CN1995387B - 分枝杆菌菌种鉴定基因芯片检测*** - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于分枝杆菌菌种鉴定的基因芯片检测***，包括用于检测分枝杆菌属、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和偶发分枝杆菌的基因芯片和待测样品中以上菌种的16S rRNA和23S rRNA之间的***序列(ITS)基因的PCR引物。本发明构建了针对分枝杆菌菌种鉴定的基因芯片检测***，可快速、准确检测临床样本中的分枝杆菌的菌种类型，具有检测周期短(整个过程只需1天)、灵敏度高、特异性强的优点，对于指导临床用药和治疗有重要的意义，可广泛用于临床分枝杆菌菌种鉴定试验。
Description
技术领域
本发明涉及含有分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列(ITS)探针的基因芯片；
本发明还涉及用于样本中分枝杆菌菌种鉴定的检测试剂。
背景技术
结核病(tuberculosis)俗称″痨病″，是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)引起的传染性疾病，是全世界由单一致病菌引致死亡最多的疾病，也是危害人类健康的主要传染病之一。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800-1000万，每年死亡人数约300万。我国的结核病情况相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，我国有5.5亿人感染了结核病；现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，结核病死亡在我国各种死亡原因中居第9位，在传染病中居第一位。
分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略带弯曲的杆菌，有分枝生长的趋势，因而得名。本菌属种类颇多，可分为三组：结核杆菌、非结核分枝杆菌、麻风杆菌。在中国分离出的分枝杆菌中，结核分枝杆菌占86.4％，牛分枝杆菌占2.5％，非结核分枝杆菌占11.1％，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。
非结核分枝杆菌病人对大多数一线抗结核药物具有天然抗药性，采用目前标准的化疗方案治疗无效。目前，非结核分枝杆菌病通常依据传统的分枝杆菌菌种鉴定来确诊，然而，传统的分枝杆菌菌种鉴定烦琐、费时、需1-2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌病人通常被作为结核病按常规治疗，病人需要经长期的规范化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治病人，细菌在局部播散。因此，分枝杆菌菌种的快速鉴定对结核病和非结核分枝杆菌病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。
公开号为CN1353753A的专利申请，公开了数种非结核分枝杆菌菌种检测和鉴定的寡聚核苷酸，但是对某些菌种不具有特异性，如不能区分鉴定出鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌。公开号为CN16535158A的专利申请，公开了分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备方法和应用，也在对某些菌种的鉴定上也不能鉴定到种，如不能区分鉴定出堪萨斯、瘰疬、胃、猿分枝杆菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定分枝杆菌到种的水平的基因芯片；
本发明的另一目的在于提供一种可快速地鉴定样本中分枝杆菌到种的水平的检测试剂。
根据本发明的一方面，本发明的基因芯片包括基底和固定于该基底上的探针，所述基底可以是例如玻片、各种纤维膜、尼龙膜等各种类型，优选为尼龙膜，所述固定于基底上的探针为可与分枝杆菌不同菌种的16S rRNA和23S rRNA之间的***序列(ITS)基因的核酸杂交的特异型探针。优选的探针序列为针对不同分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列(ITS)基因而设计的，可与含有这些间隔序列的不同分枝杆菌核酸杂交。
本发明根据不同分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列(ITS)基因设计了下面一系列探针：
GEN
5’-CTTGGTGGTGGGGTGTGGACTTT-3’(SEQ ID NO.1)
5’-AAAGTCCACACCCCACCACCAAG-3’(SEQ ID NO.2)
5’-TGGATAGTGGTTGCGAGCATC-3’ (SEQ ID NO.3)
5’-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3’ (SEQ ID NO.4)
MTC
5’-CGGGTGCATGACAACAAAGTTG-3’ (SEQ ID NO.5)
5’-CAACTTTGTTGTCATGCACCCG-3’ (SEQ ID NO.6)
5’-CCCCAACTGGTGGGGCGTAGG-3’ (SEQ ID NO.7)
5’-CCTACGCCCCACCAGTTGGGG-3’ (SEQ ID NO.8)
MIN
5’-ACGAAAAGCACTCCAATTGGTG-3’ (SEQ ID NO.9)
5’-CACCAATTGGAGTGCTTTTCGT-3’ (SEQ ID NO.10)
5’-TTCCCGTCTGTAGTGGACGGG-3’ (SEQ ID NO.11)
