CN203303034U - 一种生物神经环路活体成像*** - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种生物神经环路活体成像***，其包括多模式可调光源装置、生物行为成像装置、三轴载物运动装置、感兴趣区域实时追踪装置、生物神经环路成像装置和控制装置，多模式可调光源装置向放置在三轴载物运动装置上的经荧光标记的生物样本投射照明光以及激发光；生物行为成像装置用于获取生物样本的行为活动视频，输送给控制装置，控制装置控制三轴载物运动装置的运动，对生物样本进行实时锁定；感兴趣区域实时追踪装置用于将生物样本中生物神经环路感兴趣区域进行实时锁定；生物神经环路成像装置与生物行为成像装置同步、用于获取生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视频。本实用新型能够实现生物行为活动与其神经环路的多尺度精确同步成像，可以用于开展小型模式生物神经环路的活体成像研究。

Description

一种生物神经环路活体成像***

技术领域

本实用新型涉及成像装置，尤其涉及一种生物神经环路活体成像***。

背景技术

目前国际领先的光学显微成像技术包括受激发射减损（STED）、结构照明（SIM）和全反射结构照明（TIRF-SIM），光敏定位（PALM）和荧光光敏定位（FPALM），随机光学重建（STORM）等，这些成像技术均突破了原有显微成像技术的成像性能。光学显微成像性能主要包含时间分辨率、空间分辨率、视场和信噪比。在实际成像***中，上述性能指标之间存在相互制约，即追求某一项性能指标的提升都是以其它一项或多项性能指标的下降为代价实现的。例如，高空间分辨率成像技术会牺牲时间分辨率，高时间分辨率成像技术会牺牲空间分辨率和信噪比，大视场成像技术会牺牲空间和时间分辨率等。目前国内外研制成功的生物显微成像技术，其时间分辨率处于50Hz水平，尚无法捕捉动作电位（微米以及亚微米级尺寸）在神经环路中100Hz以上的快速精细运动。

发明内容

本实用新型的目的是提出一种生物神经环路活体成像***，该成像***能够实现生物行为活动与其神经环路的多尺度精确同步成像，可以用于开展小型模式生物神经环路的活体成像研究。

为实现上述目的，本实用新型提供了以下技术方案：

一种生物神经环路活体成像***，其包括多模式可调光源装置、生物行为成像装置、三轴载物运动装置、感兴趣区域实时追踪装置、生物神经环路成像装置和控制装置，其中：所述多模式可调光源装置向放置在所述三轴载物运动装置上的经荧光标记的生物样本投射照明光以及激发光；所述生物行为成像装置用于获取所述生物样本的行为活动视频，输送给所述控制装置，所述控制装置控制所述三轴载物运动装置的运动，对所述生物样本进行实时锁定；所述感兴趣区域实时追踪装置用于将所述生物样本中生物神经环路感兴趣区域进行实时锁定；所述生物神经环路成像装置与所述生物行为成像装置同步、用于获取所述生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视频。

进一步地，所述感兴趣区域实时追踪装置包括高速相机、第一二轴扫描镜、显微物镜和第一分光片，其中：所述多模式可调光源装置出射的第一激发光通过所述显微物镜投射在所述生物样本上，所述生物样本内的标记荧光受此激发后产生的第一发射光依次经由所述显微物镜、第一二轴扫描镜和第一分光片，在所述高速相机成像；所述控制装置获取所述高速相机的图像，并通过图像处理算法估计所述高速相机拍摄的当前帧和上一帧图像中感兴趣区域内少数荧光结构的两轴平移量，控制所述第一二轴扫描镜的动作以完成感兴趣区域的平移运动补偿，使所述生物样本中生物神经环路感兴趣区域实时锁定在100×100μm的中心视场。

进一步地，所述感兴趣区域实时追踪装置还包括聚焦透镜和二向色分光片，其中：所述多模式可调光源装置出射的第一激发光依次经由聚焦透镜和二向色分光片，所述二向色分光片的反射光通过所述显微物镜投射所述生物样本。

