CN1971279B - 喹噁啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫化学分析技术领域。公开了一种用于喹噁啉-2-羧酸残留检测的酶联免疫方法及试剂盒，本发明的方法主要包括药物改造，免疫原、包被原、抗体的制备以及样品前处理和ELISA检测方法的建立。本发明的试剂盒主要由喹噁啉-2-羧酸(QCA)特异性抗体、QCA标准品、包被有QCA与γ-氨基丁酸反应后与卵清蛋白偶联物的酶标板组成。检测时，样品经偏磷酸水解处理，释放QCA，MAX柱净化，丁胺衍生处理，采用间接竞争ELISA方法测定。本发明的方法及试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点，能同时快速检测大批样品，组织最低检测限为0.6μg/kg。

Description

喹噁啉-2-羧酸残留的酶联免疫检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于食品免疫化学分析技术领域。具体涉及一种用于喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留检测的酶联免疫方法及试剂盒，适用于测定食品动物的可食性组织如肌肉、肝脏中卡巴氧残留标示物喹噁啉-2-羧酸(QCA)的残留量。

背景技术

卡巴氧是喹噁啉类药物，为人工合成的广谱抗菌药，曾作为促生长剂广泛应用于畜、禽养殖中。毒理学研究发现，卡巴氧具有致癌性和致突变性。为了保障消费者的健康和扩大动物性食品的贸易往来，加强对动物性食品中卡巴氧残留的检测是当务之急。

卡巴氧在动物体内代谢成喹噁啉-2-羧酸(QCA)，与组织蛋白结合的QCA在体内滞留时间长，被视为卡巴氧的残留标示物，所以分析卡巴氧残留通常分析其代谢产物QCA。目前检测QCA残留的方法有高效液相色谱法(HPLC)，液质联用(LC-MS)，气质联用(GC-MS)。

常用的仪器法(HPLC、LC-MS、GC-MS)所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，分析时间较长，不能进行高通量样品筛选，不适用于广大基层检测单位应用，难于推广。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选。目前国内外还未见卡巴氧残留标示物喹噁啉-2-羧酸(QCA)的ELISA检测方法及试剂盒的报道。

本发明所提供的酶联免疫方法及试剂盒采用间按竞争ELISA法，检测范围较宽，假阳性率低，检测结果可靠、准确，适用于食品动物的可食性组织如肌肉、肝脏中QCA检测，具有非常重要的经济意义和社会意义。

发明内容

本发明的第1个目的是提供一种喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留的酶联免疫检测方法。

本发明的第2个目的是提供一种喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留的酶联免疫检测试剂盒。

本发明的方法和试剂盒专用于动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸(QCA)残留的酶联免疫检测，与现有方法相比，本发明的方法和试剂盒具有灵敏度高，检测快速，使用方便和检测成本较低等突出优点。

本发明的技术方案是：

一种喹噁啉-2-羧酸残留检测酶联免疫方法，其步骤包括药物改造、免疫原与包被原的制备、抗体的制备和样品前处理，其特征在于按照以下步骤：

(1)将喹噁啉-2-羧酸(QCA)与γ-氨基丁酸(ABA)反应得到产物QCA-ABA；

(2)将步骤(1)所述的产物QCA-ABA与卵清蛋白相偶联得到包被原；

(3)将将步骤(1)所述的产物与牛血清白蛋白相偶联得到免疫原；

(4)用步骤(2)的免疫原免疫兔得到特异性兔多克隆抗体；

(5)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(6)将所述的样品先经酸解提取后再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；

(7)将步骤(6)的待测产物进行酶联免疫检测。

其中：

所述的固相载体是酶标板。例如可以采用48或96孔的酶标板作固相载体。

所述的衍生试剂是丁胺。

所述的催化剂为腈基磷酸二乙酯。

一种基于上述方法的酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的孔酶标极和设在盒体内的试剂，在酶标板的每孔内，包被有所述的包被原；所述的试剂包括抗喹噁啉-2-羧酸特异性兔多克隆抗体，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体，浓缩洗涤液，浓缩样品稀释液，喹噁啉-2-羧酸标准溶液，底物显色A液，底物显色B液，终止液，衍生试剂和催化剂。

