CN1969923A - 板蓝根抗病毒提取物和提取方法及用途以及含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以十字花科植物菘蓝的根(板蓝根)、叶为原料提取抗病毒活性物质的方法。提取物的特征是能够被大孔树脂所吸附的化学成分的混合物，提取物中含有clemastanin B和一个具有通式(I)结构的活性化合物。用该提取物可作为抗病毒有效部位来制备抗病毒药物的制剂，在提取物中加入适宜的赋形剂，按常规的制备方法制成口服剂型或非口服剂型。本发明还涉及到提取物中含有的抗病毒活性化合物clemastanin B和具有通式(I)结构的活性化合物的提取方法，以及利用HPLC方法对该物质进行含量测定的方法，该方法可以作为药材及制剂质量控制的标准。

Description

板蓝根抗病毒提取物和提取方法及用途以及含量测定方法

一、技术领域

本发明涉及中医药技术领域，确切地说它是涉及一种从十字花科植物松蓝的根(板蓝根)、叶为原料而提取具有抗病毒作用的提取物的提取方法以及板蓝根药材中抗病毒活性成分的含量测定方法。

二、背景技术

十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根——“板蓝根”，有清热解毒，凉血利咽功能，在现代临床上常用于病毒性疾病及细菌感染疾病，尤其在抗病毒方面疗效确切，众多文献报道板蓝根对于病毒引起的流感、乙型肝炎、单纯疱疹、病毒性心肌炎、肾病综合征出血热等多种疾病在临床上均有较好的治疗或预防作用(高秀芝。板蓝根药理和临床应用概况.中医药研究，2001，17(12)：57-58)。板蓝根是较为广谱的天然抗病毒药物。

近年来国外对菘蓝植物的关注在于吲哚类生物碱的抗肿瘤活性上，抗病毒成分的研究则未见报道。国内对板蓝根的成分和药理方面做了大量研究，对化学成分的研究多为醇提取部位，已经分离并鉴定的成分达60种以上(刘云海，秦国伟，丁水平，等.板蓝根化学成分研究(I)[J].中草药，2001，32(12)：1057-1060)，但板蓝根抗病毒的活性成分和物质基础仍未得到阐明，目前临床上所应用的板蓝根制剂多为成分不明确的植物粗提取物，疗效和质量都很难得到保证。

在2005版的《中国药典》中，板蓝根及其单味药制剂仍然没有含量测定项，板蓝根药材及制剂生产中的质量控制问题也急待解决(国家药典委员会.中国药典(2005年版一部)[M].化学工业出版社，2005：142)。

三、发明内容

本发明的目的在于提供板蓝根抗病毒的提取物即有效部位和活性成分及其提取、分离纯化方法和用途，并且建立以活性成分为指标的板蓝根药材及制剂的含量测定方法。

本发明公开了一种以十字花科植物菘蓝的根(板蓝根)、叶为原料提取的抗病毒提取物，该提取物中含有活性化合物落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和一个具有通式(I)结构的活性化合物。抗病毒活性成分落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可以利用HPLC的方法进行含量测定，该测定方法可以作为药材及制剂质量控制的标准。

本发明所公开的板蓝根提取物，可以开发成为成分明确、疗效肯定的抗病毒新药。

一种具有抗病毒作用的板蓝根提取物，其特征在于该提取物是以十字花科植物菘蓝的根即板蓝根、叶为原料所提取的并且能被大孔树脂所吸附的化学成分的混合物，即为板蓝根抗病毒的有效部位；该提取物中含有活性化合物落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(clemastanin B)和一个具有以下通式(I)结构的活性化合物：

其中：R1是含有4～6个碳原子的氢芳基或杂芳基，其中的杂原子选自N、O、S；R1也包括被1个或2个下基团分别取代的氢芳基和杂芳基：CH3、CH3O、CH2OH、COOH、COOCH3、OH；R2选自以下基团：氢、(CH2)nCH3、(n＝2～8)、2～6个相互连接的五碳糖或六碳糖基。