5’-CCCGTCCACTACAGACGGGAA-3’ (SEQ ID NO.12)
5’-CTCGGTCGATCCGTGTGGAGT-3’ (SEQ ID NO.13)
5’-ACTCCACACGGATCGACCGAG-3’ (SEQ ID NO.14)
MAV
5’-ACGAAAAGCACTCCAATTGGT-3’ (SEQ ID NO.15)
5’-ACCAATTGGAGTGCTTTTCGT-3’ (SEQ ID NO.16)
5’-TTCTCGTCTGTAGTGGACGAAA-3’ (SEQ ID NO.17)
5’-TTTCGTCCACTACAGACGAGAA-3’ (SEQ ID NO.18)
MSC
5’-ACGAAAAGCACCCCAACTGGT-3’ (SEQ ID NO.19)
5’-ACCAGTTGGGGTGCTTTTCGT-3’ (SEQ ID NO.20)
5’-TTCTCGCCTGTAGTGGGCGGGAG-3’(SEQ ID NO.21)
5’-CTCCCGCCCACTACAGGCGAGAA-3’(SEQ ID NO.22)
5’-TCGGCTCGTTCTGAGTGGTGT-3’ (SEQ ID NO.23)
5’-ACACCACTCAGAACGAGCCGA-3’ (SEQ ID NO.24)
MKA
5’-AAGCATCCCAACAAGTGGGGT-3’ (SEQ ID NO.25)
5’-ACCCCACTTGTTGGGATGCTT-3’ (SEQ ID NO.26)
5’-CACGACAACAAGCAAAGCCA-3’ (SEQ ID NO.27)
5’-TGGCTTTGCTTGTTGTCGTG-3’ (SEQ ID NO.28)
MAB
5’-AGTAGGTATCTGTAGTGGATATC-3’(SEQ ID NO.29)
5’-GATATCCACTACAGATACCTACT-3’(SEQ ID NO.30)
5’-TCGGACTGTCATAAGAATTGAA-3’ (SEQ ID NO.31)
5’-TTCAATTCTTATGACAGTCCGA-3’ (SEQ ID NO.32)
MCH
5’-AGCCGAATGAGCTTGGGAACA-3’ (SEQ ID NO.33)
5’-TGTTCCCAAGCTCATTCGGCT-3’ (SEQ ID NO.34)
5’-AGTTTCTGTAGTGGTTACTCGC-3’ (SEQ ID NO.35)
5’-GCGAGTAACCACTACAGAAACT-3’ (SEQ ID NO.36)
MMA
5’-CCGGGTGCACAACAACAAGC-3’ (SEQ ID NO.37)
5’-GCTTGTTGTTGTGCACCCGG-3’ (SEQ ID NO.38)
5’-TTGGATGCGCTGCCTTTTGGT-3’ (SEQ ID NO.39)
5’-ACCAAAAGGCAGCGCATCCAA-3’ (SEQ ID NO.40)
MXE
5’-GTGGGTTCGGCGTGTTGTGGC-3’ (SEQ ID NO.41)
5’-GCCACAACACGCCGAACCCAC-3’ (SEQ ID NO.42)
5’-GGTGTTGGGCAGCAGGCAGTAA-3’ (SEQ ID NO.43)
5’-TTACTGCCTGCTGCCCAACACC-3’ (SEQ ID NO.44)
5’-CCCGTGGTGGTGTTGTGCTCCG-3’ (SEQ ID NO.45)
5’-CGGAGCACAACACCACCACGGG-3’ (SEQ ID NO.46)
MFO
5’-TGGCATCCGGTTGCGGGTGTC-3’ (SEQ ID NO.47)
5’-GACACCCGCAACCGGATGCCA-3’ (SEQ ID NO.48)
5’-CTTTTGGGGGGTGGCATCC-3’ (SEQ ID NO.49)
5’-GGATGCCACCCCCCAAAAG-3’ (SEQ ID NO.50)
在上述序列中，针对每一种分枝杆菌设计了正、反两条序列，在使用时可选择任一个(正或反)序列作为检测探针固定于尼龙膜上。
在上述设计的各种分枝杆菌序列的基础上，本领域技术人员可以通过本领域熟知的方法进行探针合成，并对其5’端或3’端进行氨基标记。优选对探针进行3’端氨基标记，其相较5’端氨基标记的探针，具有更好的杂交效果。
在本发明的一个实施方案中，制备芯片的方法为将尼龙膜经EDAC(N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐)预处理30分钟后，激活表面负电荷基团；同时，将在3’端带有氨基标记的探针用缓冲液稀释到适当的浓度后，按阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上，此时，氨基与活化的负电荷基团发生反应生成稳定的共价键，从而将探针固定在尼龙膜表面，最后，用0.1～0.5mol/L的NaOH处理尼龙膜，封闭未结合探针的表面负电荷基团，膜芯片制作完成。
根据本发明的另一方面，用于样本中分枝杆菌菌种鉴定的检测试剂至少包括用于扩增样本中分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列(ITS)的PCR引物以及上述本发明的基因芯片。本发明的PCR引物根据分枝杆菌基因组的特点设计，通过PCR反应可扩增一种或几种突变基因。在本发明中，设计了如下引物序列：
M1-F：5’-GGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGAT-3’(SEQ ID NO.51)
M1-R：5’-GGCATCCACCATGCGCCCTTAGA-3’ (SEQ ID NO.52)
M2-F：5’-CGATCCCACCTTCGACAGCTCC-3’(SEQ ID NO.53)
M2-R：5’-TGTCTAAGGGCGCATGGTGGA-3’ (SEQ ID NO.54)