其中：

所述的底物显色A液为四甲基联苯胺或邻苯二胺。

所述底物显色B液为过氧化氢或过氧化脲。

所述终止液为硫酸溶液或盐酸溶液。

所述的浓缩洗涤液为含有0.05～0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

所述浓缩样品稀释溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。

本发明酶联免疫方法及试剂盒主要采用间接竞争ELISA法定性或定量检测动物可食性组织如肝、肌肉中QCA残留。其采用高特异性的QCA多克隆抗体，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，组织最低检测限为0.6μg/kg。

附图说明

图1是本发明的免疫原合成路线。

图2是本发明免疫原紫外图谱。

图3是本发明喹噁啉-2-羧酸ELISA试剂盒标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1、抗原制备

1.1免疫原的合成

本发明的药物改造和免疫原的制备按照附图1所示的技术路线。具体步骤是：取酰氯化QCA0.0348g加入1.0mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h。离心除掉沉淀物，此为A液。将340mg牛血清白蛋白(BSA)溶于5mL生理盐水，此为B液。将A液滴加入B液，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.023g，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)0.0434g，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液并用生理盐水透析6天，每12h更换透析液，将所得产物低温冻干，分装保存于-20℃冰箱中，供免疫用。其紫外图谱如图2所示。

1.2包被原的合成

取酰氯化QCA0.0348g加入1.0mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h。离心除掉沉淀物，此为A液。将180mg卵清白蛋白(OVA)溶于5mL生理盐水，此为B液。将A液滴加入B液，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.023g，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)0.0434g，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液并用生理盐水透析6天，每12h更换透析液，将所得产物低温冻干，分装保存于-20℃冰箱中，供包被原。

实施例2、抗体的制备

2.1免疫动物

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以QCA与γ-氨基丁酸反应，反应产物与卵清蛋白偶联为免疫原，免疫剂量为0.5～1mg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫6次，免疫期间要监测血清抗体效价及特异性，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7～10d后采血，颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的QCA多克隆抗体。

2.2抗体纯化

采用辛酸-硫酸铵盐析法纯化抗体。取兔血清5mL，加入0.06mol/L pH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调至pH4.5；于室温下加入辛酸165μL，搅拌30min；将血清10000r/min 44℃离心30min，弃沉淀，用0.1mol/L的NaOH溶液将上清液pH调至7.4；向上清液缓慢滴加等量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的终浓度为50％，搅拌20min，4℃10000r/min离心30min，弃上清液，将沉淀溶于少量0.01mol/LpH7.2PBS中；将沉淀悬浮液移入透析袋，用0.01mol/L pH7.2PBS透析过夜，将纯化的血清分装小瓶，置-20℃冰箱保存。

2.3抗体效价

采用方阵滴定法测得抗体效价为1∶32000。

2.4抗体灵敏度

采用间接竞争ELISA测定，以抗体IC₅₀值(抑制率为50％所对应的药物浓度)为指标判定抗体灵敏度。将QCA-ABA稀释成0μg/L、0.2μg/L、0.8μg/L、3.2μg/L、12.8μg/L、51.2μg/L系列浓度，测定吸光值，所获得的标准品吸光值的平均值除以0μg/L标准的吸光值再乘以100，绘成一个以QCA浓度(μg/L)为半对数坐标***的曲线图。结果显示，抗体IC₅₀值为1～10μg/L。

2.5抗体特异性

采用间接竞争ELISA程序测定，按常规方法计算抗体的交叉反应率，以抗体的交叉反应率为指标判定抗体的特异性。结果如表1所示，QCA-ABA-BSA抗体除与MQCA-ABA-BSA(12％)有交叉反应，与卡巴氧、喹赛多的交叉反应不明显，与结构类似物、催化剂、衍生试剂无交叉反应。

表1本发明的抗体特异性

实施例3、样品前处理方法的建立

(1)取猪肌肉或肝脏组织均质物2g，加入5％偏磷酸10％甲醇溶液5mL，振荡2min，4800r/min离心10min，取上清液；将沉淀再按上述步骤重复提取一次，合并两次提取液；

(2)在步骤(1)的提取液中加入乙酸乙酯6mL，振荡2min，4800r/min离心10min，取上层乙酸乙酯层；对下层液体再按上述步骤重复萃取一次，合并乙酸乙酯层；

(3)在步骤(2)的乙酸乙酯层中加入0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)5mL进行反萃取，振荡1min，静置10min，取下层水相；对上层液体再按上述步骤重复提取一次，合并水相；

