CN1968964A - 寡聚肽及其治疗hiv感染的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗HIV感染生物活性并具有氨基酸序列(Z1－LE－X1－IP－X2－X3－X4－P－X5－X6－X7－X8－X9－X10－K－X11－X12－X13－X14－X15－Z2) n的寡聚肽，其中n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；X3是丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸或甘氨酸；X4是异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸；X5是脯氨酸、D－脯氨酸或者取代的L－或D－脯氨酸；X6是半胱氨酸或谷氨酸；X7是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或半胱氨酸；X8是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或半胱氨酸；X9是具有芳香侧链的氨基酸；X10是甘氨酸、丙氨酸或天冬酰胺；X11是脯氨酸、天冬氨酸、八氢吲哚基－2－羧酸或D1，2，3，4－四氢异喹啉－3－羧酸；X12是苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D－1，2，3，4－四氢异喹啉－3－羧酸；X13是具有疏水或芳香侧链的氨基酸；X14是具有疏水或芳香侧链的氨基酸；X15是苯丙氨酸或缺失；Z1是NH2或1－10个氨基酸残基的序列；Z2是COOH或1－10个氨基酸残基的序列；和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体；前提条件是(a)如果X12是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D－1，2，3，4－四氢异喹啉－3－羧酸，那么X13、X14和X15分别是苯丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；和/或(b)如果X12是苯丙氨酸，那么X13、X14和X15分别是缬氨酸、苯丙氨酸和缺失；和(c)肽中最多有三个半胱氨酸残基；和(d)所述寡聚肽不具有序列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF) 2 (VIR－576)；和(e)所述单体肽链不经一条肽链的N－端与另一条肽链的C－端之间的肽键连接。

Description

寡聚肽及其治疗HIV感染的用途
技术领域
本发明涉及对人免疫缺陷病毒(HIV)感染人细胞表现抑制活性的寡聚肽。特别地，它们包括包含氨基酸序列(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-X15-Z2)n的单体肽链的寡聚肽，其中n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；X3是丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸或甘氨酸；X4是异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸；X5是脯氨酸、D-脯氨酸或取代的L-或D-脯氨酸；X6是半胱氨酸或谷氨酸；X7是具有疏水或芳香侧链的氨基酸或半胱氨酸；X8是具有疏水或芳香侧链的氨基酸或半胱氨酸；X9是具有芳香侧链的氨基酸；X10是甘氨酸、丙氨酸或天冬酰胺；X11是脯氨酸、天冬氨酸、八氢吲哚基-2-羧酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；X12是苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；X13是具有疏水或芳香侧链的氨基酸；X14是具有疏水或芳香侧链的氨基酸；X15是苯丙氨酸或缺失；Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体；并且前提是(a)如果X12是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，那么X13、X14和X15分别是苯丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；和/或(b)如果X12是苯丙氨酸，那么X13、X14和X15分别是缬氨酸、苯丙氨酸和缺失；和(c)在寡聚肽的任意单体肽链中最多有三个半胱氨酸残基；和(d)所述寡聚肽不具有序列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(VIR-576)；和(e)所述单体肽链不经过一条肽链的N-端至另一条肽链的C-端之间的肽键连接。
本发明进一步涉及编码本发明寡聚肽的单体肽链的核酸分子，但编码WO 2004/056871中已公开的单体肽链的核酸分子除外。本发明也涉及特异性结合所述寡聚肽的抗体，以及包含所述肽、核酸和/或抗体的药物。本发明寡聚肽在制造用于治疗HIV感染的药物中的用途也被公开。本发明还涉及包含本发明至少一种寡聚肽的测试，用于确定能与HIV的融合肽相互作用的分子。而且，本发明还公开了含本发明至少一种寡聚肽、和/或本发明至少一种核酸分子和/或本发明至少一种抗体的诊断剂。还公开了本发明寡聚肽在所述测试中的用途，以及所述诊断剂在测试分离的血浆、组织、尿、***和/或脑脊液中HIV感染中的用途。
背景技术
最近这些年，对于具有抗HIV感染活性的治疗进行了大量研究。开发和测试了几种药物，它们延迟和抑制艾滋病的发作并降低血液中HIV水平。在美国，艾滋病发作后感染HIV的患者的寿命从1984年的11个月延长到1997年的46个月。在寻找治疗法中应用了多种策略，得到了几种类型的药物，如抑制病毒复制所需的蛋白酶的蛋白酶阻滞剂，以及抑制逆转录病毒复制必需的病毒逆转录酶的药物。最近刚开发的一组活性剂是融合抑制剂，它们将阻止病毒与宿主细胞的融合。已经表明，提供白细胞介素-2与其它活性剂的组合能增加免疫应答的强度。
通过阻断病毒附着和进入宿主细胞期间发生的其中一个分子步骤，进入抑制剂阻断HIV病毒颗粒与血细胞的附着。一个重要的步骤是HIV与一种主要趋化因子共受体CCR5和CXCR4(CC趋化因子受体5和CXCR趋化因子受体4)的结合。这些共受***于血细胞表面，在病毒进入前与HIV包膜蛋白结合时需要它们。进入所需要的病毒与细胞的相互作用另一步骤是HIV包膜蛋白gp120与细胞CD4受体的结合。这些步骤经常被称为病毒颗粒与细胞靶标的附着。已经显示，阻断HIV与趋化因子共受体相结合可以抑制病毒进入(Strizki J.M.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，2001，98，12718-12723)。据报告通过阻断gp120与CD4受体相互作用也可以实现相同目的(Lin et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，2003，100，11013-11018)。HIV蛋白gp41也已经被识别为开发抗HIV药物的靶标(Gordon et al.，AIDS Research and HumanRetroviruses 11，677-686，1995)。第一个批准的融合抑制剂是enfuvirtide(T-20，Fuzeon，DP178)(WO 01/51673 A2；WO 96/40191；Cervia J.S et al.，Clin.Infect.Dis，2003，37，1102-1106；Kilby J.M.，Nature Medicine，1998，4，1302-1307)。这种融合抑制剂与HIV包膜蛋白gp41中被称为HR-2的部分相同，它通过与gp41的HR-1区段(HR＝七价重复)相结合来抑制HIV-细胞融合，从而阻止HR-2与gp41的HR-1区段相结合并进而阻止六螺旋束的形成，而病毒颗粒与血细胞融合需要这种六螺旋束。T-20未显示可与HIV gp41的HR-1以外的蛋白质区段或者甚至病毒或真核起源的其它分子相结合。具有抗HIV生物活性的另一种药剂最近描述于WO 01/34640。所公开的是名为VIRIP(病毒抑制肽)的20个氨基酸的肽，它分离自人血滤出物(human hemofiltrate)并发现可抑制HIV感染人细胞。具有抗HIV生物活性的VIRIP的合成衍生物公开于WO 2004/056871。
尽管有这些努力以及可用的不同药物，问题仍未解决，还不能治愈艾滋病，因为已知治疗方法尽管能显著降低体内和感染HIV的血细胞中HIV水平，却不能完全去除病毒。一种特别的缺点是HIV尤其容易突变，经常导致产生对某种治疗方法的抗性。一般来说，已知治疗法仅仅在它们与其它治疗法联合施用时才足够有效。这种联合治疗在目前延长了普通患者的寿命，但不能治愈，并且通常伴随严重副作用，经常不允许患者过“正常”的生活。
对于提供新治疗法和改进的治疗法有很大的医学需求，这样的治疗方法将导致治疗改善、副作用降低、和显著延长HIV感染者在艾滋病发作前后的期望寿命。
本发明面对提供新治疗法的问题，该治疗法将克服上述问题，并将允许高效的治疗或者有助于高效的联合治疗。
发明内容
令人惊奇地，通过本发明提供的寡聚肽解决了这个问题，所述寡聚肽至少与HIV gp41的融合肽相互作用。该融合肽是gp41的氨基最末端的部分，由约30个氨基酸残基组成。在目前的模型中，gp41的疏水融合肽充当连接病毒颗粒与细胞宿主膜的锚(Dimitrov A.S.et al.，Biochemistry，2003，42，14150-14158；Mobley et al.，Biochim.Biophys.Acta，1999，1418，1-18)，并且本发明的肽干扰HIV的进入细胞过程，从而阻止病毒进入。
本发明的肽具有抗HIV感染的生物活性，包含氨基酸序列(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-X15-Z2)n的单体肽链，其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸或甘氨酸；
X4是异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸；
X5是脯氨酸、D-脯氨酸或取代的L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是具有疏水或芳香侧链的氨基酸或半胱氨酸；
X8是具有疏水或芳香侧链的氨基酸或半胱氨酸；
X9是具有芳香侧链的氨基酸；
X10是甘氨酸、丙氨酸或天冬酰胺；
X11是脯氨酸、天冬氨酸、八氢吲哚基-2-羧酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X12是苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X13是具有疏水或芳香侧链的氨基酸；
X14是具有疏水或芳香侧链的氨基酸；
X15是苯丙氨酸或缺失；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体；
前提条件是
(a)如果X12是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，那么X13、X14和X15分别是苯丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；和/或
(b)如果X12是苯丙氨酸，那么X13、X14和X15分别是缬氨酸、苯丙氨酸和缺失；和
(c)肽中最多有三个半胱氨酸残基；和
(d)所述寡聚肽不是(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(VIR-576)；和
(e)所述单体肽链不经一条肽链的N-端至另一条肽链的C-端之间的肽键连接。
在具有通式(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-X15-Z2)n的上述肽的一个优选实施方案中，X7是苯丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、3，3-二苯基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、或对氟苯丙氨酸；X8是苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；X9是苯丙氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；和Z1优选是NH2或1-3个氨基酸残基的序列和Z2优选是COOH或1-3个氨基酸残基的序列。上述肽的抗HIV感染的生物活性，以IC50测量，等于或小于6500nM。
具有抗HIV感染的生物活性的根据本发明肽的另一个实施方案是具有氨基酸序列
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-FVF-Z2)n的寡聚肽，其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸；
X4是异亮氨酸或半胱氨酸；
X5是脯氨酸、D-脯氨酸或任何取代的L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是苯丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或3，3-二苯基丙氨酸；
X8是苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X9是具有芳香侧链的氨基酸；
X10是甘氨酸或天冬酰胺；
X11是脯氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体。
在具有通式
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-FVF-Z2)n的上述寡聚肽的一个优选实施方案中，X9是苯丙氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；Z1优选是NH2或1-3个氨基酸残基的序列和Z2优选是COOH或1-3个氨基酸残基的序列。上述寡聚肽的抗HIV感染的生物活性，以IC50测量，等于或小于2000nM。
具有抗HIV感染的生物活性的根据本发明寡聚肽的另一个实施方案是具有氨基酸序列
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-IP-X5-X6-X7-X8-F-X10-KPFVF-Z2)n的寡聚肽，其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸或甘氨酸；
X5是L-脯氨酸、D-脯氨酸或任何取代的L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是苯丙氨酸或缬氨酸；
X8是苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X10是甘氨酸或天冬酰胺；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体。
