CN1970574B - 溶栓和抗凝双重功效融合蛋白、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白，以及编码该融合蛋白的DNA序列、含该DNA序列的载体、该融合蛋白的制备方法、该融合蛋白在制备具有溶栓和抗凝功效药物方面的应用和，由连续甘氨酸序列组成的肽段作为连接结构在制备溶栓和抗凝双重功效融合蛋白中的应用。所说融合蛋白将水蛭素III C端第55-66位氨基酸序列中的10～12个氨基酸的肽段，与t-PA截短突变体的r-PA经连接肽连接而成。该融合蛋白可应用于制备具有溶栓和抗凝双重功效的药物，具有更长的作用半衰期，方便患者使用，且能有更高选择性地作用于血栓部位和全身出血性副作用小等特点，作用更为肯定可靠。而其较小的分子量更有利于减小抗原性的副作用和影响。

Description

溶栓和抗凝双重功效融合蛋白、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种以DNA重组方式得到的具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，该融合蛋白的制备方法，该融合蛋白在制备具有溶栓和抗凝功效药物方面的应用，以及由连续甘氨酸序列组成的肽段作为连接结构在制备溶栓和抗凝双重功效融合蛋白中的应用。

背景技术

溶栓药物和抗凝药物，是目前两类治疗血栓性疾病的药物。

作为第一代溶栓药物的有葡激酶(SAK)、链激酶(SK)、尿激酶(UK)等。含有527个氨基酸的人组织纤维溶酶原激活剂(t-PA)是第二代溶栓药物，具有溶解血栓特异性高的特点，其核苷酸序列参见GENEBANK中的NM 033011，具有溶解血栓特异性高，在症状发作的短时间内给药对恢复阻塞血管的再灌流有着明显的作用等优点。但缺点是半衰期较短，短时间内需大量给药，有潜在引起颅内出血的危险，且价格昂贵。为克服这些缺点，目前已研发了属于t-PA的截短突变体的瑞替普酶(r-PA)是第三代溶栓剂，含有t-PA 527个氨基酸中的355个，单链、非糖基化，具有疗效更好和副作用小于前两代药物的优点，是目前临床应用上较理想的一种溶栓药物。

水蛭是传统中医药中的活血化淤药物。水蛭素(hirudin)是其主要有效成分，其氨基酸序列可参见GENEBANK中的NO.P09944和公开号为CN 1319671A的中国专利文献，系由65-66个氨基酸组成的单链多肽。目前研究已确认，水蛭素最小的保持抗凝活性的片断为其酸性端(C端)的10-12个氨基酸的肽段，其中以12肽为具有最大活性的最小肽段，能特异性、高亲和性地抑制凝血酶的活性，是迄今作用最强的特异性凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝、抗栓活性，其抗血栓性能优于肝素，对多种血栓疾病具有预防和治疗效果。目前在采用基因重组技术研制水蛭素方面已经取得了令人瞩目的进展。

为解决目前常用溶栓剂在包括如再栓塞、出血副作用和抗再灌注等方面的不足，进一步提高其靶向性，提高其在血栓部位的药物浓度而降低在非血栓部位的浓度或活性，CN 1480466A及WO 2004/022598等文献中报道了一种由能被凝血因子FXa(或FIIa)识别的氨基酸序列IEGR或GPR，或者含有这些氨基酸的肽段作为连接肽，将溶栓蛋白(SAK、SK、UK或t-PA等)与抗凝蛋白(水蛭素、抗凝血酶III或蛇毒等)连接而成的融合蛋白，使其能具有溶栓和抗凝双重功能。但其作用机理和过程，是必需依赖进入体内后被凝血因子识别并将其水解成两个游离蛋白，才能发挥其双功能的活性，在体外则无活性。由于体内存在许多干扰成分，这样的融合蛋白到底能否被凝血因子正确识别以及能被识别的程度，因此其水解成两个蛋白过程中存在许多不确定因素，导致了对其疗效稳定性的不利影响。

发明内容

鉴于上述情况，本发明首先的一个目的是在此基础上提出一种具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白。本发明进一步的目的还分别包括：提供编码所述该具有溶栓和抗凝双重功效融合蛋白的DNA序列；提供含有该DNA序列的载体；提供所述该融合蛋白的制备方法；提供所述该融合蛋白在制备具有溶栓和抗凝功效药物方面的应用；以及提供由连续甘氨酸序列组成的肽段作为连接结构在制备溶栓和抗凝双重功效融合蛋白中的应用。

