CN1997744B - 生产改变含油量的植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由于HIO核酸的改变的表达，而显示改变的含油量表型的植物。本发明更进一步涉及生产具有改变的含油量表型的植物的方法。

Description

生产改变含油量的植物

相关申请

本申请要求2004年7月2日提交的美国临时专利申请60/585,495的优先权，其内容全部引入作为参考。

发明背景

操纵农作物种子的组成，尤其是种子油类的含量和组成的能力在涉及加工食品油类以及动物饲养油类的农业工业中具有重要的应用价值。农作物的种子含有多种有价值的组分，包括油类，蛋白以及淀粉。工业生产过程可以分离若干或所有这些组分用于专门应用的单独销售。例如，几乎60％的美国大豆农作物通过大豆加工工业进行压榨。大豆加工产生高价销售的精炼油，而残余物主要作为低价值的饲料销售(US Soybean Board，2001 Soy Stats)。加拿大油菜(canola)种子被压榨产生油类以及副产品加拿大油菜粗粉(加拿大加拿大油菜协会)。几乎20％的1999/2000年的美国玉米农作物经过工业化精炼，主要用于产生淀粉，乙醇以及油类(玉米精炼业者协会)。因此，常常需要使种子的含油量最大化。例如，对于诸如大豆以及加拿大油菜的加工含油种子而言，提高种子的绝对含油量将提高这种谷物的价值。对于加工的玉米而言，可能需要根据其它主要组分的应用提高或者降低含油量。降低油类可以通过降低与油类氧化相关的不希望的味道改善分离的淀粉的质量。或者，在味道并不重要的乙醇产生中，提高含油量可以提高总的价值。在许多谷物饲料中，诸如玉米以及小麦，可能希望提高植物含油量，因为油类比诸如碳水化合物的其它种子组分具有较高的能含量。含油种子加工，就像大多数谷物加工业一样是资金密集型产业；因此产品从低值组分到高价值油类组分的产品分布的较小改变可能对于谷物加工者而言就具有显著的经济影响。

油类的生物技术处理可以提供组成的改变以及油产量的改进。组成的改变尤其包括高油酸的大豆以及玉米油(美国专利6,229,033以及6,248,939)，以及含有月桂酸酯的种子(美国专利5,639,790)等。组成改变的工作主要集中在加工的含油种子但是已经可以很容易地延伸至非-含油种子农作物包括玉米。虽然对提高含油量具有相当的兴趣，在这一领域目前唯一可行的生物技术是高油类玉米(HOC)技术(杜邦，美国专利5,704,160)。HOC利用通过标准的选择育种连同生产***中称为顶交(TopCross)的优良品种(***雄性)杂交雌性得到的高油类授粉者。顶交高油类***使玉米收获的谷物含油量从约3.5％提高到约7％，改善了谷物的能含量。

虽然HOC生产***已经卓有成效，但是其仍然具有固有的局限性。首先，担负全部的土地的种子栽植的低授粉者百分比的***含有固有风险，尤其是在旱年。第二，当前HOC领域含油量已经平稳在大约9％的油类。最后，高油类玉米主要不是生物化学变化，而是对于提高含油量产生间接结果的解剖学上的突变体(提高胚芽尺寸)。为此，可选择的高油类策略，尤其是来源于改变生化产量的高油类策略将是非常重要的。

操作油市场最明显的目标农作物是大豆以及油菜籽，并且大量商业工作(例如美国专利5,952,544；PCT申请WO9411516)证明拟南芥是这些农作物中油类代谢的优良模型。种子油组合物的生物化学筛选已经鉴定了拟南芥的许多关键生物合成酶基因并且导致农业上重要基因的直向同源物被鉴定出来。例如，利用化学诱变处理群的筛选已经鉴定了其种子显示脂肪酸成份改变的脂类突变体(Lemieux B等1990，James以及Dooner，1990)。检测脂肪酸成份改变的T-DNA诱变筛选(Feldmann等1989)鉴定了ω3脱氢酶(FAD3)以及δ-12脱氢酶(FAD2)基因(美国专利5952544；Yadav等，1993；Okuley等，1994)。集中在含油量而非油类质量的筛选分析化学上诱导的皱缩种子或籽粒密度改变的突变体，据此推断出改变的植物含油量(Focks以及Benning，1998)。用来鉴定参与非常长链脂肪酸产生的酶的另一种筛选鉴定了编码负责降低种子中三酰甘油聚集的甘油二酯酰基转移酶(DGAT)的基因的突变(Katavic V等，1995)。此外，还显示DGAT cDNA的种子特异性过表达与提高的植物含油量有关(Jako等，2001)。

植物中的激活标签法是一种通过***包含调节序列(例如，增强子)的异源核酸构建体到植物基因组中而产生随机突变的方法。调节序列可起到增强一个或多个天然植物基因转录的作用；因此，激活标签法是一种用于产生功能获得(gain-of-function)，通常是显性突变体的有效方法(参见，例如，Hayashi等，1992；Weigel D等，2000)。***的构建体提供了一种分子标签，其用于快速鉴定由于其错表达引起突变表型的天然植物。激活标签法同时可导致功能丧失的表型。***可导致天然植物基因的破坏，在该情况中表型通常是隐性的。

激活标签法已经被用于多种物种，包括烟草和拟南芥，来鉴定各种突变表型和与这些表型相关的基因(Wilson，等，1996，Schaffer等，1998，Fridborg等，1999；Kardailsky等，1999；Christensen S等，1998)。

发明概述

本发明提供了具有高油类含量表型的转基因植物。转基因植物包括含有编码或互补于编码HIO多肽的核苷酸序列的转化载体。在优选的实施方案中，转基因植物选自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，红花，油棕，椰子，亚麻，蓖麻以及花生。本发明还提供了产生油类的方法，包括培育转基因植物以及从所述植物回收油类。

本发明还提供了具有高油表型的转基因植物细胞。所述转基因植物细胞包括含有编码或者互补于编码高油(下文称作“HIO”)多肽的序列的核苷酸序列的转化载体。在优选的实施方案中，该转基因植物细胞选自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，红花，油棕，椰子，亚麻，蓖麻以及花生。在其它实施方案中，所述植物细胞为种子，花粉，繁殖体或者胚芽细胞。本发明进一步提供了含有编码HIO多肽的核酸序列的饲料，粗粉，谷物，食品或者种子。本发明还提供了含有HIO多肽或其直系同源物的饲料，粗粉，谷物，食品或者种子。

本发明的转基因植物通过包括向植物的祖细胞导入含有编码或互补于编码HIO多肽的序列的核苷酸序列的植物转化载体，以及培育转化的祖细胞产生转基因植物的方法产生，其中的HIO多核苷酸序列的表达产生高油类含量表型。本发明还提供了从所述转基因植物获得的植物细胞。

本发明还提供了超过约10,000，更优选约20,000，甚至优选约40,000粒种子的容器，其中超过约10％，更优选约25％，更优选约50％，甚至更优选约75％或者更优选约90％的种子为来源于本发明的植物的种子。

本发明还提供了超过约10kg，更优选约25kg，甚至更优选约50kg种子的容器，其中超过约10％，更优选约25％，更优选约50％，甚至更优选约75％或者更优选约90％的种子为来源于本发明的植物的种子。

本发明的任一植物或其部分可以被加工产生饲料，粗粉或者油制剂。用于该目的的尤其优选的植物部分为种子。在优选的实施方案中，饲料，粗粉或者油制剂被设计用于反刍动物。生产饲料，粗粉和油制剂的方法是本领域公知的。例如，参见美国专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；以及6,156,227。本发明的粗粉可以与其他的粗粉混合。在优选的实施方案中，产自本发明的植物或者由本发明的方法产生的粗粉构成任一产品的粗粉组分的超过约0.5％，约1％，约5％，约10％，约25％，约50％，约75％或约90％体积或者重量。在另一实施方案中，可以混合粗粉制剂并可以构成混合物超过约10％，约25％，约35％，约50％或约75％的体积。

发明详述

定义

除非另有陈述，这里使用的全部技术以及科学术语具有与本领域技术人员知晓的相同的含义。专业人员尤其参考Sambrook等，1989，以及Ausubel FM等，1993的定义以及术语。应该理解本发明不限于所描述的特定方法，流程以及试剂，因为这些可以改变。

此处所述的术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指可以在异源细胞中整合并表达异源DNA片段的载体。许多原核以及真核生物表达载体是可以市售获得的。选择合适的表达载体是本领域述人员所熟知的。

“异源的”核酸构建体或序列具有一部分序列不是植物细胞的野生型序列但是在其中表达。异源的控制序列是指不天然调节目前正在调节的相同基因表达的控制序列(即启动子或增强子)。通常，异源核酸序列不是它们所存在于的细胞或者基因组的一部分所内源产生的，但是已经通过传染，转染，显微注射，电穿孔法等添加到细胞中。“异源的”核酸构建体可以含有控制序列/DNA编码序列组合，其与野生型植物中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或者不同。

此处所述的术语“基因”是指参与多肽链产生的DNA片段，其可能包括或者不包括编码区之前以及之后的区域，例如5′非翻译区(5′UTR)或者“前导”序列以及3′UTR或者“尾部”序列以及单独的编码片段(外显子)以及非-转录调节序列之间的内含子序列(内含子)。

这里使用的“重组体”包括已经通过导入异源的核酸序列进行修饰的细胞或者载体，或者所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非-重组体)形式的细胞内没有发现相同形式的基因或者表达在人为干预下完全表达或者完全不表达的异常表达的天然基因。

此处所述的术语“基因表达”是指基于基因的核酸序列产生的多肽的过程。所述过程包括转录以及翻译；因此“表达”可以是针对多核苷酸或者多肽序列或者两者。有时，多核苷酸序列的表达不会引起蛋白翻译。“过表达”是指相对于其在野生型(或者其它的参考[例如，非-转基因])植物中的表达，多核苷酸和/或多肽序列表达增加并且可能涉及自然存在或者非-自然存在的序列。“异位表达”是指在未-改变或者野生型植物中不自然发生的，在某时，某地和/或提高水平的表达。“下调表达”是指多核苷酸和/或多肽序列，通常是内源性基因相对于其在野生型植物中表达的降低表达。术语“错误表达”以及“改变表达”包括过表达，下调表达以及异位表达。

在将核酸序列***细胞的概念中，术语“引入的”是指“转染”，或者“转化”或者“转导”，并且包括核酸序列整合到真核或者原核细胞中，其中核酸序列可以整合入细胞的基因组(例如染色体，质粒，质体或者线粒体DNA)，转化为自主复制子，或者瞬间表达(例如，转染的mRNA)。

本文使用的“植物细胞”是指来源于植物的任意细胞，包括来自未分化的组织(例如愈伤组织)以及植物种子，花粉，繁殖体(progagules)以及胚的细胞。

此处所述的术语“天然的”以及“野生型”相对于给定植物性状或者表型是指具有在相同种类的植物本身发现的特征或者表型的形式。

此处所述的术语关于植物特性的“修饰”是指转基因植物相对于类似的非-转基因植物的表型的改变。对于转基因植物的“目的表型(性状)”，指通过T1和/或后代植物证明的可观察到的或可测量的表型，相应的非转基因植物不显示该表型(也即，在相似条件下培养或分析的基因型类似的植物)。目的表型可表示对植物的改良，或可提供一种在其他植物中产生改良的方法。“改良”是一种通过给植物提供独特的和/或新的品质，而增强植物物种或品种的实用性的特征。“改变含油量表型”指遗传修饰植物的可测量表型，其中与类似的，但是非修饰的植物相比，该植物显示统计上显著增加或减少的总体含油量(即，油类占种子质量的百分比)。高油表型指总体含油量增加。

本文使用的“突变体”多核苷酸序列或者基因与相应的野生型多核苷酸序列或者基因在序列或者表达上不同，其中的差异导致修饰的植物的表型或者性状。相对于植物或植物株系，术语“突变体”是指植物或者株系具有修饰的植物表型或性状，其中修饰的表型或性状与野生型多核苷酸序列或基因的修饰表达有关。

此处所述的术语“T1”是指来自T0植物的种子的植物子代。T1子代是可通过应用选择性试剂筛选的第一系列转化的植物，所述的选择性试剂为例如抗生素或除草剂，由此转基因植物含有相应的抗性基因。术语“T2”是指通过T1植物的花进行自体受精产生的植物子代，所述T1植物之前被筛选作为转基因植物。T3植物是由T2植物等产生的。这里所述的特定植物的“直系子代”来源于所述植物的种子(或者，有时来自其它的组织)且是紧随的子代；例如，对于特定的家系而言，T2植物是T1植物的直系子代。特定植物的“间接子代”来源于所述植物直系子代的种子(或其它组织)，或来自该家系随后子代的种子(或其它组织)；例如，T3植物是T1植物的间接子代。

此处所述的术语“植物部分”包括任意的植物器官或组织，包括，但不限于种子，胚，分生组织区域，愈伤组织，叶，根，芽，配子体，孢子体，花粉和小孢子。植物细胞可获自任意的植物器官或组织以及由其制备的培养物。可用于本发明方法的植物种类通常是广泛的，其可以是可用于转化技术的高等植物，包括单子叶和双子叶植物。

在这里所述的“转基因植物”包括在其基因组内含有异源多核苷酸的植物。异源的多核苷酸可以稳定地整合到基因组中，或可以被***到染色体外。优选地，本发明的多核苷酸被稳定地整合到基因组中从而使多核苷酸被连续传代。植物细胞，组织，器官或已被导入异源多核苷酸的植物被认为是“转化的”，“转染的”或“转基因的”植物。也含有该异源多核苷酸的转化植物或植物细胞的直系和间接子代也被视为是转基因的。

可以利用将所需的编码所需蛋白的聚核苷酸序列导入植物细胞的多种方法，并且这些方法对本领域技术人员也是公知的，包括但不限于：(1)诸如微注射，电穿孔和微粒介导的递送(粒子枪(biolistic)或基因枪技术)的物理方法；(2)病毒介导的递送技术；以及(3)农杆菌介导的转化方法。

最常使用的转化植物细胞的方法是农杆菌介导的DNA转化方法和粒子枪或微粒轰击介导的方法(即，基因枪)。通常，核转化是所希望的，但是当需要用于特异性转化质粒，诸如叶绿体或者造粉体时，可以利用微粒介导递送所需的多核苷酸转化植物质粒。

农杆菌介导的转化通过使用基因工程化的属于农杆菌属的土壤细菌实现。具有Ti或Ri质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以及发根农杆菌(Agrobacterium Rhizogenes)的大量野生型以及卸甲(disarmed)株可用于向植物进行基因转化。通过将可被基因工程化携带任一所需DNA片段的称作“T-DNA”的特异性DNA转化到很多品种的植物内进行基因转化。