在具有通式
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-IP-X5-X6-X7-X8-F-X10-KPFVF-Z2)n的上述寡聚肽的一个优选实施方案中，Z1优选是NH2或1-3个氨基酸残基的序列和Z2优选是COOH或1-3个氨基酸残基的序列。所述肽的抗HIV感染的生物活性，以IC50测量，等于或小于800nM。
具有抗HIV感染的生物活性的根据本发明寡聚肽的另一个实施方案是具有氨基酸序列
(Z1-LEAIP-X2-SIP-X5-X6-V-X8-FNKPFVF-Z2)n的寡聚肽，其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X2和X6是半胱氨酸，或者X2是甲硫氨酸且X6是谷氨酸；
X5是D-脯氨酸或L-脯氨酸；
X8是具有疏水或芳香侧链的氨基酸或赖氨酸；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体，
前提是满足下列至少一个条件：
(1)X2和X6是半胱氨酸；或
(2)X5是D-脯氨酸，或
(3)X8不是赖氨酸。
在具有通式
(Z1-LEAIP-X2-SIP-X5-X6-V-X8-FNKPFVF-Z2)n的肽的一个优选实施方案中，Z1优选是NH2或1-3个氨基酸残基的序列和Z2优选是COOH或1-3个氨基酸残基的序列。
优选地，在本发明的寡聚肽中，单体肽链被交联。它们可以通过两个单体肽的两个氨基酸侧链之间的直接分子间键或者通过一个单体肽的氨基酸侧链与另一单体肽的N-或C-端之间交联。在本发明的另一实施方案中，所述键是经双功能连接分子的间接键。
本发明寡聚肽的另一个实施方案是这样的，其中单体肽链中在6和11位、6和12位、7和12位或8和13位处的半胱氨酸残基经分子内二硫键相连接。因此，在这些位置具有半胱氨酸残基的寡聚肽可以出现具有在一条单体肽链的这些残基之间的分子内桥，或具有单体肽链之间的二硫键，即通过该二硫键实现寡聚化。因此另一些实施方案是这样的寡聚肽，其中每个单体肽链包含两个半胱氨酸残基，其中经这两个半胱氨酸残基实现寡聚化，这两个半胱氨酸残基通过与第二个单体肽链的两个半胱氨酸残基形成的二硫键连接，形成包含经两个二硫键连接的两个单体肽链的同型二聚体。另一个实施方案是在每个单体肽链中具有三个半胱氨酸的寡聚肽，其中每个单体单元中的两个半胱氨酸残基参与分子内二硫键，而每个单体肽链的第三个半胱氨酸通过与不参与分子内二硫键的单体链的半胱氨酸残基形成二硫键而参与寡聚化。另一个实施方案是在每个单体肽链中具有单个半胱氨酸残基的寡聚肽，其中所述半胱氨酸残基经二硫键互相连接，从而连接该寡聚肽的单体肽链。优选依此方式形成的同型二聚体。在每个单体肽链中具有半胱氨酸残基的寡聚肽的另一个实施方案中，每个单体肽链中至少一个半胱氨酸残基通过含两个硫醇基团的双功能小有机间隔基团与该寡聚肽中另一单体肽链中的半胱氨酸残基相交联。二聚体是包含至少一个半胱氨酸残基的寡聚肽的优选
实施方案。
另一个实施方案是包含至少一个上述特征的寡聚肽，其中在该寡聚肽的至少一个单体肽链中，第1位氨基酸的亮氨酸残基和第2位氨基酸的谷氨酸通过N-烷基化酰胺键或者通过酯键或者通过还原的肽键或者通过逆反(retro-inverso)肽键或者通过N-烷基化的逆反肽键被共价连接。优选的是二聚体，其中第1位氨基酸的亮氨酸残基和第2位氨基酸的谷氨酸通过N-烷基化的酰胺键或者通过酯键或者通过还原的肽键或者通过逆反肽键或者通过N-烷基化的逆反肽键被共价连接。
另一个实施方案是具有至少一个上述特征的寡聚肽，其包含线性顺序的2、3或4个单体肽链重复单元，其中单体肽链通过相邻单体肽链的Z2和Z1之间的间接肽键被共价连接。如果具有氨基和羧基的小有机双功能间隔子将Z2与相邻单体肽链的Z1相连接，则出现间接肽键。在这种具有间接肽键的线性寡聚肽中，重复单元是全部相同的单体肽链，形成均一性寡聚肽，或者重复单元选自不同单体肽链，使得四聚体可以包含1、2、3或4个不相同单体肽链，三聚体可以包含1、2或3个不相同单体肽链，或者二聚体可以包含2个不相同单体肽链，形成异质性寡聚肽。优选的具有间接肽键的线性寡聚肽具有两个重复单元，即二聚体。另一个实施方案是环状寡聚肽，尤其是具有2、3或4个单体肽链的环状寡聚肽。一种形式的环状寡聚肽包含单体肽链的重复单元，其中第一个和所有相邻单体肽链通过直接肽键或Z2和相邻单体肽链的Z1之间的间接肽键被共价连接，并且至少一个另外的共价键存在于第一和第二和/或第一和第三和/或第一和第四个单体肽链、和/或第二与第三和/或第二与第四个单体肽链、和/或第三与第四个单体肽链之间。所述至少一个另外的共价键可以选自酰胺键、尤其是肽键，如它们可存在于氨基酸残基的侧链与酸性和碱性氨基酸、或第一个单体肽链的氨基端和最后一个单体肽链的羧基端之间，肟键，腙键，噻唑烷键，硫酯键、醚键，和半胱氨酸残基之间的二硫键等。
本发明的另一个实施方案是包含至少一个半胱氨酸残基的上述线性寡聚肽的任一种，通过该残基与具有至少一个半胱氨酸残基的另一个寡聚肽(包括线性寡聚肽)形成直接的二硫键，或者所述半胱氨酸残基通过具有两个硫醇基的短有机双功能间隔子互相连接。代替上述线性寡聚肽与另一个寡聚肽之间的二硫桥、或者除此之外，分别通过具有酸性和碱性侧链的氨基酸残基的一个羧基和一个氨基之间形成的至少一个酰胺键，建立这些肽之间的连接。作为替代，所述酸性和碱性侧链可以通过包含氨基以及羧基的短有机双功能间隔子相连接。
本发明寡聚肽的另一个实施方案是这样的，其中单体肽链通过两个单体肽链之间的至少一个酰胺键互相共价连接，这通过一个单体肽链中碱性氨基酸的侧链氨基与另一个单体肽链中酸性氨基酸的侧链羧基之间的共价键来实现。特别地，这种酰胺键可以在赖氨酸残基侧链与天冬氨酸残基侧链之间形成，和/或在赖氨酸残基侧链与谷氨酸残基侧链之间形成。在进一步的实施方案中，这些肽链的寡聚化间接通过含一个氨基和一个羧基的双功能小有机间隔子基团而实现，通过用其氨基共价结合至一个肽链中酸性氨基酸的羧基侧链和用其羧基共价结合至第二个肽链中碱性氨基酸的侧链氨基，该间隔子基团将这些单体肽链相交联。通过单体肽链中酸性和碱性氨基酸的侧链之间的直接或间接酰胺键可以形成四聚体、三聚体和二聚体，其中二聚体是优选实施方案。另一个实施方案是含有多达四个经肽键共价交联的肽链的寡聚肽，这是通过其羧基端与含两个氨基的氨基酸(如赖氨酸和低级赖氨酸衍生物)的氨基功能基之间的肽键实现的。进一步的实施方案是包含两个或四个单体肽链和至少一个赖氨酸核心的寡聚肽，所述至少一个赖氨酸核心将单体肽链共价连接。赖氨酸核心起连接分子(也可以描述为间隔子)的功能，并具有通式“KX”，其中“X”是氨基酸、PEG基团或缺失(即没有“X”)。赖氨酸核心通过与每个单体肽链的羧基端形成两个肽键将两个单体肽链相连接。赖氨酸核心中优选的氨基酸是丙氨酸、优选的PEG基团是小PEG(mini-PEG)。赖氨酸核心可以通过侧链中有氨基的氨基酸，如赖氨酸残基或低级赖氨酸同源物，与另一个赖氨酸核心经肽键而相连接。如果两个赖氨酸核心均共价地连接两个单体肽链，则所得寡聚肽包含4个单体肽链。赖氨酸核心也被称为接枝聚合结构(dendrimeric structure)，而单体肽链被称为连接至接枝聚合的赖氨酸核心结构上。进一步的实施方案是本发明的寡聚肽，其中用天然和非天然氨基酸的活性侧链通过至少一个肟、腙和噻唑烷键来连接单体肽链。肟、腙连接可以在由侧链中具有羟基的氨基酸例如丝氨酸生成的醛功能基与通过特殊氨基酸如氨基草酰乙酸、氨基丝氨酸或肼基羧酸而导入的羟胺或肼侧链之间形成。噻唑烷形成可以发生在N端半胱氨酸残基与醛基侧链之间(例如：Chan W.C.et al.(editors)，Fmoc solid phase peptidesynthesis：A practical approach，Oxford University Press，Oxford，2000，p243-263；Novabiochem 2004/5 Catalogue，Reagents for Peptide andHigh-Throughput Synthesis，p.5.2-5.3)。本发明的另一个实施方案是寡聚肽，其中每个单体肽链包含在其侧链中具有硫原子的至少一个氨基酸残基，使得可以通过硫醚桥实现单体肽链之间的共价连接。在通过至少一个硫醚桥连接的那些寡聚肽中，优选两个单体肽链相连接的那些，即二聚体。进一步优选的实施方案是那些寡聚肽，其中单体肽链通过双功能间隔分子互相连接，所述双功能间隔分子选自据有两个硫醇基的有机间隔子、具有两个氨基的有机间隔子、具有两个羧基的有机间隔子和具有一个羧基和一个氨基的有机间隔子。尤其是具有两个单体肽链的那些寡聚肽，即二聚体。
本发明进一步的实施方案是与gp41的HIV融合肽相互作用的寡聚肽，其特征是IC50等于或小于6500nM，如VIR-574(SEQ ID NO.2)或VIR-577(SEQ ID NO.3)，优选IC50等于或小于2000nM，最优选IC50等于或小于800nM，如具有IC50为607nM的VIR-673(SEQ ID NO.4)。本发明的另一些实施方案是编码本发明寡聚肽的单体肽链的核酸，但WO 2004/056871中已经公开的那些核酸除外。因此，WO 2004/056871中编码VIR-674、VIR-675、VIR-676、VIR-677、VIR-678、VIR-679、VIR-680、VIR-681、VIR-682、VIR-683、VIR-684、VIR-685、VIR-686、VIR-687、VIR-688、VIR-689、VIR-690、VIR-691、VIR-692、VIR-693和VIR-694的单体肽链的核酸，其分别对应VIR-166、VIR-175、VIR-261、VIR-273、VIR-274、VIR-344、VIR-345、VIR-348、VIR-352、VIR-353、VIR357、VIR-358、VIR-448、VIR-449、VIR-454、VIR-455、VIR-483、VIR-484、VIR-512、VIR-568和VIR-580，不是本发明的部分。进一步的实施方案是与本发明的这些寡聚肽特异性结合的抗体。所述抗体是特异性的，因为它们识别所述寡聚肽、但不识别分离的单体肽链。因此其抗体结合位点包含该分子的一部分，其不同于单个单体肽链。例如，所述结合位点可以包含两个单体肽链之间的连接。
进一步的实施方案是包含这些寡聚肽、编码这些寡聚肽的单体肽链的核酸(声明排除的除外)、或抗这些寡聚肽的特异性抗体中任何一种的药物。在一个实施方案中，所述药物是在用于口服、静脉、肌肉、鼻内、皮内、皮下和/或鞘内(intrathecal)施用的药物制剂中。进一步的实施方案是包含至少一种其它治疗剂的所述药物。另一个实施方案是所述药物，其中所述至少一种其它治疗剂是病毒蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、融合抑制剂、细胞因子、细胞因子抑制剂、整合酶抑制剂、糖基化抑制剂或病毒mRNA抑制剂等。这些寡聚肽在制造用于治疗HIV感染的药物中的用途是另一个实施方案。还有一个实施方案是用于确定能与HIV的融合肽相互作用的分子的测试，其包含本发明上述寡聚肽的任一种。这些寡聚肽在所述测试中的用途也是一个实施方案。进一步的实施方案是一种诊断剂，其包含上述寡聚肽、核酸或抗体中的任一种，声明排除的除外。再一个实施方案是所述诊断剂在用于检验分离的血浆、组织、尿、***和/或脑脊液中HIV感染水平的测试***中的用途。
具体实施方式
本发明的寡聚肽与公开并描述于WO01/34640中的人血滤出物来源的肽VIRIP(SEQ ID NO.1)相关，还与公开并描述于PCT/EP03/15654中、具有阻止HIV感染的生物活性的肽相关。本发明的肽与WO01/34640和PCT/EP03/15654中公开并描述的肽不同，它们全都是由至少两个单个单体肽链组成的寡聚结构。
所述单体肽链通过至少一个共价键相连接。该共价键可以是二硫键，酰胺键尤其是肽键，硫醚键，醚键或者肟、腙或噻唑烷键。为了产生本发明的寡聚肽，通过氨基酸侧链的活性基团或末端功能基连接至少两个单个单体肽链从而使单体肽链寡聚化。所述单个的单体肽链是化学合成的或者是生物技术生产的，即通过在微生物如细菌例如大肠杆菌、真菌例如酵母菌、和/或培养的哺乳动物细胞中表达编码这些单个肽链的核酸，随后将它们共价连接成寡聚体。寡聚肽也可以合成为接枝聚合结构，其含有氨基酸或含至少两个氨基的基团，所述单体肽链用固相肽合成技术被偶联至其上。这些基团的实例是鸟氨酸、赖氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸(Novabiochem 2004/5 Catalogue，Reagents for Peptide and High-Throughput Synthesis，p.26-29)。
本发明的寡聚肽还包括从单体肽链的重复单元通过间接肽键线性组装的多肽，其中所述重复单元对应于单体肽链。如果具有氨基和羧基的小有机双功能间隔子将Z2与相邻单体肽链的Z1相连接，则出现了间接肽键。
具有公开于PCT/EP03/15654中序列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(VIR-576)的寡聚肽，其中通过两个单体肽链中第6位半胱氨酸残基之间的二硫键实现二聚化，这样的寡聚肽不是本发明的寡聚肽。然而，具有序列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(SEQ ID：NO.56)的二聚体，其中二聚化以任意其它方式实现，尤其是通过谷氨酸残基和具有两个氨基的小双功能连接子中任一个经在谷氨酸残基处形成两个酰胺键而连接两个单体链，这样的二聚体是本发明的部分。作为本发明的一部分还包括具有序列(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(SEQ ID：NO.57)的二聚体，其中通过第16位氨基酸处的赖氨酸残基和具有两个羧基的小双功能连接子实现二聚化，经在所述两个赖氨酸残基处形成两个酰胺键而连接所述两个单体链。
本发明寡聚肽的单体肽链全都与野生型VIRIP(SEQ ID NO.：1)至少在第13位氨基酸处不同，其中VIRIP含有赖氨酸，而本发明寡聚肽的单体肽链在第13位氨基酸处不含赖氨酸残基。除此之外，与VIRIP(SEQ ID NO.：1)相比较，本发明寡聚肽的单体肽链在其20或21个氨基酸中还有另外的氨基酸改变。本发明寡聚肽都具有比VIRIP(SEQ ID NO.1)显著更高的抗HIV活性(以抗两种HIV-1株的IC50测量)本发明寡聚肽的单体肽链基于的是20或21个氨基酸的氨基酸序列，根据Z1和Z2的情况，在其两端有可能延长1-10个氨基酸，其中延长3个氨基酸为优选。无论由于残基Z1而可能的N端延长，此处使用的氨基酸编号总是对应于基本序列的第1-21位氨基酸，使得第1位氨基酸对应于亮氨酸而第21位氨基酸对应于苯丙氨酸或缺失。使用通用氨基酸单字母和三字母代码。如果未专门指出，则使用氨基酸的L-对映体。小字母“p”代表D-脯氨酸。其它D-对映体用“D-”前缀表示。“Tic”代表四氢异喹啉羧酸。“Oic”代表八氢吲哚羧酸。
术语“寡聚肽”表示包含尤其两个、三个或四个单体肽链的肽，这些单体肽链被互相共价连接。优选二聚体，它是由两个共价连接的单体肽链形成的寡聚肽。所述二聚体在单体肽链之间包含至少一个共价键，但也可以具有更多共价键。具有三个单体肽链的寡聚肽被称为三聚体。具有四个单体肽链的寡聚肽被称为四聚体。三聚体中连接共价键的最小数目是至少两个，但也可以更高，而四聚体则包含至少三个共价键。