本发明具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白(HrP)，由水蛭素IIIC端具有如SEQ IDNO.3所示序列的第55-66位氨基酸序列中的10～12个氨基酸肽段，与具有如SEQ IDNO.6所示氨基酸序列、属于t-PA截短突变体的r-PA(瑞替普酶)，经连接肽连接而成。

在上述的溶栓和抗凝双重功效融合蛋白中，所说的连接肽一个可以为连续的3-5个甘氨酸序列，例如在一个可参考的实施例中采用的连接肽即为连续的3个甘氨酸三肽序列。

由于目前研究已确认在水蛭素最小的保持抗凝活性的片断的其酸性端(C端)10-12个氨基酸的肽段中，以12肽为具有最大活性的最小肽段。因此，本发明上述溶栓和抗凝双重功效融合蛋白的结构中，虽然所说该水蛭素IIIC端肽段可以为该10-12个氨基酸肽段中的10肽或11肽，但以在SEQ ID NO.3所示序列中的第55-66位的12肽序列为佳，此时本发明所说的该融合蛋白具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

本发明的内容还包括一种分离的DNA分子，其能编码如上所述的具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白。具有编码本发明上述具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白的DNA分子的核苷酸序列可以不止一种，例如具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的DNA分子，就是其中可供参考的一个实例，由其编码的本发明融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。除SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的DNA分子外，例如，其中的丝氨酸对应的核苷酸除了tct以外，还可以为tcc、tca、tcg；其中的酪氨酸对应的核苷酸除了tac以外，还可以为tat，同样可以编码本发明所说的具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白。

在此基础上，本发明还包括含有如SEQ ID NO.7所示的及其它相应的核苷酸序列在内的能编码本发明具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白的DNA分子的载体及相应含有这些载体的宿主细胞，例如，当采用pET***时，可将获得所述溶栓和抗凝双重功效融合蛋白(HrP)基因与pET-21a、pET-28a等载体连接，转入BL21(DE3)、HMS174(DE3)等大肠杆菌中进行表达。

本发明的上述具有溶栓和抗凝双重功效融合蛋白的制备方法，可以包括下述的操作步骤：

1’：设计在r-PA基础上扩增水蛭素IIIC端的10～12肽序列的引物；

2’：通过两次加端PCR，在r-PA基因上游扩增出连接肽序列和水蛭素IIIC端的10～12肽序列，获得目的HrP基因；

3’：构建pET21a-HrP表达载体；

4’：转化大肠杆菌，建立工程菌；

5’：制备HrP融合蛋白；以及

进一步还可对所得该融合蛋白的生物活性进行确定。

本发明上述具有溶栓和抗凝双重功效融合蛋白的应用，包括将该融合蛋白与药物中可以接受的辅助成分共同制备成具有溶栓和抗凝双重功效的相应药物，用于对血栓性疾病的治疗。由于本发明的融合蛋白是建立在第三代溶栓剂r-PA基础上的结构改造，因而本发明的融合蛋白能具有与r-PA较t-PA、葡激酶、尿激酶等之前的第一、二代溶栓剂药物有更长的作用半衰期，方便患者使用，以及能更高选择性地作用于血栓部位和全身出血性副作用小等同样的特点。试验显示，本发明的该融合蛋白在溶栓和抗凝方面的作用更为肯定可靠，而其所具的较小分子量，能有利于减少抗原性的副作用和影响，则更是其显著的优点之一。

以下结合由附图所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。其中在实施例中未注明具体条件的实验方法，可按照通常的条件，例如可参照Sambrook等人在《分子克隆指南(科学出版社(2002)》中的相应条件，或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

图1是重组质粒pET21a-HrP的构建图

图2是HrP/BL21工程菌表达蛋白的电泳鉴定图。图中标示分别为：1：BL21菌体总蛋白；2：HrP/BL21(DE3)未诱导；3：低分子量标准蛋白质Marker(从小到大依次为14400，20100，31000，43000，66200，97400)；4：HrP/BL21(DE3)诱导4h；5：pET21a/BL21(DE3)诱导4h。

图3是HrP/BL21工程菌蛋白表达形式的电泳鉴定图。图中标示分别为：1：低分子量蛋白Marker(从小到大依次为14400，20100，31000，43000，66200，97400)；2：HrP/BL21(DE3)工程菌诱导表达菌体总蛋白；3：HrP/BL21(DE3)工程菌超声破碎后的上清液；4：HrP/BL21(DE3)工程菌超声破碎后的沉淀。