在使用时，可以选择上述给出序列作为合成的引物序列。上述本发明的引物可以通过本领域技术人员熟知的方法进行合成，可以使用混合引物。同时为便于结果检测，可以在上述引物合成时进行适当的标记，在本发明的一个实施方案中，对引物进行生物素标记，使得合成的PCR产物的5’端带有生物素标记，以在后续的显色反应方便读取结果。
本发明的探针和引物可以针对一种分枝杆菌进行检测，也可以组合使用鉴定多种分枝杆菌。例如，以SEQ ID NO.1～4所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对分枝杆菌属诊断试剂；以SEQ ID NO.5～8所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对结核分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.9～14所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对胞内分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.15～18所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对鸟分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.19～24所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对瘰疬分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.25～28所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对堪萨斯分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.29～32所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对脓肿分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.33～36所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对龟分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.37～40所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对海分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.41～46所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对蟾蜍分枝杆菌的诊断试剂；以SEQ ID NO.47～50所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于针对偶发分枝杆菌的诊断试剂；较为优选的实施方案为，以GEN、MTC、MIN、MAV、MSC、MKA、MAB、MCH、MMA、MXE、MFO所示的序列中各任选一条作为探针序列制备基因芯片，以SEQ IDNO.51～54所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于鉴定十种分枝杆菌。
根据本发明的另一方面，提供一种用于样本中分枝杆菌菌种鉴定的试剂盒，其至少包括本发明的上述检测试剂，本发明的试剂盒还可以进一步包含下述试剂中的一种或几种：样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂和显色试剂。
上述样本处理试剂、PCR扩增试剂、杂交试剂以及显色试剂均可以使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种试剂，这些试剂必要时可以包括在试剂盒中，也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的指示自行配制。
本发明的试剂盒中还可以包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。
在本发明试剂盒的操作方法中，将标记后的待测产物与固定在芯片上的探针进行杂交，其杂交原理与普通核酸杂交相同。杂交温度与探针和标记后的待测样品的长度、GC含量、盐浓度、甲酰胺等有关。优选的是在本发明的试剂盒体系中57℃孵育2-4小时后可获得满意的杂交结果。
在本发明试剂盒的操作中，利用不同的洗脱条件，如温度、盐浓度等最大限度的去除非特异性杂交。标记有过氧化物酶(POD)的链霉亲和素(链霉抗生物素蛋白)与PCR产物5’端带有的生物素特异结合，并与过氧化氢和棕色底物TMB(四甲基联苯胺)的存在下发生化学显色反应，膜条相应探针位置显现蓝色斑点。经阅读仪阅读后对信号与背景进行计算机分析，有相应的软件***分析获得最终的杂交结果。
根据本发明的再一方面，提供一种鉴定分枝杆菌菌种的方法。将来自待检测个体的样本使用本发明的检测试剂检测，通过样本中分枝杆菌各相关基因的表达情况评估该样本中是否含有该分枝杆菌。
本发明构建了针对分枝杆菌菌种鉴定的基因芯片检测***，可快速、准确检测临床样本中的分枝杆菌的菌种类型，具有检测周期短(整个过程只需1天)、灵敏度高、特异性强的优点，对于指导临床用药和治疗有重要的意义，可广泛用于临床分枝杆菌菌种鉴定试验。
附图说明
图1为本发明的分枝杆菌菌种鉴定芯片检测试剂盒样本检测的显色图，图中共有11张膜条。
图2-图26为用25种分枝杆菌标准株测试本发明检测膜条特异性的显色图。
具体实施方式
下面，结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