术语“单体肽链”表示所述寡聚肽的肽单元，是20或21个氨基酸的氨基酸序列，根据Z1和Z2的情况，可能在两末端延长1-10个氨基酸，其中延长3个氨基酸为优选。本发明的寡聚肽包含n个单体肽链。
用式(序列)n表记的术语“寡聚肽”表示由n个互相共价连接的肽形成的分子。如本文所用，很明确“寡聚肽”不受单体肽链之间具体连接类型的限制。例如，连接可以是半胱氨酸桥或涉及赖氨酸侧链的连接。因此术语“寡聚肽”和式(序列)n在本发明中不应被理解为n个氨基酸单体全部经N-和C-端之间的常规肽键相连接。
术语“交联”表示两个单体肽之间的任何分子间共价键，这种共价键不同于一个单体肽的N-端和另一个单体肽的C-端之间的常规肽键。
术语“共价连接”对本领域技术人员很容易理解，表示键，例如酰胺、硫醇基、硫酯、醚基、肟、腙和噻唑烷键。其被引入以生成寡聚肽。具体来说，它表示互相共价连接的两个、三个或四个单体肽链，从而分别产生二聚体、三聚体和四聚体。本发明的寡聚肽被描述为“共价连接”，然而这不要求寡聚肽的每个单体肽链与该寡聚肽中每个另外的单体肽链相连接；二聚体通过至少一个上述化学键共价连接；三聚体通过至少两个上述化学键共价连接，因此第一个单体肽链与第二个单体肽链相连接、以及第二个与第三个单体肽链相连接就足够了；四聚体通过至少三个上述化学键共价连接，因此第一个单体肽链与第二个单体肽链相连接、以及第二个与第三个单体肽链相连接、以及第三个单体肽链与第四个单体肽链相连接就足够了。寡聚肽中单体肽链可以具有相同或不同的氨基酸序列。由相同单体肽链构成的寡聚肽也称为“均一性”寡聚肽，当是二聚体时它们也被称为“同型二聚体”。如果寡聚肽中单体肽链不相同，则采用术语“异质性”表于寡聚肽及其单体肽链。共价键可以是各肽链之间的“直接键”，如二硫键、硫醚键、醚键、酰胺键、肟键、噻唑烷键、腙键，即没有桥接间隔分子。所述肽链也可以通过任何化学性质的间隔子被共价连接(Houben-Weyl，Methods of organic chemistry，Synthesis of peptides and peptidomimetics，Georg Thieme Verlag，Stuttgart2002)，单体肽链则被称为通过“间接键”相连接。优选小有机双功能间隔子，如具有两个硫醇基、具有两个氨基、具有两个羧基的那些以及具有一个羧基和一个氨基的那些。
本文所用术语“疏水氨基酸”对于技术人员很容易理解。具体来说，它表示天然存在的氨基酸-甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和非内源性疏水氨基酸中任何种类。也可以使用模拟天然氨基酸行为的相似的合成非内源性氨基酸，只要抗HIV生物活性不被显著降低即可。
本文所用术语“芳香氨基酸”对于技术人员很容易理解。具体来说，它表示苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和非内源性芳香氨基酸，如1-萘基丙氨酸、3，3-二苯基丙氨酸、对氟苯基丙氨酸、或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸等中任何种类。也可以使用模拟这类氨基酸行为的相似的合成非内源性氨基酸，只要抗HIV生物活性不被显著降低即可。
术语“酸性氨基酸侧链”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示谷氨酸和天冬氨酸以及携带羧酸作为侧链功能基的任何其它天然和非天然氨基酸如2-氨基己二酸的羧酸侧链。
术语“碱性氨基酸侧链”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示赖氨酸、鸟氨酸或携带氨基功能基作为侧链的任何其它天然和非天然氨基酸如二氨基丙酸的侧链氨基。本发明还涉及的具有碱性侧链的氨基酸是低级赖氨酸衍生物，其具有仅三个、二个或仅一个碳原子的更短侧链(与赖氨酸相比)，且侧链携带氨基。
术语“非天然氨基酸”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示不属于20种内源性存在的氨基酸的任意氨基酸，所述内源性存在的氨基酸是：甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。
术语“突变体”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示序列变体，其中一或多个已公开氨基酸被改变，即一或多个氨基酸被另一个氨基酸替换。具体来说，如果所述一或多个氨基酸取代物是被取代氨基酸的D-形式，则与未替换的寡聚肽相比较，该寡聚肽的生物活性未显著降低。引入D-氨基酸可用于例如提高对蛋白裂解酶作用的抗性。本发明的突变体优选与权利要求1的寡聚肽之间有一、二、三或四个氨基酸不同。在一个优选实施方案中，突变是保守的，使得改变后氨基酸的侧链的性质与原始氨基酸相比不会显著改变。突变体也包括序列变体，其中一或多个氨基酸从序列中缺失或被***序列中。
术语“片段”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示序列在N-或C-端被截短的序列变体。在优选实施方案中，所述寡聚肽在N-和/或C-端缺失多达2、4或6个氨基酸。
术语“衍生物”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示化学修饰的寡聚肽。该修饰可以是单个氨基酸替换、多重替换或在肽的N-和C-端、肽的侧链中、肽骨架的Cα-和Nα-原子以及形成骨架肽键的原子处的不同的化学修饰。
术语“酰胺化”很容易被技术人员理解。具体来说它表示寡聚肽的修饰，其中C端羧基被替换为CONR2基，其中R是氢原子或可替换至少一个所述氢原子的任意功能基。
术语“酰基化”很容易被技术人员理解。具体来说它表示这样的寡聚肽，其中除了N-端氨基处和/或氨基侧链处的氨基酸以外其还含有共价连接的羧酸残基。
术语“烷基化”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示在N-端氨基、在任意骨架原子和/或在侧链的任意功能基处用不同长度和结构的烷基修饰的寡聚肽。
术语“硫酸化”很容易被技术人员理解。具体来说它表示在酪氨酸或取代酪氨酸衍生物残基的羟基处携带硫酸结构的寡聚肽。
术语“PEG化”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示含有共价连接的聚乙二醇(PEG)结构的肽，所述聚乙二醇结构由聚乙二醇的至少两个典型重复单元-CH2-CH2-O-组成。优选所谓的mini-PEG基。PEG基团可以具有高达20kDa的分子量，并可以直接或经N-和/或C-端和/或侧链功能基处的间隔基团结合至肽序列中的不同功能基处。间隔基团选自双功能烃链之中，该双功能烃链的特征是二、三、四、五、六、七、八或九个碳原子的骨架以及两个功能基，如两个氨基、两个羧基、或一个氨基和一个羧基。一或多个PEG基团可以包含在肽的不同位点。具体来说，优选在肽C端侧的mini-PEG，其后是半胱氨酸残基。
术语“磷酸化”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示这样的寡聚肽，其中苏氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸、酪氨酸和/或任意其它非天然羟基氨基酸的侧链羟基被磷酸基酯化。
术语“糖基化”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示含单体和/或寡聚碳水化合物结构的寡聚肽，所述碳水化合物结构通过糖或醇羟基连接至丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和/或非天然氨基酸的侧链。
术语“环状”很容易被技术人员理解。具体来说，它表示在至少一个其单体肽链中包含环状结构基序或者在至少两个单体肽链处包括环状结构基序的寡聚肽。环化可以通过骨架环化或通过将一个氨基酸的侧链连接同一分子中不同氨基酸的侧链来实现。在本发明一个优选实施方案中，两个半胱氨酸残基、或一个羧酸侧链和一个含氨基的侧链分别通过二硫键或酰胺键形成环状基序。
表述“抗HIV感染的生物活性”表示寡聚肽能至少干扰或阻止病毒进入哺乳动物细胞的能力。更具体地，它表示与HIV gp41的融合肽相互作用的能力。抗HIV感染生物活性的一种量度是IC50值。优选地，本发明寡聚肽抗HIV感染的生物活性是其IC50值低于野生型VIRIP的IC50值的水平。
当与原始VIRIP(SEQ ID NO.：1)或单体类似物比较时，本发明寡聚肽在抗HIV感染的抗病毒活性以及血浆中的稳定性方面显示有利的性质。具体来说，二聚肽具有出色的性质，并因此是优选的。为了获得本发明的二聚肽，单体肽链被化学连接，在两个肽链之间引入共价键。所述共价连接可以是侧链功能基如半胱氨酸巯基之间的直接键，或者是涉及肽链之间的间隔子的键，正如两个相同链的肽结合至赖氨酸残基的两个氨基时的情形一样。后者经常被称为最小形式的赖氨酸核心树状分子(dendrimer)(Sadler K.，J.Biotechnology，2002，90，195-229)。该两个肽链也可以通过两条单个肽链之间的酰胺键连接，这通过一条肽链的侧链氨基与另一条链的侧链羧基之间的共价键来实现。该连接也可以通过使用小的双功能有机间隔分子来实现，所述分子通过共价键合至一条肽链的羧基侧链和共价键合至另一条肽链的侧链氨基从而将两条肽链交联。而且，如果间隔分子含有两个酸功能基，该有机间隔分子可用于通过氨基功能基交联两个相同的肽链；或者如果间隔分子含有两个氨基功能基，则可用于通过羧基功能基连接两条相同的肽链(Pennington et al.(editors)，Peptide synthesis protocols，Humana Press，Totowa 1994)。所述单体的两条肽链也可以通过用天然或非天然氨基酸的活性侧链形成肟、腙和噻唑烷来连接(Rose K.，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，30-33；Shao，J.& Tam J.P.，1995，J.Am.Chem.Soc.，117，3893-3899；Fisch I.etal，Bioconjugate Chem.，1992，3，147-153；Liu C.-F.& Tam J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，6584-6588)。此外，本发明的寡聚肽可通过含单体肽链重复单元的线性寡聚肽的固相肽合成来获得。
与野生型VIRIP(SEQ ID NO.1)相比，本发明的寡聚肽，尤其是本发明的二聚体肽，在结构和生物学上更稳定，并具有更高的活性。它们显示出半衰期增加，导致更高的血浆浓度。此外，它们引起抗病毒活性肽链在作用位点处的局部浓度增加。本发明的寡聚肽因此是更有利于与病毒受体分子相互作用的分子，引起更有效阻断病毒进入。
还发现通过与野生型VIRIP(SEQ ID NO.1)相比较特异性改变单体肽链的氨基酸序列，获得了抗HIV活性显著增加的寡聚肽。活性的最显著增加在这样的寡聚肽中观察到，其中在单体肽链中第10位L-脯氨酸替换为D-脯氨酸，和/或在第6和11位氨基酸处引入两个半胱氨酸，和/或其中第13位带正电的赖氨酸被交换为具有疏水或芳香侧链的氨基酸。可以相信与野生型VIRIP(SEQ ID NO.1)相比较活性的增加是由于结构的改变。已知半胱氨酸桥影响结构并显著降低肽的柔性，另外引入D-脯氨酸引起肽的二级结构元件发生变化并因而改变了肽的不同部分相互之间的定向。而且，赖氨酸交换为不带电的疏水或芳香性氨基酸将改变其结构，因为带正电的赖氨酸侧链与同一分子中第2和11位带负电的氨基酸、或者与受体分子的带负电部分的可能相互作用被改变。当通过替换为赖氨酸或天冬氨酸而将寡聚肽的单体肽链中第3位丙氨酸残基交换为带正电或负电的残基时，进一步观察到抗HIV活性显著增加。在第3位引入带电残基可以通过加强的静电或偶极力而增强与受体分子的相应部分的结合强度。也已经发现，将寡聚肽的单体肽链中第7和/或15位氨基酸残基交换为小氨基酸残基，尤其是甘氨酸，可以增加本发明寡聚肽的抗HIV活性。甘氨酸残基是立***阻最小的残基，当与受体分子结合时或者当因与受体分子结合的需要而自身形成聚集体时允许最适的肽内部结构排布。所述取代可以组合在本发明寡聚肽的单体肽链中。
本发明肽的单体链可以化学合成或通过重组表达编码根据本发明单体肽链的核酸来生产。由于其大小较小，即本发明寡聚肽所含单体肽链中氨基酸数目较小，可以利用全肽合成技术来化学合成这种单体肽链。合成HIV融合抑制剂T-20要求合成三个个体片段并随后连接这三个片段来产生最终产物T-20，与之相比较，本发明的单体肽链可以通过逐步固相方法或通过溶液相化学大规模合成。因此获得本发明寡聚肽的单体肽链的方法是直截了当的，故本发明寡聚肽的制造成本较低。单体肽链的共价连接也是直截了当的，即不需要困难的化学反应，因此连接反应不会很大影响包含寡聚肽的最终产物的成本。
本发明寡聚肽的进一步优点是在宽pH范围(pH2-8.5)和不同离子强度的溶剂中的溶解性和稳定性。尤其要强调它们在血浆中的稳定性。可以用固相技术在固体支持物上或在溶液相中进行化学合成，两者都是技术人员已知的标准方法。本发明寡聚肽的单体肽链也可以通过连接两个或更多侧链保护或侧链未保护片段来合成，这是技术人员已知的标准方法(Tam J.P.，Biopolymers，2001，60，194-205)。本发明寡聚肽的单体肽链或其片段的固相合成可以用Fmoc/tBu-或Boc/Bzl保护模式的氨基酸来进行。可以使用不在标准Fmoc保护方案中的其它保护基。通过色谱方法如反相、离子交换或大小排阻色谱法，可以实现合成单体肽链和寡聚肽的纯化。此处提到的化学合成本发明单体肽链和寡聚肽的方法在几个综述出版物中有评述(实例：ChanW.C.et al.(编)，Fmoc solid phase peptide synthesis：A practical approach，Oxford University Press，Oxford，2000；Seewald N.et al.，Peptides：biology andchemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002；Goodman M.，Houben-Weyl，Methodsof organic chemistry，Synthesis of peptides and peptidomimetics，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart 2002)。
将二硫键引入本发明寡聚肽的单体肽链中可以通过将氧化性化学方法用于含至少两个半胱氨酸残基的单体肽链来实现，其中这些方法是技术人员已知的(Pennington et al.(editors)，Peptide synthesis protocols，HumanaPress，Totowa 1994；Chan W.C.et al.(编)，Fmoc solid phase peptidesynthesis：A practical approach，Oxford University Press，Oxford，2000)。本发明寡聚肽的单体肽链之间的二硫键可以通过氧化性处理从含至少一个未保护半胱氨酸残基的还原前体单体肽链中产生，这些单体肽链是从固相或溶液合成中获得的。作为氧化剂，可以使用氧、二甲基亚砜、三价铁(III)盐、碘、或其它。作为替代，本发明寡聚肽的单体肽链的二硫键可以从在对应半胱氨酸残基处含保护基的前体引入肽链。作为保护基，可以使用乙酰氨基甲基(acetamidomethyl)、叔丁基、S-叔丁基或其它。可以用试剂如碘、膦或其它实施切除保护基和形成链内二硫键。
