CN1970781A - 超声波协同改性纤维素酶催化木质纤维素糖化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超声波协同改性纤维素酶催化木质纤维素糖化的方法。属于木质纤维素糖化的技术。该方法主要包括以下步骤：通过粉碎和碱预处理分离原料中的木质素。用活化后的单甲氧基聚乙二醇与纤维素酶在柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液中反应得到改性纤维素酶，将改性纤维素酶与β－葡萄糖苷酶、淀粉酶和果胶酶混合得到复合酶液。将复合酶按照相应的比例加入预处理后的原料中，配合超声波进行酶催化反应，最后经过滤、减压蒸发，得到浓缩糖液。本发明的优点在于：改性纤维素酶能与其他辅助酶制剂同时加入并达到较高的活性；超声振荡提高酶催化反应的效率，减少反应时间；可以得到木质素产品；最终糖化液浓度较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种超声波协同改性纤维素酶催化木质纤维素糖化的方法。属于木质纤维素糖化的技术。
背景技术
燃料乙醇的生产工艺可分为两个过程，分别是原料的糖化和糖的发酵过程，即将原料转化为可发酵糖类的过程和利用糖类进行微生物发酵生产乙醇的过程。在整个生产过程中，生物催化技术被广泛采用。传统燃料乙醇的生产以粮食为原料，主要使用淀粉酶为催化剂将淀粉转化成可发酵的糖类，其产量受到粮食资源的限制，难以长期满足能源需求。含木质纤维素的生物质废弃物是生产燃料乙醇的另一原料来源，它包括农作物秸秆、林业加工废料、甘蔗渣及城市垃圾中所含的废弃生物质等。第三代燃料乙醇以各种木质纤维素作为生产原料，由于木质纤维素具有木质素、纤维素、半纤维素相互包裹的复杂结构并且纤维素本身存在稳定的结晶结构，使木质纤维素难于分解为可用于发酵乙醇的糖类。木质纤维素的糖化是转化燃料乙醇的主要问题之一。
目前木质纤维素的糖化主要包括酸水解和生物酶催化两种方式，酸水解工艺由于成本高、污染严重，已经逐渐放弃使用，现在正被广泛研究的是利用纤维素酶生物催化分解木质纤维素的糖化工艺。此工艺具有低能耗、无污染的优势，但由于木质纤维素结构复杂，难于分解；纤维素酶作用效率低，并且其作用效率主要依赖于原料的预处理工艺；高效、低成本、的污染的预处理工艺有待开发，所以提高酶催化的效率以及降低酶的用量从而降低成本都是目前木质纤维素糖化工艺所存在的主要问题。使用复合酶催化是提高酶催化效率的有效手段，但由于不同酶制剂的使用条件有差异，使得复合酶催化工艺十分复杂或是难以完全发挥酶的催化作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用超声波协同改性纤维素酶催化木质纤维素糖化的方法。该法具有催化效率高、原料综合利用、环境污染低的特点。
为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种超声波协同改性纤维素酶催化纤维素糖化反应的方法，其特征在于包括以下过程：
1、原料的预处理：将玉米秸秆粉碎成20～40目颗粒，取粉碎好的原料，按克/毫升固液比为1∶10～20，用质量浓度3％～10％NaOH于25℃反应3h～8h，抽滤得滤渣和滤液，滤渣水洗至pH值为7～8，备用。用质量浓度98％浓硫酸将滤液调至pH值为3～6，加热到30～80℃，沉淀30～60min离心分离得到木质素。
2、纤维素酶改性：配制质量浓度为6％～15％的三聚氯氰苯溶液，2～20℃重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰。按单甲氧基聚乙二醇4000与4A分子筛和无水碳酸钠的质量比为1∶(2～6)∶(4～10)将单甲氧基聚乙二醇4000、4A分子筛和无水碳酸钠加入溶剂苯中，常温搅拌30～60分钟后，过滤，去除4A分子筛和碳酸钠得到滤液，然后按照聚甲氧基乙二醇4000与纯化的三聚氯氰的摩尔比为2～2.5∶1将纯化的三聚氯氰加入到滤液中，常温条件下反应20～50小时。溶液再经浓缩，过滤，低温干燥，得到活化的单甲氧基聚乙二醇。将纤维素酶和活化单甲氧基聚乙二醇按照质量比为1∶2～6加入到pH为5.0～7.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，控制温度为0℃～8℃，反应1～5小时。采用截留分子量为5000～10000的超滤膜分离出与单甲氧基聚乙二醇胶连得到的改性纤维素酶，低温冷冻干燥得到改性纤维素酶。
3、酶的活化：按改性纤维素酶与β-葡萄糖苷酶、淀粉酶和果胶酶的质量比为10∶1∶5∶5混合后，于40～60℃水中活化5～15min，得到复合酶液。
