CN1961077A - 酶活性测定方法及酶活性测定用柱 - Google Patents

Abstract

一种酶活性测定方法，包括以下步骤：(1)在填充有由不溶于水的底物和固定于该底物中、能识别待测酶的抗体构成的填充剂的柱内，加入含待测酶的试样，用上述抗体捕捉酶；(2)在上述柱内加入上述酶的基质，使被上述抗体捕捉的酶与上述基质反应，以及(3)检测上述反应所得生成物。上述方法可以通过良好的反应效率没有延迟地测定酶活性。

Description

酶活性测定方法及酶活性测定用柱

技术领域：

本发明涉及一种酶、特别是周期素依赖性激酶的活性测定方法及测定酶活性用柱。

背景技术：

酶活性的测定历来是通过分析酶和基质反应引起基质减少的数量或生成物增加的数量来进行的。在如生物试样那样除待测定酶外还夹杂着各种抑制酶等杂物的试样中，要想测定特定的酶的活性，就需要加一道提纯待测酶的步骤，以排除抑制酶等杂物对目标酶反应的影响。这一步骤为，比如采用免疫沉降法使对待测酶有特异性的抗体固定于不溶于水的底物，然后将该底物同含待测酶的试样混合，从而从试样中分离出目标酶。

这种免疫沉降之后再进行酶反应的酶活性测定方法，已公开(专利文献1)的方法有：测定被称为周期素依赖性激酶(CDK)的磷酸化酶群的活性的方法，这种周期素依赖性激酶是调节细胞增殖的细胞周期调节因子。

CDK通常作为非活性型单体存在于细胞内，CDK本身被磷酸化等激活移动到细胞核内。在核内，CDK与存在于核内的周期素分子结合，生成CDK/周期素复合体(以下称为活性型CDK)，在细胞周期的各个阶段调节细胞周期沿正确的轨道进行。如此，周期素和CDK有着密切的关系，但是，众所周知，周期素基因的表达亢进与各种癌的进行度和恶性度相关(非专利文献1)，因此，人们往往期待，一旦测定各种CDK的活性，其能够成为诊断与细胞周期控制有关的疾患的种类和恶性度的优良指标。

专利文献1中的CDK活性测定方法是将生物试样、抗CDK抗体和朊A凝胶混合进行免疫沉降后，在CDK存在的情况下催化作为CDK基质的基质蛋白质和硫代三磷酸腺苷(ATP-γS)反应，向基质蛋白质加入一硫代磷酸基，使标记荧光物或标记酶与加入的一硫代磷酸基的硫磺原子结合，标记基质蛋白质，测定标记的基质蛋白质的数量，从而测定CDK活性。

其他测定酶活性的方法还有诸如：向填有使烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)固定于不溶于水的底物中的酶活性测定用填充剂的柱内加入NAD要求性酶及其酶的基质，定量所得生成物，从而测定酶的活性(专利文献2)；向填充有固定基质的填充剂的柱内加入试样，通过酶和基质的反应分解基质，定量柱内流出的液体中的基质分解生成物，从而达到测定酶的活性的目的(专利文献3)；在装有通过生物素—抗生朊的结合而固定基质的底物的酶活性测定用柱内加入待测定活性的酶，定量所得基质分解物，从而测定酶的活性(专利文献4)。

专利文献1：美国专利申请公开第2002/0164673号说明书

专利文献2：特开平5-328996号公报

专利文献3：美国专利第5654152号说明书

专利文献4：特许第2810138号公报

非专利文献1：Wataru Yasui，2000，希森美康期刊国际版(Sysmex Journal International)，Vol.10，No.2；85-92

发明内容：

发明要解决的课题

过去的CDK活性测定方法测定费时，很难对大量检体进行检测，因此，人们希望有能够在更短时间内简便地测定CDK活性的酶活性测定方法。

解决课题的手段

本发明是由以下几个步骤组成的酶活性测定方法：(1)在填充有由不溶于水的底物和固定于该底物中、能识别待测酶的抗体构成的填充剂的柱内，加入含待测酶的试样，用上述抗体捕捉酶；

(2)在上述柱内加入上述酶的基质，催化被上述抗体捕捉的酶与上述基质反应，以及

(3)检测上述反应所得生成物。

本发明还是由以下步骤构成的酶活性测定方法：(1)在填充有不溶于水的底物的柱内加入识别待测酶的抗体，以此将上述抗体固定于上述底物中；

(2)在上述柱内加入含有待测定酶的试样，让上述抗体捕捉该酶；

(3)在上述柱内加入上述酶的基质，使其与上述抗体捕捉到的酶反应；以及

(4)检测上述反应的生成物。

本发明还涉及酶活性测定用柱，该柱内填充有由不溶于水的底物和固定在该底物、能识别磷酸化酶的抗体构成的填充剂。

发明效果

本发明的酶活性测定方法是将由上述底物和抗体构成的填充剂填入柱内，让该抗体捕捉待测定酶，因此，试样中的目标酶即使很少，也能捕捉，而且在该柱内加入了基质，从而可以很简便、有效地进行酶反应。