除了具有二硫键的那些以外，所述寡聚肽的环状单体肽链可以通过单体肽链的骨架环化或者通过至少一个活性侧链基如氨基、羧基、羟基或巯基和同一分子中存在的任意其它活性基团之间的化学键而获得，正如技术人员所知(Li et al.，Curr.Top.Med.Chem.，2002，2，325-341；Tam J.P.，Biopolymers，2001，60，194-205；Goodman M.，Houben-Weyl，Methods of organic chemistry，Synthesis of peptides and peptidomimetics，Georg Thieme Verlag，Stuttgart2002)。
通过经不同类型化学键连接两条肽链可以获得单体肽链的共价连接的寡聚物。通过或者经活化的半胱氨酸或者不对半胱氨酸进行任何预活化来偶联两条肽链从而合成二硫键连接的寡聚物(Sacca B.et al.，J.Pept.Sci.，2002，8，192-204；Seewald N.et al.，Peptides：biology and chemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002)。根据本领域技术人员已知以及描述于文献中的不同方法可以引入两条肽链之间的硫醚键和醚键以及肽键(Seewald N.et al.，Peptides：biology and chemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002)。通过将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH偶联至固相支持物可以合成赖氨酸核心树枝状分子。在氨基酸去保护以后，固相肽合成生成寡聚肽(Seewald N.et al.，Peptides：biology and chemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002；Chan W.C.(editors)Fmoc solid phase peptide synthesis：A practical approach，OxfordUniversity Press，Oxford 2000)。羧端赖氨酸残基和肽链之间可以放置另外的赖氨酸残基。赖氨酸残基可以替换为含两个氨基的任意的其它氨基酸如鸟氨酸和在侧链中携带氨基的任何非天然氨基酸如二氨基丙酸。
在本发明的一个优选寡聚肽中，两条肽链通过两条肽链之间的酰胺键的连接是通过一条肽链的侧链氨基与另一条侧链的侧链羧基之间的共价键实现的。该连接也可以通过使用小双功能有机间隔分子来实现，它通过共价结合至一条肽链的羧基侧链和共价结合至另一条肽链的侧链氨基而将两条肽链交联。而且，如果间隔分子含有两个酸功能基，该有机间隔分子可用于通过氨基功能基交联两个相同的肽链；或者如果间隔分子含有两个氨基功能基，则可用于通过羧基功能基连接两条相同的肽链(Pennington et al.(editors)，Peptide synthesis protocols，Humana Press，Totowa 1994)。
两条单体肽链的连接，包括用天然或非天然氨基酸形成肟、腙或噻唑烷，可以通过将具有羟胺或肼基的单体肽连接至携带醛基的肽而实现，或者通过将具有N-端半胱氨酸的肽与肽醛相耦联而实现，这些方法是技术人员已知的并已描述于文献中(Chan W.C.et al.(编)，Fmoc solid phase peptide synthesis：Apractical approach，Oxford University Press，Oxford，2000，p 243-263；Novabiochem 2004/5 Catalog，Reagents for Peptide and High-ThroughputSynthesis，p.5.2-5.3；Rose K.，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，30-33；Shao，J.&Tam J.P.，1995，J.Am.Chem.Soc.，117，3893-3899；Fisch I.，et al.，BioconjugateChem.，1992，3，147-153；Liu C.-F.& Tam J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91，6584-6588)。
在下段中简要描述了本发明的各种寡聚肽如何共价连接。这些肽都表现为二聚体。
VIR-674：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-675：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR676：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-677：通过一条单体肽链的Cys7和Cys12分别与第二条相同单体肽链的Cys7和Cys12之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-678：通过一条单体肽链的Cys7和Cys12分别与第二条相同单体肽链的Cys7和Cys12之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-679：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-680：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-681：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-682：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-683：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-684：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-685：通过一条单体肽链的Cys6和Cys11分别与第二条相同单体肽链的Cys6和Cys11之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-686：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-687：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-689：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-690：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-691：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-692：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-693：通过一条单体肽链的Cys8和Cys13分别与第二条相同单体肽链的Cys8和Cys13之间的两个半胱氨酸桥相连接。
VIR-694：通过一条单体肽链的Glu11与第二条相同单体肽链的Lys16之间的酰胺键相连接。
VIR-695：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-696：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-697：通过一条单体肽链的Cys7与第二条相同单体肽链的Cys7之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-698：通过一条单体肽链的Cys7与第二条相同单体肽链的Cys7之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-699：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-700：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-701：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-702：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-703：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-704：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-705：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-706：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-707：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-708：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-709：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-710：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-711：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-712：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-713：通过一条单体肽链的Cys8与第二条相同单体肽链的Cys8之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-714：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-715：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-716：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-717：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-718：通过赖氨酸核心树状分子相连接。
VIR-719：通过一条单体肽链的Cys6与第二条相同单体肽链的Cys6之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-720：通过两条单体肽链的羧端Cys残基之间的半胱氨酸桥相连接。
VIR-721：通过一条单体肽链的Cys7与第二条相同单体肽链的Cys7之间的半胱氨酸桥相连接，其中除所述半胱氨酸桥之外所述第一条单体肽链还含有Cys6和Cys11之间的分子内半胱氨酸桥，以及除所述半胱氨酸桥之外所述第二条单体肽链还含有Cys6和Cys11之间的分子内半胱氨酸桥，
VIR-722：通过两条单体肽链的羧端半胱氨酸残基之间的半胱氨酸桥相连接，两条链都含有其Cys6和Cys11之间的分子内半胱氨酸桥。
VIR-723：通过一条单体肽链的Cys6和羧端Cys残基分别与第二条相同单体肽链的Cys6和羧端Cys残基之间的两个半胱氨酸桥相连接。如果这些寡聚肽要携带进一步修饰，则单体肽链如以下所述在二聚化之前或更一般意义上在寡聚化之前被修饰。
通过用携带酰胺连接子的树脂进行固相肽合成来获得酰胺化肽单体，其中肽链被组装在树脂的酰胺连接子上。酸切割所合成的肽得到肽酰胺。在溶液相合成中，当C-端氨基酸用作构建模块时获得酰胺化肽，其中构建模块在C-端具有预先形成的羧酰胺。(Chan W.C.(editors)Fmoc solid phase peptidesynthesis：A practical approach，Oxford University Press，Oxford 2000)。
技术人员通过用来源于羧酸的活化酰基化试剂如酰卤或羧酸酐或其它活性羰基化合物将具有游离氨基或羟基的肽转化为相应的酰化肽，可以获得酰化肽单体。作为替代，可以用经膦阳离子或脲阳离子型化合物原位活化的游离羧酸进行酰化(Greene T.W.，Protective groups in organic chemistry，JohnWiley & Sons，New York，1991；Kocienski P.，Protecting groups，Thieme-Verlag，Stuttgart 1994；Seewald N.et al.，Peptides：biology and chemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002)。
通过在进行固相或溶液中的肽合成时掺入预先烷基化的氨基酸构建模块可以获得烷基化肽单体。这种氨基酸可以用技术人员已知的标准活化方案偶联至肽链上(Chan W.C.(编)Fmoc solid phase peptide synthesis：A practicalapproach，Oxford University Press，Oxford 2000)。也可以在组装肽链以后通过用技术人员已知的适当烷基化方法进行烷基化(Greene T.W.，Protectivegroups in organic chemistry，John Wiley & Sons，New York，1991；Kocienski P.，Protecting groups，Thieme-Verlag，Stuttgart 1994)。这些方法可以应用于活性基团，如部分被保护肽中肽骨架的氨基-、羟基-、硫代-和肽键。
通过在固相或溶液肽合成中使用酪氨酸或酪氨酸衍生物的预先硫酸化的构建模块来获得硫酸化肽。当高度酸敏感树脂如2-氯三苯甲基树脂用于合成时，在从树脂上切割肽期间，O-硫酸酯保持连接在羟基上(Seewald N.et al.，Peptides：biology and chemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002)。
PEG化肽含有结合至肽的功能基上的PEG残基。PEG残基的特征是具有重复单元-CH2-CH2O-的亲水线性或支链聚合物链。在肽链组装以后用合适的功能改性的含PEG的活性物质将PEG残基引入肽中。技术人员通过不同活化方法可以将多种活化PEG基团连接至肽的不同侧链或末端功能基团，如氨基、羧基、羟基和硫代基(Veronese F.M.et al.，Bioconjug.Chem.，2001，12，62-70；Veronese F.M.，Biomaterials，2001，22，405-417)。