上述板蓝根的提取物的用途是作为抗病毒有效部位来制备抗病毒药物的制剂，该有效部位可单独或加入适量的赋形剂，用常规的制备方法制成口服剂型或非口服剂型的药物；包括把此提取物添加到药用组合物中或此提取物参与组方的复方制剂；同时也包括该提取物制备保健品、保健食品方面的用途。

上述具有抗病毒作用的板蓝根提取物，其提取步骤如下：

(1)板蓝根药材用热水提取，水提取物经浓缩，用乙醇沉淀得水提醇沉上清液；

(2)将上清液浓缩后经大孔树脂吸附，用乙醇冲洗树脂柱、收集洗脱液；

(3)将洗脱液减压浓缩、干燥后得抗病毒有效部位。

上述步骤(1)的板蓝根药材为干燥饮片或粉末，用药材量4-20倍量的60～100℃水提取1～4次，每次0.5h～2h，合并提取液后浓缩，在提取液中加入95％的乙醇至乙醇终浓度为30～80％，静置过滤得上清液。

上述步骤(2)中将上清液抽滤或离心，滤液回收乙醇后浓缩经大孔树脂吸附，用10-90％的乙醇冲洗树脂柱，收集乙醇洗脱液。

上述抗病毒提取物中含有的化学成分落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，可利用HPLC的方法进行含量测定。测定的流动相选用水、甲醇、乙腈等色谱试剂中的一种或一定比例的几种混合；紫外检测波长为200nm～400nm之间。该测定方法可用于以菘蓝属植物为来源的药材和处方中以这些药材为主要原料的药物制剂或复方药物制剂的质量控制标准。

上述抗病毒提取物中含有化学成分落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，其提取方法为：取板蓝根药材干燥饮片或粉末，用10～95％醇水溶液回流提取，将提取液减压浓缩得浸膏；浸膏在水浴加热情况下溶于水中，通过大孔树脂，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得粗提物；此粗提物经硅胶柱色谱分离，以落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷纯品作为对照品TLC跟踪检识，与对照品有相同斑点的流份合并，回收溶剂后，经溶剂反复重结晶，得到落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。重经晶溶剂可选用水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮、乙酸乙酯中的一种或两种以上。

上述抗病毒提取物中包含有通式(I)结构的活性化合物，其提取方法为：板蓝根药材干燥饮片或粉末，用10～95％醇水溶液回流提取，将提取液减压浓缩得浸膏；浸膏在水浴加热情况下溶于水中，通过大孔树脂，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得到粗提物，此粗提物经硅胶柱色谱分离，收集具有含有此化合物的流分合并，回收溶剂后，经溶剂反复重结晶，重经晶溶剂可选用水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮、乙酸乙酯中的一种或两种以上，得到具有通式(I)结构的化合物。含有治疗有效量的通式(I)的化合物及其衍生物单独应用，或与其它药物的组合物，具有抗病毒药物用途。

板蓝根药材中落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量的测定方法如下：

(1)对照品溶液的制备：精密称取落叶松脂素-4，4’-二-O-β-D-二葡萄糖苷对照品适量，加甲醇逐步稀释至每1ml含0.02mg的溶液；

(2)供试样品溶液的制备：精密称取板蓝根过40目筛的粉末1g，置于25ml容量瓶中，加60％甲醇定容至25ml，60℃超声提取1h，再加60％甲醇至刻度，用3500r/min的速度离心10min，上清液过0.45μm微孔滤膜后，得供试品溶液，备用；

(3)色谱仪测定：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中进行测定，即得测定的含量。

板蓝根提取物即有效部位在制备抗病毒药物中的应用。

落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或具有通式(I)结构的活性化合物在制备抗病毒药物中的应用。

四、具体实施方式

以下通过实施例和实验例对本发明作进一步的说明，但本发明不受限于这些

实施例。

实施例1板蓝根抗病毒提取物即有效部位的提取方法

板蓝根干燥饮片2kg，分别用醇水溶液提取2h、1.5h，滤过，合并两次提取液并浓缩至4kg，滤过。搅拌情况下，于提取液中加入95％乙醇，至乙醇含量60-80％。静置过夜，抽滤，滤液回收溶剂，浓缩至2kg。上述板蓝根提取液反复通过大孔树脂吸附，分别用不同浓度乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥得到精制有效部位17g。