农杆菌介导的植物的遗传转化包括若干步骤。第一步，首先将毒性的农杆菌和植物细胞彼此接触，通常这一步称作“接种”。接种后，使农杆菌和植物细胞/组织在一起培养几小时到几天的时间或者更长时间，培养条件适于生长和T-DNA的转化。这一步称作“共培养”。共培养和T-DNA递送以后，用杀细菌或者制菌剂处理植物细胞灭杀与外植体接触或者保留在含有外植体分容器中的农杆菌。如果在缺乏任一选择剂促进转基因植物细胞相比非转基因植物细胞的优先生长的条件下进行，通常这一步称作“延迟”步骤。如果在存在选择性好压转基因植物细胞的条件下进行，这一步称作“选择”步骤。在使用“延迟”步骤时，通常紧接着一个或者多个“选择步骤”。

对于微粒轰击(美国专利5,550,318(Adams等)；美国专利5,538,880(Lundquist等)，美国专利5,610,042(Chang等)；以及PCT公开WO95/06128(Admas等)；每一个都在此处具体引入作为参考)而言，粒子涂覆有核酸并通过推进力递送到细胞中。示范性的粒子包括钨，铂，并优选金。

通过加速将DNA递送到植物细胞中的方法的示范性实施方案为粒子枪粒子递送***(Biolistics Particle Delivery System)(BioRad，Hercule，CA)，该***可被用于将通过筛子，诸如不锈钢或者Nytex筛子涂覆DNA或者细胞的粒子推进到用悬浮培养的单子叶植物细胞覆盖的过滤器表面上。

微粒轰击技术是广泛应用的技术，并且可几乎被用于转化任一的植物品种。已通过微粒轰击转化的植物品种的实例包括单子叶植物品种，诸如玉米(国际公开WO95/06128)(Adams等)，大麦，小麦(美国专利5,563,055(Townsend等)，在此处全文引入作为参考)，大米，燕麦，黑麦(rye)，甘蔗以及高粱；以及大量包括烟草，大豆的双子叶植物(美国专利5,322,783(Tomes等)，在此处全文引入作为参考)，向日葵，花生，棉花，番茄以及豆类(美国专利5,563,055(Townsend等)在此处全文引入作为参考)。

为了不考虑转化方法对转化的植物细胞进行选择或者记分，导入细胞中的DNA含有在可再生的植物组织中发挥产生对植物组织赋予对其他毒性化合物抗性的化合物的基因。用作可选择的，可筛选的或者可记分的标记的目的基因包括但不限于GUS，绿色荧光蛋白(GFP)，荧光酶(LUX)，抗生素或者除草剂耐受基因。抗生素抗性基因的实例包括青霉素，卡那霉素(以及新霉素，G418，博来霉素)；氨甲蝶呤(以及三甲氧苄二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素以及四环素。编码参与除草剂耐受的蛋白的多核苷酸分子是本领域公知的，包括但不限于美国专利5,627,061(Barry等)，美国专利5,633,435(Barry等)，以及美国专利6,040,497(Spencer等)记载的编码5-烯醇丙酮基莽草酸盐-3-磷酸盐合成酶(EPSPS)以及美国专利5,094,945(Comai)描述的用于耐受glyphosate的aroA；描述于美国专利4,810,648(Duerrschnabel等)用于耐受溴苯腈(bromoxynil)的编码溴苯腈水解酶(Nitrilase)(Bxn)的多核苷酸分子；描述于Misawa et al，(1993)Plant J.4：833-840and Misawaet al，(1994)Plant J.6：481-489用于耐受哒草伏(norflurazon)的编码八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的多核苷酸分子；描述于Sathasiivan等，(1990)Nucl.Acids Res.18：2188-2193用于耐受磺酰脲类除草剂的编码乙酰羟基酸合成酶(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子；以及描述于DeBlock等，(1987)EMBO J.6：2513-2519用于耐受草铵膦(Glufosinate)和双丙氨膦(bialaphos)的bar基因。

从多种转化的外植体再生，发育和培育植物是本领域公知的。这种再生和生长过程通常包括选择转化的细胞以及通过常规的胚芽发育到生根的小苗发育阶段培育这些单独的细胞的阶段。类似地再生转基因胚芽和种子。然后将所产生的转基因生根的小苗种植在合适的植物生长介质，诸如土壤中。暴露选择性试剂但存活下来的细胞，或者在筛选分析中记分为阳性的细胞可以培养在支持植物体再生的培养基中。将发育中的小苗转移到土壤较少的植物生长混合物中，并在转移到温室或者用于成熟的生长室之前使(幼苗)受冷而变得耐寒。

本发明可以与转化的细胞或者组织一起使用。本文中所使用的“可转化的”是指能够进一步繁殖产生植物体的细胞或者组织。本领域技术人员认识到大量***外源DNA的植物细胞或者组织是可以转化的，并且在合适的培养条件下，该植物细胞或者组织可以形成分化的植物。适于这些目的的组织可以包括但不限于未成熟的胚芽，小组织，悬浮细胞培养物，未成熟的花序，茎分生组织，结外植体，愈伤组织，下胚轴组织，子叶，根和叶。

可以使用任一合适的培养基。合适的培养基的实例包括但不限于基于MS-的培养基(Murashige and Skoog，Physiol.Plant，15：473-497，1962)或填充有包括但不限于植物激素，细胞***素，ABA和赤霉素的其他植物生长调节剂的基于N6-的培养基(Chu等，Scientia Sinica 18：659，1975)。本领域技术人员熟知多种组织培养基，其当进行适当补充时可以支持植物组织生长和发育并适于植物转化和再生。这些组织培养基可以作为市售制剂，或者用户制备以及改进的试剂出售。本领域技术人员可以认识到用于转化和再生的诸如营养剂和生长调节剂的培养基和培养基补充剂以及其他培养条件，诸如培养期间的光密度，pH，可被优化用于特定的多种目的的培养温度。

本领域技术人员将认识到将表达盒稳定整合到转基因植物并证实可以操作后，可以通过有性杂交导入其他的植物体内。取决于所杂交的品种，可以使用大量标准的繁殖技术。

具有改变的含油量表型的植物的鉴定

我们使用拟南芥激活标签筛选来鉴定我们已经鉴定并命名的在下表1中第1栏中所列的HIO#的基因与改变的含油量表型(具体地，高油表型)之间的关联。简要地，而且如实施例中进一步描述的，用pSKI015载体对许多拟南芥植物进行了突变，所述载体包含来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA，病毒增强子元件和选择性标记基因(Weigel等，2000)。当T-DNA***到转化植物的基因组中时，增强子元件可导致附近基因的上调，通常在增强子的大约9千碱基(kb)内。为了特异性回收表达选择性标记并因此具有T-DNA***序列的转化植物，把T1植物暴露于选择剂。为了扩大种子原种，培育大约18株T2植物并暴露于选择性试剂来回收表达选择性标记并因此具有T-DNA元件的植物。收获来自这些植物的T3种子并将它们集中。如实施例的描述利用近红外光谱(NIR)法评估种子的含油量。

对显示高油表型的拟南芥系进行了鉴定。通过分析所鉴定的品系中侧接T-DNA***片段的基因组DNA序列发现了HIO基因与高油表型之间的关联。因此，HIO基因和/或多肽可用于开发具有修饰的含油量表型(“HIO表型”)的基因修饰的植物。HIO基因可用于产生含油种子作物，其从含油种子加工提供提高的产油量，以及用于生产能提供能量增加的饲料谷物作物用于动物饲养。HIO基因可进一步用于增加特种油料作物的含油量，以便增加所需稀有脂肪酸的产量。已经进行遗传修饰表达HIO的转基因植物可用于生产油，其中利用标准方法培养转基因植物，并从植物部分(例如，种子)获得油。

HIO核酸和多肽

在我们的激活标记筛选中发现的HIO基因列举在表1的第1栏中。拟南芥信息源(TAIR)鉴定号提供在第2栏。第3栏提供了Genbank鉴定号(GI#)(GI#18391126，GI#30683964以及GI#30693108)以及相应的核苷酸序列的序列鉴定子(SEQ ID NO：1，3或5)，并且第4栏提供了多肽序列的GI#(GI#15218452，GI#15226916，GI#15229046)以及相应的序列鉴定子(SEQ ID NO：2，4或6)。第5栏列举了可能的生物化学功能和/或蛋白名称。第6栏列举了保守的蛋白结构域。第7栏列举了过量表达HIO基因的植物的相对种子含油量。第8栏提供了来自其他植物品种的直系同源物基因的核酸和/或多肽序列的GI#。

如这里使用的术语“HIO多肽”指全长HIO蛋白或其“功能活性”的片段，衍生物(变体)或者直系同源物，指该蛋白片段，衍生物或者直系同源物显示与全长HIO多肽(SEQ ID NO：2，4或6)相关的一种或多种功能活性。在一个优选的实施方案中，功能活性HIO多肽，当在植物中错表达时，导致改变的含油量表型。在更进一步优选的实施方案中，HIO多肽在植物中的错表达导致高油表型。在另一个实施方案中，功能活性HIO多肽当在植物或植物细胞中表达时，能拯救缺陷的(包括缺失的)内源HIO活性；该拯救多肽可来自与具有缺陷活性的植物相同的或不同的物种。在另一个实施方案中，全长HIO多肽的功能活性片段(也即，具有SEQ ID NO：2，4或6的序列的天然多肽或其天然存在的直系同源物)保留与全长HIO多肽相关的一种或多种生物学特性，例如信号活性，结合活性，催化活性或细胞或者细胞外定位活性。HIO片段优选包括HIO结构域，例如C-或N-末端或者催化结构域，尤其，优选包括HIO蛋白的至少10个，优选至少20个，更优选至少25个，最优选至少50个的连续氨基酸。HIO基因的功能域列举在表1的第6栏中，并可使用PFAM程序进行鉴定(Bateman A等，1999NucleicAcids Res 27：260-262)。

全长HIO多肽或其片段的功能活性变体包括具有氨基酸***序列，缺失，或者置换，但保留与全长HIO多肽相关的一种或多种生物学特性的多肽。有时，产生的变体能改变HIO多肽的翻译后加工。例如，与天然多肽相比，变体可以具有改变的蛋白转运或者蛋白定位特性，或者改变的蛋白的半衰期。

这里使用的术语“HIO核酸”包含具有表1的第3栏的GenBank登录序列提供的序列(SEQ ID NO：1，3，5)，或者与其互补的序列的核酸，及其功能活性片段，衍生物或直系同源物。本发明的HIO核酸可以是来源于基因组DNA或者cDNA的DNA，或者RNA。

在一个实施方案中，功能活性的HIO核酸编码或者互补于编码功能活性的HIO多肽的核酸。基因组DNA包括在该定义内，其用作原始RNA转录本(也即，mRNA前体)的模板，其在编码功能活性HIO多肽之前需要加工，例如剪接。HIO核酸可包括其他的非编码序列，其可以转录或者不被转录；这种序列包括5’和3’UTRs，聚腺苷酸化信号和尤其是本领域已知的控制基因表达的调节序列。一些多肽需要加工事件，例如蛋白水解剪切，共价修饰，等等，以便完全活化。因此，功能活性核酸可编码成熟的或者预先加工的HIO多肽，或者中间体形式。HIO多核苷酸还可以包括异源编码序列，例如，编码包括的促进融合多肽纯化的标记或者转化标记的序列。

在另一个实施方案中，功能活性HIO核酸可用于例如，通过反义抑制，共抑制等产生功能丧失的HIO表型。

在一个优选的实施方案中，用于本发明方法的HIO核酸，包括编码或互补于编码HIO多肽的序列的核酸序列，该HIO多肽与表1的第4栏的GenBank登录序列提供的多肽序列(SEQ ID NO：2，4，6)具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或以上的序列同一性。

在另一个实施方案中，本发明的HIO多肽包括与表1的第4栏的GenBank登录序列提供的HIO多肽序列(SEQ ID NO：2，4，6)具有至少50％或60％同一性的多肽序列，而且与HIO多肽序列可具有至少70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性，并且可以包括HIO多肽的保守蛋白结构域，诸如表1的第6栏所列举的蛋白结构域。在另一个实施方案中，HIO多肽包括与表1的第4栏的GenBank登录序列提供的多肽序列(SEQ ID NO：2，4，6)的功能活性片段具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性的多肽序列。在另一个实施方案中，HIO多肽包括与表1的第4栏的GenBank登录序列提供的多肽序列(SEQ ID NO：2，4，6)的全长具有至少50％，60％，70％，80％或90％的序列同一性的多肽序列并且包括表1的第6栏所列举的保守蛋白结构域。

在另一个方面，HIO多核苷酸序列与表1的第3栏的GenBank登录序列提供的HIO核酸序列(SEQ ID NO：1，3，5)的全长或是与这种HIO序列互补的核酸序列具有至少50％到60％的同一性，而且可包含至少70％，80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。

这里使用的，特定的目标序列或其特定部分的“百分比(％)序列同一性”被定义为如果需要获得最大的百分比序列同一性，如通过WU-BLAST-2.0al9程序(Altschul等，J.Mol.Biol.(1990)215：403-410)所产生的，其中搜索参数设为缺省值，在进行序列比对和引入缺口之后，候选的衍生序列中核苷酸或氨基酸与目标序列(或其特定部分)中核苷酸或氨基酸相同的百分比。HSP S和HSP S2参数是机动值，而且是通过程序本身取决于特定序列的组成和在其中对感兴趣的序列进行搜索的特定数据库的组成而确定的。“％同一性值”通过把匹配的相同核苷酸或氨基酸的数目除以报告的百分比同一性的序列的序列长度而确定。“百分比(％)氨基酸序列相似性”通过进行与确定百分比氨基酸序列同一性相同的计算而确定，但是在计算中除了相同的氨基酸之外还包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代，即其中氨基酸被具有相似特性的另一个氨基酸所取代，而对蛋白的折叠或活性没有显著的影响。可以互相取代的芳香族氨基酸为苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸；可互换的疏水氨基酸为亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸和缬氨酸；可互换的极性氨基酸为谷氨酰胺和天门冬酰胺；可互换的碱性氨基酸为精氨酸，赖氨酸和组氨酸；可互换的酸性氨基酸为天冬氨酸和谷氨酸；可互换的小氨基酸为丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。

