CN202903791U - T-2毒素elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括：96孔酶标板、浓缩酶结合物、酶结合物稀释液、6个浓度的标准品溶液、底物液A液、底物液B液、终止液。采用竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的T-2毒素与酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争T-2毒素的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含T-2毒素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中T-2毒素的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在T-2毒素的残留检测中发挥重要作用。

Description

T-2毒素ELISA检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒。 

背景技术

T-2毒素（T-2 toxin）是镰刀菌所产生的单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种，能导致动物产生中毒反应的次级代谢物质，它广泛分布于自然界，常在被污染的田间作物和库存谷物中发现。无论饲料中T-2毒素的含量是高水平还是低水平均会导致动物采食量下降、增重缓慢、免疫***损伤等。研究表明，T-2毒素对人和动物表现出基因毒性、免疫毒性、血液毒性等多种毒性，并可致多种细胞凋亡。1973年***粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席会议上，把T-2毒素同黄曲霉毒素一样作为自然存在的最危险的食品污染源。 

T-2毒素的测定方法主要有薄层色谱法（TCL）、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、放射性免疫检测法、酶联免疫法等，TLC法是最早最常用的检测方法之一，具有操作简单、费用低廉、分离效果好、分离速度快等优点，是一种常见的检测方法，但是还存在样品提纯繁琐、定量不够精确、成本较高等缺点，而且同时TLC法涉及到一个可视化颜色定量的问题，还是不如气相色谱和液相色谱方便、准确。气相色谱和液相色谱分析方法需要对T-2毒素进行衍生化处理；液相色谱-质谱联用灵敏度较高，不需要进行衍生化处理，因而液相色谱-质谱联用是检测T-2毒素比较理想的方法。目前报道比较多的方法为单极质谱选择离子技术(SIM)。然而，对于复杂基质样品（如谷物），采用多级串联质谱技术可以更为有效地去除基质的干扰，保证痕量物质分析的准确性。TCL法、色谱法等有的太复杂，有的缺乏灵敏度，有的价格昂贵，不适于常规毒素分析。免疫学检测因其灵敏、快速、简单，而被用于T-2毒素的测定。应用于T-2毒素测定的免疫学方法主要有放射免疫法、酶联免疫吸附法及免疫荧光法等。由于放射性同位素储存、使用不便，近年来非放射性标记应用较多。酶联免疫吸附法(ELISA)以其灵敏度高、特异性好、操作简便、成本低等优点已被我国于1992年定为检测标准，ELISA法作为一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大量样品的快速筛选。 

实用新型内容

本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的T-2毒素残留检测试剂盒，其操作简 便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，可同时进行多个样品中T-2毒素残留的检测，减少了检测样本所需要的时间。 

本实用新型的技术方案是：一种T-2毒素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、11瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被T-2毒素偶联抗原制成检测板，11瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、浓缩酶结合物、酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液。 

盒体为硬纸盒，96孔试剂板为96孔聚苯乙烯酶标板，96孔的聚苯乙烯酶标板，放入真空铝箔袋中，盖板膜是塑料硬膜，将6瓶1ml梯度浓度的标准品溶液、1.2ml浓缩酶结合物、12ml酶结合物稀释液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml终止液用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。标准品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，浓缩酶结合物用红色帽的白色PE塑料瓶，酶结合物稀释液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被T-2毒素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，1ml/瓶，浓度分别为0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L；浓缩酶结合物1瓶，1.2ml；酶结合物稀释液1瓶，12ml；底物液A液1瓶，7ml；底物液B液1瓶，7ml；终止液1瓶，7ml。 

每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定（包括标准分析孔），既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的T-2毒素将和酶标板微孔条上预包被偶联抗原竞争T-2毒素的酶结合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含残留物T-2毒素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中T-2毒素含量，其操作简便易行。 

经实验表明本试剂盒检测饲料（原料、配合料和浓缩料）样本中T-2毒素残留，具有很高的灵敏度（1μg/L），样本的最低检测限为10μg/kg，回收率为90%±20%。本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、均质器、振荡器、离心机、微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。 