磷酸化肽可以通过固相或溶液相肽合成来合成。通常通过由技术人员用磷酸化羟基氨基酸构建模块和/或通过链组装后磷酸化具有一或多个游离羟基功能基的被保护肽来进行磷酸化肽的合成(Murray J.S.，Biopolymers，2001，60，3-31；Chan W.C.et al.(编)，Fmoc solid phase peptide synthesis：Apractical approach，Oxford University Press，Oxford，2000；Seewald N.et al.，Peptides：biology and chemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002)。
技术人员用可掺入固相或溶液相肽合成的糖基化氨基酸构建模块或者通过总体性链组装后糖基化方法可以获得糖基化肽(Davis B.G.，Chem.Rev.，2002，102，579-602；Chan W.C.et al.(编)，Fmoc solid phase peptide synthesis：Apractical approach，Oxford University Press，Oxford，2000；Seewald N.et al.，Peptides：biology and chemistry，Wiley-VCH，Weinheim，2002)。
本发明也涉及编码根据本发明寡聚肽的单体肽链的核酸分子。优选的核酸分子是DNA和RNA，尤其是cDNA和mRNA。
本发明的主题还包括特异性结合本发明肽的抗体。术语“特异性”对于技术人员很容易理解。具体来说，它表示所述抗体不结合或基本不结合不是本发明肽的相关肽如VIRIP。本领域技术人员通过常规方法可获得抗本发明肽的抗体，并可通过已知筛选方法选择本发明的特异性抗体。
本发明涉及与HIV的包膜蛋白gp41的N-端区域特异性相互作用并结合的寡聚肽。术语“相互作用”和“结合”很容易被技术人员理解。
通过这种结合和相互作用，本发明寡聚肽可阻断HIV颗粒感染宿主细胞。本发明也涉及与对应于HIV gp41的融合肽的合成肽相结合的寡聚肽。本领域技术人员通过应用定量结构/活性关系(QSAR)测试来检测任一种本发明寡聚肽与HIV gp41的合成融合肽的结合和相互作用。这些测试包括但不限于检测对合成融合肽的溶血作用的抑制(Mobley P.W.et al.，Biochim.Biophys.Acta，1992，1139，251-256；Gordon L.，Biochim.Biophys.Acta，1992，1139，257-274)、微量热法(Gohlke H.et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，2002，41，2644-2676)、或NMR波谱技术，其可以是化学位移滴定试验、饱和转移差异波谱或或二维技术(Meyer et al.，Ernst Schering Res.Found.Workshop，2004，44，149-167)。
本发明还涉及含本发明寡聚肽、核酸或抗体的药物。所述药物优选在用于口服、静脉、肌肉、皮内、皮下和/或鞘内施用的医用制剂中提供。
在一个优选实施方案中，所述药物包含至少一种其它治疗剂。所述至少一种其它治疗剂可以是病毒蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、融合抑制剂、细胞因子、细胞因子抑制剂、糖基化抑制剂或病毒mRNA抑制剂等。优选地，这些抑制剂针对的是HIV。这些联合治疗在艾滋病治疗中高度相关。本发明的肽、核酸和抗体优选用于制造用于治疗HIV感染的药物。这包括逆转录病毒HIV(人免疫缺陷病毒)的所有已知株系，尤其是HIV-1的最常见株系。HIV-1与艾滋病发作相关。
本发明还涉及包含本发明寡聚肽、核酸和/和抗体的诊断剂。所述诊断剂可以用于检验分离的血浆、血清、组织、尿、***和/和脑脊液中HIV感染的测试***。
本发明也涉及这样的测试***，其涉及至少一种本发明寡聚肽作为鉴定与HIV包膜蛋白gp41、尤其是gp41的N-端融合肽相结合的物质的工具。这些测试可以是适于测量任何物质与所述融合肽相结合的***，所述融合肽或者整合在分离的、病毒或任何其它形式的完整gp41蛋白中，或者是从gp41的N-末端开始具有多达35个氨基酸残基的合成形式中。所述测试可以是任何波谱、细胞或放射性配体测试，在这些测试中，测量物质竞争性地与至少一种本发明寡聚肽结合。作为使用本发明寡聚肽作为工具的这种竞争测试的结果，可鉴定到对HIV gp41有高亲和力和结合位点特异性的物质。这些物质具有改进的阻断HIV颗粒感染细胞的能力。它们可用作治愈艾滋病的改进的治疗剂。
化学合成本发明的几种寡聚肽以后，分析所得产物的产率和分子量。对于所有肽都实现了高产率并确认了理论分子量(见表1)，反映了合成工艺的成功。本发明肽被用于多种测试中。
第一组试验涉及本发明肽抑制HIV感染的功效(见表2)。所述肽在HIV-1株系NL4-3上进行测试并计算IC50值。具有相当大的活性的肽是IC50等于或小于2000nM的那些肽(VIR-673，SEQ ID NO.4)，IC50等于或小于6500nM的那些肽(VIR-574，SEQ ID NO.2；VIR-577，SEQ ID NO.3)。如果分别用HIV株系NL4-3进行测试，则与天然VIRIP(SEQ ID NO.1)相比较，测试的所述寡聚肽的活性有所增加；并发现天然VIRIP(SEQ ID NO.1)的IC50是15,000。综合表2的结果可看出，与天然VIRIP相比较，本发明肽的抗HIV活性显示增加5-22倍。
第二组试验涉及本发明肽在哺乳动物血浆中的稳定性。向从不同动物和人分离的血浆中掺入规定浓度的各种本发明肽。所述肽显示其在人血浆中的半衰期和代谢有相当大的改进。所述肽还显示在活动物血浆中的稳定性也被提高。
简而言之，本发明肽的特征在于具有抗HIV活性，以IC50表示，其抗HIV活性等于或小于6500nM，其中活性最大的肽具有小于2000nM的IC50。也发现个别的本发明肽具有小于800nM的IC50(见表1)。本发明肽的特征还在于其血浆中的半衰期有所提高。
实施例1：本发明肽的化学合成
A.合成单体肽链：
用固相肽合成原理和Fmoc或Boc保护基策略化学合成根据本发明寡聚肽的单体肽链(Atherton and Sheppard，1989，Solid Phase Peptide Synthesis，IRL Press；Merrifield，1986，Solid phase synthesis，Science 232，341-347)，但也可以用溶液相合成或者通过偶联本发明肽的被保护或未被保护的片段来进行合成。
作为实例，在此描述用芴甲氧羰基(Fmoc)-保护的氨基酸在自动肽合成仪433A(Applied Biosystems)上合成寡聚肽VIR-577的单体肽链[氨基酸序列：LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF](SEQ ID NO.55)。所述单体肽的合成用预装载的Fmoc-Phe-Wang树脂在0.1mmol规模进行，所用树脂的负载能力为1mmol/g树脂，其中用标准HBTU[(2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲阳离子-六氟磷酸盐]/HOBt(1-羟基苯并***)活化，加帽循环使用溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)的乙酸酐。所用氨基酸构建模块的侧链如下进行保护：Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Cys(Trt)。肽链组装的酰化步骤进行15-60分钟，每步酰化以后用吡啶的NMP溶液对Fmoc基团脱保护。第1位亮氨酸去保护以后，用NMP、2-丙醇和二氯甲烷洗涤所得受保护的肽酰树脂，然后干燥。室温下用三氟乙酸/二巯基乙烷/水(94∶3∶3，体积/体积/体积，40ml/g树脂)的新鲜混合物处理干树脂2-4.5小时。将混合物过滤入冰冷的叔丁基甲基醚(TBME)中以沉淀肽。所得沉淀用离心分离，用TBME洗涤并真空干燥。用C18分析HPLC和电喷雾质谱法(API 100，Perkin Elmer)分析粗制肽(图1+2)。
B.单体肽链寡聚化为二聚体VIR-577：
VIR-577的粗制单体肽链以肽浓度4mg/ml溶于CH3CN/H2O(1∶4)中。向溶液中加入8％DMSO，用稀氨水调节pH至约8。室温下剧烈搅拌溶液过夜。18小时后用乙酸酸化粗混合物，并加载到制备型Vydac C18柱(47×300mm，15-20μm，流速40ml/min；溶剂A，0.07体积％TFA；溶剂B，0.07体积％TFA的乙腈/H2O 80∶20(体积％)溶液；在215nm进行UV检测；梯度如下：50分钟内45-70体积％B)上。将经质谱(API 100，Perkin Elmer)和C18分析HPLC检测或者作为替代经毛细管区带电泳检测为含期望的纯寡聚肽的级分合并并冷冻干燥。冻干的寡聚肽用于经C18分析HPLC(图3)、毛细管区带电泳和质谱(图4)分析其纯度和分子量。该肽(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2的产量是7mg。
C.合成赖氨酸核心树状分子：
对于赖氨酸核心树状分子的合成，使用Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Wang-Ala树脂。Fmoc-Lys(Fmoc)-衍生物或Fmoc-Orn(Fmoc)衍生物被偶联到第一个氨基酸上。用20％哌啶的NMP溶液去保护Fmoc以后，树脂具有两个功能性氨基，用标准Fmoc循环将线性VIRIP肽合成到其上。通过将另一个Fmoc-Lys(Fmoc)或Fmoc-Orn(Fmoc)衍生物偶联到该赖氨酸核心，可以容易地延长该核心，产生四个游离氨基用于线性肽合成。作为实例，在此描述用芴甲氧羰基(Fmoc)-保护的氨基酸在自动肽合成仪433A(Applied Biosystems)上合成VIR-574[氨基酸序列：(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G](SEQ ID NO.2)。所述合成用预装载的Fmoc-Gly-Wang树脂在0.1mmol规模进行，所用树脂的负载能力为0.68mmol/g树脂，其中用标准HBTU[(2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲阳离子-六氟磷酸盐]/HOBt(1-羟基苯并***)活化，加帽循环使用溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)的乙酸酐。所用氨基酸构建模块的侧链如下进行保护：Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Lys(Fmoc)、Ser(tBu)。肽链组装的酰化步骤进行15-60分钟，每步酰化以后用哌啶的NMP溶液对Fmoc基团去保护。对第1位亮氨酸去保护以后，用NMP、2-丙醇和二氯甲烷洗涤所得受保护的肽酰树脂，然后干燥。室温下用三氟乙酸/二巯基乙烷/水(94∶3∶3，体积/体积/体积，40ml/g树脂)的新鲜混合物处理干树脂2-4.5小时。将混合物过滤入冰冷的叔丁基甲基醚(TBME)中以沉淀肽。所得沉淀物经离心分离，用TBME洗涤并真空干燥。粗制寡聚肽溶于稀乙酸中并加载到制备型VydacC18柱(47×300mm，15-20μm，流速40ml/min；溶剂A，0.07体积％TFA；溶剂B，0.07体积％TFA的乙腈/H2O 80∶20(体积％)溶液；在215nm进行UV检测；梯度如下：50分钟内45-70体积％B)上。将经质谱(API 100，PerkinElmer)和C18分析HPLC检测或者作为替代经毛细管区带电泳检测为含期望的纯寡聚肽的级分合并并冷冻干燥。冻干的寡聚肽用于经C18分析HPLC(图5)、毛细管区带电泳和质谱(图6)分析其纯度和分子量。
也对合成工艺进行修改以适应小规模多重肽合成。用空气在pH7.5-8.5、用或不用二甲基亚砜、以及随后用碘处理具有两个分子间二硫键的本发明寡聚肽以促进形成半胱胺酸桥，从具有一个乙酰氨基甲基保护的半胱氨酸和一个未被保护的半胱氨酸的前体开始形成二聚体。
D.合成在半胱氨酸处具有Acm保护的单体肽链：
用固相肽合成原理和Fmoc或Boc保护基策略化学合成根据本发明寡聚肽的单体肽链(Atherton and Sheppard，1989，Solid Phase Peptide Synthesis，IRL Press；Merrifield，1986，Solid phase synthesis，Science 232，341-347)，但也可以用溶液相合成或者通过偶联根据本发明肽的被保护或未被保护片段来进行合成。
作为实例，在此描述用芴甲氧羰基(Fmoc)-保护氨基酸在自动肽合成仪433A(Applied Biosystems)上合成寡聚肽VIR-705的单体Acm保护的肽链[氨基酸序列：LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF](SEQ ID NO.36)。所述单体肽的合成用预装载的Fmoc-Phe-Wang树脂在0.1mmol规模进行，所用树脂的负载能力为1mmol/g树脂，其中用标准HBTU[(2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲阳离子-六氟磷酸盐]/HOBt(1-羟基苯并***)活化，加帽循环使用溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)的乙酸酐。所用氨基酸构建模块的侧链如下进行保护：Glu(OtBu)、Asn(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Cys(Acm)。肽链组装的酰化步骤进行15-60分钟，每步酰化以后用哌啶的NMP溶液对Fmoc基团去保护。对第1位亮氨酸去保护以后，用NMP、2-丙醇和二氯甲烷洗涤所得受保护的肽酰树脂，然后干燥。室温下用三氟乙酸/二巯基乙烷/水(94∶3∶3，体积/体积/体积，40ml/g树脂)的新鲜混合物处理干树脂2-4.5小时。将混合物过滤入冰冷的叔丁基甲基醚(TBME)中以沉淀肽。所得沉淀用离心分离，用TBME洗涤并真空干燥。用C18分析HPLC和电喷雾质谱(API 100，Perkin Elmer)分析粗制肽(图8+9)。
E.单体Acm保护的肽链寡聚化为二聚体VIR-705：
将VIR-577的粗制单体肽链以肽浓度6mg/ml溶于HOAc/H2O(4∶1)中。向溶液中加入来自HOAc中的0.05M I2溶液的4当量碘。室温下剧烈搅拌溶液60分钟，剩余I2用抗坏血酸溶液还原。用5体积水稀释粗混合物，并加载到制备型Vydac C18柱(47×300mm，15-20μm，流速40ml/min；溶剂A，0.07体积％TFA；溶剂B，0.07体积％TFA的乙腈/H2O 80∶20(体积％)溶液；在215nm进行UV检测；梯度如下：50分钟内45-70体积％B)上。将经质谱(API 100，Perkin Elmer)和C18分析HPLC检测或者作为替代经毛细管区带电泳检测为含期望的纯寡聚肽的级分合并并冷冻干燥。冻干的寡聚肽用于经C18分析HPLC(图10)、毛细管区带电泳和质谱(图11)分析其纯度和分子量。该肽(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)2(SEQ ID NO.36)的产量是97mg。