进一步地，所述生物神经环路成像装置包括科学级相机和第二二轴扫描镜；其中：所述多模式可调光源装置出射的第二激发光通过所述显微物镜投射在所述生物样本上，所述生物样本内的标记荧光受此激发后产生的第二发射光依次经由所述显微物镜、二向色分光片、第一二轴扫描镜和第一分光片，投射在所述科学级相机上，得到由若干个帧内不同时刻生物神经环路感兴趣区域图像经阵列排布组成的图像，并同步传输给所述控制装置；所述控制装置根据所述科学级相机的外触发信号同步控制所述第二二轴扫描镜在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的移动切换。

进一步地，所述生物神经环路成像装置还包括薄膜变形镜；所述薄膜变形镜设置在所述第一分光片与所述第二二轴扫描镜之间的光路中，并与所述显微物镜的主平面满足物像共轭位置关系；所述控制装置根据预先标定好的生物神经环路感兴趣区域对应图像各个子视场的波前像差分布，控制所述薄膜变形镜在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的波前像差补偿。

进一步地，所述生物神经环路成像装置还包括可调视场光阑；所述可调视场光阑设置在所述第一分光片与所述薄膜变形镜之间的中继像面上的矩形通光区域，所述第一二轴扫描镜的动作能够使所述生物样本的生物神经环路感兴趣区域锁定在所述矩形通光区域内。

进一步地，所述生物神经环路成像装置还包括第一滤光片、反射镜和五棱镜，其中：所述第一滤光片设置在所述可调视场光阑与所述薄膜变形镜之间的光路中，透射光经由所述薄膜变形镜依次经由所述反射镜和五棱镜，投射在所述第二二轴扫描镜上。

进一步地，所述生物行为成像装置获取所述生物样本在照明光照射下的行为活动视频时，所述控制装置通过图像处理算法估计所述生物行为成像装置拍摄的当前帧和上一帧图像中所述生物样本的两个平移量和旋转量，通过控制所述三轴载物运动装置完成包含两个平移量和一个旋转量的生物行为成像帧间运动补偿，使所述生物样本实时锁定在5×5mm的中心视场。

进一步地，所述生物行为成像装置为0.7～4.5×变焦镜组、同轴照明光路和工业级相机。

进一步地，所述控制装置包括计算机和FPGA(Field Programmable Gate Array，现场可编程门阵列)，其中：所述计算机用于接收外界传输的各种图像信息和完成一部分计算复杂度不高的图像处理算法，经由所述FPGA完成剩余的图像处理算法和精确控制各个硬件设备的操作时序以实现同步。

进一步地，所述第一二轴扫描镜和所述第二二轴扫描镜的时间带宽均为5kHz，所述薄膜变形镜的时间带宽为10kHz。

基于上述技术方案中的任一技术方案，本实用新型实施例至少可以产生如下技术效果：

由于本实用新型设置了多模式可调光源装置、生物行为成像装置、三轴载物运动装置、感兴趣区域实时追踪装置、生物神经环路成像装置和控制装置，多模式可调光源装置向放置在三轴载物运动装置上的经荧光标记的生物样本投射照明光以及激发光；生物行为成像装置获取生物样本的行为活动视频，并输送给控制装置，控制装置控制三轴载物运动装置的运动，对生物样本的活动区域进行实时锁定；感兴趣区域实时追踪装置能够对生物样本中感兴趣区域进行高速精确地补偿进而实现实时锁定；生物神经环路成像装置与生物行为成像装置同步，用于获取生物样本的神经环路视频，由此可以看出，本实用新型具有对生物小目标和生物感兴趣区域（神经环路）的实时追踪功能，能够实现生物行为活动与其神经环路的多尺度精确同步成像，因此利用本实用新型可以开展小型模式生物神经环路信息传递的活体成像研究，进而可以开展小型模式生物神经***的动力学机制研究。

除此之外，本实用新型的优选技术方案至少还存在以下优点：

1、由于本实用新型中的多模式可调光源装置出射的第一激发光通过显微物镜投射在生物样本上，生物样本内的荧光受此激发后产生的第一发射光依次经由显微物镜、二向色分光片、第一二轴扫描镜和第一分光片；第一分光片的反射光在高速相机成像；控制装置通过获取高速相机的图像，并通过图像处理算法估计高速相机拍摄的当前帧和上一帧图像中感兴趣区域内少数荧光结构的两轴平移量，控制第一二轴扫描镜的动作以完成感兴趣区域的平移运动补偿，从而可以将生物样本中生物神经环路感兴趣区域实时锁定在100×100μm的中心视场，因此本实用新型具有视场要求小的优势，进而为本实用新型同时具备高时间分辨率和高空间分辨率的显微成像性能提供了有利条件。