用本发明的酶活性测定方法测定CDK活性，比用过去的免疫沉降法大大缩短了反应时间，使检测更加快捷。

附图说明：

图1为可使用本发明的酶活性测定方法的柱的理想形态。

图1-1为将图1的柱分为蓄液器、柱体和底部的图。

图2为从实施例1和比较例1获得的CDK2活性比较图。

图3为用柱测定酶活性方法所测定的试样中CDK2对蛋白质量的比较图。

图4为使用过去的免疫沉降测定酶活性方法所测定的试样中CDK2对蛋白质量的比较图。

图5为使用柱测定酶活性法测定含20μg蛋白质的试样中CDK活性的结果。

符号说明

1蓄液器

2柱体

3底部

4连接部

5连接部

具体实施方式：

作为本发明酶活性测定方法可以测定的酶可以举出：诸如周期素依赖性激酶(CDK)、丝氨酸/苏氨酸激酶(如PKB、PKC等)、酪氨酸激酶(如Src，Abl等)等磷酸化酶；诸如MMP(基质金属蛋白酶)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)那样的蛋白酶等。本发明的酶活性测定方法特别是能够快捷地测定磷酸化酶，而该磷酸化酶优选CDK。

所谓CDK包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK6及CDK7。

识别上述酶的抗体既可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是基因重组技术得到的物质。

本发明的酶活性测定方法使用层析柱进行测定。层析柱的形状可以适当选择，以便提高酶的反应效率。即，最好根据装填在柱内的填充剂与加入柱内的试样中分子的碰撞效率，再考虑柱的加工性和对使用本柱的***的适用性等因素，决定柱的形状(粗细、长短等)。根据以上几点，柱径可以是0.3～30mm，优选0.5～20mm，最好是0.5～15mm。柱长可以是5～100mm之间，优选10～80mm，最好为10～50mm。

柱的材质只要在待测定酶的活性测定条件下不易分解、没有强度和蛋白质吸附问题、不会给酶反应造成不良影响即可，可以使用氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)等。从柱的强度高、易加工、导热性低能使柱内保持一定温度这几点看，优选PVC制柱。在低蛋白质吸附这一点上PP制的层析柱略胜一筹。

在本发明中可以使用的柱的优选形态如图1和图1-1所示。柱如图1-1所示，最好是柱体2的上部有可以储蓄试样的蓄液器1，柱体2的下部有防止填充剂外漏的底部3。将这些部分组装起来即可以作为图1所示层析柱来使用。

蓄液器1和柱体2的连接部4、及柱体2和底部3的连接部5分别可以使用滤膜。滤膜的材质只要是蛋白质吸附率低、具有向柱内加入液体时不会破损的强度即可，可以使用聚偏氟乙烯(PVDF)、尼龙、玻璃纤维膜等。其中以PVDF为最好，PVDF膜可以用市场销售品，比如微孔滤膜(Durapore)(密理博公司生产)。

根据本发明的酶活性测定方法，填充剂装填到柱体2。在本说明书中，“填充剂”这一用语指固定于不溶于水的底物中能识别待测定酶的抗体。

本发明的酶活性测定方法所用底物一般只要不溶于水、在待测酶的活性测定条件下不易分解、且不对酶反应产生不良影响即可，比如可以使用纤维素、琼脂糖、葡聚糖等多糖类和硅胶等。其中，以琼脂糖为最好。

作为上述底物的形态，只要是可以填充到所用柱中即可，但如后所述，当让固定在填充剂中的抗体捕捉试样中的酶时，抗体与试样的接触面积会增大，因此，推荐使用粒子或多孔的底物。粒子的粒径推荐0.01～0.5mm，优选0.05～0.4mm，最好为0.05～0.2mm。

作为多孔的底物，可根据柱体的形状比如使用圆筒形的。其材质可以使用单体式硅等。

在本发明的酶活性测定方法中，也可将能与抗体结合的物质(以下称抗体结合物)固定在底物中，在此让其与抗体结合，作为填充剂使用。抗体结合物可举出识别抗原结合片段(Fab段)、可结晶片段(Fc段)、K链等抗体的一部分并与之结合的物质，作为这种物质，有朊A、朊G、朊L和朊LA等，其中以朊A或朊G为优选。朊A和朊G可以使用天然材料、转基因技术生产的东西或修饰它们所得的物质。作为该修饰，比如有除去白朊结合领域、除去细胞壁结合领域等提高对抗体识别的特异性的修饰。

作为将抗体结合物固定于底物的方法，可采用使用反应性化合物的方法。可用p-硝基苯氯甲酸酯、溴化氰、N-羟琥珀酰亚胺和环氧化物类等作为反应性化合物。此时，反应性化合物与底物结合，抗体结合物与该反应性化合物结合，从而使抗体结合物得以固定于底物。

与抗体结合物结合的底物也可以用市场出售产品，但当上述可与抗体结合的物质为朊A时，可以使用朊A琼脂糖凝胶FF、朊A琼脂糖凝胶HP(Amersham公司产品)等，当可与抗体结合的物质为朊G时，可使用朊G琼脂糖凝胶HP(Amersham公司产品)等。