4、原料纤维素的糖化：向步骤1得到的滤渣中按颗粒原料与水的质量比1∶8～10加入水，调节温度至45～55℃，用质量浓度98％浓硫酸pH值为5～6。按玉米秸秆重量的0.5～1％加入活化后的混合酶液，利用超声振荡促进酶催化水解反应，超声振荡功率为80～800w，振荡频率为20～40kHz，反应时间为3～8h。抽滤得糖液备用。
5、糖液的浓缩：步骤4的糖液40℃～70℃，减压蒸发得到质量浓度为25～35％糖液，用于燃料乙醇的发酵工艺。
本发明的优点在于：整个糖化工艺避免了高温高压及酸处理过程，设备成本降低，且能耗相对较低，污染小；改性纤维素酶对环境的适应能力增强，能与其他辅助酶制剂同时加入并达到较高的活性；超声振荡可以有效的提高酶催化反应的效率，减少反应时间；对原料综合利用，可以得到木质素产品；最终糖化液浓度较高，且不含对发酵酵母有害的毒性成分。
具体实施方式
实施例一：将玉米秸秆粉碎成40目颗粒，取10g粉碎好的原料，加入8％NaOH150ml于25℃反应8h，抽滤得滤渣和滤液。用6.5ml质量浓度98％浓硫酸将滤液pH值调整为3，温度50℃，沉淀30min离心分离得到纯净的木质素0.92g，提取率为84.4％，产品纯度为82％。滤渣水洗至pH值为8，再向滤渣中加入80mlH2O，调整温度至50℃，用1.2ml浓度2mol/L硫酸将pH值调至6.5。
将20.0g三聚氯氰溶解于300mL苯中，20℃重结晶两次后，得到纯化的三聚氯氰17.9g。在1000mL的三口烧瓶中加入5.0g的4A分子筛，10.0g无水碳酸钠，500mL苯和20.0g单甲氧基聚乙二醇4000，常温搅拌30分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.4613g，常温条件下反应36小时。溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，然后在温度为-14℃下低温干燥，得到活化的单甲氧基聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入4.0g的活化单甲氧基聚乙二醇4000和pH为6.8柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液100mL，调节温度为4℃，活化单甲氧基聚乙二醇4000充分溶解后加入1.0g纤维素酶，反应2小时后利用截留分子量为5000的聚砜超滤膜分离得到改性纤维素酶。
分别取改性纤维素酶50mg、β-葡萄糖苷酶5mg、淀粉酶25mg、果胶酶25mg、于20ml、50℃水中活化15min。然后向溶液中加入活化后的酶液，在超声场中进行酶催化反应，超声振荡功率为80w，振荡频率为20kHz，反应8h。抽滤得滤液，滤液55℃减压蒸发得到还原糖浓度为35.5％的糖液12ml，该糖液用于燃料乙醇的发酵工艺。测得木质纤维素的降解率为67.2％，糖化率44.3％。
实施例二：将玉米秸秆粉碎成20目颗粒，取10g粉碎好的原料，加入5％NaOH150ml于25℃反应3h，抽滤得滤渣和滤液。用4.2ml质量浓度98％浓硫酸将滤液pH值调整为3，温度50℃，沉淀30min离心分离得到纯净的木质素0.73g，提取率为67％，产品纯度为79％。滤渣水洗至pH值为8，再向滤渣中加入80mlH2O，调整温度至50℃，用1.1ml浓度2mol/L硫酸将pH值调至6.5。
将10.0g三聚氯氰溶解于150mL苯中，12℃重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰8.7g。在1000mL的三口烧瓶中加入2.5g的4A分子筛，8.0g无水碳酸钠，400mL苯和10.0g单甲氧基聚乙二醇4000，常温搅拌40分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.2306g，常温条件下反应38小时。溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，温度为-14℃下低温干燥，得到活化的单甲氧基聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入8.0g活化单甲氧基聚乙二醇4000和pH为7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液200mL，调节温度为4℃，活化单甲氧基聚乙二醇4000充分溶解后加入2.0g纤维素酶，反应2小时后用截留分子量为4000的聚砜超滤膜分离得到改性纤维素酶。