2、由于本实用新型中的多模式可调光源装置出射的第二激发光通过显微物镜投射在生物样本上，生物样本内的荧光受此激发后产生的第二发射光依次经由显微物镜、二向色分光片、第一二轴扫描镜和第一分光片；第一分光片的透射光通过第二二轴扫描镜投射至在科学级相机，得到由若干个帧内不同时刻生物神经环路感兴趣区域图像经阵列排布组成的图像，并同步传输给控制装置；控制装置根据科学级相机的外触发信号同步控制第二二轴扫描镜在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的移动切换，加之本实用新型所获取的生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视场范围要求非常小，也就是说，对于时间分辨率、空间分辨率、视场和信噪比四个相互制约的光学显微成像性能来说，本实用新型通过引入第二二轴扫描镜并运用像元时分复用技术实现了科学级相机的超帧频成像性能，由此实现生物神经环路感兴趣区域成像的高时间分辨率。

3、由于本实用新型还在第一分光片与第二二轴扫描镜之间的光路设置了薄膜变形镜，控制装置根据预先标定好的生物神经环路感兴趣区域对应图像各个子视场的波前像差分布，控制薄膜变形镜在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的波前像差补偿，本实用新型通过引入薄膜变形镜并运用波前像差校正技术实现了生物神经环路感兴趣区域成像的高空间分辨率。

4、由于本实用新型的生物行为成像装置在获取生物样本的行为活动视频时，控制装置便可以通过图像处理算法估计生物行为成像装置拍摄的当前帧和上一帧图像中生物样本的两个平移量和旋转量，然后通过控制三轴载物运动装置完成包含两个平移量和一个旋转量的生物行为成像帧间运动补偿，因此可以将生物样本实时锁定在5×5mm的中心视场。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本实用新型的进一步理解，构成本申请的一部分，本实用新型的示意性实施例及其说明用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的不当限定。在附图中：

图1为本实用新型所提供的生物神经环路活体成像***的一实施例的原理示意图；

图2为利用本实用新型所提供的生物神经环路活体成像***获得的生物行为活动与神经环路的同步成像示意图；

图3为图1中感兴趣区域实时追踪装置的一实施例的原理示意图；

图4为图1中感兴趣区域实时追踪装置的另一实施例的原理示意图；

图5为图1中生物神经环路成像装置的第一实施例的原理示意图；

图6为图1中生物神经环路成像装置的第二实施例的原理示意图；

图7为图1中生物神经环路成像装置的第三实施例的原理示意图；

图8为图1中生物神经环路成像装置的第四实施例的原理示意图；

图9为图1的结构示意图；

图10为图1中多模式可调光源装置的结构示意图；

图11为科学级相机超帧频时分复用的原理图；

图12为控制装置的原理示意图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本实用新型的技术方案做进一步的详细描述。

本实用新型中所采用的生物样本是未限制活动自由的活体。首先需要对生物样本的生物神经环路感兴趣区域进行荧光标记，再利用特定波段的激发光对生物样本感兴趣区域进行激发，然后利用本实用新型所提供的生物神经环路活体成像***，同步获取生物样本的行为活动视频以及生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视频（如图2所示）。

如图1-10所示，本实施例所提供的生物神经环路活体成像***包括多模式可调光源装置1、生物行为成像装置2、三轴载物运动装置3、感兴趣区域实时追踪装置4、生物神经环路成像装置5和控制装置6。其中：多模式可调光源装置1向放置在三轴载物运动装置3上的生物样本投射照明光以及激发光。生物行为成像装置2用于获取生物样本的行为活动视频，输送给控制装置6，控制装置6控制三轴载物运动装置3的运动，将生物样本的行为活动实时锁定在5×5mm的中心视场。感兴趣区域实时追踪装置4用于将生物样本中生物神经环路感兴趣区域实时锁定在100×100μm的中心视场。生物神经环路成像装置5与生物行为成像装置2同步、用于获取生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视频。