目标核酸分子的衍生核酸分子包括能选择性地与表1的第3栏的GenBank登录序列提供的核酸序列(SEQ ID NO：1，3，5)杂交的序列。杂交的严谨度可通过温度，离子强度，pH，以及杂交和洗涤期间变性剂诸如甲酰胺的存在来进行控制。通常使用的条件是大家所熟知的(参见，例如，Current Protocol in Molecular Biology，Vol.1，Chap.2.10，John Wiley&Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，MolecularCloning，Cold Spring Harbor(1989))。在一些实施方案子中，本发明的核酸分子能在如下的严谨杂交条件下与包含表1的第3栏的GenBank登录序列提供的核苷酸序列(SEQ ID NO：1，3，5)的核酸分子杂交：含有核酸的滤纸，在含有6X单倍浓度的柠檬酸盐(SSC)(1X SSC为0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠；pH7.0)，5X Denhardt溶液，0.05％焦磷酸钠和100μg/ml的鲱鱼***DNA的溶液中，65℃预杂交8小时至过夜；在含有6X SSC，1X Denhardt溶液，100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸钠的溶液中，65℃杂交18-20小时；在含有0.1X SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中，65℃洗涤滤纸1小时。在其他的实施方案中，使用如下的中等严谨杂交条件：包含核酸的滤纸，在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，1％Ficoll，1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼***DNA的溶液中，40℃预处理6小时；在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼***DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中，40℃杂交18-20小时；接着，在含有2X SSC和0.1％SDS的溶液中，55℃洗涤两次1小时。或者，可使用如下的低严谨条件：在含有20％甲酰胺，5x SSC，50mM磷酸钠(pH7.6)，5X Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml变性剪切鲑鱼***DNA的溶液中，37℃孵育8小时到过夜；在相同的缓冲液中杂交18到20小时；在1x SSC中，大约37℃洗涤滤纸1小时。

由于遗传密码的简并性，可产生许多编码HIO多肽的多核苷酸序列。例如，根据特定宿主生物显示的最佳密码子使用，可选择密码子以增加多肽在特定的宿主物种中的表达(参见，例如，Nakamura等，1999)。这种序列变体可用于本发明的方法中。

本发明的方法可使用拟南芥HIO的直系同源物。在下表1中鉴定的每一种拟南芥HIO基因的可能直系同源物鉴定在表1的第8栏。从其他植物品种鉴定HIO基因的这些以及直系同源物的方法是本领域公知的。一般说来，不同物种中的直系同源物保持相同的功能，由于存在一个或多个蛋白基序和/或三维结构。在进化过程中，当物种形成后发生基因重复事件时，一个物种，例如拟南芥中的单个基因可能相应于另一个物种中的多个基因(旁系同源物)。这里使用的，术语“直系同源物”包括旁系同源物。当序列数据可用于特定的植物物种时，通常可通过序列同源性分析，例如BLAST分析，一般使用蛋白饵序列，来鉴定直系同源物。如果来自正向BLAST结果的最合适序列检索到了反向BLAST中原始的查询序列，该序列则为可能的直系同源物(HuynenMA和Bork P，Proc Natl Acad Sci(1998)95：5849-5856；Huynen MA等，Genome Research(2000)10：1204-1210)。

用于多个序列比对的程序，例如CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 22：4673-4680)，可用于突出直系同源蛋白的保守区域和/或残基，并产生***树。在表示来自不同物种的多个同源序列(例如，通过BLAST分析检索到的)的***树中，来自2个物种的直系同源序列，相对于来自2个物种的所有其他的序列，通常在***树上显得最靠近。结构串线(threading)或蛋白折叠的其他分析(例如，使用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的软件)也可鉴定可能的直系同源物。核酸杂交方法也可用于寻找直向同源基因，而且当不能获得序列数据是优选的。简并PCR和cDNA或基因组DNA文库筛选是寻找相关基因序列的常见方法，而且是本领域熟知的(参见，例如，Sambrook，1989；Dieffenbach and Dveksler，1995)。例如，Sambrook等中描述了用于从感兴趣的植物物种产生cDNA文库，和用部分同源基因探针探测文库的方法。拟南芥HIO编码序列的高度保守部分可用作探针。HIO直系同源核酸可在高度，中度或低度严谨条件下与表1第3栏的GenBank登录序列提供的核酸杂交。扩增或分离假定的直系同源物的部分之后，可通过标准技术克隆该部分并进行测序，而且用作探针来分离完整的cDNA或基因组克隆。或者，可以启动EST方案来产生感兴趣的植物物种的序列信息数据库。在另一种方法中，能特异性结合已知的HIO多肽的抗体，用于直系同源物分离(参见，例如，Harlowand Lane，1988，1999)。Western印迹分析可确定HIO直系同源物(也即，直系同源蛋白)存在于特定植物物种的粗提取物中。当观察反应性时，可通过筛选显示特定植物物种的表达文库，来分离编码候选直系同源物的序列。如Sambrook等1989中所述，可在各种商业可获得的载体中构建表达文库，包括λgt11。一旦通过任何这些方法鉴定到了候选的直系同源物，候选的直系同源序列可用作饵(“查询”)，用于从其中已经鉴定到HIO核酸和/或多肽序列的拟南芥或其他的物种中对序列进行反向BLAST。

可使用任何可用的方法来获得HIO核酸和多肽。例如，通过如前所述的筛选DNA文库或通过使用聚合酶链式反应(PCR)，分离感兴趣的cDNA或基因组DNA序列的技术是本领域熟知的。或者，可合成核酸序列。任何已知的方法，例如位点定向诱变(Kunkel TA等，1991)，可用于将所需的改变引入到克隆的核酸中。

通常，本发明的方法包括把所需形式的HIO核酸整合到用于转化植物细胞的植物表达载体中，并在宿主植物中表达HIO多肽。

分离的HIO核酸分子是不同于天然发现的形式或设置的核酸分子，而且从至少一个杂质核酸分子中鉴定和分离，该杂质核酸分子通常结合在HIO核酸的天然来源中。然而，分离的HIO核酸分子包括包含在通常表达HIO的细胞中的HIO核酸分子，例如，该核酸分子位于与天然细胞的核酸分子不同的染色***置中。

产生具有改变的含油量表型的遗传修饰的植物

HIO核酸和多肽可用于产生具有修饰的含油量表型的遗传修饰的植物。这里使用的，“修饰的含油量表型”可指植物任何部分中修饰的含油量；经常在种子中观察到修饰的含油量。在一个优选的实施方案中，植物中HIO基因的改变表达可用于产生具有高油表型的植物。

这里所述的方法一般适用于所有植物。尽管在拟南芥中进行了激活标签法和基因鉴定，但是HIO基因(或其直系同源物，变体或片段)可在任何植物种类中表达。在一个优选的实施方案中，本发明涉及产油植物，其在特异性器官，主要是在种子中生产和储存三酰基甘油。这些物种包括大豆(Glycine max)，油菜籽和加拿大油菜(包括甘蓝型油菜(Brassica napus)，B.campestris)，向日葵(Helianthus annus)，棉花(陆地棉)，玉米(Zea maya)，可可(Theobroma cacao)，红花(Carthamustinctorius)，油棕(Elaeis guineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亚麻(Linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和花生(Arachis hypogaea)。本发明还涉及产生果实和蔬菜的植物，产生谷物的植物，产生坚果的植物，快速周期的芸苔品种，紫花苜蓿(Medicago sativa)，烟草(Nicotiana)，草坪草(Poaceae family)，其他的饲料作物，和可能是稀有脂肪酸来源的野生物种。

本领域技术人员应该了解本领域存在的各式各样的转化技术，而且新技术不断地变成可用的。适于靶宿主植物的任何技术可用于本发明的范围内。例如，可引入各种形式的构建体，包括但不限于DNA链，到质粒，或人工染色体中。可通过各种技术将构建体引入到靶植物细胞中，包括但不限于异源核酸的土壤农杆菌介导的转化，电穿孔法，显微注射，微粒轰击，磷酸钙-DNA共沉淀或脂质体介导的转化。植物转化优选是永久的，也即通过使导入的表达构建体整合到宿主植物基因组中，以便该导入的构建体传递给连续的植物世代。根据目的用途，包含HIO多核苷酸的异源核酸构建体可编码完整的蛋白或其生物学活性部分。

在一个实施方案中，双元的基于Ti的载体***可用于转移多核苷酸。标准的土壤农杆菌双元载体是本领域技术人员已知的，而且许多是可商业获得的(例如，pBI121 Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。构建体或者载体可以包括植物启动子来表达所选择的核酸分子。在优选的实施方案中，启动子为植物启动子。

用土壤农杆菌载体转化植物的最佳方法随待转化的植物种类而变化。用于土壤农杆菌介导的转化的示例性方法包括转化来源于无菌籽苗和/或小植株的胚轴，芽，茎或叶组织的外植体。这种转化的植物可有性繁殖，或通过细胞或组织培养繁殖。先前已经描述了土壤农杆菌转化用于许多不同类型的植物，而且可在科学文献中找到这种转化方法。其中特别相关的是转化商业上重要的作物，例如油菜籽(De Block等，1989)，向日葵(Everett等，1987)和大豆(Christou等，1989；Kline等，1987)的方法。

根据表达水平，发生表达的组织类型和/或表达的发育阶段，可调节HIO的表达(包括转录和翻译)。许多异源调节序列(例如，启动子和增强子)可用于控制HIO核酸的表达。这些包括组成型，诱导型和可调节的启动子，以及能以组织或瞬时特异性方式调控表达的启动子和增强因子。示例性的组成型启动子包括树莓E4启动子(美国专利5,783,393和5,783,394)，胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Ebert等，Proc.Nat.Acad.Sci(U.S.A)84：5745-5749，1987)，章鱼碱合成酶(OCS)启动子(其由根癌农杆菌的诱导肿瘤的质粒携带)，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，Plant Mol.Biol，9：315-324，1987)以及CaMV35S启动子(Odell et al.，Nature 313：810-812，1985 and Jones JD et al，1992)的花椰菜病毒启动子，甜瓜肌动蛋白启动子(公开的PCT申请WO0056863)，玄参花叶病毒35S-启动子(美国专利5,378,619)，光诱导的来自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的启动子(ssRUBISCO)，Adh启动子(Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：6624-6628，1987)，蔗糖合成酶启动子(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：4144-4148，1990)，R基因复合启动子(Chandler等，The Plant Cell 1：1175-1183，1989)，叶绿素a/b结合蛋白基因启动子，CsVMV启动子(Verdaguer B等，1998)；这些启动子也被用于产生在植物中表达的DNA构建体，例如PCT公开WO 84/02913。示例性的组织特异性启动子包括番茄E4和E8启动子(美国专利5,859,330)和番茄2AII基因启动子(Van Haaren MJJ等，1993)。

在一个优选的实施方案中，HIO表达在来自其表达与早期种子和/或胚胎发育相关的基因的调节序列的调控下。实际上，在优选的实施方案中，所使用的启动子为种子增强的启动子。这种启动子的实例包括来自诸如napin(Kridl等，Seed Sci.Res.1：209：219，1991)，球蛋白(Belanger and Kriz，Genet.，129：863-872，1991，GenBank Accession No.L22295)，γ玉米醇溶蛋白Z 27(Lopes等，Mol Gen Genet.，247：603-613，1995)，L3油质蛋白启动子(美国专利6,433,252)，菜豆蛋白(Bustos等，Plant Cell，1(9)：839-853，1989)，arcelin5(US 2003/0046727)，大豆7S启动子，7Sα启动子(US 2003/0093828)，大豆7Sα’β黄豆蛋白启动子，7Sα’启动子(Beachy等，EMBO J.，4：3047，1985；Schuler等，Nucleic AcidRes.，10(24)：8225-8244，1982)，大豆胰蛋白酶抑制剂(Riggs等，PlantCell 1(6)：609-621，1989)，ACP(Baerson等，Plant Mol.Biol.，22(2)：255-267，1993)，硬脂酰-ACP脱氢酶(Slocombe等，Plant Physiol.104(4)：167-176，1994)，β黄豆蛋白的大豆a′亚基(Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.83：8560-8564，1986)，蚕豆USP(P-Vf.Usp，SEQ ID NO：1，2，和3(US 2003/229918)以及玉米L3油质蛋白启动子(Hong等，Plant Mol.Biol.，34(3)：549-555，1997)等基因的5’调节区域。还包括玉米醇溶蛋白，是在玉米胚乳中发现的一组贮藏蛋白。玉米醇溶蛋白基因的基因组克隆已被分离(Pedersen等，Cell 29：1015-1026，1982；以及Russell等，Transgenic Res.6(2)：157-168)并且来自这些克隆的启动子，包括15kD，16kD，19kD，22kD，27kD以及这些基因也可被利用。已知例如在玉米内发挥功能的其他启动子包括下列基因的启动子：waxy，Brittle，Shrunken 2，分支酶I和II，淀粉合成酶，去分支酶，油质蛋白，谷蛋白以及蔗糖合成酶。其启动子与早期种子和胚胎发育相关的豆科植物基因包括V.faba豆球蛋白(Baumlein等，1991，Mol Gen Genet 225：121-8；Baumlein等，1992，Plant J 2：233-9)，V.faba usp(Fiedler等，1993，Plant Mol Biol 22：669-79)，豌豆convicilin(Bown等，1988，Biochem J 251：717-26)，豌豆凝集素(dePater等，1993，Plant Cell 5：877-86)，P.vulgarisβ菜豆蛋白(Bustos等，1991，EMBO J 10：1469-79)，P.vulgaris DLEC2和PHS[β](Bobb等，1997，Nucleic Acids Res 25：641-7)和大豆β-conglycinin，7S贮藏蛋白(Chamberland等，1992，PlantMol Biol 19：937-49)。

其启动子与早期种子和胚胎发育相关的谷类基因包括水稻谷蛋白(″GluA-3，″Yoshihara and Takaiwa，1996，Plant Cell Physiol 37：107-11；″GluB-1，″Takaiwa等，1996，Plant Mol Biol 30：1207-21；Washida等，1999，Plant Mol Biol 40：1-12；″Gt3，″Leisy等，1990，Plant Mol Biol 14：41-50)，水稻醇溶谷蛋白(Zhou&Fan，1993，Transgenic Res 2：141-6)，小麦醇溶谷蛋白(Hammond-Kosack等，1993，EMBO J 12：545-54)，玉米醇溶蛋白(Z4，Matzke等，1990，Plant Mol Biol 14：323-32)和大麦B-hordein(Entwistle等，1991，Plant Mol Biol 17：1217-31)。

其他的其启动子与早期种子和胚胎发育相关的基因，包括油棕GL07A(7S球蛋白，Morcillo等，2001，Physiol Plant 112：233-243)，甘蓝型油菜napin，2S贮藏蛋白和napA基因(Josefsson等，1987，J BiolChem 262：12196-201；Stalberg等，1993，Plant Mol Biol 1993 23：671-83；Ellerstrom等，1996，Plant Mol Biol 32：1019-27)，甘蓝型油菜油质蛋白(Keddie等，1994，Plant Mol Biol 24：327-40)，拟南芥油质蛋白(Plant等，1994，Plant Mol Biol 25：193-205)，拟南芥FAE1(Rossak等，2001，Plant Mol Biol 46：717-25)，刀豆conA(Yamamoto等，1995，Plant Mol Biol 27：729-41)和长春花异胡豆苷合成酶(Str，Ouwerkerk andMemelink，1999，Mol Gen Genet 261：635-43)。在另一个优选的实施方案中，使用来自在油生物合成期间表达的基因的调节序列(参见，例如，美国专利5,952,544)。可选择的启动子来自于植物贮藏蛋白基因(Bevan等，1993，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342：209-15)。其他可使用的启动子例如描述于美国专利5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435和4,633,436。