实施例2不同产地板蓝根药材落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量测定

2.1仪器与试剂

岛津CBM-10A高效液相色谱***；SPD-10A紫外检测器；CLASS SAILNET Driver工作站。

落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品由板蓝根药材中自行分离，经UV、IR、NMR、MS等鉴定为落叶松脂素-4，4’-二-O-β-D-二葡萄糖苷(clemastanin B)。经HPLC及TLC检验为单一成分，HPLC峰面积归一化法检测纯度为99.2％。

板蓝根药材购自江苏、安徽、河北等主要产地，经鉴定为菘蓝(Isatisindigotica Fort.)干燥根。甲醇、乙腈等试剂均为色谱纯。

2.2方法和结果

2.2.1测定方法

对照品溶液的制备精密称取落叶松脂素-4，4’-二-O-β-D-二葡萄糖苷对照品适量，加甲醇逐步稀释至每1ml含0.02mg的溶液。

供试样品溶液的制备精密称取板蓝根粉末(过40目筛)1g，置于25ml容量瓶中，加60％甲醇定容至25ml，60℃超声提取1h，再加60％甲醇至刻度，离心(3500r/min)10min，上清液过0.45μm微孔滤膜后，得供试品溶液，备用。

测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中进行测定，即得测定的含量。

2.2.2线性关系

对照品在5.5μg/mL～110.0μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3精密度实验

同一对照品溶液连续进样7次，其RSD为2.89％。

2.2.4稳定性试验

同一供试样品溶液，每隔2小时测定一次，结果表明，该样品溶液在12小时内稳定，RSD为2.87％。

2.2.5加样回收率试验

精密称取已知含量的江苏产板蓝根粉末约1g，共6份，每份加入和药材含量大致相等的对照品，精密称定。按“供试品溶液的制备”项下进行样品处理并测定，计算回收率，得落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的平均回收率为98.80％，RSD为0.60％。

2.2.6重复性试验

结果表明，该方法重复性良好，RSD为2.79％。

2.2.7主产地样品测定

分别取板蓝根各产地样品1g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下进行处理并测定，结果见表1。

表1板蓝根主产地样品含量测定结果(n＝3)

产地	含量(mg/g)
		河南商丘河北定县河北安国安徽毫州吉林延边湖北房县江苏连云港	0.34610.41240.36560.44070.61920.21380.5240

实施例3标准物质落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法

3.1制备方法

板蓝根粉末1kg，80％甲醇水溶液回流提取2次，提取液减压浓缩得浸膏65g。浸膏在水浴加热情况下溶于1000ml水中，通过大孔树脂，收集乙醇洗脱部份，减压浓缩、干燥，得12g。此样品经硅胶柱色谱分离，以落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷纯品作为对照品TLC跟踪检识，与对照品有相同斑点流份合并，回收溶剂后，分别经水、甲醇两次重结晶，得标准品落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷120mg。