如图10所示，多模式可调光源装置1为观测生物样本提供反射型和透射型的照明光和激发光，其光源模式包括窄谱带光、宽谱带光和激光。各种模式下的光源的出光强度均可调节。其中，宽谱带光可作为照明光源使用，激光和窄谱宽光可作为激发光源使用。窄谱带光和宽谱带光均可由卤素灯11以及滤光片12来实现，激光可由单台半导体激光器15来实现，也可以由多台半导体激光器15、16和17通过合束器18来实现。对于以上三种光源模式的输出均使用光纤跳线13连接到已五维定位的FC/PC光纤调整架上，上述设计可避免更换光源模式时重复调整光源在光路中的定位。此外，使用光纤跳线13可进一步整合出射光斑的均匀性并控制出射光斑的数值孔径，光纤跳线13的两端均采用FC/PC接口14。

生物行为成像装置2获取生物样本在照明光照射下的行为活动视频时，控制装置6通过图像处理算法估计生物行为成像装置2拍摄到的当前帧和上一帧图像中生物样本的两个平移量（图9中示出的x轴和y轴平移量）和z轴（图9中示出的z轴旋转量），通过控制三轴载物运动装置3，完成包含两个平移量和一个旋转量的生物行为成像帧间运动补偿。

本实施例中，生物行为成像装置2包括0.7～4.5×变焦镜组、同轴照明光路和工业级相机。其中：变焦镜组的成像放大率可以调节，同轴照明光路用于将多模式可调光源装置1出射的照明光投射并覆盖整个生物样本。工业级相机能够完成针对成像目标的自动对焦，即通过电动平移台移动成像相机和前置镜头，通常完成5-7步移动，工业级相机实时传输每步的图像信号给控制装置6，控制装置6分析每步图像中感兴趣目标的轮廓的锐利程度，由此拟合出准确的焦面位置，从而再经一次移动完成精确对焦。

三轴载物运动装置3包括一个支撑平台31、培养皿32和三轴驱动机构（图中未示出）。培养皿32用于放置生物样本，其直径可以选用不超出90mm的任意规格。培养皿32通常是固定在支撑平台31中央。所述三轴驱动机构为支撑平台31的x轴平移、y轴平移和z轴旋转提供驱动力，其中的三轴指的是图10中示出的x轴、y轴和z轴。

作为三轴驱动机构的一种实现方式，三轴驱动机构可以包括平台控制器、压电陶瓷致动器、光栅尺、步进电机控制器和步进电机。当进行x轴和y轴平移控制的时候，控制装置6将x轴和y轴平移量转换成控制指令，并将控制指令经由1000M网线传输给两个平台控制器，两个平台控制器再驱动支撑平台31的前端的压电陶瓷致动器（Piezoceramic Motor）作高速闭环运动，运动过程中一直由光栅尺监测支撑平台31的当前位置，由此反馈控制压电陶瓷致动器的运动，最终实现精密的x轴和y轴平移运动。当进行Z轴旋转控制的时候，控制装置6将支撑平台31的旋转运动量转换成控制指令，并将控制指令经由RS232串口线传输给步进电机控制器，步进电机控制器再驱动步进电机完成旋转运动，以控制支撑平台31的旋转运动，其中没有测量反馈控制。本实施例中，三轴载物运动装置3的运动时间带宽是10Hz，定位精度10μm。

如图3、图9所示，感兴趣区域实时追踪装置4包括高速相机41、第一二轴扫描镜42、显微物镜43和第一分光片44，其中：多模式可调光源装置1出射中心波长为405nm的第一激发光，该激发光通过显微物镜43投射在生物样本上，生物样本内的标记荧光受此激发产生谱段为500～520nm的第一发射光，并依次通过显微物镜43、第一二轴扫描镜42和第一分光片44。

第一分光片44的作用是反射波长小于530nm的光，透射大于530nm的光。由于生物样本内激发出的第一发射光波长小于530nm，因此，该部分发射荧光全被第一分光片44反射到高速相机41上，并在高速相机41成像。

控制装置6同步获取高速相机41的图像，并通过图像处理算法估计高速相机41拍摄的当前帧和上一帧图像中感兴趣区域内少数荧光结构的两轴平移量，从而控制第一二轴扫描镜42的动作（摆动方向和幅度），以完成感兴趣区域的平移运动补偿，将生物样本中生物神经环路感兴趣区域实时锁定在100×100μm的中心视场。