在另一个方面，有时可能需要抑制宿主细胞中内源HIO的表达。用于实施本发明该方面的示例性方法包括，但不限于反义抑制(Smith等，1988；van der Krol等，1988)；共抑制(Napoli，等，1990)；核酶(PCT公开WO 97/10328)；和正义与反义的组合(Waterhouse，等，1998)。抑制宿主细胞中内源序列的方法，一般使用待抑制序列的至少一部分的转录或转录和翻译。这种序列可以与内源序列的编码以及非编码区同源。反义抑制可使用完整的cDNA序列(Sheehy等，1988)，部分cDNA序列包括5’编码序列(Cannon等，1990)或3’非编码序列(Ch′ng等，1989)的片段。共抑制技术可使用完整的cDNA序列(Napoli等，1990；van der Krol等，1990)或部分cDNA序列(Smith等，1990)。

可进行标准的分子和遗传试验，以更进一步分析基因与观察到的表型之间的关联。示例性技术描述如下。

1.DNA/RNA分析

例如，通过原位杂交，可通过突变体与野生型系的对比确定阶段-与组织特异性基因表达模式。可进行基因，尤其是侧接调节区甲基化状况的分析。其他的适用技术包括过表达，异位表达，在其他植物物种中的表达和基因敲除(反向遗传学，靶向敲除，病毒诱导的基因沉默[VIGS，参见Baulcombe D，1999])。

在优选的应用中，通过微阵列分析的表达分布被用于同时测量许多不同基因表达中的差异或诱导的改变。用于微阵列分析的技术是本领域熟知的(Schena M等，Science(1995)270：467-470；Baldwin D等，1999；Dangond F，Physiol Genomics(2000)2：53-58；van Hal NL等，JBiotechnol(2000)78：271-280；Richmond T and Somerville S，Curr OpinPlant Biol(2000)3：108-116)。可以进行单独标签的株系的表达分布分析。这种分析可鉴定由于感兴趣基因的过表达而协调调节的其它基因，其可有助于把未知基因置于特定的途径。

2.基因产物的分析

基因产物分析可包括重组蛋白表达，抗血清产生，免疫定位，催化或其他的活性的生物化学分析，磷酸化状况分析和通过酵母双杂交分析进行与其他蛋白之间的相互作用分析。

3.途径分析

途径分析可包括，基于它的错表达表型或通过与相关基因的序列同源性，把基因或基因产物置于特定的生物化学，新陈代谢或信号途径中。或者，分析可包括与野生型系和其它突变系的遗传交叉(产生双突变体)，以把基因指定于途径中，或确定在途径中突变对下游“报告”基因表达的作用。

产生具有改变含油量的表型的突变植物

本发明更进一步提供了鉴定在内源HIO或者其等位基因中具有能赋予这些植物及其后代HIO表型的突变的非转基因植物的方法。在一种称为“TILLING”的方法中(用于在基因组中靶向诱导的局部病变)，例如，使用EMS处理，在感兴趣植物的种子中诱导突变。培养得到的植物，并且自花受精，后代用于制备DNA样品。HIO-特异性PCR被用于鉴定突变的植物是否具有HIO突变。然后测试具有HIO突变的植物含油量的改变，或者，测试植物的含油量的改变，然后使用HIO-特异性PCR确定具有改变含油量的植物是否具有突变的HIO基因。TILLING可鉴定能改变特异性基因的表达或由这些基因编码的蛋白的活性的突变(参见Colbert等(2001)Plant Physiol 126：480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18：455-457)。

在另一种方法中，候选基因/数量性状基因座(QTL)方法可用于标记辅助的育种项目，以鉴定HIO基因或HIO直系同源物中能赋予含油量的改变的等位基因或突变(参见Bert等，Theor Appl Genet.2003 Jun；107(1)：181-9；以及Lionneton等，Genome.2002Dec；45(6)：1203-15)。因此，在本发明更进一步的方面中，HIO核酸被用于鉴定具有改变的含油量的植物是否在内源HIO中具有突变，或是否具有能导致含油量改变的特定等位基因。

虽然参考特定的方法和实施方案已经描述了本发明，应当理解只要不背离本发明可以进行各种修饰和改变。这里引用的所有出版物都明确地在这里作为参考引入，用于描述和公开可与本发明一起使用的组合物和方法的目的。所有引用的专利，专利申请和参考的网站和公共数据库中的序列信息也引入作为参考。

实施例

实施例1

利用激活标签构建体进行转化产生具有HIO表型的植物

使用激活标签“ACTTAG”载体，pSKI015产生突变体(GI#6537289；Weigel D等，2000)。使用标准方法产生拟南芥转基因植物，基本上如公开的申请PCT WO0183697中所述。简要地，T0拟南芥(Col-0)植物用携带有pSKI015载体的土壤农杆菌进行转化，该载体包括来源于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA，除草剂抗性选择性标记基因和4X CaMV35S增强子元件。根据除草剂抗性，在T1世代选择转基因植物。

在收获时通过近红外光谱学(NIR)分析T3种子。利用Bruker 22N/F捕获NIR红外光谱。利用NIR分析的数据和参考厂商说明通过Bruker软件估计总种子油的含量以及总种子蛋白含量。将我们的校准预测的油含量(ren油14731d+sline.q2，预测己烷萃取油)，紧接美国石油化学家学会官方的方法以及推荐作法(Official and RecommendedPractices of American Oil Chemists Society)，第五版本，AOCS，Champaign，Ill的AOCS法AM1-92的一般方法，与38,090个个体ACTTAG系进行比较。种子组成分析之后，通过反向PCR以及测序确定各品系基因组中ACTTAG元件的位置。在这个分析中考虑38,090个具有回收的侧接序列的品系。

由于种植了38,090个品系并且长满12个月，将种子油含量值校正到使环境差异的影响最小化，所述环境差异可以改变种子油含量。计算所种植的品系每天的平均种子油含量及其标准偏差。种子油含量表示为“相对标准偏差距离”(SD距离)，通过从各品系种子油含量减去种植日平均种子油含量并由那天标准偏差除差异进行计算。该标准化可以比较整年生长的种植种子中的种子油含量。

通过评价38,090个品系中所有受ACTTAG元件影响的基因鉴定过表达时引起高种子油表现型的基因。通过下列方法实现；首先，鉴定各品系中可能由ACTTAG元件激活的基因并将品系的种子油含量指定给这些基因；第二，当特定的基因过表达时通过获得各基因单独的种子油值的平均值确定种子油含量。由于评价了38,090个品系，并且各元件影响平均2.5个基因，各基因将具有4个种子油值的平均值。具有最高平均SD距离的基因被确定为过表达时引起高种子油的基因。

实施例2

显示改变的含油量表型的植物中T-DNA***序列的表征

我们进行了基本上如专利申请PCT WO0183697中所示的标准分子分析，以确定与改变的含油量表型相关的T-DNA***位点。简而言之，从显示改变的含油量表型的植物提取基因组DNA。使用pSKI015载体的特异性引物进行的PCR，确认了来自HIO油系的植物中存在35S增强子，Southern印迹分析证实了ACTTAG T-DNA的基因组整合，并且显示单独的T-DNA***序列在转基因系中的存在。

反相PCR被用于回收T-DNA***序列侧翼的基因组DNA，然后使用基础的BLASTN搜索和/或拟南芥信息源(TAIR)数据库(可以在公众可以进入的拟南芥信息资源网站获得)进行序列分析。

实施例3

HIO表型的重演

为了检验At1g10220的过表达是否引起高种子油表型，将从过表达该基因的转基因植物的种子中的油含量与来自非-转基因对照植物种子中的油含量。为了这么做，将At1g10220克隆到种子特异性CsVMV启动子后植物转化载体中并利用花浸渍法转化到拟南芥植物中。该植物转化载体含有由RE4启动子启动的nptII基因提供针对卡那霉素的抗性并用作选择性标记。将来自转化的植物的种子接种在含有卡那霉素的琼脂培养基上。7天后，鉴定作为健康绿色植物的转基因植物并移植到土壤上。非-转基因对照植物在琼脂培养基上萌芽，生长7天然后移植到土壤上。将22个转基因的幼苗和10个非转基因的对照植物转移到相同的32格平地的随机位置。植物生长至成熟并自花授精并结子。从每一植物收获种子，通过如下所述的方法由Near Infrared(NIR)波谱学评估种子的含油量。由NIR光谱学测定的从各植物收获的种子中的油百分比显示于表2中。通过用预测的油值除以对照种子(即没有转基因的植物的种子)中的平均油值确定相对的油值。

已经在3个实验中检验了At1g10220的过表达对种子油的影响。在3个实验中，过表达At1g10220的植物具有比生长在相同的平地的对照植物高的种子油含量。整个实验中，过表达At1g10220的植物的平均种子油含量比未转化的对照高3.4％。过表达At1g10220的植物的种子油含量显著高于非-转基因对照植物(双向ANOVA；P＝0.0043)。

表2

实验	植物ID	转基因	预测的平均值	相对值平均值
					1	DX06876001	无	28.42	99.45

1	DX06876002	无	29.53	103.34
					1	DX06876003	无	27.00	94.46
1	DX06876004	无	26.26	91.90
					1	DX06876005	无	31.26	109.39
1	DX06876006	无	28.34	99.15

1	DX06876007	无	27.27	95.41
					1	DX06876008	无	28.64	100.19
1	DX06876009	无	31.77	111.17
					1	DX06876010	无	27.31	95.54
1	DX06894001	CsVMV::At1g10220	28.02	98.04
					1	DX06894002	CsVMV::At1g10220	29.06	101.67
1	DX06894003	CsVMV::At1g10220	27.65	96.74
					1	DX06894005	CsVMV::At1g10220	32.28	112.95
1	DX06894006	CsVMV::At1g10220	33.08	115.76
					1	DX06894007	CsVMV::At1g10220	29.21	102.22
1	DX06894008	CsVMV::At1g10220	28.28	98.94
					1	DX06894009	CsVMV::At1g10220	29.03	101.57
1	DX06894010	CsVMV::At1g10220	30.09	105.30
					1	DX06894011	CsVMV::At1g10220	31.38	109.80
1	DX06894012	CsVMV::At1g10220	29.13	101.93
					1	DX06894013	CsVMV::At1g10220	30.01	105.01

1	DX06894014	CsVMV::At1g10220	27.83	97.39
					1	DX06894015	CsVMV::At1g10220	25.99	90.96
1	DX06894016	CsVMV::At1g10220	28.59	100.04
					1	DX06894017	CsVMV::At1g10220	31.37	109.77
1	DX06894018	CsVMV::At1g10220	28.94	101.25
					1	DX06894019	CsVMV::At1g10220	30.01	104.99
1	DX06894020	CsVMV::At1g10220	28.61	100.10
					1	DX06894021	CsVMV::At1g10220	27.88	97.56
1	DX06894022	CsVMV::At1g10220	27.24	95.33
					2	DX06877001	无	29.11	97.56
2	DX06877002	无	27.83	93.27
					2	DX06877003	无	31.39	105.20
2	DX06877004	无	28.63	95.95

2	DX06877005	无	32.60	109.28
					2	DX06877006	无	31.39	105.20
2	DX06877007	无	29.09	97.51
					2	DX06877008	无	28.75	96.36
2	DX06877009	无	29.84	100.02
					2	DX06877010	无	29.73	99.64
2	DX06895001	CsVMV::At1g10220	32.66	109.46
					2	DX06895002	CsVMV::At1g10220	30.29	101.52

2	DX06895003	CsVMV::At1g10220	30.12	100.95
					2	DX06895004	CsVMV::At1g10220	31.43	105.34
2	DX06895005	CsVMV::At1g10220	33.31	111.64
					2	DX06895006	CsVMV::At1g10220	32.71	109.64
2	DX06895007	CsVMV::At1g10220	31.89	106.90
					2	DX06895008	CsVMV::At1g10220	29.91	100.25
2	DX06895009	CsVMV::At1g10220	33.17	111.19
					2	DX06895010	CsVMV::At1g10220	33.25	111.44
2	DX06895011	CsVMV::At1g10220	34.24	114.76
					2	DX06895012	CsVMV::At1g10220	31.91	106.94
2	DX06895013	CsVMV::At1g10220	30.52	102.28
					2	DX06895014	CsVMV::At1g10220	28.95	97.05
2	DX06895015	CsVMV::At1g10220	27.55	92.33
					2	DX06895016	CsVMV::At1g10220	32.14	107.74
2	DX06895017	CsVMV::At1g10220	29.99	100.54
					2	DX06895018	CsVMV::At1g10220	29.33	98.32
2	DX06895019	CsVMV::At1g10220	30.57	102.46
					2	DX06895020	CsVMV::At1g10220	30.04	100.67
2	DX06895021	CsVMV::At1g10220	31.18	104.50
					2	DX06895022	CsVMV::At1g10220	30.35	101.73
3	G002758001	无	32.09	99.77

3	G002758002	无	31.97	99.39
					3	G002758003	无	32.09	99.78
3	G002758004	无	31.66	98.44
					3	G002758005	无	32.60	101.35
3	G002758007	无	32.41	100.77
					3	G002758008	无	31.81	98.90
3	G002758010	无	32.67	101.59
					3	G002749001	CsVMV::At1g10220	33.80	105.08
3	G002749002	CsVMV::At1g10220	31.87	99.10
					3	G002749003	CsVMV::At1g10220	32.93	102.37
3	G002749004	CsVMV::At1g10220	32.20	100.11
					3	G002749005	CsVMV::At1g10220	33.37	103.76
3	G002749006	CsVMV::At1g10220	35.77	111.22
					3	G002749007	CsVMV::At1g10220	34.00	105.70
3	G002749008	CsVMV::At1g10220	32.10	99.79
					3	G002749009	CsVMV::At1g10220	35.77	111.23
3	G002749010	CsVMV::At1g10220	32.94	102.43
					3	G002749011	CsVMV::At1g10220	36.04	112.04
3	G002749012	CsVMV::At1g10220	32.77	101.90
					3	G002749013	CsVMV::At1g10220	33.74	104.91
3	G002749014	CsVMV::At1g10220	33.87	105.29