对根据本发明寡聚肽的合成工艺进行修改以适应从0.5至20mmol范围的更大规模，获得1g-5g量的纯化的本发明肽。
使用这些通用合成策略，合成表1所示寡聚肽等，经色谱方法纯化至高达98％的程度并进行分析：
表1：合成寡肽的产率和分子量
  肽   产率[mg]   分子量(计算)   分子量(质谱测定)
  VIR-574VIR-577VIR-673VIR-705VIR-706VIR-712VIR-716VIR-717   5749570696873   4726.44589.65052.04549.54551.44529.54643.74617.5   4726.84590.05052.94549.94551.34529.74644.34617.7
VIR-577是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第7位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-574是赖氨酸核心连接的同型二聚体。VIR-673是二硫键键合的同型二聚体，具有半胱氨酸残基和在半胱氨酸和肽序列之间的PEG间隔子。VIR-705是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-706是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-712是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-716是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-717是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。
实施例2：用本发明寡聚肽抑制HIV感染
表达主要的CD4受体以及主要的HIV-1进入辅因子CXCR4和CCR5的P4-CCR5指示细胞(Charneau et al.，1994；Journal of Molecular Biology241，651-662)被用于评价本发明的寡聚肽是否是HIV-1感染的强效抑制剂。这些细胞含有在HIV-1启动子控制之下的β-半乳糖苷酶报告基因。因此，β-半乳糖苷酶报告基因的活化允许测量HIV-1感染效率并因此允许量化HIV-1抑制剂的强度(Detheux M.et al.，2000；Journal of Experimental Medicine 192，1501-1508；Münch et al.，2002；Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46，982-990)。
为进行典型的感染测试，将P4-CCR5细胞(Charneau et al.，1994；Journal of Molecular Biology 241，651-662；Charneau et al.，Virology.1994205，247-53)维持于补充了10体积％FCS的RPMI 1640培养基中。该细胞系共表达CD4以及HIV-1共受体CCR5和CXCR4并含有在HIV-1启动子控制之下的β-半乳糖苷酶报告基因。用已描述的钙共沉淀方法产生病毒原液(Detheux et al.，J Exp Med.192：1501-8；2000)，用通过NIH AIDS试剂项目获得的HIV p24 ELISA试剂盒量化p24抗原水平。将细胞接种于平底96孔板中，培养过夜，并与不同剂量的肽一起孵育2小时，然后用在总体积50ml介质中含1ng p24抗原的病毒进行感染。过夜孵育以后，洗涤细胞两次，在不含抑制性肽的新鲜培养基中培养。感染后3天裂解细胞，根据制造商推荐用Galacto-Light PlusTM化学发光报告基因测试试剂盒(Tropix，Bedford，MA)定量感染性。所有感染重复进行5次。
该测试的结果表明，与VIRIP相比较，本发明的寡聚肽具有大大增强的抗HIV-1活性。本发明的寡聚肽抑制X4向性的HIV-1 NL4-3的感染高达22倍(表2)。这些数据表明，野生型VIRIP序列的寡聚化和特异性修饰大大增强了本发明寡聚肽的抗HIV-1强度。下面提供从所述感染测试中获得的本发明肽的IC50值。
表2：氨基酸序列和抗HIV活性
  肽   氨基酸序列   SEOID NO.   IC50NL4-3[nM]
  VIR-574VIR-577VIR-673VIR-705VIR-706VIR-712VIR-716VIR-717   (LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-minIPEG-C-amide)2(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)2(LEAIPCGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2(N-Me-LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(N-Me-LEKIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(N-Me-LEDIPCSIPPEFLFGKPFVF)2   2343637434748   3085327066448474195182635
VIR-577是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第7位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-574是赖氨酸核心连接的同型二聚体。VIR-673是二硫键键合的同型二聚体，具有半胱氨酸残基以及在半胱氨酸和肽序列之间的PEG间隔子。VIR-705是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-706是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-712是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-716是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。VIR-717是同型二聚体；分子间二硫键桥出现在第6位氨基酸处的半胱氨酸上。
附图说明
图1：
VIR-577单体[LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF](SEQ ID NO.55)的C18HPLC曲线。条件：Vydac C18(4.6×250mm，300，5μm，流速：0.8ml/min，梯度：30分钟内10-70体积％B，缓冲液A：0.07体积％TFA，缓冲液B：0.05体积％TFA，80体积％乙腈)。
图2：
VIR-577单体[LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF](SEQ ID NO.55)的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)。用Sciex API 100质谱仪记录质谱图。标出了分子离子[M+2H]2+(m/z 1148.5)和[M+1H]1+(m/z 2296.5)。
图3：
VIR-577[(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2](SEQ ID NO.3)的C18HPLC曲线。条件：Vydac C18(4.6×250mm，300，5μm，流速：0.8ml/min，梯度：30分钟内10-70体积％B，缓冲液A：0.07体积％TFA，缓冲液B：0.05体积％TFA，80体积％乙腈)。
图4：
VIR-577[(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2](SEQ ID NO.3)的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)。用Sciex API 100质谱仪记录质谱图。标出了分子离子[M+4H]4+(m/z 1148.5)、[M+3H]3+(m/z 1531.0)和[M+2H]2+(m/z 2294.5)。
图5：
VIR-574[(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G](SEQ ID NO.2)的C18HPLC曲线。条件：Vydac C18(4.6×250mm，300，5μm，流速：0.8ml/min，梯度：30分钟内10-70体积％B，缓冲液A：0.07体积％TFA，缓冲液B：0.05体积％TFA，80体积％乙腈)。
图6：
VIR-577[(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G](SEQ ID NO.2)的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)。用Sciex API 100质谱仪记录质谱图。标出了分子离子[M+4H]4+(m/z 1183.0)、[M+3H]3+(m/z 1576.5)和[M+2H]2+(m/z 2364.0)。
图7：
作为赖氨酸核心树状分子的实例，VIR-574[(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G](SEQ ID NO.2)的化学图。
图8：
VIR-705单体[LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF](SEQ ID NO.36)的C18 HPLC曲线。条件：Vydac C18(4.6×250mm，300，5μm，流速：0.8ml/min，梯度：60分钟内10-70体积％B，缓冲液A：0.07体积％TFA，缓冲液B：0.05体积％TFA，80体积％乙腈)。
图9：
VIR-705单体[LEKIPC(Acm)SIPpEVAFNKPFVF](SEQ ID NO.36)的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)。用Sciex API 100质谱仪记录质谱图。标出了分子离子[M+3H]3+(m/z 696.5)、[M+2H]2+(m/z 1174.5)和[M+1H]1+(m/z2347.5)。
图10：
VIR-705-二聚体[(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)2](SEQ ID NO.36)的C18 HPLC曲线。条件：Vydac C18(4.6×250mm，300，5μm，流速：0.8ml/min，梯度：30分钟内10-70体积％B，缓冲液A：0.07体积％TFA，缓冲液B：0.05体积％TFA，80体积％乙腈)。
图11：
VIR-705二聚体[(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)2](SEQ ID NO.36)的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)。用Sciex API 100质谱仪记录质谱图。标出了分子离子[M+4H]4+(m/z 1138.5)、[M+3H]3+(m/z 1517.5)和[M+2H]2+(m/z 2276.0)。
缩写：
AIDS：获得性免疫缺陷综合征
Boc：叔丁氧羰基
CXCR4：CXC趋化因子受体4
CCR5：CC趋化因子受体5
ESI-MS：电喷雾离子化-质谱
FP：融合肽
HIV：人免疫缺陷病毒
HPLC：高效液相色谱
HR-1，HR-2：七价重复1，2
MALDI-TOF：基质辅助激光解吸/电离-飞行时间
Mini-PEG：-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-
          CH2-CO-NH2
NMP：核磁共振
Oic：八氢吲哚基-2-羧酸
PEG：PEG基，聚乙二醇
QSAR：定量结构-活性关系
tBu：叔丁基
TFA：三氟乙酸
Tic：1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸
Trt：三苯甲基
权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.寡聚肽，其具有抗HIV感染的生物活性，并包含氨基酸序列(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-X15-Z2)n的单体肽链，
其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸或甘氨酸；
X4是异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸；
X5是脯氨酸、D-脯氨酸或取代的L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或者半胱氨酸；
X8是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或者半胱氨酸；
X9是具有芳香侧链的氨基酸；
X10是甘氨酸、丙氨酸或天冬酰胺；
X11是脯氨酸、天冬氨酸、八氢吲哚基-2-羧酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X12是苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X13是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸；
X14是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸；
X15是苯丙氨酸或缺失；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物且具有抗HIV感染生物活性的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体；
其前提条件是
(a)如果X12是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，那么X13、X14和X15分别是苯丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；和/或
(b)如果X12是苯丙氨酸，那么X13、X14和X15分别是缬氨酸、苯丙氨酸和缺失；和
(c)寡聚肽的任何单体肽链中最多有三个半胱氨酸残基；和
(d)所述寡聚肽不是(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(VIR-576)；和
(e)所述单体肽链不经一条肽链的N-端至另一条肽链的C-端之间的肽键连接。
2.根据权利要求1的寡聚肽，其具有抗HIV感染的生物活性，并具有氨基酸序列
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-FVF-Z2)n