本实施例中，高速相机41能够完成针对成像目标的自动对焦，其自动变焦的原理与工业级相机22相同，在此不再详述。第一二轴扫描镜42必须在帧间的等待时间内完成动作，之后静止下来，即进入图像曝光时间，让高速相机41完成曝光。例如，第一二轴扫描镜42的时间带宽为5kHz，即是单步运动时间要求在200μs内完成。显微物镜43采用的是数值孔径0.6～0.8、工作距离0.5～2.0mm、放大倍率25～60的显微物镜。

如图4、图9所示，上述实施例中，感兴趣区域实时追踪装置4还可以包括聚焦透镜45和二向色分光片46，其中：多模式可调光源装置1出射中心波长为405nm的第一激发光，依次经由聚焦透镜45和二向色分光片46，投射到显微物镜43上，并且，该激发光通过显微物镜43投射在生物样本上，生物样本内的标记荧光受此激发产生谱段为500～520nm的第一发射光，并依次通过显微物镜43、二向色分光片46、第一二轴扫描镜42和第一分光片44，直至在高速相机41上成像。

聚焦透镜45可以作轴向移动用以改变第一激发光的聚焦面位置，由此实现对投射在生物样本上的激发光光斑大小的控制，即在焦平面附件光斑很小能量集中，在离焦平面上光斑较大，从而实现控制激发光仅照射生物样本的感兴趣区域。聚焦透镜45的轴向移动可以通过手动方式完成，也可以采用电控的方式实现。

二向色分光片46的作用是反射波长小于500nm的光，透射大于500nm的光。中心波长为405nm的第一激发光经由二向色分光片46的反射，通过显微物镜43透射到生物样本上。由于生物样本内的标记荧光受此激发后产生谱段为500～520nm的第一发射光，因此，该谱段发射光再经由显微物镜43，到达二向色分光片46，二向色分光片46将其全部透射到第一二轴扫描镜42上。

如图11所示，由于科学级相机的成像帧频最高50Hz，无法满足本实用新型对神经环路成像的时间分辨率1000Hz的要求，因此必须设法让该科学级相机在一帧曝光时间，即20ms内实现分时复用，因此本实用新型引入了第二二轴扫描镜52。考虑到神经环路成像的视场可以是500×500像素，科学级相机的全视场是2560×2160像素。于是将科学级相机的全视场划分为5×4个子视场，子视场间空余几行、几列即可。也就是说，图11中的A是科学级相机的全视场，B是神经环路成像的子视场。使用第二二轴扫描镜52，可以将中心视场平移到任意子视场。若要求每个子视场曝光时间800μs，子视场帧间运动时间为200μs，帧间运动时间内第一二轴扫描镜42必须完成感兴趣区域运动补偿以及第二二轴扫描镜52必须完成子视场的平移（如图11所示）。

基于以上原因，如图5、图9和图11所示，生物神经环路成像装置5包括科学级相机51和第二二轴扫描镜52，其中：多模式可调光源装置1出射中心波长为488nm的第二激发光，通过显微物镜43投射在生物样本上，生物样本内的标记荧光受此激发后产生波长为530～560nm的第二发射光，并依次经由显微物镜43、二向色分光片46、第一二轴扫描镜42和第一分光片44。二向色分光片46仅透射波长大于500nm的发射荧光至第一二轴扫描镜42，第一分光片44仅透射波长大于530nm的发射荧光至第二二轴扫描镜52，经由第二二轴扫描镜52反射后，在科学级相机51成像，得到由若干个帧内不同时刻生物神经环路感兴趣区域图像经阵列排布组成的图像，并同步传输给控制装置6。控制装置6根据科学级相机51的外触发信号同步控制第二二轴扫描镜52在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的移动切换，从而可以获得1000Hz成像时间分辨率的生物神经环路活体成像。

加之本实用新型所获取的生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视场范围要求非常小，也就是说，对于时间分辨率、空间分辨率、视场和信噪比四个相互制约的光学显微成像性能来说，本实用新型通过引入第二二轴扫描镜并运用像元时分复用技术实现了科学级相机的超帧频成像性能，由此实现生物神经环路感兴趣区域成像的高时间分辨率。

本实施例中，科学级相机51能够完成针对成像目标的自动对焦，其自动变焦的原理与工业级相机22相同，在此不再详述。科学级相机51的大数据量传输需同时满足相机缓存、CameraLink接口、PCI-E总线、计算机内存、计算机硬盘写入的速度要求。第二二轴扫描镜52的时间带宽为5kHz。