3	G002749015	CsVMV::At1g10220	35.25	109.60
					3	G002749016	CsVMV::At1g10220	33.29	103.51
3	G002749017	CsVMV::At1g10220	30.82	95.83
					3	G002749018	CsVMV::At1g10220	33.01	102.63
3	G002749019	CsVMV::At1g10220	31.82	98.92
					3	G002749020	CsVMV::At1g10220	32.12	99.88
3	G002749021	CsVMV::At1g10220	31.43	97.73
					3	G002749022	CsVMV::At1g10220	33.31	103.57

实施例4

为了确定高油表型是否传递到下一代，将来自实验3中培育的7株植物的T2种子接种在含有卡那霉素的琼脂培养基上，并允许其萌芽以及生长7天。这8株植物代表8种不同的转化事件。将22个卡那霉素抗性幼苗转移到如上所述的32格平地的随机位置。将10株非转基因对照(Col-O)植物也转移到平地上。植物生长至成熟并自花授精并结子。从每一植物收获种子，通过如下所述的方法由Near Infrared(NIR)波谱学评估种子的含油量。由NIR光谱学测定的从各植物收获的种子中的油百分比显示于表3中。通过用预测的油值除以对照种子(即没有转基因的植物的种子)中的平均油值确定相对的油值。

由T-检验所确定的，来自所检验的7个转化事件中的5个的转基因植物比生长在相同平地上的对照植物具有显著高的含油量(p＞0.05)。

表3

实验	植物	母株	预测的平均值	相对值的平均值	T-检验P值
						1	DX07702001	G002749011	33.02	99.87	4.8E-05
1	DX07702002	G002749011	35.94	108.69

1	DX07702003	G002749011	37.66	113.91
						1	DX07702004	G002749011	36.76	111.17
1	DX07702005	G002749011	36.24	109.6
						1	DX07702006	G002749011	34.37	103.94
1	DX07702007	G002749011	36.71	111.03
						1	DX07702009	G002749011	34.91	105.58
1	DX07702010	G002749011	35.68	107.89
						1	DX07702011	G002749011	35.89	108.56
1	DX07702012	G002749011	35.47	107.27

1	DX07702013	G002749011	35.13	106.25
						1	DX07702014	G002749011	35.24	106.57
1	DX07702015	G002749011	35.15	106.32
						1	DX07702016	G002749011	35.26	106.63
1	DX07702017	G002749011	33.57	101.53
						1	DX07702018	G002749011	36.65	110.84
1	DX07702019	G002749011	35.43	107.15
						1	DX07702020	G002749011	33.52	101.37
1	DX07702021	G002749011	36.79	111.27
						1	DX07702022	G002749011	37.34	112.93
1	DX07716001	COL-0	33.26	100.59
						1	DX07716002	COL-0	31.27	94.58

1	DX07716003	COL-0	31.12	94.13
						1	DX07716004	COL-0	33.64	101.75
1	DX07716005	COL-0	33.5	101.33
						1	DX07716006	COL-0	34.48	104.28
1	DX07716007	COL-0	32.22	97.43
						1	DX07716008	COL-0	34.42	104.09
1	DX07716009	COL-0	34.1	103.13
						1	DX07716010	COL-0	32.64	98.71
2	DX07703001	G002749009	33.98	109.86	0.0017
						2	DX07703002	G002749009	36.14	116.81
2	DX07703003	G002749009	31.87	103.02
						2	DX07703004	G002749009	35.64	115.21
2	DX07703005	G002749009	35.58	115.01
						2	DX07703006	G002749009	33.72	109.01
2	DX07703007	G002749009	32.91	106.4
						2	DX07703008	G002749009	34.28	110.81
2	DX07703009	G002749009	33.46	108.17

2	DX07703010	G002749009	32.69	105.67
						2	DX07703011	G002749009	29.04	93.86
2	DX07703012	G002749009	35.59	115.04
						2	DX07703013	G002749009	33.2	107.33

2	DX07703014	G002749009	31.99	103.4
						2	DX07703015	G002749009	33.17	107.22
2	DX07703016	G002749009	33.88	109.52
						2	DX07703017	G002749009	34.12	110.3
2	DX07703018	G002749009	32.75	105.87
						2	DX07703019	G002749009	34.97	113.03
2	DX07703020	G002749009	30.19	97.6
						2	DX07703021	G002749009	35.22	113.86
2	DX07703022	G002749009	31.07	100.45
						2	DX07717001	COL-0	32.2	104.08
2	DX07717002	COL-0	33.83	109.34
						2	DX07717003	COL-0	32.44	104.87
2	DX07717004	COL-0	29.35	94.87
						2	DX07717005	COL-0	30.67	99.15
2	DX07717006	COL-0	29.21	94.42
						2	DX07717007	COL-0	30.94	100.02
2	DX07717008	COL-0	29.14	94.2
						2	DX07717009	COL-0	30.64	99.05
3	DX07706001	G002749007	32.51	106.61	0.0156
						3	DX07706002	G002749007	31.13	102.06
3	DX07706003	G002749007	34.87	114.33

3	DX07706004	G002749007	30.63	100.44
						3	DX07706005	G002749007	33.4	109.51
3	DX07706006	G002749007	31.07	101.86
						3	DX07706007	G002749007	29.99	98.32

3	DX07706008	G002749007	30.06	98.57
						3	DX07706009	G002749007	35.68	116.98
3	DX07706010	G002749007	32.95	108.04
						3	DX07706011	G002749007	34.21	112.16
3	DX07706012	G002749007	33.95	111.33
						3	DX07706013	G002749007	31.96	104.81
3	DX07706014	G002749007	31.23	102.39
						3	DX07706015	G002749007	30.03	98.47
3	DX07706016	G002749007	31.75	104.1
						3	DX07706018	G002749007	30.8	101.01
3	DX07706019	G002749007	31.34	102.75
						3	DX07706020	G002749007	31.44	103.07
3	DX07706021	G002749007	32.55	106.72
						3	DX07706022	G002749007	34.34	112.61
3	DX07720001	COL-0	31.75	104.1
						3	DX07720002	COL-0	29.67	97.29
3	DX07720003	COL-0	31	101.65

3	DX07720004	COL-0	32.1	105.26
						3	DX07720005	COL-0	32.08	105.2
3	DX07720006	COL-0	31.23	102.41
						3	DX07720007	COL-0	30.53	100.12
3	DX07720008	COL-0	27.09	88.81
						3	DX07720009	COL-0	28.51	93.49
3	DX07720010	COL-0	31.01	101.67
						4	DX07707001	G002749014	33.52	113.42	0.0067
4	DX07707002	G002749014	34.49	116.7
						4	DX07707003	G002749014	34.25	115.88
4	DX07707004	G002749014	35.94	121.61
						4	DX07707005	G002749014	29.51	99.85

4	DX07707006	G002749014	28.3	95.73
						4	DX07707007	G002749014	35.69	120.74
4	DX07707008	G002749014	30.63	103.62
						4	DX07707009	G002749014	35.53	120.22
4	DX07707010	G002749014	32.76	110.84
						4	DX07707011	G002749014	35.38	119.71
4	DX07707012	G002749014	30.68	103.81
						4	DX07707013	G002749014	31.36	106.11
4	DX07707014	G002749014	31.43	106.35

4	DX07707015	G002749014	35.11	118.79
						4	DX07707016	G002749014	33.02	111.7
4	DX07707017	G002749014	32.11	108.64
						4	DX07707018	G002749014	29.25	98.97
4	DX07707019	G002749014	32	108.25
						4	DX07707020	G002749014	30.8	104.21
4	DX07707021	G002749014	35.33	119.54
						4	DX07707022	G002749014	32.01	108.29
4	DX07721001	COL-0	33.18	112.26
						4	DX07721002	COL-0	26.24	88.78
4	DX07721003	COL-0	34.38	116.31
						4	DX07721004	COL-0	27	91.36
4	DX07721005	COL-0	28.82	97.51
						4	DX07721006	COL-0	28.15	95.25
4	DX07721007	COL-0	27.3	92.37
						4	DX07721008	COL-0	29.29	99.11
4	DX07721009	COL-0	29.19	98.75
						4	DX07721010	COL-0	32.01	108.31
5	DX07708001	G002749001	31.16	105.11	0.0023
						5	DX07708002	G002749001	34.12	115.12

5	DX07708003	G002749001	33.61	113.38
						5	DX07708004	G002749001	34.5	116.4
5	DX07708005	G002749001	28.52	96.21
						5	DX07708006	G002749001	34.7	117.07
5	DX07708007	G002749001	29.88	100.8
						5	DX07708008	G002749001	33.76	113.88
5	DX07708009	G002749001	32.11	108.34
						5	DX07708010	G002749001	31.45	106.09
5	DX07708011	G002749001	29.06	98.05
						5	DX07708012	G002749001	32.46	109.53
5	DX07708013	G002749001	31.88	107.57
						5	DX07708014	G002749001	33.52	113.09
5	DX07708015	G002749001	33.19	111.96
						5	DX07708016	G002749001	30.56	103.09
5	DX07708017	G002749001	27.04	91.23
						5	DX07708018	G002749001	33.67	113.6
5	DX07708019	G002749001	32.7	110.31
						5	DX07708020	G002749001	30.88	104.17
5	DX07708021	G002749001	33.23	112.12
						5	DX07722001	COL-0	30.59	103.19
5	DX07722002	COL-0	29.09	98.13

5	DX07722003	COL-0	27.94	94.27
						5	DX07722004	COL-0	28.26	95.33
5	DX07722005	COL-0	29.08	98.12
						5	DX07722006	COL-0	30.42	102.61
5	DX07722007	COL-0	31.36	105.79
						5	DX07722008	COL-0	32.84	110.78
5	DX07722009	COL-0	29	97.84
						5	DX07722010	COL-0	27.85	93.95

实施例5

HIO表型的重演

为了检验At2g28630的过表达是否引起高种子油表型，将从过表达该基因的转基因植物的种子中的油含量与来自非-转基因对照植物种子中的油含量。为了这么做，将At2g28630克隆到种子特异性CsVMV启动子后植物转化载体中并利用花浸渍法转化到拟南芥植物中。该植物转化载体含有由RE4启动子启动的nptII基因提供针对卡那霉素的抗性并用作选择性标记。将来自转化的植物的种子接种在含有卡那霉素的琼脂培养基上。7天后，鉴定作为健康绿色植物的转基因植物并移植到土壤上。非-转基因对照植物在琼脂培养基上萌芽，生长7天然后移植到土壤上。将22个转基因的幼苗和10个非转基因的对照植物转移到相同的32格平地的随机位置。植物生长至成熟并自花授精并结子。从每一植物收获种子，通过如下所述的方法由Near Infrared(NIR)波谱学评估种子的含油量。由NIR光谱学测定的从各植物收获的种子中的油百分比显示于表4中。通过用预测的油值除以对照种子(即没有转基因的植物的种子)中的平均油值确定相对的油值。

已经在6个实验中检验了At2g28630的过表达对种子油的影响。在4个实验中，过表达At2g28630的植物具有比生长在相同的平地的对照植物高的种子油含量。整个实验中，过表达At2g28630的植物的平均种子油含量比未转化的对照高2.6％。过表达At2g28630的植物的种子油含量显著高于非-转基因对照植物(双向ANOVA；P＝0.0297)。

表4

实验	植物ID	转基因	预测的平均值	相对值平均值
					1	DX01869001	CsVMV：At2g28630	41.41	104.26
1	DX01869002	CsVMV：At2g28630	41.87	105.42

1	DX01869003	CsVMV：At2g28630	41.48	104.44
					1	DX01869004	CsVMV：At2g28630	40.66	102.37

1	DX01869005	CsVMV：At2g28630	40.57	102.15
					1	DX01869006	CsVMV：At2g28630	39.63	99.79
1	DX01869007	CsVMV：At2g28630	41.03	103.31
					1	DX01869008	CsVMV：At2g28630	40.73	102.55
1	DX01869009	CsVMV：At2g28630	40.77	102.66
					1	DX01869010	CsVMV：At2g28630	40.33	101.56
1	DX01869011	CsVMV：At2g28630	40.03	100.79
					1	DX01869012	CsVMV：At2g28630	41.19	103.72
1	DX01869013	CsVMV：At2g28630	40.56	102.13
					1	DX01869014	CsVMV：At2g28630	37.68	94.87
1	DX01869015	CsVMV：At2g28630	39.33	99.04
					1	DX01849001	无	37.75	95.04
1	DX01849002	无	39.76	100.11
					1	DX01849003	无	40.31	101.49
1	DX01849004	无	40.40	101.74
					1	DX01849005	无	40.46	101.89
1	DX01849006	无	41.06	103.40
					1	DX01849007	无	40.87	102.92
1	DX01849008	无	37.10	93.41

2	Z004182001	CsVMV：At2g28630	30.40	95.24
					2	Z004182002	CsVMV：At2g28630	29.13	91.28
2	Z004182003	CsVMV：At2g28630	32.54	101.95
					2	Z004182004	CsVMV：At2g28630	33.88	106.16
2	Z004182005	CsVMV：At2g28630	33.62	105.33
					2	Z004182006	CsVMV：At2g28630	35.55	111.40
2	Z004182007	CsVMV：At2g28630	32.32	101.27
					2	Z004182008	CsVMV：At2g28630	32.54	101.97
2	Z004182009	CsVMV：At2g28630	33.10	103.72
					2	Z004182010	CsVMV：At2g28630	33.23	104.11

2	Z004182011	CsVMV：At2g28630	33.45	104.82
					2	Z004182012	CsVMV：At2g28630	31.11	97.48
2	Z004182013	CsVMV：At2g28630	33.30	104.34
					2	Z004182014	CsVMV：At2g28630	31.49	98.68
2	Z004182015	CsVMV：At2g28630	36.69	114.95
					2	Z004182016	CsVMV：At2g28630	34.76	108.91
2	Z004182017	CsVMV：At2g28630	34.00	106.53
					2	Z004182018	CsVMV：At2g28630	35.50	111.24
2	Z004182019	CsVMV：At2g28630	34.38	107.73
					2	Z004182020	CsVMV：At2g28630	35.12	110.04
2	Z004182021	CsVMV：At2g28630	33.32	104.39

2	Z004182022	CsVMV：At2g28630	33.80	105.92
					2	Z004198001	无	31.51	98.72
2	Z004198002	无	30.62	95.94
					2	Z004198003	无	32.85	102.94
2	Z004198004	无	32.90	103.08
					2	Z004198005	无	31.46	98.57
2	Z004198006	无	31.63	99.12
					2	Z004198007	无	33.29	104.31
2	Z004198008	无	34.92	109.42
					2	Z004198009	无	30.12	94.38
2	Z004198010	无	30.31	94.97
					3	Z004183001	CsVMV：At2g28630	33.40	107.43
3	Z004183002	CsVMV：At2g28630	31.50	101.30
					3	Z004183003	CsVMV：At2g28630	34.82	111.99
3	Z004183004	CsVMV：At2g28630	35.51	114.19
					3	Z004183005	CsVMV：At2g28630	35.51	114.21
3	Z004183006	CsVMV：At2g28630	30.84	99.20
					3	Z004183007	CsVMV：At2g28630	35.04	112.70