(4)分别用甲醇3mL和蒸馏水3mL活化MAX柱，流速控制在1滴/秒，加入上述步骤(3)制备的样品；

(5)待样品提取液全部流出后，分别用0.05mol/L NaOH溶液3mL、甲醇3mL淋洗MAX柱，正压吹干，除去杂质干扰；

(6)用2％甲酸甲醇溶液3mL洗脱并收集洗脱液，正压吹干以便收集完全；

(7)40℃氮气吹干，向吹干后的试管中加入二氯甲烷2mL，涡动30s，溶解残渣；

(8)分别向试管中加入稀释后的衍生试剂和催化剂各10μL，置37℃水浴锅避光反应5h；

(10)反应完毕后47℃氮气吹干，向试管中加入本发明所述的样品稀释液2mL，振荡30s，溶解残渣，作为试样溶液，供ELISA方法测定。

实施例4、检测方法的建立

4.1灵敏度

将QCA用二氯甲烷稀释成0ng/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、3.2ng/mL、12.8ng/mL、51.2ng/mL系列浓度，加入10μL丁胺和20μL腈基磷酸二乙酯(DEPC)37℃反应5h，47℃N₂吹干，用磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)定容至原始浓度，用间接竞争ELISA测定。所获得的标准品吸光值的平均值除以0ng/mL标准的吸光值(抑制率)，以QCA溶液浓度的对数为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制标准曲线。

采用IC₅₀评价本发明的灵敏度。分别测定20次标准曲线的IC₅₀(见表2)，结果表明IC₅₀的变动范围在1～10μg/L之间，均值为4.44μg/L。测定20份空白组织(猪肌肉、肝脏)样品，将其平均值加3倍标准差，即为组织最低检测限。结果(见表3)显示猪肝脏和肌肉组织最低检测限分别为0.68μg/kg和0.60μg/kg。

表2 50％抑制浓度

表3组织最低检测限(n＝20，LOD＝X+3SD)

4.2准确度

将1mg/mLQCA液添加到猪肌肉或猪肝脏组织中，使其终浓度为0μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、20μg/kg，每个浓度5个重复，重复7天，按照实施例3所述方法提取、净化、衍生，采用间接竞争ELISA测定样品中QCA浓度，并计算回收率和变异系数(结果见表4)。猪肉、猪肝组织中添加1μg/kg、5μg/kg、20μg/kg的QCA，回收率均在60％～115％之间，批间变异系数均＜20％。

表4本发明方法的准确度

4.3精密度

以标准品抑制率的变异系数为指标，评价本发明的精密度(板内变异和板间变异)。结果(表5)表明，所建立的ELISA方法重复性好，板内和板间变异系数均＜20％。

表5本发明方法的精密度

实施例5、酶联免疫检测试剂盒的制备

5.1酶联免疫检测试剂盒的组装

本发明试剂盒主要由盒体、酶标板、QCA标准品母液(1mg/mL)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体、QCA抗体液、底物显色A液、底物显色B液、终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液、衍生试剂丁胺、催化剂腈基磷酸二乙酯(DEPC)和泡沫托架组成

5.2所用试剂的配制

(1)包被稀释液：取Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，Na₂N₃0.2g，加双蒸水至1000mL，调至pH9.6；(2)封闭液：取卵清蛋白0.1g溶于100mLpH7.4PBS；(3)浓缩洗涤液：取NaCl80.0g，KH₂PO42g，Na₂HPO₄·12H2O29g，KCl2g，加吐温(Tween)-20 5mL，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL，调至pH7.4；(4)浓缩样品稀释液：取NaCl80.0g，KH₂PO₄2g，Na₂HPO₄·12H₂O29g，KCl2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL，调至pH7.4；(5)底物显色A液：再本实施例中，采用的是四甲基联苯胺溶液，即取四甲基联苯胺200mg，无水乙醇(在另外的实施例中，可将所述的四甲基联苯胺改为邻苯二胺，无水乙醇可改为二甲亚砜)100mL，加双蒸水至1000mL；(6)底物显色B液：取Na₂HPO₄14.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调至pH5.0～5.4：(7)底物显色混合液(在本实施例中是四甲基联苯胺-过氧化氢尿素溶液)：将底物显色A液和底物显色液B按体积比1∶1混合即为底物显色液混合液；(8)终止液：在本实施例中采用的是2mol/L的硫酸溶液，即取18mol/L浓硫酸100mL，缓慢滴加到双蒸水至900mL，即为终止液(在另外的实施例中可将2mol/L的硫酸溶液改为4mol/L的盐酸溶液)。