同理，为了获得生物神经环路感兴趣区域成像的高空间分辨率，生物神经环路成像装置5还包括薄膜变形镜53（如图6、图9所示），薄膜变形镜53设置在第一分光片44与第二二轴扫描镜52之间的光路中，并同显微物镜43的主平面满足物像共轭位置关系。

以上所提到的第一激发光、第二激发光、第一发射光和第二发射光，以及对应的所有二向色分光片、滤光片的波长、波段并不局限于上述实施例中所给出的具体数值，这些波长和波段的具体数值均可根据关注的特征荧光波长来自行改换设计。

控制装置6根据事先标定好的生物神经环路感兴趣区域对应图像各个子视场的波前像差分布，控制薄膜变形镜53在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的波前像差补偿。

基于第一二轴扫描镜42在子视场帧间运动时间内对感兴趣区域的运动补偿以及第二二轴扫描镜52在子视场帧间运动时间内对子视场的移动切换，再结合薄膜变形镜53在子视场帧间运动时间内对各子视场的波前像差校正，本实用新型可以使每个子视场的成像空间分辨率优于0.5μm，曝光时间控制为800μs，帧间运动时间控制为200μs，由此实现1000Hz的成像时间分辨率。

本实施例中，薄膜变形镜53采用的是可高速、精确电控镜面面形的特殊类反射镜，时间带宽为10kHz。本实用新型运用波前像差校正技术可实现对光学***不同视场像差的实时校正，使得神经环路成像接近***衍射极限的高空间分辨率，即可以获得优于0.5μm空间分辨率的生物神经环路活体成像。

如图7、图9所示，生物神经环路成像装置5还包括可调视场光阑54，可调视场光阑54设置在第一分光片44与薄膜变形镜53之间的中继像面上的矩形通光区域，矩形通光区域的长度和宽度可电动调节，以保证生物样本的生物神经环路感兴趣区域经由感兴趣区域实时追踪装置4静止位于可调视场光阑54的矩形通光区域内。

如图8、图9所示，生物神经环路成像装置5还可以包括第一滤光片55、反射镜56和五棱镜57，其中：第一滤光片55设置在可调视场光阑54与薄膜变形镜53之间的光路中。第一滤光片55仅透射波长小于600nm的发射荧光至薄膜变形镜53，经由薄膜变形镜53反射的发射荧光依次经由反射镜56和五棱镜57，投射在第二二轴扫描镜52上。五棱镜57的作用是确保平行光产生90度折转，以投射到第二二轴扫描镜52上。

上述各实施例中，如图12所示，控制装置6包括计算机61和具有独立处理器和操作***的FPGA62，其中：计算机61用于接收外界传输的各种图像信息和完成一部分计算复杂度不高的图像处理算法，经由FPGA62完成剩余的图像处理算法和精确控制各个硬件设备的操作时序以实现同步。

基于本实用新型所获取的生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视场范围要求非常小，也就是说，对于时间分辨率、空间分辨率、视场和信噪比四个相互制约的光学显微成像性能来说，本实用新型通过引入第二二轴扫描镜并运用像元时分复用技术实现了科学级相机的超帧频成像性能，同时结合引入薄膜变形镜并运用波前像差校正技术，同时实现了生物神经环路感兴趣区域成像的0.5μm成像空间分辨率和1000Hz成像时间分辨率的双高水平，对生物行为和生物神经环路感兴趣区域在长时间序列下（0.5-1.0小时）进行同步成像。

最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本实用新型进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本实用新型的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本实用新型技术方案的精神，其均应涵盖在本实用新型请求保护的技术方案范围当中。

Claims (11)

1.一种生物神经环路活体成像***，其特征在于：

包括多模式可调光源装置、生物行为成像装置、三轴载物运动装置、感兴趣区域实时追踪装置、生物神经环路成像装置和控制装置，其中：

所述多模式可调光源装置向放置在所述三轴载物运动装置上的经荧光标记的生物样本投射照明光以及激发光；

所述生物行为成像装置用于获取所述生物样本的行为活动视频，输送给所述控制装置，所述控制装置控制所述三轴载物运动装置的运动，对所述生物样本进行实时锁定；

所述感兴趣区域实时追踪装置用于将所述生物样本中生物神经环路感兴趣区域进行实时锁定；

所述生物神经环路成像装置与所述生物行为成像装置同步、用于获取所述生物样本中生物神经环路感兴趣区域的视频。

2.如权利要求1所述的***，其特征在于：

所述感兴趣区域实时追踪装置包括高速相机、第一二轴扫描镜、显微物镜和第一分光片，其中：

所述多模式可调光源装置出射的第一激发光通过所述显微物镜投射在所述生物样本上，所述生物样本内的标记荧光受此激发后产生的第一发射光依次经由所述显微物镜、第一二轴扫描镜和第一分光片，在所述高速相机成像；