【实施例1】分支杆菌菌种检测芯片的制备
1.生产原材料的厂商、规格
| 名称 | 厂商 | 规格 | 商品名 |
| EDAC | Sigma |
| 名称 | 厂商 | 规格 | 商品名 |
| 尼龙膜 | Pall | Pore size：0.45uM30cm×3M | Biodyne CMembrane |
探针序列设计如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.47所示，按照本领域技术人员熟知的方法由上海博亚生物技术有限公司合成3’端氨基标记探针。
2.生产膜条
按照以下的步骤及原料生产膜条：
将膜条按要求裁剪
↓
新鲜配制EDAC溶液泡膜30分钟
↓
用蒸馏水洗膜4次，2分钟/次，滤纸上晾干，将膜片固定在滤纸上
↓
用探针稀释液将探针母液稀释
各探针的终浓度为10μM
↓
按照膜上的格子按顺序每格点入1ul探针
↓
点好的膜室温放置20分钟晾干
↓
用0.1mol/L NaOH浸泡膜条5分钟
↓
弃去NaOH，用蒸馏水洗4次
↓
充分晾干后，裁成条状，干燥瓶内保存备用
【实施例2】分枝杆菌菌种鉴定芯片检测试剂盒样本检测
2005年7月～11月，分别在深圳东湖医院和广州胸科医院进行了临床验证，结果证明，本发明的检测***通量大、灵敏度高，基因芯片技术的引入使得该方法具有比培养法更高的灵敏度和准确性。具体试剂、检测方法如下：
| 组成成分 | 数量 | 保存条件 |
| PCR Mix | 50管(20μL/管) | -20℃ |
| 10mMTris | 60ml | 4℃ |
| 组成成分 | 数量 | 保存条件 |
| 裂解液 | 1瓶 | 4℃ |
| 矿物油膜条 | 1管50张 | 室温室温干燥存放 |
| POD母液 | 1管(100μL) | 4℃ |
| TMB(2mg/mL)NALC(N-乙酰-L-半胱氨酸) | 1瓶(20mL)1管(1g) | 4℃4℃ |
本实施例中PCR引物上游序列为SEQ.ID 51，下游序列为SEQ.ID 51。
其他仪器及试剂
PCR仪、DNA电泳仪、分子杂交箱、摇床、生理盐水、3％H2O2
配制或市场购买下述溶液：
| 20×SSC， pH7.0NaCl 175.3g柠檬酸钠 88.2g加H<sub>2</sub>O溶至1000mL，用pH计调pH至7.0，高压灭菌 | 10％SDS，pH7.0SDS 20g溶于180mL水，调pH至7.0，最后定容至200mL |
| A液(1×SSC，0.1％SDS，pH7.4)20×SSC 50mL10％SDS 10mL加H<sub>2</sub>O溶至1000mL，调pH至7.4 | B液(0.5×SSC，0.1％SDS，pH7.4)20×SSC 25mL10％SDS 10mL加H<sub>2</sub>O溶至1000mL，调pH至7.4 |
| C液(0.1M柠檬酸钠，pH5.0)柠檬酸钠 14.7g溶于450mL水，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至500mL | 痰样化解液(未加NALC)柠檬酸钠 29.4gNaOH 40g加水定容至1000mL，灭菌存于4℃备用。 |
| 10×PBSNa<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 47.35gKH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 45.35g加水定容至1000mL。 | 1×PBS10×PBS 100mL加水定容至1000mL，灭菌存于4℃备用。 |
●操作步骤
1.临床痰样的处理方法
1)收集病人痰样，加入等量的化痰试剂(痰样化解液+约0.5％NALC，现配当天用)，化痰处理15～30分钟。
2)痰样消化液转移到1.5mL离心管中，13000转/分钟，离心5分钟。倒净上清液，再用移液器吸去残余在离心管底附近的液体。
3)加入1mLPBS，混合悬浮样品并转移到1.5mL离心管里，13000rpm离心5min，弃上清。
4)沉淀物加入10mMTris，混合悬浮样品，13000rpm离心5min，弃上清。
5)加入50μL裂解液，打散沉淀块，于沸水浴中煮沸10分钟(注意离心管盖可能会爆开，小心污染)。
6)短暂离心，上清液即可作为PCR模板。
2.PCR扩增
每个样品各取一管20μL的PCR Mix，分别加入5μL样品上清液作为PCR扩增模板。PCR扩增程序为：
3.杂交
打开杂交箱，预热至57℃。
取15mL塑料离心管，放入标有样本编号的膜条(应在膜条的一角用铅笔标记)，加入A液4-6mL及相应的两管PCR产物，置于沸水浴中加热10分钟(确保杂交液面完全位于水浴液面之下)。
拧紧离心管盖子，放入杂交箱于57℃杂交1.5小时至过夜。同时取50mL塑料管，加入40mLB液于杂交箱或水浴箱中预热至57℃。
4.洗膜
取出膜条，移至装有预热B液的50mL管中，于56℃轻摇洗涤15分钟(每管40mL溶液，最多可同时洗涤6张膜)
5.显色
用A液配制1∶2000的POD溶液(单做两张膜只需3μLPOD母液，配制成6mL使用液，做四张膜可用5μLPOD母液，配制成10mL使用液)，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液(显色液需新鲜配制，配法：按顺序加入以下成份：19mL 0.1M柠檬酸钠；1mL TMB 10μL3％H2O2)。将膜条浸泡于显色液中避光显色(每隔5-10分钟观察一次，直至肺结核阳性样品显现蓝色斑点，此过程约需30分钟至数小时)。
6.结果判定
膜条上的探针排列顺序：
| GEN | MIN | MKA | MCH | MMA | MFO |
| MTC | MAV | MSC | MAB | MFO | PC |