3	Z004183008	CsVMV：At2g28630	35.28	113.48
					3	Z004183009	CsVMV：At2g28630	31.47	101.22
3	Z004183010	CsVMV：At2g28630	34.99	112.53

3	Z004183011	CsVMV：At2g28630	30.29	97.42
					3	Z004183012	CsVMV：At2g28630	32.62	104.91
3	Z004183013	CsVMV：At2g28630	30.45	97.92
					3	Z004183014	CsVMV：At2g28630	31.31	100.71
3	Z004183015	CsVMV：At2g28630	33.31	107.13
					3	Z004183016	CsVMV：At2g28630	30.45	97.94
3	Z004183017	CsVMV：At2g28630	32.23	103.66
					3	Z004183018	CsVMV：At2g28630	31.58	101.57
3	Z004183019	CsVMV：At2g28630	32.84	105.64
					3	Z004183020	CsVMV：At2g28630	34.85	112.09
3	Z004183021	CsVMV：At2g28630	31.63	101.71
					3	Z004183022	CsVMV：At2g28630	32.40	104.20
3	Z004199001	无	28.91	92.97
					3	Z004199002	无	31.13	100.12
3	Z004199003	无	31.49	101.27
					3	Z004199004	无	29.81	95.88
3	Z004199005	无	32.65	105.01
					3	Z004199006	无	33.51	107.77
3	Z004199007	无	30.84	99.18
					3	Z004199008	无	31.30	100.65
3	Z004199009	无	30.20	97.15

4	DX06647001	CsVMV：At2g28630	30.19	98.92
					4	DX06647002	CsVMV：At2g28630	31.93	104.62
4	DX06647003	CsVMV：At2g28630	30.20	98.94
					4	DX06647004	CsVMV：At2g28630	31.08	101.83
4	DX06647005	CsVMV：At2g28630	35.62	116.70

4	DX06647006	CsVMV：At2g28630	31.66	103.74
					4	DX06647007	CsVMV：At2g28630	33.16	108.64
4	DX06647008	CsVMV：At2g28630	33.58	110.01
					4	DX06647009	CsVMV：At2g28630	33.74	110.52
4	DX06647010	CsVMV：At2g28630	30.32	99.33
					4	DX06647011	CsVMV：At2g28630	32.57	106.71
4	DX06647012	CsVMV：At2g28630	30.59	100.23
					4	DX06666001	无	31.61	103.55
4	DX06666002	无	31.02	101.63
					4	DX06666003	无	29.63	97.07
4	DX06666004	无	29.45	96.49
					4	DX06666005	无	31.88	104.46
4	DX06666006	无	32.66	106.98
					4	DX06666007	无	30.26	99.14
4	DX06666008	无	30.88	101.18
					4	DX06666009	无	29.11	95.36

4	DX06666010	无	28.74	94.14
					5	DX06843001	CsVMV：At2g28630	31.81	110.13
5	DX06843002	CsVMV：At2g28630	27.87	96.49
					5	DX06843003	CsVMV：At2g28630	25.69	88.96
5	DX06843004	CsVMV：At2g28630	25.29	87.57
					5	DX06843005	CsVMV：At2g28630	27.73	96.03
5	DX06843006	CsVMV：At2g28630	32.06	111.00
					5	DX06843007	CsVMV：At2g28630	26.60	92.09
5	DX06843008	CsVMV：At2g28630	27.65	95.75
					5	DX06843009	CsVMV：At2g28630	30.82	106.71
5	DX06843010	CsVMV：At2g28630	29.62	102.56
					5	DX06843011	CsVMV：At2g28630	31.34	108.51
5	DX06843012	CsVMV：At2g28630	27.87	96.52

5	DX06843013	CsVMV：At2g28630	27.55	95.41
					5	DX06843014	CsVMV：At2g28630	30.64	106.09
5	DX06843016	CsVMV：At2g28630	30.33	105.00
					5	DX06843017	CsVMV：At2g28630	27.92	96.68
5	DX06843018	CsVMV：At2g28630	28.07	97.19
					5	DX06825001	无	28.93	100.18
5	DX06825002	无	34.13	118.19
					5	DX06825003	无	32.84	113.70

5	DX06825004	无	28.03	97.06
					5	DX06825005	无	26.18	90.63
5	DX06825006	无	28.60	99.03
					5	DX06825007	无	27.16	94.04
5	DX06825008	无	28.83	99.83
					5	DX06825009	无	26.79	92.75
5	DX06825010	无	27.32	94.59
					6	DX06844001	CsVMV：At2g28630	28.60	94.68
6	DX06844002	CsVMV：At2g28630	30.65	101.45
					6	DX06844003	CsVMV：At2g28630	33.32	110.29
6	DX06844004	CsVMV：At2g28630	29.43	97.41
					6	DX06844005	CsVMV：At2g28630	31.54	104.39
6	DX06844006	CsVMV：At2g28630	29.37	97.21
					6	DX06844007	CsVMV：At2g28630	31.55	104.44
6	DX06844008	CsVMV：At2g28630	27.60	91.36
					6	DX06844009	CsVMV：At2g28630	28.92	95.74
6	DX06844010	CsVMV：At2g28630	31.35	103.77
					6	DX06844011	CsVMV：At2g28630	29.45	97.49
6	DX06844012	CsVMV：At2g28630	30.11	99.66
					6	DX06844014	CsVMV：At2g28630	30.67	101.52
6	DX06844015	CsVMV：At2g28630	29.11	96.34

6	DX06844016	CsVMV：At2g28630	28.09	92.99
					6	DX06844017	CsVMV：At2g28630	33.38	110.49
6	DX06844018	CsVMV：At2g28630	30.15	99.81
					6	DX06844019	CsVMV：At2g28630	27.87	92.24
6	DX06844020	CsVMV：At2g28630	29.61	98.02
					6	DX06844021	CsVMV：At2g28630	29.12	96.40
6	DX06844022	CsVMV：At2g28630	29.58	97.92
					6	DX06826001	无	31.80	105.27
6	DX06826002	无	29.53	97.76
					6	DX06826003	无	28.06	92.90
6	DX06826004	无	28.68	94.94
					6	DX06826005	无	28.99	95.95
6	DX06826006	无	36.13	119.58
					6	DX06826007	无	28.10	93.02
6	DX06826008	无	30.50	100.95
					6	DX06826009	无	30.66	101.48
6	DX06826010	无	29.65	98.15

实施例6

为了确定高油表型是否传递到下一代，将来自实验2中培育的8株植物的T2种子接种在含有卡那霉素的琼脂培养基上，并允许其萌芽以及生长7天。这8株植物代表8种不同的转化事件。将22个卡那霉素抗性幼苗转移到如上所述的32格平地的随机位置。将10株非转基因对照(Col-0)植物也转移到平地上。植物生长至成熟并自花授精并结子。从每一植物收获种子，通过如下所述的方法由Near Infrared(NIR)波谱学评估种子的含油量。由NIR光谱学测定的从各植物收获的种子中的油百分比显示于表5中。通过用预测的油值除以对照种子(即没有转基因的植物的种子)中的平均油值确定相对的油值。

由T-检验所确定的，来自所检验的8个转化事件中的2个的转基因植物比生长在相同平地上的对照植物具有显著高的含油量(p＞0.05)。

表5

实验	植物	母株	预测的平均值	相对值的平均值	T-检验P值
						1	DX07749001	Z004182015	35.97	109.05	0.0028
1	DX07749002	Z004182015	33.79	102.43
						1	DX07749003	Z004182015	36.23	109.82
1	DX07749004	Z004182015	36.58	110.89
						1	DX07749005	Z004182015	35.24	106.83
1	DX07749006	Z004182015	34.35	104.11
						1	DX07749007	Z004182015	37.00	112.16
1	DX07749008	Z004182015	37.58	113.93
						1	DX07749009	Z004182015	34.74	105.30
1	DX07749010	Z004182015	36.87	111.77
						1	DX07749011	Z004182015	34.90	105.79
1	DX07749012	Z004182015	35.54	107.75
						1	DX07749013	Z004182015	37.68	114.21
1	DX07749014	Z004182015	34.22	103.74
						1	DX07749015	Z004182015	36.60	110.96
1	DX07749016	Z004182015	34.82	105.54
						1	DX07749017	Z004182015	32.12	97.36

1	DX07749018	Z004182015	32.53	98.60
						1	DX07749019	Z004182015	34.83	105.59
1	DX07749020	Z004182015	31.86	96.57
						1	DX07749021	Z004182015	33.93	102.84
1	DX07749022	Z004182015	35.95	108.99
						1	DX07765001	COL-0	32.84	99.55

1	DX07765002	COL-0	32.92	99.80
						1	DX07765003	COL-0	29.95	90.79
1	DX07765004	COL-0	33.37	101.15
						1	DX07765005	COL-0	33.22	100.70
1	DX07765006	COL-0	34.48	104.52
						1	DX07765007	COL-0	31.64	95.90
1	DX07765008	COL-0	35.50	107.60
						1	DX07765009	COL-0	31.56	95.67
1	DX07765010	COL-0	34.41	104.31
						2	DX07750001	Z004182006	35.21	105.42	0.0032
2	DX07750002	Z004182006	36.56	109.47
						2	DX07750003	Z004182006	33.62	100.67
2	DX07750004	Z004182006	35.30	105.70
						2	DX07750005	Z004182006	34.44	103.11
2	DX07750006	Z004182006	36.23	108.47

2	DX07750007	Z004182006	35.76	107.05
						2	DX07750008	Z004182006	33.27	99.61
2	DX07750009	Z004182006	35.53	106.37
						2	DX07750010	Z004182006	37.42	112.05
2	DX07750011	Z004182006	35.16	105.26
						2	DX07750012	Z004182006	33.25	99.54
2	DX07750013	Z004182006	35.50	106.29
						2	DX07750014	Z004182006	36.16	108.27
2	DX07750015	Z004182006	34.94	104.61
						2	DX07750016	Z004182006	35.54	106.41
2	DX07750017	Z004182006	35.59	106.56
						2	DX07750018	Z004182006	32.83	98.29
2	DX07750019	Z004182006	36.50	109.28
						2	DX07750020	Z004182006	33.54	100.42

2	DX07750021	Z004182006	34.62	103.66
						2	DX07750022	Z004182006	37.02	110.83
2	DX07766001	COL-0	32.64	97.71
						2	DX07766002	COL-0	30.97	92.71
2	DX07766003	COL-0	33.53	100.39
						2	DX07766004	COL-0	3331	99.72
2	DX07766005	COL-0	34.65	103.74

2	DX07766006	COL-0	34.35	102.83
						2	DX07766007	COL-0	34.49	103.25
2	DX07766008	COL-0	31.32	93.78
						2	DX07766009	COL-0	33.74	101.01
2	DX07766010	COL-0	35.02	104.86

实施例7

HIO表型的重演

为了检验At3g48910的过表达是否引起高种子油表型，将从过表达该基因的转基因植物的种子中的油含量与来自非-转基因对照植物种子中的油含量。为了这么做，将At3g48910克隆到种子特异性CsVMV启动子后植物转化载体中并利用花浸渍法转化到拟南芥植物中。该植物转化载体含有由RE4启动子启动的nptII基因提供针对卡那霉素的抗性并用作选择性标记。将来自转化的植物的种子接种在含有卡那霉素的琼脂培养基上。7天后，鉴定作为健康绿色植物的转基因植物并移植到土壤上。非-转基因对照植物在琼脂培养基上萌芽，生长7天然后移植到土壤上。在最初的2个实验中，15株转基因植物连同8株非转基因对照植物转移到土壤上。在第3个实验中，将22个转基因的幼苗和10个非转基因的对照植物转移到相同的32格平地的随机位置。植物生长至成熟并自花授精并结子；然而。一些植物没有经受住转移。从每一植物收获种子，通过如下所述的方法由Near Infrared(NIR)波谱学评估种子的含油量。由NIR光谱学测定的从各植物收获的种子中的油百分比显示于表6中。通过用预测的油值除以对照种子(即没有转基因的植物的种子)中的平均油值确定相对的油值。

已经在3个实验中检验了At3g48910的过表达对种子油的影响。

在所有3个实验中，过表达At3g48910的植物具有比生长在相同的平

地的对照植物高的种子油含量。整个实验中，过表达At3g48910的植物的平均种子油含量比未转化的对照高8.5％。过表达At3g48910的植物的种子油含量显著高于非-转基因对照植物(双向ANOVA；P＝0.0014)。

表6

实验	植物ID	转基因	预测的平均值	相对值平均值
					1	DX02775001	CsVMV::At3g48910	38.84	126.54
1	DX02775002	CsVMV::At3g48910	37.74	122.98
					1	DX02775003	CsVMV::At3g48910	35.77	116.56
1	DX02775004	CsVMV::At3g48910	32.72	106.63
					1	DX02775005	CsVMV::At3g48910	33.02	107.60
1	DX02775006	CsVMV::At3g48910	31.27	101.89
					1	DX02775008	CsVMV::At3g48910	35.84	116.78
1	DX02775009	CsVMV::At3g48910	34.84	113.53
					1	DX02775010	CsVMV::At3g48910	35.59	115.98
1	DX02774002	无	33.35	108.67
					1	DX02774003	无	30.78	100.31
1	DX02774004	无	30.88	100.61
					1	DX02774005	无	31.07	101.24
1	DX02774006	无	28.25	92.05
					1	DX02774007	无	26.57	86.58
1	DX02774008	无	33.11	107.88
					2	DX02861001	CsVMV::At3g48910	36.82	113.46

2	DX02861002	CsVMV::At3g48910	32.50	100.13
					2	DX02861003	CsVMV::At3g48910	34.56	106.50
2	DX02861004	CsVMV::At3g48910	33.65	103.68
					2	DX02861005	CsVMV::At3g48910	36.04	111.07
2	DX02861006	CsVMV::At3g48910	35.33	108.87
					2	DX02861008	CsVMV::At3g48910	33.55	103.39
2	DX02861010	CsVMV::At3g48910	36.64	112.90
					2	DX02861011	CsVMV::At3g48910	33.24	102.42
2	DX02861012	CsVMV::At3g48910	34.99	107.82
					2	DX02861013	CsVMV::At3g48910	27.83	85.76
2	DX02862001	无	32.49	100.12
					2	DX02862002	无	33.11	102.03
2	DX02862003	无	35.12	108.22
					2	DX02862004	无	31.55	97.21
2	DX02862005	无	32.26	99.42
					2	DX02862006	无	32.92	101.44
2	DX02862007	无	29.78	91.75
					2	DX02862008	无	32.39	99.81

