装置1中包含的培养基5的量可以为2～4ml，优选为2ml或3ml，由于相比于现有技术，所采用的培养基量减少，因此能够相应地减少所需的全血量，例如可仅使用100～200微升等。

本实用新型中，所述培养基5填充至瓶体高度的2/5～3/4，优选为瓶体高度的1/2～2/3，进一步优选为2/3。由于本实用新型的微量培养装置1比现有技术中的培养瓶(如图2所示)的瓶体高度与直径比大并且培养基的填充高度高，因此在培养中能够使淋巴细胞更好地悬浮生长，从而保证很好的淋巴细胞生长状态。而且，由于在摇晃时不需要很大的倾斜角度即可将其混匀，因此还能够避免接触被认为可能存在污染的瓶口部分，从而进一步解决了易污染的问题。

本实用新型的淋巴细胞微核实验用试剂盒的特征在于，包含上述微量培养装置1、装有细胞松弛素-B的试剂瓶和装有氯化钾的试剂瓶，另外，其中根据实际需要，还可以包含装有固定液的试剂瓶、载玻片和/或注射器、以及对试剂盒的使用方法进行说明的说明书等。

淋巴细胞培养(例如在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养42～44小时)结束后加入所述细胞松弛素-B，使其达到规定的终浓度(例如6μg/ml)，以抑制淋巴细胞的细胞质***，从而成为双核细胞；

所述氯化钾用于对淋巴细胞进行低渗处理，是试剂盒必不可少的部分。

所述固定液用于对淋巴细胞进行固定处理，以获得淋巴细胞微核涂片，该固定液可以为甲醇、或者是甲醇与冰醋酸(如甲醇∶冰醋酸＝4∶1)的混 合溶液等。

本实用新型中，每一试剂盒中的各部分可以分别具有1～100份，没有特殊的限定，可以根据实际需要来具体确定，如各为1、10、20、30、40、50、60、70、80等份，具体地作为试剂盒的一个例子，例如包含50个本实用新型的微量培养装置，1个装有细胞松弛素-B的试剂瓶、1个装有固定液的试剂瓶、1个装有氯化钾的试剂瓶、并可选地具有50～60片载玻片、50～60个注射器等，1份使用说明书以及1个能够容纳上述各部分的容器等。另外，根据具体微核实验的需要，还可以在试剂盒中包括阳性对照或者阴性对照，常用的阳性对照例如有博来霉素等。

本实用新型的淋巴细胞微核实验用试剂盒操作方便，并能够保证较好的无菌培养条件，因此能够在临床、实验室以及疾病控制现场等条件下方便地用于微核实验，具有很高的职业卫生健康监护和临床应用价值。

实施例

下面通过实施例对本实用新型的微量培养装置进行具体说明，但是需要说明的是，本实用新型并不受下面具体实施例的限定。

实施例1：微量培养装置

1、准备瓶体高度与底面直径比为5∶1，且底面直径为1cm的透明玻璃瓶50个。

2、微核实验用培养基的制备

(1)用于制备培养基的材料准备如下：

1640固体培养基和胎牛血清，购自Gibco公司；将1640固体培养基按照其说明书的记载用HEPES缓冲液配置成液体。

植物血凝素(PHA)、细胞松弛素-B(Cyt-B)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；

双抗(青霉素、链霉素)，购自华北制药股份有限公司；

碳酸氢钠，购自北京化学试剂公司，配置成3.5％碳酸氢钠缓冲液。

(2)按下述比例配制培养基

表2

(3)将配置好并过滤除菌得到的150ml培养基分装到50个透明玻璃瓶中，使每个玻璃瓶中的培养基为3ml，密封，获得本实用新型的淋巴细胞微核实验用的微量培养装置。

实施例2：微核实验用试剂盒

将50个实施例1制备的微量培养装置、1个装有2mg/ml细胞松弛素-B的6ml棕黑色试剂瓶、1个装有0.75mol/l氯化钾溶液的6ml试剂瓶、1个装有固定液(甲醇∶冰醋酸＝4∶1)的混合溶液的试剂瓶装入容器，构成试剂盒。

试剂盒的具体使用步骤示例如下：

1、抽取待测对象的静脉血2ml，与肝素混匀后，分别各取0.2ml注入到10个微量培养装置中；

2、将微量培养装置置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养42～44小时；

3、加入细胞松弛素-B，使终浓度为6μg/ml，继续培养至72小时；

4、将含血细胞的培养液移至5ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清后收获细胞；

5、向细胞中加入1ml 0.075mol/l KCL，轻轻吹打混匀，37℃放置2-3分钟；

6、逐滴加入固定液1ml吸管吹打混匀后，1000rpm离心8分钟，吸弃上清；

7、加入5ml的固定液(甲醇∶冰醋酸＝4∶1)中固定10分钟后滴片；

8、玻片干燥后使用10％Gimsa染液染色，显微镜下观察、记数，进行评价。

根据本实用新型，能够提供可节约全血样本(仅需100～200微升)、并且使用安全，操作过程无溶液接触污染、淋巴细胞生长状态良好的淋巴细 胞微核实验用的微量培养装置以及包含该微量培养装置的试剂盒。

以上对本实用新型的微量培养装置以及微核实验用试剂盒进行了说明，但是本领域技术人员应当理解的是，在不脱离本实用新型主旨的前提下，各要素均可以进行适当的变更和替换，通过这些变更和替换获得的技术方案同样包含在本实用新型的权利要求范围内。

Claims (8)

1.一种淋巴细胞微核实验用的微量培养装置，其特征在于，包含透明瓶体、弹性密封塞、位于弹性密封塞外侧并与瓶口锁扣的硬质外盖、以及装在透明瓶体内的2～4ml的微核实验用培养基，所述透明瓶体为长圆柱状且瓶体高度(H)与底面直径(D)比即H/D为3～8∶1，所述硬质外盖的上表面中心处具有能够去除的脱离部，所述培养基填充至瓶体高度的2/5～3/4。

2.根据权利要求1所述的培养装置，其中，所述H/D为4～7∶1。

3.根据权利要求2所述的培养装置，其中，所述H/D为5～6∶1。

4.根据权利要求1所述的培养装置，其中，所述培养基为3ml。

5.根据权利要求1所述的培养装置，其中，所述培养基填充至瓶体高度的1/2～2/3。

6.根据权利要求1所述的培养装置，其中，所述培养基含有培养液、胎牛血清或小牛血清、植物血凝素、抗生素和pH缓冲液。

7.一种淋巴细胞微核实验用试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～5中任一项所述的微量培养装置、装有细胞松弛素-B的试剂瓶和装有氯化钾的试剂瓶。

8.根据权利要求7所述的淋巴细胞微核实验用试剂盒，其进一步包含装有固定液的试剂瓶、载玻片和/或注射器。