CN1961961B

CN1961961B - 一种药物制剂及其制备方法

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Publication number: CN1961961B
Application number: CN200510124441A
Authority: CN
Inventors: 黄伟东; 秦华; 周向军
Original assignee: SHENZHEN YUANXING BIO-PHARM Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN YUANXING GENE TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2005-11-11
Filing date: 2005-11-11
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2025-11-11
Also published as: CN1961961A

Abstract

一种药物制剂，其由10⁶-10¹³vp/ml纯化病毒颗粒和辅料组成，辅料包括：磷酸盐缓冲体系，10-200mM的NaCl，1-2mM的MgCl₂或者CaCl₂，10-500μM EDTA，0.15-1％无水乙醇，0.01-0.09％的Tween 80，0-21mM组氨酸，甘油，还可以包括L-半胱氨酸。此药物制剂可于8℃或8℃以下保存3年以上时间。

Description

一种药物制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂及制备领域，尤其是涉及一种重组病毒制剂及其制备方法。

背景技术

随着2004年世界上第一个基因治疗产品今又生的上市，基因治疗越来越得到人们的认可。基因治疗有三个组成要素：目的基因，携带基因进入细胞内表达的载体，靶细胞。其中，缺乏特异性、靶向性及高效性的基因转移载体一直是基因治疗的一个难题。目前，用于基因治疗研究的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。非病毒载体主要指脂质体和裸DNA，其基因转导***由于可转载基因不受限制、安全、可操控性强等特点，其的开发近年来受到重视，但由于基因导入效率低和特异性差，限制了非病毒载体在基因治疗领域更广泛应用。

病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解等，因此病毒载体是良好的基因转运体，在基因治疗中的运用越来越广泛。但是大多数野生型病毒对机体都具有致病性，因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面，从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，已经对反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等进行了改造，并成功的用于基因转移载体。

随着病毒载体的广泛应用，病毒载体制剂的稳定性也越来越受到相关人员的重视，因为药物制剂稳定性研究是保证药品质量的重要手段。药物制剂的稳定性涉及到药物制剂的运输和储存条件，影响到药物的成本，也影响到用药的安全和有效。影响重组腺病毒制剂稳定性的因素很多，主要因素包括处方因素和外界因素。外界因素主要指光线、湿度、温度，冻融次数等等；处方因素主要指处方组成，除主药外，还加入了各种辅料，处方组成对制剂的稳定性影响较大。

顾菁，童涌等的专利(200410016000.7)介绍了冻干重组腺病毒的制剂：采用冷冻干燥过程，使之成为冻干制剂后能于4-8℃保藏30个月，有很好的稳定性。

美国merck公司的专利也保护了重组腺病毒的制剂，其中专利20050186225保护的制剂包括病毒，至少一个抗氧化剂和至少一种糖，浓度为100mM的盐。该制剂在2-8℃可以储存两年。

专利20020041884保护的制剂包括纯化病毒，Tris，蔗糖，盐，MgCl₂和非离子洗涤剂。

WO99/41416 保护了病毒制剂，包括甘油，磷酸钠缓冲液，Tris，蔗糖，MgCl₂和Tween 80。该制剂在4℃储存一年其的病毒滴度下降0.52 log。

美国专利6,451,256保护了0.75-1.5M蔗糖浓度的制剂。

Nyberg-Hoffman等公开了腺病毒冻干制剂，其成分包括Tris，蔗糖和MgCl₂。

Croyle等公开了腺病毒冻干制剂和液体制剂，包括Tris，磷酸钠缓冲液，蔗糖，海藻糖或者山梨糖/凝胶。同时也公开了以环式糊精为基础的辅料能增强液体腺病毒制剂的稳定性。

目前世界上只有一个基因治疗产品上市，即今又生，它的储存温度是-20℃，储存时间是三年。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定性好的药物制剂。该药物具有安全、高效、稳定性好等特点。