注：1.GEN代表分枝杆菌属特异性探针，其它探针简称代表的意义是：MTC→结核分枝杆菌复合群、MAV→鸟分枝杆菌、MIN→胞内分枝杆菌、MKA→堪萨斯分枝杆菌、MSC→瘰疠分枝杆菌、MAB→脓肿分枝杆菌、MCH→龟分枝杆菌、MMA→海分枝杆菌、MXE→蟾蜍分枝杆菌、MFO→偶发分枝杆菌；2.PC代表质控对照。
参见图1，为膜条显色结果示例。编号为1的膜条显示所测样品中有结核分枝杆菌；编号为2的膜条显示所测样品中有堪萨斯分枝杆菌；编号为3的膜条显示所测样品中有胞内分枝杆菌；编号为4的膜条显示所测样品中有脓肿分枝杆菌；编号为5的膜条显示所测样品中有偶发分枝杆菌；编号为9的膜条显示所测样品中有分枝杆菌；编号为18的膜条显示所测样品中有鸟分枝杆菌；编号为20的膜条显示所测样品中有瘰疠分枝杆菌；编号为23的膜条显示所测样品中有蟾蜍分枝杆菌；编号为24的膜条显示所测样品中有脓肿分枝杆菌；编号为“空”的膜条检测的是阴性对照样品。
为判定检测结果的可靠性，每次检测务必设置阴性对照。
【实施例3】不同分枝杆菌扩增后杂交效果比较的特异性试验。
在本发明中，对于其它的分枝杆菌的杂交有很好的特异性。以下实验旨在证明本产品的特异性：
针对下列不同的分枝杆菌标准株：H37Rv(ATCC27294)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC12478)、胞内分枝杆菌(ATCC13950)、偶发分枝杆菌(ATCC6481)、戈登分枝杆菌(ATCC14470)、金色分枝杆菌(ATCC23366)、新金色分枝杆菌(ATCC25795)、浅黄分枝杆菌(ATCC43909)、爱知分枝杆菌(ATCC27280)、田鼠分枝杆菌(ATCC19422)、耻垢分枝杆菌(ATCC19420)、副偶发分枝杆菌(ATCC19686)、土分枝杆菌(ATCC19619)、不产色分枝杆菌(ATCC19530)、母牛分枝杆菌(ATCC15483)、鸟分枝杆菌(ATCC25291)、草分枝杆菌(ATCC11758)、瘰疬分枝杆菌(ATCC19981)、胃分枝杆菌(ATCC15754)、次要分枝杆菌(ATCC23292)、蟾蜍分枝杆菌(ATCC19250)、脓肿分枝杆菌(ATCC19977)、非洲分枝杆菌(ATCC25420)、牛分枝杆菌、溃疡分枝杆菌(ATCC19423)。
按照实施例2的方法以上述25种分枝杆菌标准株为样本PCR扩增产物分别与膜条杂交，水为阴性对照，结果见图2-26，图2-26依次为H37Rv、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、金色分枝杆菌、戈登分枝杆菌、新金色分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、爱知分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、副偶发分枝杆菌、土分枝杆菌、不产色分枝杆菌、母牛分枝杆菌、草分枝杆菌、胃分枝杆菌、次要分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的显色结果。
由图2-26结果可见，不同分枝杆菌均获得了很好的杂交结果，并且不存在交叉杂交的情况，因此证明本发明的特异性极高。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变化，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>亚能生物技术(深圳)有限公司
<120>分枝杆菌菌种鉴定基因芯片检测***
<130>
<160>54
<170>PatentIn version 3.3
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cttggtggtg gggtgtggac ttt 23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aaagtecaca ccccaccacc aag 23
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tggatagtgg ttgcgagcat c 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gatgctcgca accactatcc a 21
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cgggtgcatg acaacaaagt tg 22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
caactttgtt gtcatgcacc cg 22
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccccaactgg tggggcgtag g 21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cctacgcccc accagttggg g 21
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
acgaaaagca ctccaattgg tg 22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
caccaattgg agtgcttttc gt 22
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ttcccgtctg tagtggacgg g 21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cccgtccact acagacggga a 21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