3.2标准品的结构确认

按“制备方法”项下所得单体经13CNMR、1HNMR分析，波谱数据如下：1H-NMR(DMSO-d6)，δ：6.88(d，J＝1.5，H-2)，7.02(d，J＝8.6，H-5)，6.77(dd，J＝8.6，1.5，H-6)，4.72(d，J＝6.5，H-7)，2.20(m，H-8)，3.47(d，J＝8.0，H-α)，3.65(d，J＝8.0，H-9)，6.82(d，J＝1.5，H-2’)，6.97(d，J＝8.6，1.5，H-5’)，6.68(dd，J＝6.5，H-6’)，2.46(d，，J＝11.0，H-7’α)，2.84(dd，J＝11.0，3.8，H-7’β)，2.61(m，H-8’)，3.56(t，J＝7.0，H-9’α)，3.90(t，J＝7.0，H-9’β)，3.74(s，-OCH3)，4.84(d，J＝5.0，β-glu-1”)，4.86(d，J＝5.5，β-glu-1)。1C-NMR(DMSO-d6)，δ：137.8(C-1)，110.2(C-2)，149.0(C-3)，145.7(C-4)，115.2(C-5)，118.0(C-6)，81.8(C-7)，52.7(C-8)，58.8(C-9)，134.8(C-1’)，113.2(C-2’)，149.0(C-3’)，145.0(C-4’)，115.5(C-5’)，120.5(C-6’)，32.4(C-7’)，42.0(C-8’)，72.1(C-9’)，55.8(OCH3)，100.4(C-1”)，100.3(C-1)，73.4(C-2”、2)，77.1(C-3’3)，69.9(C-4’、4)，77.2(C-5”、5)，60.9(C-6”、6)。以上数据与文献对照完全一致，为落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(lariciresinol-4，4’-bis-O-β-D-glucopyranoside)，即clemastanin B。

3.3标准品的纯度检查

TLC法检查：精密称取标准品重量，加甲醇制成每1ml含标准品10mg的溶液，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液4，6，8，10μl，点于同一含硅胶G板上，分别以氯仿-甲醇(7∶3)、正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)为展开剂，展开，以10％磷钼酸乙醇溶液溶液显色。

结果表明，所制备的落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷标准品在两种不同溶剂***下展开，经10％磷钼酸乙醇溶液加热显色后，均呈单一斑点。

实施例4具有通式(I)结构的活性化合物I的提取方法

板蓝根粉末1kg，醇水溶液提取2次，提取液减压浓缩得浸膏65g。浸膏在水浴加热情况下溶于1000ml水中，通过大孔树脂，收集乙醇洗脱部份，减压浓缩、干燥，得12g。此样品经硅胶柱色谱分离，经结构鉴定的通式(I)化合物纯品作为对照品TLC跟踪检识，与对照品有相同斑点流份合并，回收溶剂后，经甲醇重结晶，得通式(I)化合物20mg。

实施例5板蓝根抗病毒有效部位及新化合物的体外抗病毒药效学实验

5.1材料

5.1.1受试药物：

(1)实例一中所分离得到的有效部位

(2)具有发明内容中通式(I)结构的化合物单体。

(3)阳性对照药：阿昔洛韦(ACV)，湖北潜江制药股份有限公司，批号：20040802。

5.1.2病毒

人类单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、II型(HSV-2)。

5.1.3细胞株

vero细胞(非洲绿猴肾细胞)，为HSV型病毒敏感细胞。

5.2.实验方法

5.2.1药物对细胞的毒性作用

取长成单层细胞的96孔细胞培养板，弃去上清液，将含不同浓度药物的细胞培养液0.2ml加入细胞，每个浓度4个复孔，37℃5％CO2培养72h，每孔加入20μL5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h，倾去上清液，加入0.2mL DMSO，570-630nm双波长法测O.D值，计算细胞存活率及半数毒性浓度(TC50)。以最大无毒浓度为起始浓度，倍比稀释几个浓度，进行抗病毒实验。

细胞存活率＝(药物组平均O.D值/细胞对照组平均O.D值)×100％

5.2.2抗病毒实验

设空白细胞对照、病毒感染对照、阿昔洛韦(ACV)阳性对照和受试药物组，共4个组。取长成单层的细胞，弃去上清液，加入20μL 100TCID50病毒液，吸附1h，用PBS液洗去未吸附的病毒，加入含不同浓度药物的细胞培养液0.2mL，每个浓度4个复孔，37℃5％CO2培养72h，每孔加入20μL 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h，倾去上清液，加入0.2mL DMSO，570nm(630nm作为参考波长)双波长法测O.D值，计算病毒抑制率、药物对50％抑制病毒细胞病变的药物浓度(IC50)，并计算治疗指数(TI)。

病毒抑制率＝(实验组平均O.D值-病毒对照组平均O.D值)/(细胞对照组平均O.D值-病毒对照组平均O.D值)×100％

治疗指数(TI)＝半数毒性浓度(TC50)/半数抑制浓度(IC50)