为实现上述目的，本发明提供一种包含病毒颗粒和辅料的制剂成分。该病毒颗粒数为10⁶-10¹³vp/ml。辅料成分包括缓冲体系，10-200mM的NaCl，激活剂，抗氧化剂，非离子表面活性剂，热稳定剂等成分组成。

本发明所述的重组病毒为任何类型的经过改造的病毒，包括腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒，疱疹病毒、甲病毒等。优选为经过改造的腺病毒。包括但不局限于Ad5，Ad2，Ad6，Ad24，Ad35亚型或各亚型的混合型。

本发明所述的缓冲体系是磷酸盐缓冲体系，可以是HPO₄ ^2-和H₂PO₄ ^-的钠盐和钾盐，如K₂HPO₄、KH₂PO₄缓冲体系和Na₂HPO₄、KH₂PO₄缓冲体系。优选为20-50mM K₂HPO₄和2-5mM KH₂PO₄；液体制剂处方中，往往需要加入大量缓冲剂来维持制剂所需的pH值，使其维持在生理学上可耐受的范围，优选为7.0-8.0。同时，加入NaCl，调节制剂的等渗点，以满足生物适应性要求。

本发明所述的激活剂可以是二价盐，如MgCl₂、CaCl₂等。主要起激活病毒活性的作用。

本发明所述的抗氧化剂可以是乙二胺四乙酸(EDTA)，组氨酸，乙醇，L-半胱氨酸等，本发明中的基本抗氧化剂是EDTA和乙醇，还可以添加组氨酸、L-半胱氨酸中的一种或者两种。在制剂中EDTA通过防止金属离子催化自由基氧化从而避免病毒失活；组氨酸和乙醇通过防止自由基氧化从而保护病毒。

本发明所述的非离子表面活性剂可以是Tween-80，40等，优选为Tween-80。在重组病毒制剂中加入非离子表面活性剂可防止病毒吸附在容器表面从而避免病毒损失活性。

本发明所述的热稳定剂是甘油。

本发明的药物制剂可以用于治疗和预防动物的疾病，特别是人类、哺乳动物和鸟类的疾病。

本发明的药物制剂可以通过下列途径：肌肉内，气管内，皮下，鼻内，真皮内，直肠，经口，和肠胃外给药。

本发明的病毒制剂可以是基因治疗产品，也可以是疫苗，包括预防性和治疗性疫苗。

附图说明

附图1不同处方经过不同冻融次数后的滴度变化

附图2 8℃条件下不同处方在经过不同时间后的滴度变化

附图3 37℃条件下不同处方在经过不同时间后的滴度变化

附图4 制剂加速实验的滴度变化

附图5 长期稳定性实验的滴度变化

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1：制剂配方选择实验

重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂处方：

处方1：KH₂PO₄ 0.41g；K₂HPO₄ 5.59g；NaCl 4.38g；

MgCl₂·6H₂O 0.20g；甘油100ml；Tween80 0.2ml；

EDTA 0.03g；乙醇5ml；pH 7.5

处方2：KH₂PO₄ 0.41g；K₂HPO₄ 5.59g；NaCl 9.00g；

组氨酸1.55g；甘油：100ml；pH 7.5

处方3：KH₂PO₄ 0.41g；K₂HPO₄ 5.59g；NaCl 4.38g；

MgCl₂·6H₂O：0.20g；pH 7.5

处方4：KH2PO4 0.41g；K2HPO4 5.59g；NaCl 9.00g；

甘油100ml；Tween80：0.2ml；L-半胱氨酸1.20g；pH 7.5制备：

按配方称量各组分，加入蒸馏水至约500ml，搅匀，待全溶解，再将纯化后的浓度为5×10¹¹vp/ml的重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂10ml加入到上述溶解好的辅料中，调pH，蒸馏水补足1000ml，混合均匀，0.22μm膜除菌过滤，最后按1ml/支进行无菌分装。