分别取纤维素酶50mg、β-葡萄糖苷酶5mg、淀粉酶25mg、果胶酶25mg、于20ml、50℃水中活化10min。然后向溶液中加入活化后的酶液，在超声场中进行酶催化反应，超声振荡功率为300w，振荡频率为40kHz，反应4h。压滤得滤液，滤液加温减压蒸发得到还原糖浓度为30.2％的糖液12ml，可用于燃料乙醇的发酵工艺。测得木质纤维素的降解率为54.2％，糖化率36％。
实施例三：将玉米秸秆粉碎成40目颗粒，取10g粉碎好的原料，加入3％NaOH120ml于25℃反应3h，抽滤得滤渣和滤液。用3.6ml质量浓度98％浓硫酸将滤液pH值调整为6，温度30℃，沉淀30min离心分离得到纯净的木质素0.66g，提取率为60.6％，产品纯度为72％。滤渣水洗至pH值为8，再向滤渣中加入80mlH2O，调整温度至50℃，pH值为6.5。
将20.0g三聚氯氰溶解于300mL苯中，3℃重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰18.3g。在1000mL的三口烧瓶中加入8.0g的4A分子筛，12.0g无水碳酸钠，600mL苯和30.0g单甲氧基聚乙二醇4000，常温搅拌60分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.5535g，常温条件下反应40小时。溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，温度为-14.2℃下低温干燥，得到活化的单甲氧基聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入8.0g活化单甲氧基聚乙二醇4000和pH为6.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液200mL，调节温度为4℃，活化单甲氧基聚乙二醇4000充分溶解后加入2.0g纤维素酶，反应2小时后利用截留分子量为4000的聚砜超滤膜分离得到改性纤维素酶。
分别取纤维素酶100mg、β-葡萄糖苷酶10mg、淀粉酶50mg、果胶酶50mg、于20ml50℃水中活化5min。然后向溶液中加入活化后的酶液，在超声场中进行酶催化反应，超声振荡功率为500w，振荡频率为20kHz，反应3h。压滤得滤液，滤液加温减压蒸发得到还原糖浓度为28％的糖液15ml，可用于燃料乙醇的发酵工艺。测得木质纤维素的降解率为56.3％，糖化率42％。
Claims (1)
1、一种超声波协同改性纤维素酶催化纤维素糖化反应的方法，其特征在于包括以下过程：
1)、原料的预处理：将玉米秸秆粉碎成20～40目颗粒，取粉碎好的原料，按克/毫升固液比为1∶10～20，用质量浓度3％～10％NaOH于25℃反应3～8小时，抽滤得滤渣和滤液，滤渣水洗至pH值为7～8，备用，用质量浓度98％浓硫酸将滤液调至pH值为3～6，加热到30～80℃，沉淀30～60分钟离心分离得到木质素；
2)、纤维素酶改性：配制质量浓度为6％～15％的三聚氯氰苯溶液，重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰，按单甲氧基聚乙二醇4000与4A分子筛和无水碳酸钠的质量比为1∶2～6∶4～10将单甲氧基聚乙二醇4000、4A分子筛和无水碳酸钠加入溶剂苯中，常温搅拌30～60分钟后，过滤，去除4A分子筛和碳酸钠得到滤液，然后按照聚甲氧基乙二醇4000与纯化的三聚氯氰的摩尔比为2～2.5∶1将纯化的三聚氯氰加入到滤液中，常温条件下反应20～50小时，溶液再经浓缩，过滤，低温干燥，得到活化的单甲氧基聚乙二醇，将纤维素酶和活化单甲氧基聚乙二醇按照质量比为1∶2～6加入到pH为5.0～7.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，控制温度为0℃～8℃，反应1～5小时，采用截留分子量为5000～10000的超滤膜分离出与单甲氧基聚乙二醇胶连得到的改性纤维素酶，低温冷冻干燥得到改性纤维素酶；
3)、酶的活化：按改性纤维素酶与β-葡萄糖苷酶、淀粉酶和果胶酶的质量比为10∶1∶5∶5混合后，于40～60℃水中活化5～15分钟，得到复合酶液；
4)、原料纤维素的糖化：向步骤1)得到的滤渣中按颗粒原料与水的质量比1∶8～10加入水，调节温度至50℃，用质量浓度98％浓硫酸pH值为6.5，按玉米秸秆重量的0.5％加入活化后的混合酶液，利用超声振荡促进酶催化水解反应，超声振荡功率为80～800w，振荡频率为20～40kHz，反应时间为3～8小时，抽滤得糖液备用；
5)、糖液的浓缩：步骤4)的糖液40℃～70℃，减压蒸发得到质量浓度为25～35％糖液，用于燃料乙醇的发酵工艺。
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