5.3酶标板的制备

取48或96孔酶标板，用包被缓冲液将QCA与γ-氨基丁酸反应后与卵清蛋白偶联物稀释成4μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用铝膜真空密封保存、备用。

5.4本发明试剂盒的稳定性

2～8℃稳定性试验：将试剂盒置于4℃下保存，于0、1、2、3、4、5、6、7月分别取试剂盒，测定IC₅₀值、0标准溶液的吸光值和猪肝脏中添加量为4μg/kg时的回收率。以IC₅₀值大于10μg/L、0标准溶液的吸光值小于0.6和回收率不在50％～120％范围内为判定试剂盒失效的标准，结果见表6。

表6本发明的试剂盒4℃稳定性试验

37℃加速稳定性试验：将试剂盒置于37℃下保存，于0、1、2、3、4、5d分别取试剂盒，测定IC₅₀值、0标准溶液的吸光值和猪肝脏中添加量为4μg/kg时的回收率。以IC₅₀值大于10μg/L、0标准溶液的吸光值小于0.6和回收率不在50％～120％范围内为判定试剂盒失效的标准，结果见表7。

表7本发明的试剂盒37℃加速稳定性试验

表6和表7结果显示，试剂盒在4℃保存到第3个月时，所有指标均在正常波动范围内。37℃保存到第5d，0标准溶液的吸光值下降到0.66，IC₅₀值为12.38μg/L，回收率为108％，说明试剂盒中的部分试剂已开始失效。试验方法参照唐伟国主编，《医学检验诊断试剂的制备与应用》，上海科学技术文献出版社，1996年版。试剂盒在37℃放置一天，相当于2～8℃保存一个半月。稳定性试验结果表明本试剂盒在4℃条件下的保存期至少为6个月。

实施例6、酶联免疫检测试剂盒的测定程序

6.1工作液配制

QCA标准品溶液工作液配制：用二氯甲烷将QCA母液稀释到各浓度QCA标准溶液(0ng/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、3.2ng/mL、12.8ng/mL、51.2ng/mL)，混匀，分别向试管中加入稀释后的衍生试剂丁胺和催化剂腈基磷酸二乙酯各10μL，置37℃水浴锅反应5h；反应完毕后47℃氮气吹干，向试管中加入样本稀释液2mL，振荡30s，作为QCA标准试样溶液，备用，供ELISA方法测定；

5％偏磷酸10％甲醇溶液配制：偏磷酸50g，甲醇100mL，加双蒸水定容至1000mL；

2％甲酸甲醇溶液配制：2mL甲酸加入98mL甲醇混匀；

0.5mol/LK₂HPO₄溶液配制：K₂HPO₄3H₂O114.11g，加双蒸水至1000mL，用H₃PO₄调pH至7.0；

0.05mol/L NaOH溶液配制：NaOH2g，加双蒸水至1000mL；

样品稀释液配制：将试剂盒中提供的浓缩样品稀释液用蒸馏水10倍稀释后使用，置4℃冰箱保存；

洗涤液配制：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水10倍稀释后使用，置4℃冰箱保存；

辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体工作液配制：根据每次检测样品数量决定所需试剂的用量，将HRP标记的羊抗兔抗体和样品稀释溶液按体积比1∶10的比例稀释，混匀，备用；

QCA抗体工作液配制：根据每次所需用量，将QCA抗体液和样品稀释液按体积比1∶10的比例稀释，混匀，备用；

衍生试剂工作液：取试剂盒所提供的衍生试剂丁胺30μL于1mL乙腈中，使其终浓度为300mmol/L，混匀，现配现用；

催化剂工作液：取试剂盒所提供的催化剂腈基磷酸二乙酯(DEPC)50μL于500μL乙腈中，使其终浓度为600mmol/L，混匀，现配现用；

底物显色A液配制：向底物显色A液瓶中加入10mL乙醇，置4℃冰箱保存1月。临用前，根据每次所需用量，取适量底物A贮存液用蒸馏水10倍稀释；

底物显色B液贮存液配制：向底物显色B液瓶中加入2mL蒸馏水，置4℃冰箱可保存1月。临用前，根据每次所需用量，底物显色B液按每毫升柠檬酸缓冲液加底物显色B液贮存液6.4μL；