图4是本发明融合蛋白样品溶栓圈试验结果的平板图。图中的标示1、2、3、4、6分别为尿激酶5、40、10、20、80IU/ml；标示5、7分别为本发明融合蛋白样品稀释4倍的试液及样品原浓度的试液。

具体实施方式

实施例1

一、通过PCR获得目的基因序列

如图1所示，根据已知的基因序列，应用加端PCR方法在r-PA基因(图1中的J1质粒含有如SEQ ID NO.4所示的r-PA基因，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)的5’端加重组水蛭素HV3的12肽(55～66)和GlyGlyGly连接肽的基因，但由于加端序列大于60bp，可能造成PCR结果的不准确，所以分两次PCR，以期提高PCR的准确性。

1.第一轮PCR

以r-PA质粒为模板，以引物1、2为引物，TaqDNA聚合酶催化扩增得到第一轮PCR产物P1。

引物1(SEQ ID NO.10)：

GGAGACGCGTACGATGAA

TCTTACCAAGGAAACAGTGAC

其中划线部分为三个甘氨酸的连接肽序列。

引物2(SEQ ID NO.11)：

GC

TTACTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCTAGGTAG

其中划线部分为HindIII的酶切位点。

第二轮PCR

以P1为模板，以引物2、3为引物，TaqDNA聚合酶催化扩增得到第二轮PCR产物P2。

引物3(SEQ ID NO.12)：

G

GACTTCGAACCGATCCCGGAAGACGCGTACGATGAAGG

其中阴影部分为NheI的酶切位点。划线部分为水蛭素III12肽的核苷酸序列(水蛭素III1-198位相应的核甘酸序列如SEQ ID NO.1，编码的1-66位氨基酸序列分别如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所说的该12肽是其中的55-66位氨基酸)。

引物2(SEQ ID NO.11)：

GC

TTACTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCTAGGTAG

其中阴影部分为HindIII的酶切位点。

上述两轮PCR扩增条件均为：

94℃5min

94℃1min，63℃1min，72℃1min 30sec，28Cycles

72℃10min

4℃∞，Hold。

二、pET21a-HrP表达载体的构建

将第二轮PCR产物P2进行HindIII和NheI双酶切，同样pET21a载体也进行HindIII和NheI双酶切，将两者的双酶切产物在16℃用T4DNA连接酶连接过夜。将连接产物转化感受态DH5α菌。筛选阳性克隆，经核酸电泳和PCR验证正确后送上海英骏(invitrogen)生物技术有限公司进行测序，测序结果中包含SEQ NO.7中所示的核苷酸序列。结果正确后提取表达质粒转化感受态BL21(DE3)菌。

三、大肠杆菌中的诱导表达

接种pET21a-HrP/BL21菌于LB中，37℃振摇过夜，以1％的接种量接种于摇瓶中，37℃振摇3h，加入IPTG(终浓度为1mM)继续诱导4h，收菌。8000r/min，3min，4℃冷冻离心，沉淀菌体用冷的PBS洗，将菌体重悬于50mM Tris-HCl pH8.0缓冲液中，冰浴超声破菌，得到沉淀包涵体。菌体总蛋白和包涵体通过12％SDS-PAGE电泳鉴定。可见菌体总蛋白40KDa处附近有目的蛋白条带，如图2所示。经过超声破菌后，目的蛋白全以包涵体形式存在，上清液中并无目的条带，如图3所示。

四、融合蛋白的生物活性检测

1.抗凝活性的测定：

于酶标板小孔中加200μl0.5％牛血纤维蛋白原(0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)配制)，再加入10～100μl经过初步复性的蛋白溶液，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100NIH单位)，时间间隔为1min，若在1min内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达滴定终点。每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝单位(ATU)。

2.纤溶活性测定：采用纤维蛋白-琼脂糖平板测定法。

配制平板用溶液均为PBS(pH7.4)。将1BP单位/ml的凝血酶溶液贴壁加入10ml血纤蛋白原(5mg/ml)溶液中，快速混匀，倾入至完全融化且已降至45℃的10ml琼脂糖溶液(1.0％)中，混匀，倒入直径90mm的平皿中，凝固后打孔使用。分别吸取不同比活性的尿激酶标准品，滴于孔中，于37℃温育12h。溶栓圈平板试验结果如图4所示。