3	DX06633001	CsVMV::At3g48910	34.21	115.58
					3	DX06633002	CsVMV::At3g48910	29.16	98.53
3	DX06633003	CsVMV::At3g48910	33.57	113.42
					3	DX06633004	CsVMV::At3g48910	31.56	106.64
3	DX06633005	CsVMV::At3g48910	30.02	101.43
					3	DX06633006	CsVMV::At3g48910	28.40	95.95
3	DX06633007	CsVMV::At3g48910	35.45	119.80
					3	DX06633008	CsVMV::At3g48910	33.86	114.40
3	DX06633009	CsVMV::At3g48910	31.65	106.95
					3	DX06633010	CsVMV::At3g48910	27.91	94.30
3	DX06633011	CsVMV::At3g48910	30.63	103.50

3	DX06633012	CsVMV::At3g48910	34.74	117.37
					3	DX06615001	无	27.71	93.64
3	DX06615002	无	28.04	94.73
					3	DX06615003	无	31.24	105.55
3	DX06615004	无	32.51	109.84
					3	DX06615005	无	27.95	94.44
3	DX06615006	无	29.57	99.90
					3	DX06615007	无	31.05	104.91
3	DX06615008	无	31.19	105.39
					3	DX06615009	无	29.04	98.13

3

DX06615010

无

27.66

93.46

实施例8

为了确定高油表型是否传递到下一代，将来自实验1中培育的7株植物的T2种子接种在含有卡那霉素的琼脂培养基上，并允许其萌芽以及生长7天。这8株植物代表8种不同的转化事件。将22个卡那霉素抗性幼苗转移到如上所述的32格平地的随机位置。将10株非转基因对照(C0l-0)植物也转移到平地上。植物生长至成熟并自花授精并结子。从每一植物收获种子，通过如下所述的方法由Near Infrared(NIR)波谱学评估种子的含油量。由NIR光谱学测定的从各植物收获的种子中的油百分比显示于表7中。通过用预测的油值除以对照种子(即没有转基因的植物的种子)中的平均油值确定相对的油值。

由T-检验所确定的，来自所检验的7个转化事件中的1个的转基因植物比生长在相同平地上的对照植物具有显著高的含油量(p＞0.05)。

实验

植物

母株

预测的平均值

相对值的平均值

T-检验P值

1	DX07710001	DX02775002	35.24	113.01	0.003257
						1	DX07710002	DX02775002	34.43	110.4
1	DX07710003	DX02775002	34.38	110.27
						1	DX07710004	DX02775002	35.9	115.14
1	DX07710005	DX02775002	32.19	103.23
						1	DX07710006	DX02775002	35.22	112.95
1	DX07710007	DX02775002	32.1	102.94
						1	DX07710008	DX02775002	34	109.03
1	DX07710009	DX02775002	34.11	109.39
						1	DX07710010	DX02775002	33.48	107.37
1	DX07710011	DX02775002	31.19	100.03
						1	DX07710012	DX02775002	33.07	106.05

1	DX07710013	DX02775002	29.4	94.28
						1	DX07710014	DX02775002	32.44	104.03
1	DX07710015	DX02775002	34.66	111.15
						1	DX07710016	DX02775002	31.93	102.4
1	DX07710017	DX02775002	34.88	111.87
						1	DX07710018	DX02775002	33.35	106.95
1	DX07710019	DX02775002	32.77	105.11
						1	DX07710020	DX02775002	32.88	105.43
1	DX07710021	DX02775002	33.67	107.98
						1	DX07710022	DX02775002	31.78	101.92
1	DX07724001	COL-0	33.34	106.91
						1	DX07724002	COL-0	30.42	97.55
1	DX07724003	COL-0	28.61	91.74
						1	DX07724004	COL-0	33.44	107.24
1	DX07724005	COL-0	32.95	105.66
						1	DX07724006	COL-0	29.87	95.8
1	DX07724007	COL-0	29.69	95.23

1	DX07724008	COL-0	31.67	101.56
						1	DX07724009	COL-0	30.37	97.39
1	DX07724010	COL-0	31.47	100.92

实施例9

拟南芥HIO序列的分析

用BLAST(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)，PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res 27：260-262)，PSORT(Nakai K，和Horton P，1999，Trends Biochem Sci 24：34-6)，和/或CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 22：4673-4680)进行序列分析。

实施例10

通过根癌土壤杆菌介导的转化或微粒轰击获得油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，红花，油椰，椰子，亚麻，蓖麻以及花生的转化的外植体。由转化的组织再生植物。然后分析温室生长的植物目的基因的表达水平以及油的水平。

实施例11

本实施例提供了测定转基因包谷植物的油以及蛋白含量，质量差，氨基酸组成，游离氨基酸水平以及微量元素含量的分析方法。

通过低分辩率¹H核磁共振(NMR)(Tiwari等，JAOCS，51：104-109(1974)；或Rubel，JAOCS，71：1057-1062(1994))确定第一代单个玉米粒以及解剖的胚芽以及胚乳的油水平(基于质量以及组织重量百分比)，由此测定单个粒样品的NMR张弛时间，并基于利用从根据加速溶剂萃取之后重量分析测定的具有改变的油水平的玉米粒分析产生的标准曲线的回归分析计算油水平。进行单向方差分析以及Student’s t-检验(JMP，版本4.04，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)来通过转基因-特异性PCR鉴定转基因以及非-转基因粒之间的显著差别。

通过NIT光谱学确定第二代种子中油水平以及蛋白水平，由此测定由单株植物收获的接种样本品集的NIT谱，并基于利用由玉米粒分析产生的标准曲线的回归分析计算油以及蛋白水平，所述玉米粒具有分别由加速溶剂萃取或元素(％N)分析之后重量分析测定的改变的油或蛋白水平。进行单向方差分析以及Student’s t-检验来鉴定阳性标记以及阴性标记植物的种子之间油(％粒重)以及蛋白(％粒重)的显著差异。

利用下列方法分析来自每一转基因事件的游离氨基酸的水平。将每一转基因植物的种子逐一粉碎成细小的粉末并将约50mg所产生的粉末转入预称重的离心管。记录精确的样品重量并将1.0ml的5％三氯乙酸添加到各样品管中。在室温下通过涡旋混合样品然后在Eppendorf微量离心机(Model 5415C，Brinkmann Instrument，Westbury，NY)上在14,000rpm离心15分钟。取出等分样品的上清液并通过利用AgilentTechnical Publication“Amino Analysis Using the Zorbax Eclipse-AAAColumns and Agilent 1100 HPLC，”2000年3月17，所述的方法通过HPLC(Agilent 1100)进行分析。

通过下列方法对来自谷物的总氨基酸进行定量测定。研磨谷粒并利用6N HCl在100℃回流条件下24小时酸水解约60mg的所产生的粗粉。干燥样品并在0.1N HCl中重构继之以用α-苯二醛(OPA)预柱衍生化作用用于HPLC分析。通过反相Zorbax Eclipse XDB-C18HPLC柱在Agilent 1100HPLC(Agilent，Palo Alto，CA)上分离氨基酸。通过荧光检测氨基酸。半胱氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺以及色氨酸并未包括在该氨基酸筛选中(Henderson等，″Rapid，Accurate，Sensitiveand Reproducible HPLC Analysis of Amino acids，Amino Acid AnalysisUsing Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100HPLC，″Agilent Publication(2000)；也参见″Measurement of Acid-Stable AminoAcids，″AACC Method 07-01(American Association of Cereal Chemists，Approved Methods，9th版本(LCCC#_9575308))。利用(ApprovedMethods of the美国谷物化学家协会-10th版本，AACC编辑，(2000)07-20Measurement of Tryptophan-Alakline Hydrolysis)所述的碱解方法测定玉米粒中的总色氨酸。

通过本领域已知的方法分析种子中生育酚以及生育三烯酚的水平。简而言之，将10mg的种子组织添加到已经添加了500μl1％连苯三酚(pyrogallol)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)/乙醇的无菌微量离心管中的1g微株上(Biospec Product Inc，Barlesville，OK。微Beadbeater(Biospec)中“快”速振荡混合物3分钟，然后过滤通过0.2μm滤膜进入自动取样器管。利用带有荧光检测以及带通以及狭缝的Zorbax硅石HPLC柱(4.6mm×250mm)经HPLC分析过滤的提取物，荧光检测的激发波长290nm，发射波长336nm。溶剂成分以及工作条件如下所列，溶剂A为己烷，溶剂B为甲基-叔丁基醚。注射体积为20μl，流速为1.5ml/分钟并且运行时间为40℃12分钟。溶剂梯度为90％溶剂A，10％溶剂B10分钟；25％溶剂A，75％溶剂B11分钟；以及90％溶剂A，10％溶剂B12分钟。在1％连苯三酚/乙醇中进行生育酚标准的运行用于比较(α-生育酚，γ-生育酚，β-生育酚，δ-生育酚以及生育酚(母育酚))。利用Chemstation软件(Hewlett Packard)计算α，β，δ以及γ生育酚的标准曲线。在1％连苯三酚/乙醇中进行生育三烯酚标准用于比较(α-生育三烯酚，γ-生育三烯酚，β-生育三烯酚，δ-生育三烯酚)。利用Chemstation软件(HewlettPackard)计算α-，β-，δ-以及γ-生育三烯酚的标准曲线。

经标准的方案(Craft，Meth.Enzymol.，213：185-205(1992)确定转基因玉米粒内类胡萝卜素的水平。经标准的方案(Threlfall等，Methodsin Enzymology，XVIII，C部分，369-396(1971)；以及Ramadan等，Eur.Food Res.Technol.，214(6)：521-527(2002))确定plastiquinol以及叶绿醌。

参考文献

Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990.

Ausubel FM et al.，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sohs，New York，N.Y.，1993.

Baldwin D et al.，Cur Opin Plant Biol.2(2)：96-103，1999.

Bateman et al.，1999，Nucleic Acids Res 27：260-262.

Baulcombe D，Arch Virol Suppl 15：189-201，1999.

Cannon et al.，Plant Molec.Biol.(1990)15：39-47.

Ch′ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86：10006-10010

Christensen S et al.，9th International Conference on ArabidopsisResearch.Univ.of Wisconsin-Madison，June 24-28，1998.Abstract 165.

Christou et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1989)86：7500-7504.

De Block et al.，Plant Physiol.(1989)91：694-701.

Dieffenbach C and Dveksler G(Eds.)PCR Primer：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1995.

Everett et al.，Bio/Technology(1987)5：1201

Feldmann et al.，Science 243：1351-1354，1989.

Focks N and Benning C，Plant Physiol 118：91-101，1998.

Fridborg I et al.，Plant Cell 11：1019-1032，1999.

Harlow E and Lane D，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988，New York.

Harlow E and Lane D，Using Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1999，New York

Hayashi H et al.，Science 258：1350-1353，1992.

Jako et al.，Plant Physiology 126(2)：861-74，2001.

James DW and Dooner HK(1990)Theor Appl Genet 80，241-245.

Jones JD et al.，Transgenic Res 1：285-2971992.

Kardailsky I et al.，Science 286：1962-1965，1999.

Katavic V et al.，Plant Physiology 108(1)：399-409，1995.

Kline et al.，Nature(1987)327：70.

Kunkel TA et al.，Methods Enzymol.204：125-39，1991.

Lemieux B.，et al.，1990，Theor Appl Genet 80，234-240.

Nakamura Y et al.，1999，Nucleic Acids Res 27：292.

Napoli，et al.，Plant Cell 2：279-289，1990.

Okuley et al.，Plant Cell 6(1)：147-158，1994.

Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(SecondEdition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989.

Schaffer R，et al.，Cell 93：1219-1229，1998.

Sheehy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：8805-8809.

Smith，et al.，Nature 334：724-726，1988.

Smith et al.，Mol.Gen.Genetics(1990)224：477-481.

Thompson JD et al.，Nucleic Acids Res 22：4673-4680，1994.

van der Krol et al.，Biotechniques(1988)6：958-976.

van der Krol et al.，The Plant Cell(1990)2：291-299.

Van Haaren MJJ et al.，Plant Mol Bio 21：625-640，1993.

Verdaguer B et al.，Plant Mol Biol 37：1055-1067，1998.

Waterhouse，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964，1998.

Weigel D，et al.，Plant Physiology，122：1003-1013，2000.

Wilson K et al.，Plant Cell 8：659-671，1996.

Yadav NS et al.，(1993)Plant Physiol 103，467-476.

序列表

<110>农业经济有限责任公司(Agrinomics，LLC)

 

<120>生产改变含油量的植物

(GENERATION OF PLANTS WITH ALTERED OIL CONTENT)

 

<130>SCT066346-66

 

<150>US 60/585,495

<151>2004-07-02

 

<160>6

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>804

<212>DNA

<213>Arabidopsis thaliana

 

<400>1

atgttgagtc cgttttcgtc acctaggaga tcgagaagag gaaacaaaga aagcaagaat   60

ccttattcaa atcaaggact tgacaagttc tctgcacttc tatctgagct cgatgagaaa  120

agacagagca tttacgcaaa gaggcttgat cctgatggac cgcctcttgt tcggtttgtc  180

ttcactagct ccggcgagtg cgtccctgta atgatcaaga caaagagggc aagtcagaag  240

aaggatgttc tagatgattt caaggtcaag aagaaggacg ttctagatga tttcaaggtc  300

aagaataagg atgttctaga tgatttcaat gtaaagaccg aatcaaaaac agagcaggaa  360

aaagaaataa agcaaacaga tttggaaaca gagcagaaac agagctgtgt attgaatgag  420

aatctgaaga agatttcaag accaaaccat ttattacccg tgacagtggt gctgttgatg  480

gagagaatga acatgagcga agaggaggag caatgcaaaa gaaaccaaga ggcattcaag  540

agattcttcg agcaaatccc caggactgcg gtgataggca tgctttcctt cttcctccac  600

ggccagatga gtaagttcga gaaagctcca agcaagcctc tttccaatgc tttcgccttc  660

gcctccgtgg gctacgttgt gttgcaggtc gcacacggct ttgctcgagc taatcgtcct    720

tcatctttcg ctttcgactt cctctctgtt ctctgtggac ttgcatccgt tgccattctc    780

ttcactgcca tcttcaacga ctga                                           804

 

<210>2

<211>267

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

 

<400>2

 