其中
n表示单体肽的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸；
X4是异亮氨酸或半胱氨酸；
X5是脯氨酸、D-脯氨酸或任何取代的L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是苯丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或3，3-二苯基丙氨酸；
X8是苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X9是具有芳香侧链的氨基酸；
X10是甘氨酸或天冬酰胺；
X11是脯氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物且具有抗HIV感染生物活性的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体。
3.根据权利要求1至2的寡聚肽，其具有抗HIV感染的生物活性，并具有氨基酸序列
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-IP-X5-X6-X7-X8-F-X10-KPFVF-Z2)n，
其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸或甘氨酸；
X5是L-脯氨酸、D-脯氨酸或任意的取代L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是苯丙氨酸或缬氨酸；
X8是苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X10是甘氨酸或天冬酰胺；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物且具有抗HIV感染生物活性的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体。
4.根据权利要求1-3中任一项的寡聚肽，其具有氨基酸序列(Z1-LEAIP-X2-SIP-X5-X6-V-X8-FNKPFVF-Z2)n，
其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X2和X6是半胱氨酸，或者X2是甲硫氨酸且X6是谷氨酸；
X5是D-脯氨酸或L-脯氨酸；
X8是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或赖氨酸；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体，其具有抗HIV感染的生物活性，
前提是满足以下至少一项条件：
X2和X6是半胱氨酸；
X5是D-脯氨酸；或
X8不是赖氨酸。
5.权利要求1-4中任一项的寡聚肽，其中所述单体肽链被交联。
6.根据权利要求1-5中任一项的寡聚肽，其中在第6和11位、6和12位、7和12位、或8和13位处的半胱氨酸残基被分子内二硫键相连接。
7.根据权利要求1-6中任一项的寡聚肽，其中第1位氨基酸处的亮氨酸残基和第2位氨基酸处的谷氨酸被N-烷基化酰胺键或被酯键或被还原的肽键或被逆反肽键或被N-烷基化逆反肽键共价连接。
8.根据权利要求1-5中任一项或权利要求7的寡聚肽，其中至少两条单体肽链都具有至少一个单个的半胱氨酸残基，其通过二硫键彼此共价连接。
9.根据权利要求1-7中任一项的寡聚肽，其中所述单体肽链通过酸性氨基酸侧链的COOH基团和碱性氨基酸侧链的NH2基团之间的至少一个酰胺键彼此共价连接。
10.根据权利要求1-9中任一项的寡聚肽，其中所述单体肽链通过双功能间隔分子彼此连接，所述双功能间隔分子选自具有两个硫醇基的有机间隔子、具有两个氨基的有机间隔子、具有两个羧基的有机间隔子和具有一个羧基和一个氨基的有机间隔子。
11.根据权利要求1-10中任一项的寡聚肽，其中包含两条或四条单体肽链和至少一个与所述单体肽链共价连接的赖氨酸核心。
12.根据权利要求1-11中任一项的肽，其具有以下氨基酸序列之一：
VIR-574(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G                 SEQ ID NO.2
VIR-577(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2                     SEQ ID NO.3
VIR-673(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-miniPEG-C-酰胺)2      SEQ ID NO.4
VIR-674(LEAIPCSIPPCVA(D-Tic)NKP(D-Tic)FVF)2        SEQ ID NO.5
VIR-675(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2                     SEQ ID NO.6
VIR-676(LEAIPMSIPpE(3，3-二苯基丙氨酸)AFNKPFVF)2   SEQ ID NO.7
VIR-677(LEAIPMCIPPECFFNKPFVF)2                     SEQ ID NO.8
VIR-678(LEAIPMCIPPECLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.9
VIR-679(LEAIPCSIPPCVFFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.10
VIR-680(LEAIPCSIPPCFLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.11
VIR-681(LEAIPCSIPpCVGFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.12
VIR-682(LEAIPCSIPpCVFFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.13
VIR-683(LEAIPCSIPpCFLFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.14
VIR-684(LEDIPCSIPpCVAFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.15
VIR-685(LEKIPCSIPpCVAFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.16
VIR-686(LEAIPMGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.17
VIR-687(LEAIPMGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.18
VIR-688(LEKIPMSIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.19
VIR-689(LEKIPMSIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.20
VIR-690(LEKIPIGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.21
VIR-691(LEKIPIGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.22
VIR-692(N-Me-LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2                 SEQ ID NO.23
VIR-693(LEAIPMSCPPEFCFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.24
VIR-694(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-miniPEG)2              SEQ ID NO.25
VIR-695(LEAIPCSIPPEVA(D-Tic)NKP(D-Tic)FVF)2         SEQ ID NO.26
VIR-696(LEAIPCSIPpE(3，3-二苯基丙氨酸)AFNKPFVF)2    SEQ ID NO.27
VIR-697(LEAIPMCIPPEVFFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.28
VIR-698(LEAIPMCIPPEVLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.29
VIR-699(LEAIPCSIPPEVFFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.30
VIR-700(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.31
VIR-701(LEAIPCSIPpEVGFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.32
VIR-702(LEAIPCSIPpEVFFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.33
VIR-703(LEAIPCSIPpEFLFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.34
VIR-704(LEDIPCSIPpEVAFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.35
VIR-705(LEKIPCSIPpEVAFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.36
VIR-706(LEAIPCGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.37
VIR-707(LEAIPCGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.38
VIR-708(LEKIPCSIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.39
VIR-709(LEKIPCSIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2              SEQ ID NO.40
VIR-710(LEKIPCGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2              SEQ ID NO.41
VIR-711(LEKIPCGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2              SEQ ID NO.42
VIR-712(N-Me-LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2               SEQ ID NO.43
VIR-713(LEAIPMSCPPEFLFGKPFVF)2                    SEQ ID NO.44
VIR-714(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF-(miniPEG)2-酰胺)2    SEQ ID NO.45
VIR-715(N-Me-LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF-(miniPEG)2-酰胺)2     SEQ ID NO.46
VIR-716(N-Me-LEKIPCSIPPEFLFGKPFVF)2               SEQ ID NO.47
VIR-717(N-Me-LEDIPCSIPPEFLFGKPFVF)2               SEQ ID NO.48
VIR-718(LEKIPIGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2-KA           SEQ ID NO.49
VIR-719(N-Me-LEAIPCSIPpEFLFGKPFVF)2               SEQ ID NO.50
VIR-720(LEKIPIGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF-miniPEG-C)2    SEQ ID NO.51
VIR-721(LEKIPCCIPpCVAFNKPFVF)2                    SEQ ID NO.52
VIR-722(N-Me-LEDIPCSIPpCVAFNKPFVF-miniPEG-C)2     SEQ ID NO.53
VIR-723(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF-(miniPEG)2-C)2       SEQ ID NO.54
13.根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽，其与HIV的融合肽相互作用。
14.根据权利要求1-13中任一项的寡聚肽，其具有等于或小于6500nM的IC50，如VIR-574、VIR-577和VIR-673。
15.编码根据权利要求12中任一条单体肽链的单体肽链的核酸，但编码VIR-674、VIR-675、VIR-676、VIR-677、VIR-678、VIR-679、VIR-680、VIR-681、VIR-682、VIR-683、VIR-684、VIR-685、VIR-686、VIR-687、VIR-688、VIR-689、VIR-690、VIR-691、VIR-692、VIR-693和VIR-694的单体肽链的核酸除外。
16.与根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽特异性结合的抗体。
17.包含根据权利要求1-14中任一项的寡聚肽、权利要求15的核酸和/或权利要求16的抗体中至少一种的药物。
18.权利要求17的药物，其在用于口服、静脉、肌肉、皮内、皮下和/或鞘内施用的医用制剂中。
19.权利要求17或18的药物，其包含至少一种其它治疗剂。
20.权利要求19的药物，其中所述至少一种其它治疗剂是病毒蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、融合抑制剂、细胞因子、细胞因子抑制剂、糖基化抑制剂或病毒mRNA抑制剂。
21.根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽用于制造用于治疗HIV感染的药物中的用途。