ctcggtcgat ccgtgtggag t 21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
actccacacg gatcgaccga g 21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
acgaaaagca ctccaattgg t 21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
accaattgga gtgcttttcg t 21
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ttctcgtctg tagtggacga aa 22
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tttcgtccac tacagacgag aa 22
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
acgaaaagca ccccaactgg t 21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
accagttggg gtgcttttcg t 21
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
ttctcgcctg tagtgggcgg gag 23
<210>22
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctcccgccca ctacaggcga gaa 23
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
tcggctcgtt ctgagtggtg t 21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
acaccactca gaacgagccg a 21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
aagcatccca acaagtgggg t 21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
accccacttg ttgggatgct t 21
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
cacgacaaca agcaaagcca 20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
tggctttgct tgttgtcgtg 20
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
agtaggtatc tgtagtggat atc 23
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
gatatccact acagatacct act 23
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tcggactgtc ataagaattg aa 22
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
ttcaattctt atgacagtcc ga 22
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
agccgaatga gcttgggaac a 21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
tgttcccaag ctcattcggc t 21
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
agtttctgta gtggttactc gc 22
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gcgagtaacc actacagaaa ct 22
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ccgggtgcac aacaacaagc 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
gcttgttgtt gtgcacccgg 20
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
ttggatgcgc tgccttttgg t 21
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
accaaaaggc agcgcatcca a 21
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gtgggttcgg cgtgttgtgg c 21
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
gccacaacac gccgaaccca c 21
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
ggtgttgggc agcaggcagt aa 22
<210>44
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
ttactgcctg ctgcccaaca cc 22
<210>45