Met Leu Ser Pro Phe Ser Ser Pro Arg Arg Ser Arg Arg Gly Asn Lys

1               5                  10                  15

Glu Ser Lys Asn Pro Tyr Ser Asn Gln Gly Leu Asp Lys Phe Ser Ala

            20                  25                  30

Leu Leu Ser Glu Leu Asp Glu Lys Arg Gln Ser Ile Tyr Ala Lys Arg

        35                  40                  45

Leu Asp Pro Asp Gly Pro Pro Leu Val Arg Phe Val Phe Thr Ser Ser

    50                  55                  60

Gly Glu Cys Val Pro Val Met Ile Lys Thr Lys Arg Ala Ser Gln Lys

65                  70                  75                  80

Lys Asp Val Leu Asp Asp Phe Lys Val Lys Lys Lys Asp Val Leu Asp

                85                  90                  95

Asp Phe Lys Val Lys Asn Lys Asp Val Leu Asp Asp Phe Asn Val Lys

            100                 105                 110

Thr Glu Ser Lys Thr Glu Gln Glu Lys Glu Ile Lys Gln Thr Asp Leu

        115                 120                 125

Glu Thr Glu Gln Lys Gln Ser Cys Val Leu Asn Glu Asn Leu Lys Lys

    130                 135                 140

Ile Ser Arg Pro Asn His Leu Leu Pro Val Thr Val Val Leu Leu Met

145                 150                 155                 160

Glu Arg Met Asn Met Ser Glu Glu Glu Glu Gln Cys Lys Arg Asn Gln

                165                 170                 175

Glu Ala Phe Lys Arg Phe Phe Glu Gln Ile Pro Arg Thr Ala Val Ile

            180                 185                 190

Gly Met Leu Ser Phe Phe Leu His Gly Gln Met Ser Lys Phe Glu Lys

        195                 200                 205

Ala Pro Ser Lys Pro Leu Ser Asn Ala Phe Ala Phe Ala Ser Val Gly

    210                 215                 220

Tyr Val Val Leu Gln Val Ala His Gly Phe Ala Arg Ala Asn Arg Pro

225                 230                 235                 240

Ser Ser Phe Ala Phe Asp Phe Leu Ser Val Leu Cys Gly Leu Ala Ser

                245                 250                 255

Val Ala Ile Leu Phe Thr Ala Ile Phe Asn Asp

            260                 265

 

<210>3

<211>1927

<212>DNA

<213>Arabidopsis thaliana

 

<400>3

atgcatctta ctcacttcat catctcttct taaaccccaa aacaaacaaa caaacaaaca     60

aaaaatacca aaacaaagaa gaaaaaaaaa ataactatgg atcttctctt tctctttttc    120

tctcttctcc tctcttacct ctttttcaag atctggaaac tcatagactc aaagcaagac    180

aaagattgct acattttaga ctaccaatgt cataaaccaa ccgacgatcg aatggtgagc    240

actcaattca gtggagagat catttatcga aaccaaaacc ttggtttaac cgaatacaag    300

ttccttctca aagccatagt aagctcaggg attggagaac aaacctacgc tccaagactt    360

gtctttgaag gtcgagaaga gcgtccttcg ttacaagatg ggatctccga gatggaagag    420

ttctacgtgg acagcatcgg aaaactcctg gagagaaatc aaatatctcc taaagacata    480

gacatcctcg tagtcaacgt ctccatgctc tcttcaacgc catctttagc ttcaagaatc    540

attaaccatt acaagatgag agacgacgtc aaagtcttca acttgaccgg gatgggatgc    600

agcgcaagtc taatctccgt agacattgtc aagaacattt ttaagagcta cgcaaacaag    660

ttagctcttg ttgccacctc cgagtctttg agccctaatt ggtatagcgg aaacaaccgt    720

tcaatgatct tagccaactg tttgttccgg tccggtggat gtgctattct cttgactaac    780

aaacgtagct tgagaaagaa agcaatgttt aaactcaagt gtatggtacg gactcaccat    840

ggagctagag aggagtctta taattgttgc atccaagccg aagatgaaca aggccgtgtc    900

gggttttact tggggaagaa tctaccaaaa gccgctactc gtgcttttgt agaaaacctc    960

aaggttataa cacccaagat tcttcccgta accgagctta taaggttcat gttaaagctt   1020

cttatcaaga aaatcaagat tcgtcaaaac cctagcaagg gctccacgaa tctcccaccg   1080

gggactccat taaaggcagg aatcaacttc aagaccggga tcgaacattt ttgcatacat   1140

accggaggaa aagctgtgat tgatgggatt ggacatagct tggatttaaa cgagtatgat   1200

attgaacctg cgaggatgac tcttcaccgg tttggcaata cttcggcgag tagtttgtgg   1260

tatgtgttgg cttacatgga ggccaagaag agattgaaga gaggagatag agtttttatg   1320

ataagctttg gagctggttt taagtgtaat agctgcgttt gggaagttgt gagagatctt    1380

actggtggtg aatcaaaagg aaatgtgtgg aatcattgca ttgatgatta tccaccaaaa    1440

tcgattctga atccttattt ggagaagttt ggctggattc aagatgaaga tcctgacact    1500

ttcaaggtcc ctgacgcttt catgtaaaac gtttacgcac aaaaacgcaa acgcaaacgc    1560

aaaaacaaca caaggtgata caatattctc tctttcttaa tttcttcttt tttgccttta    1620

gttaaaattt ttacgttttt ttgtttaaat ggattggaaa ggagatatga atgtaaaaga    1680

aactttaatt agtttttttt ttaatatgat tttttttggg tgttataatt tgttaattac    1740

atactttgaa ataagggttt taagggacat gcacttccaa tacgatgaga atttactaat    1800

ttgccatcat attggaatgc tgccttcttt ttttcttgtt aaatgttgta tcaattttat    1860

attttttgta atgttcattt ttcactctat gttgtacttg tttcgcatta actcaagctt    1920

gccactg                                                              1927

 

<210>4

<211>476

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

 

<400>4

 

Met Asp Leu Leu Phe Leu Phe Phe Ser Leu Leu Leu Ser Tyr Leu Phe

1               5                   10                  15

Phe Lys Ile Trp Lys Leu Ile Asp Ser Lys Gln Asp Lys Asp Cys Tyr

            20                  25                  30

Ile Leu Asp Tyr Gln Cys His Lys Pro Thr Asp Asp Arg Met Val Ser

        35                  40                  45

Thr Gln Phe Ser Gly Glu Ile Ile Tyr Arg Asn Gln Asn Leu Gly Leu

    50                  55                  60

Thr Glu Tyr Lys Phe Leu Leu Lys Ala Ile Val Ser Ser Gly Ile Gly

65                  70                  75                  80

Glu Gln Thr Tyr Ala Pro Arg Leu Val Phe Glu Gly Arg Glu Glu Arg

                85                  90                  95

Pro Ser Leu Gln Asp Gly Ile Ser Glu Met Glu Glu Phe Tyr Val Asp

            100                 105                 110

Ser Ile Gly Lys Leu Leu Glu Arg Asn Gln Ile Ser Pro Lys Asp Ile

        115                 120                 125

Asp Ile Leu Val Val Asn Val Ser Met Leu Ser Ser Thr Pro Ser Leu

    130                 135                 140

Ala Ser Arg Ile Ile Asn His Tyr Lys Met Arg Asp Asp Val Lys Val

145                 150                 155                 160

Phe Asn Leu Thr Gly Met Gly Cys Ser Ala Ser Leu Ile Ser Val Asp

                165                 170                 175

Ile Val Lys Asn Ile Phe Lys Ser Tyr Ala Asn Lys Leu Ala Leu Val

            180                 185                 190

Ala Thr Ser Glu Ser Leu Ser Pro Asn Trp Tyr Ser Gly Asn Asn Arg

        195                 200                 205

Ser Met Ile Leu Ala Asn Cys Leu Phe Arg Ser Gly Gly Cys Ala Ile

    210                 215                 220

Leu Leu Thr Asn Lys Arg Ser Leu Arg Lys Lys Ala Met Phe Lys Leu

225                 230                 235                 240

Lys Cys Met Val Arg Thr His His Gly Ala Arg Glu Glu Ser Tyr Asn

                245                 250                 255

Cys Cys Ile Gln Ala Glu Asp Glu Gln Gly Arg Val Gly Phe Tyr Leu

            260                 265                 270

Gly Lys Asn Leu Pro Lys Ala Ala Thr Arg Ala Phe Val Glu Asn Leu

        275                 280                 285

Lys Val Ile Thr Pro Lys Ile Leu Pro Val Thr Glu Leu Ile Arg Phe

    290                 295                 300

Met Leu Lys Leu Leu Ile Lys Lys Ile Lys Ile Arg Gln Asn Pro Ser

305                 310                 315                 320

Lys Gly Ser Thr Asn Leu Pro Pro Gly Thr Pro Leu Lys Ala Gly Ile

                325                 330                 335

Asn Phe Lys Thr Gly Ile Glu His Phe Cys Ile His Thr Gly Gly Lys

            340                 345                 350

Ala Val Ile Asp Gly Ile Gly His Ser Leu Asp Leu Asn Glu Tyr Asp

        355                 360                 365

Ile Glu Pro Ala Arg Met Thr Leu His Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ala

    370                 375                 380

Ser Ser Leu Trp Tyr Val Leu Ala Tyr Met Glu Ala Lys Lys Arg Leu

385                 390                 395                 400

Lys Arg Gly Asp Arg Val Phe Met Ile Ser Phe Gly Ala Gly Phe Lys

                405                 410                 415

Cys Asn Ser Cys Val Trp Glu Val Val Arg Asp Leu Thr Gly Gly Glu

            420                 425                 430

Ser Lys Gly Asn Val Trp Asn His Cys Ile Asp Asp Tyr Pro Pro Lys

        435                 440                 445

Ser Ile Leu Asn Pro Tyr Leu Glu Lys Phe Gly Trp Ile Gln Asp Glu

    450                 455                 460

Asp Pro Asp Thr Phe Lys Val Pro Asp Ala Phe Met

465                 470                 475

 

<210>5

<211>775

<212>DNA

<213>Arabidopsis thaliana

 

<400>5

atgccagaga agtgtccggt gtctgaaatc ataaagaccc gaaaagtaca ggggcgagaa     60

tgttttgaag tctcatggaa tgatctagaa gggttagagt cgtccattgt tcctgcagat    120

cttgtagaaa gggcttgtcc tgagaagatc atagagttca aggagaaaat ggcagcaaaa    180

aagaagaaac cgaagccgaa acaaaaacag aaggaaacga gttcaccgac caaatcttct    240

tctcttgtcg aactcagcct cgaactccaa caccttgatc tcaactcaac ctctctagta    300

agtagaagca ccttagaaga agcagagcaa gagaacgaac aacaaaactc caagaaacat    360

gattacttgc gtcttatcga ttcacctgat agagaaaatt gcaataacgc ttggtcaaac    420

agggatagat tgggtgttgg aatgagttca tttccattgt atccggaaac agaagtcatt    480

gatctgataa gcccttgtcc tgaagctcgt tcacggagcg tgtcaagaag ttatcaagaa    540

cagaagagcc atgatcacca acttgagact gtgattgagc tgagtgattc agagacagat    600

gatgaggaac attgcaagaa agctagagag cttaggatct ttcttcaaaa tatcaggaaa    660

gacattatcc tatgataaca aaaaaggaaa aataatgtta atgagttctt ttatcttaat    720

ttatggattt catgaaaact attaaaagtt tgaagctata tttttctctt ttgtt         775

 

<210>6

<211>224

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

 

<400>6

 

Met Pro Glu Lys Cys Pro Val Ser Glu Ile Ile Lys Thr Arg Lys Val

1               5                   10                  15

Gln Gly Arg Glu Cys Phe Glu Val Ser Trp Asn Asp Leu Glu Gly Leu

            20                  25                  30

Glu Ser Ser Ile Val Pro Ala Asp Leu Val Glu Arg Ala Cys Pro Glu

        35                  40                  45

Lys Ile Ile Glu Phe Lys Glu Lys Met Ala Ala Lys Lys Lys Lys Pro

    50                  55                  60

Lys Pro Lys Gln Lys Gln Lys Glu Thr Ser Ser Pro Thr Lys Ser Ser

65                  70                  75                  80

Ser Leu Val Glu Leu Ser Leu Glu Leu Gln His Leu Asp Leu Asn Ser

                85                  90                  95

Thr Ser Leu Val Ser Arg Ser Thr Leu Glu Glu Ala Glu Gln Glu Asn

            100                 105                 110

Glu Gln Gln Asn Ser Lys Lys His Asp Tyr Leu Arg Leu Ile Asp Ser

        115                 120                 125

Pro Asp Arg Glu Asn Cys Asn Asn Ala Trp Ser Asn Arg Asp Arg Leu

    130                 135                 140

Gly Val Gly Met Ser Ser Phe Pro Leu Tyr Pro Glu Thr Glu Val Ile

145                 150                 155                 160

Asp Leu Ile Ser Pro Cys Pro Glu Ala Arg Ser Arg Ser Val Ser Arg

                165                 170                 175

Ser Tyr Gln Glu Gln Lys Ser His Asp His Gln Leu Glu Thr Val Ile

            180                 185                 190

Glu Leu Ser Asp Ser Glu Thr Asp Asp Glu Glu His Cys Lys Lys Ala

        195                 200                 205

Arg Glu Leu Arg Ile Phe Leu Gln Asn Ile Arg Lys Asp Ile Ile Leu

    210                 215                 220

Claims (9)

1.一种生产油的方法，其包括：

培育包括植物转化载体的转基因植物，该植物转化载体含有编码或互补于编码包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HIO108多肽或其直系同源物的序列的核苷酸序列，由此相对于对照植物，该转基因植物具有高油表型；以及

从所述植物回收油。

2.权利要求1的方法，其中转基因植物选自油菜籽，大豆，玉米，向日葵，棉花，可可，红花，油棕，椰子，亚麻，蓖麻和花生。

3.权利要求1的方法，其中的油回收自所述植物的种子。

4.产生高油表型植物的方法，所述方法包括：

a)把植物转化载体导入到植物的祖细胞中，该植物转化载体含有编码或互补于编码包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的HIO108多肽或其直系同源物的序列的核苷酸序列，

b)培育该转化的祖细胞以生产转基因植物，其中表达所述的核苷酸序列，以及

c)确定所述的转基因植物的含油量，从而鉴定出相对于对照植物显示改变的含油量表型的转基因植物。

5.鉴定具有高油表型植物的方法，包括鉴定具有HIO108基因的等位基因的植物以及产生所述鉴定的植物的子代，所述HIO108基因的等位基因引起与缺少该等位基因的植物相比含油量的增加，其中产生的子代遗传该等位基因并且为高油表型。

6.权利要求5的方法，其使用候选基因/QTL法。

7.权利要求5的方法，其使用TILLING法。

8.饲料，粗粉，谷粒，或者食物，包含由SEQ ID NO：1的核酸序列编码的多肽。

9.饲料，粗粉，谷粒，或者食物，包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽或者其直向同源物。