经另行检测，本发明上述融合蛋白的溶栓比活达到8400.5IU/mg，抗凝比活达到930.2ATU/mg，表明本发明该融合蛋白具有溶栓和抗凝的双重活性。

实施例2水蛭素11肽和r-PA的融合蛋白的制备及生物活性检测

基本过程如上述实施例1，除其中的第二轮PCR与实施例1不同外，其余操作和条件均同实施例1。

以P1为模板，以引物4、5为引物，TaqDNA聚合酶催化扩增得到第二轮PCR产物P2。

引物4：(SEQ ID NO.13)

G

TTCGAACCGATCCCGGAAGACGCGTACGATGAAGG

其中黑体为NheI的酶切位点。划线部分为水蛭素IIll2肽的核苷酸序列。

引物5：(SEQ ID NO.14)

GC

TTACTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCT

其中阴影部分为HindIII的酶切位点。

实施例3水蛭素10肽和r-PA的融合蛋白的制备及生物活性检测

基本过程如上述实施例1，除其中的第二轮PCR与实施例1不同外，其余操作和条件均同实施例1。

以P1为模板，以引物6、5为引物，TaqDNA聚合酶催化扩增得到第二轮PCR产物P2。

引物6：(SEQ ID NO.15)

G

GAACCGATCCCGGAAGACGCGlACGATGAAGG

其中黑体为NheI的酶切位点。划线部分为水蛭素IIll2肽的核苷酸序列。

引物5：(SEQ ID NO.14)

GCTTACTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCT

其中阴影部分为HindIII的酶切位点。

序列表编号说明：

SEQ ID NO.1-3水蛭素III编码核苷酸序列及相应的蛋白质氨基酸序列

SEQ ID NO.4-6r-PA编码核苷酸序列及相应的蛋白质氨基酸序列

SEQ ID NO.7-9HrP融合蛋白编码核苷酸序列及相应的蛋白质氨基酸序列

SEQ ID NO.10-15引物1～引物6的核苷酸序列

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 溶栓和抗凝双重功效融合蛋白、制备方法及其应用

<130> 001

<160> 15

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 198

<212> DNA

<213> Hirudo medicinalis

<400> 1

atcacctaca ctgactgcac cgaatctggt cagaacctgt gcctgtgcga aggttctaac  60

gtttgcggta agggaaacaa atgcatcctg ggttctcaag gtaaggacaa ccagtgcgtt  120

actggtgaag gtactccgaa accgcagtct cacaaccagg gtgacttcga accgatcccg  180

gaagacgcgt acgatgaa                                                198

<210> 2

<211> 198

<212> DNA

<213> Hirudo medicinalis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<223>