本实用新型的有益效果是：能快速、简便、准确地用于T-2毒素残留量的检测。 

附图说明

图1为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图（长为8.55cm）； 

图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图（长为12.8cm）； 

图3为本实用新型酶标板的俯视图； 

图4为本实用新型盖板膜平面图； 

图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图； 

图6为本实用新型固定泡沫模具俯视图； 

图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具侧视图。 

参见附图：酶标反应微孔条（2）预包被T-2毒素偶联抗原（3）固定于酶标板的外框支撑架（1）上，酶标反应微孔条（2）可随要求拆卸；盖板膜（4）用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条（2），盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；白色帽的白色塑料试剂瓶（5）用于封装7ml底物液A液，红色帽的黑色塑料试剂瓶（5）用于封装7ml底物液B液，黄色帽的白色塑料试剂瓶（5）用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶（6）用于封装1.2ml浓缩酶结合物，绿色帽的白色塑料试剂瓶（6）用于封装12ml酶结合物稀释液，白色帽的白色塑料瓶（7）用于封装1ml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具（8）瓶位放置位置依次为：7ml底物液A液瓶位（10），7ml底物液B液瓶位（11)，7ml终止液瓶位（12），12ml酶结合物稀释液瓶位（13），1.2ml浓缩酶结合物瓶位（14），6种1ml/瓶各种浓度的标准品溶液瓶位（15），盒体（9）是硬纸盒。 

具体实施方式

一、样本的前处理 

1．配液 

配液1：50%甲醇溶液 

用去离子水将甲醇(分析纯)按1:1体积比进行稀释（1份甲醇+1份去离子水）用于样本前处理。 

配液2：10% NaCl水溶液 

称取10.0g氯化钠粉末加100mL去离子水溶解混匀。 

2．饲料（原料、配合料和浓缩料）样本前处理方法 

用均质器均质饲料样本；称取5.0g±0.05g均质后的饲料样本至50ml聚苯乙烯离心管中， 加入25ml 50%甲醇，用振荡器剧烈振荡5min，3000g以上，室温（20-25℃/68-77℉）离心5min；取500μl上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入500μl 10%氯化钠水溶液用振荡器振荡1min，混匀；取20μl用于分析。 

二、使用试剂盒的操作步骤 

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃/68-77℉）回温，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 

2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。 

3、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 

4、酶结合物工作液配制：根据需要量将浓缩酶结合物用酶结合物稀释液按照1:10的体积进行稀释（即1份浓缩酶结合物加入10份酶结合物稀释液）。 

5、加标准品/样本、酶结合物工作液：加标准品/样本20μl到对应的微孔中，随即加入酶结合物工作液100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃（77℉）避光环境中反应10min。 

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用去离子水250μl/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。 

7、显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应5min。 

8、 测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。 

三、结果判定 

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含T-2毒素的含量成负相关。 

1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μg/L)。假设样本1的吸光度值为1.249，样本2的吸光度值为0.813，标准液吸光度值分别是：0μg/L为1.768；1μg/L为1.436；3μg/L为1.055；9μg/L为0.569；27μg/L为0.273；81μg/L为0.124。则样本1的浓度范围是1μg/L-3μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中T-2毒素残留的浓度范围；样本2的浓度范围是3μg/L-9μg/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中T-2毒素残留的浓度范围。 

2、定量分析 

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即 

B—标准品或样本溶液的平均吸光度值 

B₀—0μg/L 标准溶液的平均吸光度值 

（2）标准曲线的绘制与计算 

以标准品百分吸光率为纵坐标，以T-2毒素标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中T-2毒素的实际浓度。 

四、注意事项 

1、室温低于20℃（68℉）或试剂及样本没有回到室温（20-25℃/68-77℉）会导致所有标准的OD值偏低。 

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 

3、每加一种试剂前需将其摇匀。 

4、反应终止液为2mol/L硫酸，避免接触皮肤。 

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。 

6、储存条件 

保存试剂盒于2-8℃（36-46℉），不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 

7、试剂变质的迹象 

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A_450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。 

8、在加入底物液A液和底物液B后，一般显色5min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到7 min（或更长），但不得超过10min。反之，则减短反应时间。 

9、该试剂盒最佳反应温度为25℃（77℉），温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果。 

Claims (3)

1.一种T-2毒素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、11瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其特征在于：酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被T-2毒素偶联抗原制成的检测板，11瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、浓缩酶结合物、酶结合物稀释液、底物液A液、底物液B液、终止液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，浓缩酶结合物用红色帽的白色PE塑料瓶，酶结合物稀释液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被T-2毒素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，1ml/瓶，浓度分别为0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L，27μg/L，81μg/L；浓缩酶结合物1瓶，1.2ml；酶结合物稀释液1瓶，12ml；底物液A液1瓶，7ml；底物液B液1瓶，7ml；终止液1瓶，7ml。

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