5.3.实验结果

5.3.1药物对细胞的毒性测定

经测定，有效部位和新化和物的TC50值分别为：10.00mg/mL和0.662mg/mL。结果见表1。

表1受试药物对细胞毒性测定

组别	药物浓度(mg/mL)	OD值(x±s)	细胞存活率(％)	TC50(mg/mL)
					部位给药组细胞对照	10.0005.0002.5001.2500.625	0.914±0.1020.840±0.0791.039±0.2581.469±0.1371.448±0.0191.647±0.079	55.4951.0263.0889.1987.09	10.00
化合物给药组细胞对照	2.0001.0000.5000.2500.125	0.260±0.0440.332±0.0671.198±0.0501.532±0.0801.818±0.1511.695±0.027	15.3619.5670.6490.39107.22	0.662

5.3.2抗病毒实验

板蓝根有效部位和新化合物对病毒感染细胞显示出较强的抗HSV病毒作用。经MTT法测定细胞活性并计算病毒抑制率分别为53.21％、57.31％，与阳性对照药阿昔洛韦接近；治疗指数(TI)分别为8.3、7.1。

表2板蓝根有效部位和新化合物对HSV病毒的抑制作用

组别	药物浓度(mg/mL)	OD值(x±s)		病毒抑制率(％)
						HSV-1	HSV-2	HSV-1	HSV-2
		有效部位阳性对照组病毒感染组细胞对照组	4.8002.4001.2000.6000.3000.1500.200	0.436±0.3470.788±0.0681.100±0.0980.883±0.0500.853±0.0590.733±0.0871.186±0.0370.611±0.0231.531±0.055	0.299±0.0511.025±0.0490.881±0.0490.885±0.0620.819±0.0730.762±0.0610.972±0.0500.634±0.0061.555±0.122					-19.0119.3053.2129.5526.3713.2662.55	-36.4442.4526.7727.2020.1013.9136.73
新化合物阳性对照组病毒感染组细胞对照组	0.5000.2500.1250.0630.0310.0160.200					0.479±0.0740.792±0.2620.647±0.1290.474±0.0810.536±0.0260.759±0.1341.014±0.0670.506±0.0151.427±0.019	0.422±0.0650.835±0.3671.023±0.3430.861±0.3330.868±0.3920.944±0.3671.137±0.0110.482±0.0221.426±0.022	-2.9331.1115.34-3.473.2627.5055.14	-6.4337.3557.3140.1440.9248.9469.36

实施例6板蓝根抗病毒有效部位的体内抗病毒药效学实验

6.4.1受试药物

(1)实例一中所分离得到的有效部位

(2)阳性对照药，利巴韦林片，四川美大康药业股份有限公司，批号：051101

6.4.2实验用病毒

甲型流感病毒A/PR8/34(H1H1)，由中国预防医学实验室病毒研究所提供。

6.4.3实验方法和结果

(1)甲型流感病毒经鸡胚增毒，经血凝试验结果血凝滴度为640以上，可以用于体内感染动物。

(2)经测定病毒感染小鼠半数死亡(LD50)滴定，结果LD50为10-1.71。

(3)板蓝根有效部位对甲型流感病毒A/PR8/34感染小鼠的保护作用

取ICR小鼠80只，体重18-22g，雌雄各半，按以下方法随机分5组，每组16只。

I正常对照组，等量NS

II病毒对照组，等量NS

III利巴韦林组，50mg/kg

IV有效部位给药组，0.15g/kg

V有效部位给药组，0.30g/kg

以上各组动物均采用灌胃给药，每日一次，连续给药5天。于开始给药次日，除正常对照组外的各组小鼠在浅麻醉下，以血凝滴度640以上的尿囊液给小鼠滴鼻感染病毒，每鼠50ul，观察动物感染发病情况及死亡数目，记录14d内死亡数目，并比较存活天数。结果见表3。