<400> 2

atc acc tac act gac tgc acc gaa tct ggt cag aac ctg tgc ctg tgc    48

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys

1                     5                       10                   15

gaa ggt tct aac gtt tgc ggt aag gga aac aaa tgc atc ctg ggt tct    96

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser

              20                     25                      30

caa ggt aag gac aac cag tgc gtt act ggt gaa ggt act ccg aaa ccg    144

Gln Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro

        35                      40                     45

cag tct cac aac cag ggt gac ttc gaa ccg atc ccg gaa gac gcg tac    192

Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr

    50                      55                      60

gat gaa                                                            198

Asp Glu

65

<210> 3

<211> 66

<212> PRT

<213> Hirudo medicinalis

<400> 3

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys

1                  5                      10                        15

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser

              20                      25                     30

Gln Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro

         35                    40                     45

Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr

    50                     55                       60

Asp Glu

65

<210> 4

<211> 1065

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

tcttaccaag gaaacagtga ctgctacttt gggaatgggt cagcctaccg tggcacgcac    60

agcctcaccg agtcgggtgc ctcctgcctc ccgtggaatt ccatgatcct gataggcaag    120

gtttacacag cacagaaccc cagtgcccag gcactgggcc tgggcaaaca taattactgc    180

cggaatcctg atggggatgc caagccctgg tgccacgtgc tgaagaaccg caggctgacg    240

tgggagtact gtgatgtgcc ctcctgctcc acctgcggcc tgagacagta cagccagcct    300

cagtttcgca tcaaaggagg gctcttcgcc gacatcgcct cccacccctg gcaggctgcc    360

atctttgcca agcacaggag gtcgcccgga gagcggttcc tgtgcggggg catactcatc    420

agctcctgct ggattctctc tgccgcccac tgcttccagg agaggtttcc gccccaccac    480

ctgacggtga tcttgggcag aacataccgg gtggtccctg gcgaggagga gcagaaattt    540

gaagtcgaaa aatacattgt ccataaggaa ttcgatgatg acacttacga caatgacatt    600

gcgctgctgc agctgaaatc ggattcgtcc cgctgtgccc aggagagcag cgtggtccgc    660

actgtgtgcc ttcccccggc ggacctgcag ctgccggact ggacggagtg tgagctctcc    720

ggctacggca agcatgaggc cttgtctcct ttctattcgg agcggctgaa ggaggctcat    780

gtcagactgt acccatccag ccgctgcaca tcacaacatt tacttaacag aacagtcacc    840

gacaacatgc tgtgtgctgg agacactcgg agcggcgggc cccaggcaaa cttgcacgac    900

gcctgccagg gcgattcggg aggccccctg gtgtgtctga acgatggccg catgactttg  960

gtgggcatca tcagctgggg cctgggctgt ggacagaagg atgtcccggg tgtgtacacc  1020

aaggttacca actacctaga ctggattcgt gacaacatgc gaccg                  1065

<210> 5

<211> 1065

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1065)

<223>

<400> 5

tct tac caa gga aac agt gac tgc tac ttt ggg aat ggg tca gcc tac    48

Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr

1                  5                      10                       15

cgt ggc acg cac agc ctc acc gag tcg ggt gcc tcc tgc ctc ccg tgg    96

Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp

            20                       25                      30

aat tcc atg atc ctg ata ggc aag gtt tac aca gca cag aac ccc agt    144

Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser

        35                        40                     45

gcc cag gca ctg ggc ctg ggc aaa cat aat tac tgc cgg aat cct gat    192

Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp

     50                    55                      60

ggg gat gcc aag ccc tgg tgc cac gtg ctg aag aac cgc agg ctg acg      240

Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr

65                    70                       75                    80

tgg gag tac tgt gat gtg ccc tcc tgc tcc acc tgc ggc ctg aga cag      288

Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln

                 85                      90                    95

tac agc cag cct cag ttt cgc atc aaa gga ggg ctc ttc gcc gac atc      336

Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile

              100                    105                    110

gcc tcc cac ccc tgg cag gct gcc atc ttt gcc aag cac agg agg tcg      384

Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser

         115                    120                       125

ccc gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc ata ctc atc agc tcc tgc tgg      432

Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp

    130                   135                        140

att ctc tct gcc gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccg ccc cac cac      480

Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His

145                     150                   155              160

ctg acg gtg atc ttg ggc aga aca tac cgg gtg gtc cct ggc gag gag      528

Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu

                  165                     170                    175

gag cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac att gtc cat aag gaa ttc gat      576

Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp

              180                     185                     190

gat gac act tac gac aat gac att gcg ctg ctg cag ctg aaa tcg gat       624

Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp

      195                        200                   205

tcg tcc cgc tgt gcc cag gag agc agc gtg gtc cgc act gtg tgc ctt       672

Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu

     210                   215                      220

ccc ccg gcg gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gag ctc tcc       720

Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser

225                    230                   235                      240

ggc tac ggc aag cat gag gcc ttg tct cct ttc tat tcg gag cgg ctg       768

Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu

                  245                    250                   255

aag gag gct cat gtc aga ctg tac cca tcc agc cgc tgc aca tca caa       816

Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln

             260                     265                     270

cat tta ctt aac aga aca gtc acc gac aac atg ctg tgt gct gga gac       864

His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp

         275                     280                  285

act cgg agc ggc ggg ccc cag gca aac ttg cac gac gcc tgc cag ggc       912

Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly

    290                     295                   300

gat tcg gga ggc ccc ctg gtg tgt ctg aac gat ggc cgc atg act ttg       960

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu

305                        310                      315                   320

gtg ggc atc atc agc tgg ggc ctg ggc tgt gga cag aag gat gtc ccg      1008

Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro

                     325                   330                        335

ggt gtg tac acc aag gtt acc aac tac cta gac tgg att cgt gac aac       1056

Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn

              340                     345                     350

atg cga ccg    1065

Met Arg Pro

         355

<210> 6

<211> 355

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr

1                  5                      10                      15

Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp

             20                      25                      30

Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser

         35                      40                       45

Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp

     50                      55                      60

Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr

65                    70                      75                  80

Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln

                  85                      90                   95

Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile

             100                      105                    110

Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser

         115                      120                     125

Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp

    130                    135                        140

Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His

145                    150                          155            160

Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu

                 165                            170             175

Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp

            180                       185                  190

Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp

        195                    200                      205

Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu

    210                      215                   220

Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser

225                    230                     235                  240

Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu

                 245                     250                     255

Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln

             260                     265                     270

His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp

         275                     280                     285

Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly

    290                     295                     300

Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu

305                     310                     315                     320

Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro

                     325                     330                     335

Gly Val TTyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn

               340                     345                     350

Met Arg Pro

          355

<210> 7

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifcial)

<400> 7

atggctagcg acttcgaacc gatcccggaa gacgcgtacg atgaaggtgg tggttcttac     60

caaggaaaca gtgactgcta ctttgggaat gggtcagcct accgtggcac gcacagcctc     120

accgagtcgg gtgcctcctg cctcccgtgg aattccatga tcctgatagg caaggtttac     180

acagcacaga accccagtgc ccaggcactg ggcctgggca aacataatta ctgccggaat     240

cctgatgggg atgccaagcc ctggtgccac gtgctgaaga accgcaggct gacgtgggag     300

tactgtgatg tgccctcctg ctccacctgc ggcctgagac agtacagcca gcctcagttt     360

cgcatcaaag gagggctctt cgccgacatc gcctcccacc cctggcaggc tgccatcttt     420

gccaagcaca ggaggtcgcc cggagagcgg ttcctgtgcg ggggcatact catcagctcc     480

tgctggattc tctctgccgc ccactgcttc caggagaggt ttccgcccca ccacctgacg     540

gtgatcttgg gcagaacata ccgggtggtc cctggcgagg aggagcagaa atttgaagtc     600

gaaaaataca ttgtccataa ggaattcgat gatgacactt acgacaatga cattgcgctg     660

ctgcagctga aatcggattc gtcccgctgt gcccaggaga gcagcgtggt ccgcactgtg     720

tgccttcccc cggcggacct gcagctgccg gactggacgg agtgtgagct ctccggctac     780

ggcaagcatg aggccttgtc tcctttctat tcggagcggc tgaaggaggc tcatgtcaga     840

ctgtacccat ccagccgctg cacatcacaa catttactta acagaacagt caccgacaac     900

atgctgtgtg ctggagacac tcggagcggc gggccccagg caaacttgca cgacgcctgc     960

cagggcgatt cgggaggccc cctggtgtgt ctgaacgatg gccgcatgac tttggtgggc     1020

atcatcagct ggggcctggg ctgtggacag aaggatgtcc cgggtgtgta caccaaggtt     1080

accaactacc tagactggat tcgtgacaac atgcgaccgt agtaa                     1125

<210> 8

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifcial)

<220>

<221> CDS

<222> (10)..(1119)

<223>

<400> 8

atggctagc gac ttc gaa ccg atc ccg gaa gac gcg tac gat gaa ggt ggt     51

             Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Gly Gly

             1                  5                       10

ggt tct tac caa gga aac agt gac tgc tac ttt ggg aat ggg tca gcc       99

Gly Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala

15                     20                     25                     30

tac cgt ggc acg cac agc ctc acc gag tcg ggt gcc tcc tgc ctc ccg       147

Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro

                  35                     40                     45

tgg aat tcc atg atc ctg ata ggc aag gtt tac aca gca cag aac ccc       195

Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro

             50                       55                      60

agt gcc cag gca ctg ggc ctg ggc aaa cat aat tac tgc cgg aat cct       243

Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

         65                     70                     75

gat ggg gat gcc aag ccc tgg tgc cac gtg ctg aag aac cgc agg ctg       291

Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu

    80                     85                      90

acg tgg gag tac tgt gat gtg ccc tcc tgc tcc acc tgc ggc ctg aga        339

Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg

95                     100                     105                     110

cag tac agc cag cct cag ttt cgc atc aaa gga ggg ctc ttc gcc gac       387

Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp

                  115                     120                     125

atc gcc tcc cac ccc tgg cag gct gcc atc ttt gcc aag cac agg agg        435

Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg

               130                     135                     140

tcg ccc gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc ata ctc atc agc tcc tgc        483

Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys

          145                   150                     155

tgg att ctc tct gcc gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccg ccc cac        531

Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His

     160                     165                     170

cac ctg acg gtg atc ttg ggc aga aca tac cgg gtg gtc cct ggc gag        579

His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu

175                     180                     185                     190

gag gag cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac att gtc cat aag gaa ttc         627

Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe

                 195                      200                     205

gat gat gac act tac gac aat gac att gcg ctg ctg cag ctg aaa tcg         675

Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser

             210                     215                     220

gat tcg tcc cgc tgt gcc cag gag agc agc gtg gtc cgc act gtg tgc         723

Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys

          225                       230                      235

ctt ccc ccg gcg gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gag ctc       771

Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu

    240                    245                     250

tcc ggc tac ggc aag cat gag gcc ttg tct cct ttc tat tcg gag cgg        819

Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg

255                    260                    265                    270

ctg aag gag gct cat gtc aga ctg tac cca tcc agc cgc tgc aca tca        867

Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser

                  275                    280                    285

caa cat tta ctt aac aga aca gtc acc gac aac atg ctg tgt gct gga        915

Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly

             290                    295                    300

gac act cgg agc ggc ggg ccc cag gca aac ttg cac gac gcc tgc cag        963

Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln

         305                    310                    315

ggc gat tcg gga ggc ccc ctg gtg tgt ctg aac gat ggc cgc atg act        1011

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr

    320                    325                    330

ttg gtg ggc atc atc agc tgg ggc ctg ggc tgt gga cag aag gat gtc       1059

Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val

335                    340                    345                    350

ccg ggt gtg tac acc aag gtt acc aac tac cta gac tgg att cgt gac        1107

Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp

                   355                    360                    365

aac atg cga ccg tag taa                                         1125

Asn Met Arg Pro

             370

<210> 9

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Ser

1                  5                      10                    15

Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg

             20                      25                     30

Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn

         35                     40                      45

Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala

    50                       55                      60

Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly

65                     70                     75                     80

Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp

                   85                     90                     95

Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr

              100                    105                     110

Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala

         115                     120                    125

Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro

     130                     135                     140

Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile

145                   150                     155                  160

Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu

                  165                     170                   175

Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu

              180                     185                     190

Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp

         195                     200                     205

Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser

    210                     215                    220

Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro

225                   230                       235                  240

Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly

                 245                      250                     255

Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys

             260                     265                     270

Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His

         275                     280                     285

Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr

    290                     295                     300

Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp

305                    310                     315                   320

Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val

                  325                     330                     335

Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly

               340                     345                     350

Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met

         355                     360                     365

Arg Pro

    370

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

ggagacgcgt acgatgaagg tggtggttct taccaaggaa acagtgac    48

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artifcial)

<400> 11

gcaagctttt actacggtcg catgttgtca cgaatccagt ctaggtag    48

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

ggctagcgac ttcgaaccga tcccggaaga cgcgtacgat gaagg       45

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

ggctagcttc gaaccgatcc cggaagacgc gtacgatgaa gg           42

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

gcaagctttt actacggtcg catgttgtca cgaatccagt ct    42

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial)

<400> 15

ggctagcgaa ccgatcccgg aagacgcgta cgatgaagg        39

Claims (5)

1.溶栓和抗凝双重功效融合蛋白，由水蛭素IIIC端如SEQ ID NO.3所示序列的第55-66位氨基酸序列中的12个氨基酸肽段，与组织纤溶酶原激活剂截短突变体的如SEQID NO.6所示氨基酸序列的瑞替普酶(r-PA)，经连续的三个甘氨酸三肽序列连接肽连接而成，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.一种分离的DNA分子，其特征是能编码如权利要求1所述的溶栓和抗凝双重功效融合蛋白。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征是如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征是含有如权利要求3所述的DNA分子。

5.一种制备权利要求1所述溶栓和抗凝双重功效融合蛋白的方法，其特征是操作步骤为：

1′：设计在r-PA基础上扩增水蛭素IIIC端的12肽序列的引物；

2′：通过两次加端PCR，在r-PA基因上游扩增出连接肽序列和水蛭素IIIC端的12肽序列，获得目的物溶栓和抗凝双重功效融合蛋白基因；

3′：构建pET21a-HrP表达载体；

4′：转化大肠杆菌，建立工程菌；

5′：制备目的物溶栓和抗凝双重功效融合蛋白，

其中第3′步中的Hrp为具有溶栓和抗凝双重功效的融合蛋白。