对于腺病毒制品，一般要求冰点以下冷冻贮存，在运输和使用过程中，由于温度变化就会有冻融的情况发生，因此设计反复冻融试验来考察重组腺病毒制剂的稳定性。冻融试验的一次循环为：在-80℃冰箱冻15分钟以上，然后在37℃水浴解冻约15分钟。每个处方各取4支(1ml/支)，分别冻融0次，5次，10次，20次。之后进行TCID50的测定。测定结果见附图1。实验结果表明：采用处方1经过不同的冻融次数后，保存重组腺病毒制剂的稳定性最好，病毒滴度损失最小。处方2和4的次之。

另外由于腺病毒制剂对温度比较敏感，故设计在8℃，37℃两个温度进行四个处方不同时间的病毒滴度测定，以此来比较四种处方。测定结果分别见图2，3。在8℃进行的不同时间的病毒滴度检测表明处：采用处方1进行8℃保存，能完整的保存8周，病毒滴度没有变化；而在37℃进行保存，病毒滴度发生损失，但是相比较而言，处方1的损失最小，处方2和4的损失次之

药物稳定性的试验方法包括加速试验和长期试验。

实施例2：制剂加速试验(温度-时间试验)

通过加速药物的化学或者物理变化，预测药物的稳定性。

从同一批制剂中取出一定数量的处方1制剂，分不同的温度条件存放：-80℃，-20℃，8℃，37℃。将制剂分别标记好批号和存放温度。在分不同温度存放的当天(0周)，取样检测，以后按照以下表格中的时间点分别取样进行TCID50检测。

表1：制剂加速实验不同温度条件检测频率

检测结果见图4。由图可知，在-80℃、-20℃和8℃存放24周，制剂的质量都很稳定，检测结果在测量偏差范围内波动，而在37℃其质量有显著下降。故腺病毒制剂可以在这三个温度进行短期存放，不影响制剂的感染性滴度。是否能进行长期存放需进一步验证。

实施例3：长期稳定性试验

长期试验是在接近药品的实际贮存条件下进行的，其目的是为制订药物的有效期提供依据。

结合实施例3的结果，设计本实验：选定8℃进行长期稳定性实验。将三个批次的处方1制剂在8℃存放，存放的当天(0月)，取样检测，以后在存放1，3，6，9，12，18，24，36个月时取样进行TCID50检测。检测结果见表2：

表2：8℃存放的长期稳定性试验结果：(单位：IU/ml)

根据实验检测结果作图，见图5。结果表明：按本发明处方1制成的腺病毒液体制剂，具有良好的稳定性，在8℃条件下存放36个月(即3年)，制剂感染性滴度平均下降了0.2 logTCID50IU/ml。具体为批次1的制剂感染性滴度下降了0.22logTCID50IU/ml，批次2的制剂感染性滴度下降了0.12logTCID50IU/ml，批次的制剂感染性滴度下降了0.26logTCID50IU/ml。根据本实验的测定结果，表明选用本发明的处方1制剂在8℃进行长达3年的存放，结果对制剂的感染性滴度影响不大。

实施例4：制剂配方及制备

配方：KH₂PO₄ 0.27g；K₂HPO₄ 8.70g；NaCl 0.58g；MgCl₂·6H₂O 0.40g；甘油10ml；Tween 80 0.20ml；EDTA 0.03g；乙醇5ml；组氨酸0.75g；pH 7.5

制备：按配方称量上述各组分，加入蒸馏水至约500ml，搅匀，待全溶解，再将纯化后的浓度为5×10¹³vp/ml的重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂200ml加入到上述溶解好的辅料中，调pH，蒸馏水补足1000ml，混合均匀，0.22μm膜除菌过滤，最后按1ml/支进行无菌分装。

实施例5：制剂配方及制备

配方：KH₂PO₄ 0.27g；K₂HPO₄ 3.48g；NaCl 11.60g；MgCl₂·6H₂O 0.20g；甘油150ml；Tween 80 0.90ml；EDTA1.00g；乙醇1.50ml；pH 7.5

制备：按配方称量上述各组分，加入蒸馏水至约500ml，搅匀，待全溶解，再将纯化后的浓度为1×10⁹vp/ml的重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂1ml加入到上述溶解好的辅料中，调pH，蒸馏水补足1000ml，混合均匀，0.22μm膜除菌过滤，最后按1ml/支进行无菌分装。