表3板蓝根抗病毒有效部位对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用

组别	动物数(只)	剂量(g/kg)	存活天数
				正常组病毒感染组利巴韦林组有效部位组有效部位组	1616161616	等量NS等量NS0.050.100.20	5.68±3.3311.06±3.98*9.13±3.15*10.50±3.72*

实验结果表明，板蓝根有效部位提取物可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数，与病毒模型组比较有显著性差异，疗效与利巴韦林相当。

实施例7板蓝根抗病毒胶囊的制备

取实施例1中方法所制备的板蓝根精制有效部位200g，加淀粉约300g，制备颗粒，干燥，装入胶囊，每粒装0.5g，共制成约1000粒，即得。

实施例8板蓝根抗病毒注射液的制备

板蓝根干燥饮片500g，分别用适当的溶剂提取2h、1.5h，滤过，合并两次提取液并浓缩至1kg，滤过。搅拌情况下，于提取液中加入95％乙醇，至适宜浓度。静置过夜，抽滤，滤液回收溶剂，浓缩至500g。上述板蓝根提取液反复通过大孔树脂吸附，分别用不同浓度乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，合并，浓缩至350～500ml，冷藏，滤过，滤液用氨试液调节pH值为8.0～8.5，搅匀，冷藏48小时，加热除去氨，加注射用水至900ml，冷藏，滤过，滤液用1％氢氧化钠溶液调节pH值为7.0～7.5，冷藏，滤过，滤液加甘露醇10g.并加注射用水调整总量至1000ml，滤过，即得。

实施例9板蓝根抗病毒滴眼液的制备

板蓝根干燥饮片500g，分别用适当的溶剂提取2h、1.5h，滤过，合并两次提取液并浓缩至1kg，滤过。搅拌情况下，于提取液中加入95％乙醇，至适宜浓度。静置过夜，抽滤，滤液回收溶剂，浓缩至500g。上述板蓝根提取液反复通过大孔树脂吸附，分别用不同浓度乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，合并，浓缩至350～500ml，冷藏，滤过，滤液用氨试液调节pH值为8.0～8.5，搅匀，冷藏48小时，加热除去氨，加入1g尼泊金乙酯，加蒸馏水至1000ml，灭菌，用G4垂熔漏斗、0.22um滤漠滤过，灌封，即得。

实施例10板蓝根抗病毒片剂的制备

取实施例1中方法所制备的板蓝根精制有效部位200g，加淀粉约300g，混匀，95％乙醇湿法制备颗粒，干燥，压制成1000片，即得。

实施例11板蓝根抗病毒颗粒的制备

取实施例1中方法所制备的板蓝根精制有效部位200g，加蔗糖400g，糊精260g，混匀，95％乙醇湿法制备颗粒，干燥，制成约1000袋，即得。

实施例12板蓝根抗病毒口服液的制备

板蓝根干燥饮片500g，分别用适当的溶剂提取2h、1.5h，滤过，合并两次提取液并浓缩至1kg，滤过。搅拌情况下，于提取液中加入95％乙醇，至适宜浓度。静置过夜，抽滤，滤液回收溶剂，浓缩至500g。上述板蓝根提取液反复通过大孔树脂吸附，分别用不同浓度乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，合并，浓缩至350～500ml，加入矫味剂(蔗糖400g)、防腐剂(苯甲酸钠3g)，溶解后过滤，加水调节至1000ml，灌装，即得。

Claims (10)

1.一种具有抗病毒作用的板蓝根提取物，其特征在于该提取物是以十字花科植物菘蓝的根即板蓝根、叶为原料所提取的并且能被大孔树脂所吸附的化学成分的混合物，即为板蓝根抗病毒的有效部位；该提取物中含有活性化合物落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(clemastanin B)和一个具有以下通式(I)结构的活性化合物：

其中：R1是含有4～6个碳原子的氢芳基或杂芳基，其中的杂原子选自N、O、S；R1也包括被1个或2个下述基团分别取代的氢芳基和杂芳基：CH3、CH3O、CH2OH、COOH、COOCH3、OH；R2选自以下基团：氢、(CH2)nCH3、(n＝2～8)、2～6个相互连接的五碳糖或六碳糖基。