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
cccgtggtgg tgttgtgctc cg 22
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
cggagcacaa caccaccacg gg 22
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
tggcatccgg ttgcgggtgt c 21
<210>48
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
gacacccgca accggatgcc a 21
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
cttttggggg gtggcatcc 19
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
ggatgccacc ccccaaaag 19
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
ggagggagct gtcgaaggtg ggat 24
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
ggcatccacc atgcgccctt aga 23
<210>53
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
cgatcccacc ttcgacagct cc 22
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
tgtctaaggg cgcatggtgg a 21
Claims (6)
1.一种用于样本中分枝杆菌菌种鉴定的检测试剂，包括基底及固定于该基底上的探针，所述探针为可分别与分枝杆菌属、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶发分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列(ITS)基因杂交的核酸，以及从待测样本中扩增分枝杆菌不同菌种的16S rRNA和23S rRNA之间的***序列(ITS)基因的PCR引物，其特征是：所述探针的核苷酸序列为：SEQID NO.1～4、SEQ ID NO.5～8、SEQ ID NO.9～14、SEQ ID NO.15～18、SEQ ID NO.19～24、SEQ ID NO.25～28、SEQ ID NO.29～32、SEQID NO.33～36、SEQ ID NO.37～40、SEQ ID NO.41～46和SEQ ID NO.47～50序列中各任选一条，所述PCR引物为上游引物SEQ ID NO.51与下游引物SEQ ID NO.52。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于所述引物的末端进行生物素标记。
3.一种用于样本中分枝杆菌菌种鉴定的检测试剂，包括基底及固定于该基底上的探针，所述探针为可分别与分枝杆菌属、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶发分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列(ITS)基因杂交的核酸，以及从待测样本中扩增分枝杆菌不同菌种的16S rRNA和23S rRNA之间的***序列(ITS)基因的PCR引物，其特征是：所述探针的核苷酸序列为：SEQID NO.1～4、SEQ ID NO.5～8、SEQ ID NO.9～14、SEQ ID NO.15～18、SEQ ID NO.19～24、SEQ ID NO.25～28、SEQ ID NO.29～32、SEQID NO.33～36、SEQ ID NO.37～40、SEQ ID NO.41～46和SEQ ID NO.47～50序列中各任选一条，所述PCR引物为上游引物SEQ ID NO.53与下游引物SEQ ID NO.54。
4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于所述引物的末端进行生物素标记。
5.一种用于样本中分枝杆菌菌种鉴定的检测试剂，包括基底及固定于该基底上的探针，所述探针为可分别与分枝杆菌属、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、海分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶发分枝杆菌的16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列(ITS)基因杂交的核酸，以及从待测样本中扩增分枝杆菌不同菌种的16S rRNA和23S rRNA之间的***序列(ITS)基因的PCR引物，其特征是：所述探针的核苷酸序列为：SEQID NO.1～4、SEQ ID NO.5～8、SEQ ID NO.9～14、SEQ ID NO.15～18、SEQ ID NO.19～24、SEQ ID NO.25～28、SEQ ID NO.29～32、SEQID NO.33～36、SEQ ID NO.37～40、SEQ ID NO.41～46和SEQ ID NO.47～50序列中各任选一条，所述PCR引物为SEQ ID NO.51至SEQ IDNO.54所示的序列。
6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于所述引物的末端进行生物素标记。
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