实施例6：制剂配方及制备

配方：KH₂PO₄ 0.27g；K₂HPO₄ 8.70g；NaCl 0.58g；CaCl₂0.23g；甘油10ml；Tween800.10ml；EDTA 0.15g；乙醇5ml；组氨酸1.55g；pH 7.0

制备：按配方称量上述各组分，加入蒸馏水至约500ml，搅匀，待全溶解，再将纯化后的浓度为1×10¹⁰vp/ml的重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂10ml加入到上述溶解好的辅料中，调pH，蒸馏水补足1000ml，混合均匀，0.22μm膜除菌过滤，最后按1ml/支进行无菌分装。

实施例7：制剂配方及制备

配方：KH₂PO₄ 0.68g；K₂HPO₄ 5.59g；NaCl 4.38gCaCl₂ 0.11g；甘油50ml；Tween 80 0.90ml；EDTA 0.09g；乙醇10ml；组氨酸1.55g；L-半胱氨酸1.20g；pH 8.0

制备：按配方称量上述各组分，加入蒸馏水至约500ml，搅匀，待全溶解，再将纯化后的浓度为5×10¹¹vp/ml的重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂10ml加入到上述溶解好的辅料中，调pH，蒸馏水补足1000ml，混合均匀，0.22μm膜除菌过滤，最后按1ml/支进行无菌分装。

实施例8：制剂配方及制备

配方：KH₂PO₄ 0.68g；Na₂HPO₄ 5.59g；NaCl 4.38g；MgCl₂·6H2O 0.40g；甘油50ml；Tween 80 0.90ml；EDTA 0.03g；乙醇10ml；组氨酸1.55g；L-半胱氨酸1.20g；pH 8.0

制备：按配方称量上述各组分，加入蒸馏水至约500ml，搅匀，待全溶解，再将纯化后的浓度为1×10⁹vp/ml的重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂10ml加入到上述溶解好的辅料中，调pH，蒸馏水补足1000ml，混合均匀，0.22μm膜除菌过滤，最后按1ml/支进行无菌分装。

实施例9：制剂配方及制备

配方：KH₂PO₄ 0.68g；Na₂HPO₄ 5.59g；NaCl 9.68g；MgCl₂·6H₂O 0.20g；甘油100ml；Tween 80 0.90ml；EDTA0.03g；乙醇10ml；组氨酸0.75g；L-半胱氨酸0.80g；pH 8.0

制备：按配方称量上述各组分，加入蒸馏水至约500ml，搅匀，待全溶解，再将纯化后的浓度为1×10¹³vp/ml的重组人乙肝核心抗原腺病毒制剂100ml加入到上述溶解好的辅料中，调pH，蒸馏水补足1000ml，混合均匀，0.22μm膜除菌过滤，最后按1ml/支进行无菌分装。

Claims

1.一种药物制剂，其由10⁶-10¹³vp/ml纯化重组人乙肝核心抗原腺病毒颗粒和辅料组成，其pH为7.0-8.0，辅料包括：缓冲体系，10-200mM的NaCl，1-2mM的MgCl₂或者CaCl₂，10-500μM EDTA，0.15-1％的无水乙醇，0.01-0.09％的Tween 80，0-21mM组氨酸，其特征在于：缓冲体系是20-50mM K₂HPO₄/Na₂HPO₄和2-5mM KH₂PO₄的磷酸盐缓冲体系，辅料还包括1-15％的甘油。

2.权利要求1中的药物制剂，其中的甘油用量为5-15％。

3.权利要求1中的药物制剂，其中的甘油用量为10％。

4.权利要求1中的药物制剂，其中的组氨酸用量为0-10mM。

5.权利要求1中的药物制剂，其中的辅料还可以包括L-半胱氨酸。

6.权利要求5中的药物制剂，其中的L-半胱氨酸用量为0.001-10mM。