2.如权利要求1所述具有抗病毒作用的板蓝根提取物，其特征在于：它是用菘蓝的根即板蓝根、叶为原料提取的被大孔树脂所吸附的化学成分作为抗病毒有效部位来制备抗病毒药物的制剂，该有效部位可单独或加入适量的赋形剂，用常规的制备方法制成口服剂型或非口服剂型的抗病毒药物，或者把此提取物添加到药用组合物中或此提取物参与组方的复方制剂，或者制成保健品、保健食品。

3.一种提取权利要求1所述具有抗病毒作用的板蓝根提取物的方法，其提取步骤如下：

(1)板蓝根药材用热水提取，水提取物经浓缩，用乙醇沉淀得水提醇沉上清液；

(2)将上清液浓缩后经大孔树脂吸附，用乙醇冲洗树脂柱、收集洗脱液；

(3)将洗脱液减压浓缩、干燥后得抗病毒提取物即有效部位。

4.根据权利要求3所述的板蓝根提取物的提取方法，其特征在于步骤(1)所述的板蓝根药材为干燥饮片或粉末，用药材量4-20倍量的60～100℃水提取1～4次，每次0.5h～2h，合并提取液后浓缩，在提取液中加入95％的乙醇至乙醇终浓度为30～80％，静置过滤得上清液。

5.根据权利要求3所述的板蓝根提取物的提取方法，其特征在于步骤(2)中将上清液抽滤或离心，滤液回收乙醇后浓缩经大孔树脂吸附，用10-90％的乙醇冲洗树脂柱，收集乙醇洗脱液。

6.如权利要求1所述的板蓝根提取物，其特征是所述的落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的提取方法为：取板蓝根药材干燥饮片或粉末，用10～95％醇水溶液回流提取，将提取液减压浓缩得浸膏；浸膏在水浴加热情况下溶于水中，通过大孔树脂，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得粗提物；此粗提物经硅胶柱色谱分离，以落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷纯品作为对照品TLC跟踪检识，与对照品有相同斑点的流份合并，回收溶剂后，经溶剂反复重结晶，得到落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，所述重结晶溶剂选用水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮、乙酸乙酯中的一种或两种。

7.如权利要求1所述的板蓝根提取物，其特征是所述的具有通式(I)结构的活性化合物的提取方法为：板蓝根药材干燥饮片或粉末，用10～95％醇水溶液回流提取，将提取液减压浓缩得浸膏；浸膏在水浴加热情况下溶于水中，通过大孔树脂，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，干燥，得到粗提物，此粗提物经硅胶柱色谱分离，收集具有含有此化合物的流分合并，回收溶剂后，经溶剂反复重结晶，此重结晶溶剂选用水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、丙酮、丁酮、乙酸乙酯中的一种或两种。

8.如权利要求1所述的板蓝根提取物，其特征在于所述的落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可利用HPLC的方法进行含量测定，测定的流动相选用水、甲醇或乙腈色谱试剂中的一种或两种混合；紫外检测波长为200nm～400nm之间；其含量测定方法的具体步骤如下：

(1)对照品溶液的制备：精密称取落叶松脂素-4，4’-二-O-β-D-二葡萄糖苷对照品适量，加甲醇逐步稀释至每1ml含0.02mg的溶液；

(2)供试样品溶液的制备：精密称取板蓝根过40目筛的粉末1g，置于25ml容量瓶中，加60％甲醇定容至25ml，60℃超声提取1h，再加60％甲醇至刻度，用3500r/min的速度离心10min，上清液过0.45μm微孔滤膜后，得供试品溶液，备用；

(3)测定：分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中进行测定，即得测定的含量。

9.根据权利要求8所述的落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量测定方法，其特征在于：可用于以菘蓝属植物为来源的药材和处方中以这些药材为原料的药物制剂或复方药物制剂或保健品、保健食品的质量控制标准。

10.如权利要求1所述的板蓝根提取物即有效部位或落叶松树脂醇-4，4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或具有通式(I)结构的活性化合物在制备抗病毒药物中的应用。