所述控制装置获取所述高速相机的图像，并通过图像处理算法估计所述高速相机拍摄的当前帧和上一帧图像中感兴趣区域内少数荧光结构的两轴平移量，控制所述第一二轴扫描镜的动作以完成感兴趣区域的平移运动补偿，使所述生物样本中生物神经环路感兴趣区域实时锁定在100×100μm的中心视场。

3.如权利要求2所述的***，其特征在于：

所述感兴趣区域实时追踪装置还包括聚焦透镜和二向色分光片，其中：

所述多模式可调光源装置出射的第一激发光依次经由聚焦透镜和二向色分光片，所述二向色分光片的反射光通过所述显微物镜投射所述生物样本。

4.如权利要求3所述的***，其特征在于：

所述生物神经环路成像装置包括科学级相机和第二二轴扫描镜；其中：

所述多模式可调光源装置出射的第二激发光通过所述显微物镜投射在所述生物样本上，所述生物样本内的标记荧光受此激发后产生的第二发射光依次经由所述显微物镜、二向色分光片、第一二轴扫描镜和第一分光片，投射在所述科学级相机上，得到由若干个帧内不同时刻生物神经环路感兴趣区域图像经阵列排布组成的图像，并同步传输给所述控制装置；

所述控制装置根据所述科学级相机的外触发信号同步控制所述第二二轴扫描镜在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的移动切换。

5.如权利要求4所述的***，其特征在于：

所述生物神经环路成像装置还包括薄膜变形镜；

所述薄膜变形镜设置在所述第一分光片与所述第二二轴扫描镜之间的光路中，并与所述显微物镜的主平面满足物像共轭位置关系；

所述控制装置根据预先标定好的生物神经环路感兴趣区域对应图像各个子视场的波前像差分布，控制所述薄膜变形镜在相机的帧内和帧间逐一完成生物神经环路感兴趣区域对应图像子视场的波前像差补偿。

6.如权利要求5所述的***，其特征在于：

所述生物神经环路成像装置还包括可调视场光阑；

所述可调视场光阑设置在所述第一分光片与所述薄膜变形镜之间的中继像面上的矩形通光区域，所述第一二轴扫描镜的动作能够使所述生物样本的生物神经环路感兴趣区域锁定在所述矩形通光区域内。

7.如权利要求6所述的***，其特征在于：

所述生物神经环路成像装置还包括第一滤光片、反射镜和五棱镜，其中：

所述第一滤光片设置在所述可调视场光阑与所述薄膜变形镜之间的光路中，透射光经由所述薄膜变形镜依次经由所述反射镜和五棱镜，投射在所述第二二轴扫描镜上。

8.如权利要求1所述的***，其特征在于：

所述生物行为成像装置获取所述生物样本在照明光照射下的行为活动视频时，所述控制装置通过图像处理算法估计所述生物行为成像装置拍摄的当前帧和上一帧图像中所述生物样本的两个平移量和旋转量，通过控制所述三轴载物运动装置完成包含两个平移量和一个旋转量的生物行为成像帧间运动补偿，使所述生物样本实时锁定在5×5mm的中心视场。

9.如权利要求8所述的***，其特征在于：

所述生物行为成像装置为0.7～4.5放大倍率变焦镜组、同轴照明光路和工业级相机。

10.如权利要求1-9中任一项所述的***，其特征在于：

所述控制装置包括计算机和FPGA，其中：

所述计算机用于接收外界传输的各种图像信息和完成一部分计算复杂度不高的图像处理算法，经由所述FPGA完成剩余的图像处理算法和精确控制各个硬件设备的操作时序以实现同步。

11.如权利要求4所述的***，其特征在于：

所述第一二轴扫描镜和所述第二二轴扫描镜的时间带宽均为5kHz，所述薄膜变形镜的时间带宽为10kHz。

Images