底物混合液配制：根据每次检测组织样品的多少决定所需本试剂的用量，将底物显色A液和底物显色B液按体积1∶1混匀，现配现用。

6.2测定步骤

取微孔条：将足够标准品和样品所用数量的孔条***微孔架，标准品和样品做两个平行试验，记下标准品和样品的位置；

加标准液或待测样品：加入标准品或处理好的样品液30μL到微孔中，每孔加入样品或标准品时注意更换移液器的吸头；

加抗体：加入QCA抗体工作液70μL到每一个微孔中充分混合，在培养箱孵育1h(37℃)，覆盖上薄膜(防止蒸发)；

洗涤：倒出孔中的液体，洗涤3次并拍干；

加HRP标记的羊抗兔抗体：加入HRP标记的羊抗兔抗体工作液100μL到每一微孔中充分混合，在培养箱孵育1h(37℃)，覆盖上薄膜(防止蒸发)；

洗涤：倒出孔中的液体，洗涤5次并拍干；

加底物：加入底物混合液100μL到每一微孔中，充分混合并在37℃暗处孵育15min；

终止：加入反应终止液50μL到每一微孔中；

测定：在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，必须在加入终止液后60min内读取吸光值。

6.3结果判断

所获得的标准品和样品吸光值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光值再乘以100，以抑制率为纵坐标，以QCA浓度的对数为横坐标作标准曲线，曲线在0.1～51.2ng/mL范围内趋近直线，相对应每一个样品的浓度(ng/g)可以从标准曲线上读出。

实施例7、本发明试剂盒的考核与应用

7.1本发明试剂盒的先进性

将本发明试剂盒与HPLC方法进行比较，结果(见表8)显示ELISA具有良好的灵敏度和特异性，与HPLC方法相关性良好。

表8HPLC法与本发明的比较

7.2本发明试剂盒的应用

将21头45日龄，体重15.0±2.0kg品种为“长大“二元杂交去势健康仔猪，随机分为2组，一组为空白对照组(3头)，另一组为试验组(12头)。试验组饲喂含50mg/kg的卡巴氧7d，于停药0d、4d、10d、14d分别屠宰3头，空白对照组分别在停药0d、4d、10d各屠宰1头，采用ELISA法和高效液相色谱法同时测定猪肝脏、肌肉中QCA的含量。测定结果(表9)显示：停药0天，ELISA方法测定肝脏、肌肉中QCA含量分别为82ng/g和7.6ng/g，而HPLC方法检测结果分别为88ng/g和6.9ng/g，停药14天，用ELISA方法和HPLC方法检测肝脏中QCA含量分别为4.8ng/g和4.6ng/g，肌肉中均未检出。两种方法测定结果都能反映QCA在肝脏和肌肉中的残留量随时间的延长逐渐降低，阴性对照组测定结果均为阴性(＜1μg/kg)，加药组均为阳性(＞1μg/kg)，说明本发明的试剂盒具有良好的实际检出能力，可以筛选出阳性样品(＞1μg/kg)。

表9猪肝脏和肌肉组织中QCA含量的测定

注：“-”表示不予计算

Claims (3)

1.一种喹噁啉-2-羧酸残留检测酶联免疫方法，包括药物改造、免疫原与包被原的制备、抗体的制备和样品前处理，其特征在于按照以下步骤：

(1)将喹噁啉-2-羧酸(QCA)与γ-氨基丁酸(ABA)反应得到产物QCA-ABA；

(2)将步骤(1)所述的产物QCA-ABA与卵清蛋白相偶联得到包被原；

(3)将将步骤(1)所述的产物与牛血清白蛋白相偶联得到免疫原；

(4)用步骤(3)的免疫原免疫兔得到特异性兔多克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；

(6)将猪肉或猪肝组织先经5％偏磷酸10％甲醇提取后再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂丁胺和催化剂腈基磷酸二乙酯进行处理，得到待测产物；

(7)将步骤(6)的待测产物进行酶联免疫检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固相载体是酶标板。

3.适用于权利要求1或2所述方法的酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，包被有所述的包被原；所述的试剂包括抗喹噁啉-2-羧酸特异性兔多克隆抗体，辣根过氧化酶标记羊抗兔抗体，浓缩洗涤液，浓缩样品稀释液，喹噁啉-2-羧酸标准溶液，底物显色A液，底物显色B液，终止液，衍生试剂和催化剂；

其中

所述的底物显色A液为四甲基联苯胺或邻苯二胺；

所述底物显色B液为过氧化氢或过氧化脲；

所述终止液为硫酸溶液或盐酸溶液；

所述的浓缩洗涤液为含有0.05～0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液；

所述浓缩样品稀释溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。

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