22.确定能与HIV的融合肽相互作用的分子的测试，其中包含根据权利要求1-12中任一项的至少一种寡聚肽。
23.根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽在根据权利要求22的测试中的用途。
24.诊断剂，其包含根据权利要求1-12中任一项的至少一种寡聚肽、根据权利要求15的核酸或根据权利要求16的抗体。
25.根据权利要求24的诊断剂用于检验分离的血、血浆、组织、尿、***和/或脑脊液中HIV感染的用途。

Claims (25)

1.寡聚肽，其具有抗HIV感染的生物活性，并包含氨基酸序列
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-X15-Z2)n的单体肽链，
其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸或甘氨酸；
X4是异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸；
X5是脯氨酸、D-脯氨酸或取代的L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或者半胱氨酸；
X8是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或者半胱氨酸；
X9是具有芳香侧链的氨基酸；
X10是甘氨酸、丙氨酸或天冬酰胺；
X11是脯氨酸、天冬氨酸、八氢吲哚基-2-羧酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X12是苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X13是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸；
X14是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸；
X15是苯丙氨酸或缺失；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体；
其前提条件是
(a)如果X12是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸，那么X13、X14和X15分别是苯丙氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；和/或
(b)如果X12是苯丙氨酸，那么X13、X14和X15分别是缬氨酸、苯丙氨酸和缺失；和
(c)寡聚肽的任何单体肽链中最多有三个半胱氨酸残基；和
(d)所述寡聚肽不是(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF)2(VIR-576)；和
(e)所述单体肽链不经一条肽链的N-端至另一条肽链的C-端之间的肽键连接。
2.根据权利要求1的寡聚肽，其具有抗HIV感染的生物活性，并具有氨基酸序列
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-X4-P-X5-X6-X7-X8-X9-X10-K-X11-FVF-Z2)n
其中
n表示单体肽的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸；
X4是异亮氨酸或半胱氨酸；
X5是脯氨酸、D-脯氨酸或任何取代的L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是苯丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或3，3-二苯基丙氨酸；
X8是苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X9是具有芳香侧链的氨基酸；
X10是甘氨酸或天冬酰胺；
X11是脯氨酸或D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体。
3.根据权利要求1至2的寡聚肽，其具有抗HIV感染的生物活性，并具有氨基酸序列
(Z1-LE-X1-IP-X2-X3-IP-X5-X6-X7-X8-F-X10-KPFVF-Z2)n，
其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X1是赖氨酸、丙氨酸或天冬氨酸；
X2是半胱氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸；
X3是丝氨酸或甘氨酸；
X5是L-脯氨酸、D-脯氨酸或任意的取代L-或D-脯氨酸；
X6是半胱氨酸或谷氨酸；
X7是苯丙氨酸或缬氨酸；
X8是苯丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸或L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；
X10是甘氨酸或天冬酰胺；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的寡聚肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体。
4.根据权利要求1-3中任一项的寡聚肽，其具有氨基酸序列
(Z1-LEAIP-X2-SIP-X5-X6-V-X8-FNKPFVF-Z2)n，
其中
n表示单体肽链的数目，其中n是2、3或4；
X2和X6是半胱氨酸，或者X2是甲硫氨酸且X6是谷氨酸；
X5是D-脯氨酸或L-脯氨酸；
X8是具有疏水性或芳香侧链的氨基酸或赖氨酸；
Z1是NH2或1-10个氨基酸残基的序列；
Z2是COOH或1-10个氨基酸残基的序列；
和是其片段和/或衍生物的肽，尤其是酰胺化、烷基化、酰基化、硫酸化、PEG化、磷酸化和/或糖基化的衍生物，及其突变体，其具有抗HIV感染的生物活性，
前提是满足以下至少一项条件：
X2和X6是半胱氨酸；
X5是D-脯氨酸；或
X8不是赖氨酸。
5.权利要求1-4中任一项的寡聚肽，其中所述单体肽链被交联。
6.根据权利要求1-5中任一项的寡聚肽，其中在第6和11位、6和12位、7和12位、或8和13位处的半胱氨酸残基被分子内二硫键相连接。
7.根据权利要求1-6中任一项的寡聚肽，其中第1位氨基酸处的亮氨酸残基和第2位氨基酸处的谷氨酸被N-烷基化酰胺键或被酯键或被还原的肽键或被逆反肽键或被N-烷基化逆反肽键共价连接。
8.根据权利要求1-5中任一项或权利要求7的寡聚肽，其中至少两条单体肽链都具有至少一个单个的半胱氨酸残基，其通过二硫键彼此共价连接。
9.根据权利要求1-7中任一项的寡聚肽，其中所述单体肽链通过酸性氨基酸侧链的COOH基团和碱性氨基酸侧链的NH2基团之间的至少一个酰胺键彼此共价连接。
10.根据权利要求1-9中任一项的寡聚肽，其中所述单体肽链通过双功能间隔分子彼此连接，所述双功能间隔分子选自具有两个硫醇基的有机间隔子、具有两个氨基的有机间隔子、具有两个羧基的有机间隔子和具有一个羧基和一个氨基的有机间隔子。
11.根据权利要求1-10中任一项的寡聚肽，其中包含两条或四条单体肽链和至少一个与所述单体肽链共价连接的赖氨酸核心。
12.根据权利要求1-11中任一项的肽，其具有以下氨基酸序列之一：
VIR-574(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2-K-G                  SEQ ID NO.2
VIR-577(LEAIPMCIPPEFLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.3
VIR-673(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-miniPEG-C-酰胺)2       SEQ ID NO.4
VIR-674(LEAIPCSIPPCVA(D-Tic)NKP(D-Tic)FVF)2         SEQ ID NO.5
VIR-675(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.6
VIR-676(LEAIPMSIPpE(3，3-二苯基丙氨酸)AFNKPFVF)2    SEQ ID NO.7
VIR-677(LEAIPMCIPPECFFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.8
VIR-678(LEAIPMCIPPECLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.9
VIR-679(LEAIPCSIPPCVFFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.10
VIR-680(LEAIPCSIPPCFLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.11
VIR-681(LEAIPCSIPpCVGFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.12
VIR-682(LEAIPCSIPpCVFFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.13
VIR-683(LEAIPCSIPpCFLFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.14
VIR-684(LEDIPCSIPpCVAFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.15
VIR-685(LEKIPCSIPpCVAFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.16
VIR-686(LEAIPMGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.17
VIR-687(LEAIPMGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.18
VIR-688(LEKIPMSIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.19
VIR-689(LEKIPMSIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.20
VIR-690(LEKIPIGIPpEV(D-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.21
VIR-691(LEKIPIGIPpEV(L-Tic)FNKPFVF)2                SEQ ID NO.22
VIR-692(N-Me-LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF)2                 SEQ ID NO.23
VIR-693(LEAIPMSCPPEFCFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.24
VIR-694(LEAIPMSIPPEFLFGKPFVF-miniPEG)2              SEQ ID NO.25
VIR-695(LEAIPCSIPPEVA(D-Tic)NKP(D-Tic)FVF)2         SEQ ID NO.26
VIR-696(LEAIPCSIPpE(3，3-二苯基丙氨酸)AFNKPFVF)2    SEQ ID NO.27
VIR-697(LEAIPMCIPPEVFFNKPFVF)2                      SEQ ID NO.28
VIR-698(LEAIPMCIPPEVLFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.29
VIR-699(LEAIPCSIPPEVFFGKPFVF)2                      SEQ ID NO.30
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VIR-716(N-Me-LEKIPCSIPPEFLFGKPFVF)2                    SEQ ID NO.47
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VIR-722(N-Me-LEDIPCSIPpCVAFNKPFVF-miniPEG-C)2          SEQ ID NO.53
VIR-723(LEAIPCSIPPEFLFGKPFVF-(miniPEG)2-C)2            SEQ ID NO.54
13.根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽，其与HIV的融合肽相互作用。
14.根据权利要求1-13中任一项的寡聚肽，其具有等于或小于6500nM的IC50，如VIR-574、VIR-577和VIR-673。
15.编码根据权利要求12中任-条单体肽链的单体肽链的核酸，但编码VIR-674、VIR-675、VIR-676、VIR-677、VIR-678、VIR-679、VIR-680、VIR-681、VIR-682、VIR-683、VIR-684、VIR-685、VIR-686、VIR-687、VIR-688、VIR-689、VIR-690、VIR-691、VIR-692、VIR-693和VIR-694的单体肽链的核酸除外。
16.与根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽特异性结合的抗体。
17.包含根据权利要求1-14中任一项的寡聚肽、权利要求15的核酸和/或权利要求16的抗体中至少一种的药物。
18.权利要求17的药物，其在用于口服、静脉、肌肉、皮内、皮下和/或鞘内施用的医用制剂中。
19.权利要求17或18的药物，其包含至少一种其它治疗剂。
20.权利要求19的药物，其中所述至少一种其它治疗剂是病毒蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、融合抑制剂、细胞因子、细胞因子抑制剂、糖基化抑制剂或病毒mRNA抑制剂。
21.根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽用于制造用于治疗HIV感染的药物中的用途。
22.确定能与HIV的融合肽相互作用的分子的测试，其中包含根据权利要求1-12中任一项的至少一种寡聚肽。
23.根据权利要求1-12中任一项的寡聚肽在根据权利要求22的测试中的用途。
24.诊断剂，其包含根据权利要求1-12中任一项的至少一种寡聚肽、根据权利要求15的核酸或根据权利要求16的抗体。
25.根据权利要求24的诊断剂用于检验分离的血、血浆、组织、尿、***和/或脑脊液中HIV感染的用途。
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