关于本发明的酶活性测定法的优选实施方式，首先向层析柱装填填充剂，该填充剂由识别待测酶的抗体和底物构成。作为得到填充剂的方法，可以在由适当的缓冲剂中加入抗体构成的溶液中加入底物，进行培养。另外，也可预先将抗体结合物固定于底物中。培养的温度可以是2～10℃，优选4～6℃。培养时间为20～90分钟之间，最好在40～70分钟之间。

还可以对如此得到的填充剂进行洗涤，以去除未固定的抗体。洗涤用的洗涤剂只要能去除未固定的抗体即可，也可含有少量白朊和表面活性剂。进行这种清洗后，即可将该填料悬浮于合适的缓冲剂中，装入层析柱。

固定于底物的抗体的数量可根据底物的抗体结合容量、待测定酶的种类等因素适当选择。一般为0.1～100μg，推荐0.5～50μg，最好是0.7～20μg。

作为向上述层析柱填料的方法，只要填充剂装入后可以提高其与加入柱内的试样中的分子的碰撞效率即可，比如可以采用将粒子状填充剂悬浮于适当的缓冲液中、以一定的流速向柱内装填的方法。装填粒子状填充剂时的流速可以根据填充剂的种类适当选择，推荐10～1000μl/分，优选20～700μl/分，最好是50～500μl/分。

填充到柱内的填充剂的量优选10μl～15ml，最好是15μl～15ml。

本发明的酶活性测定方法的其他优选实施方式，是将底物填充到层析柱。以与上述向层析柱装填填充剂同样的流速向柱内装填底物后，将识别待测定酶的抗体加入柱内。如此将识别待测定酶的抗体加入柱内，而作为使抗体固定于该底物的方法，可以将该抗体溶于合适的缓冲液中，以一定量的抗体可被固定于底物的流速向柱内灌注。抗体溶液的流速推荐5～500μl/分，优选10～350μl/分，最好是25～250μl/分。

装入柱内的底物数量优选10μl～15ml，最好是15μl～15ml。

将抗体固定于底物后，也可以用上述洗涤剂洗涤，以去除残留于柱内的未固定的抗体。洗涤剂的流速为5～500μl/分，优选10～200μl/分。

如此得到的酶活性测定用柱即是本发明之一，它装填有填充剂，该填充剂由不溶于水的底物和固定于该底物、能识别磷酸化酶的抗体组成。此酶活性测定用柱可在2～10℃条件下保存，使用时通过以下步骤，即可用于测定酶活性。

向通过上述操作得到的柱内加入含待测定酶的试样，让上述抗体捕捉该酶。

含待测定酶的试样可以是只含目标酶的提纯的单一样品或粗提纯产品，也可以是生物试样。如果使用生物试样，也可以用色层分离法预先进行粗提纯。当待测定酶为CDK时，可以对生物试样中的生物细胞进行化学或物理处理，破碎其细胞膜和核膜来制备试样。作为该处理方法，比如可以在含有表面活性剂、蛋白质水解酶抑制剂和脱磷酸化酶抑制剂的缓冲液中进行诸如韦林氏搅切器(Waring blender)那种电动均化器处理，或用注射器抽吸，或进行超声波处理。

向柱内进样时的流速可以在5～500μl/分之间，优选10～350μl/分之间，最好是25～250μl/分之间。

当向柱内进样、捕捉到酶后，为了除去残存在柱内的末捕捉的酶和试样中所含其他杂物，最好进行清洗。如果测定对象是CDK，则洗涤剂可以是含氯化镁的清洗剂，以提高与后述基质的反应性，还可以含二硫苏糖醇(DTT)以作为酶的稳定剂。

洗涤剂的流速可以在5～500μl/分之间，优选10～200μl/分之间。

清洗时间可在3～30分钟、最好在5～15分钟之间，以免残留在柱内的未被抗体捕捉到的游离的酶和杂物对后述酶反应造成不良影响。

向上述捕捉到酶的柱内加入该酶的基质进行酶反应。所谓基质只要与待测定酶接触可产生反应生成物即可。该基质可以是一种，也可以是二种以上，如果是二种以上，则可以将其同时加入层析柱，也可以分别加入。

上述酶反应可通过将由基质溶于适量缓冲液配制的基质溶液加入层析柱进行。基质溶液的流速可根据测定的酶、使用的基质和柱的尺寸等因素适当选择，但一般为0.1～200μl/分，优选0.5～150μl/分，最好是1～100μl/分。

基质溶液的pH值和进行酶反应的温度可根据待测定酶和所用基质选择最适宜待测定酶的反应条件的。比如：以CDK作为该测定酶时的pH值为6.5～8.5，最好为7.0～7.4。反应温度可在25～40℃之间，最好为37℃。

在以CDK为测定酶的情况下，基质推荐使用基质蛋白质和硫代三磷酸腺苷(ATP-γS)。

[化学式1]

如上所述，CDK与周期素结合而成的活性型CDK，通常会向基质蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基中导入来源于ATP的单磷酸基，如果用ATP-γS取代ATP，则一硫代磷酸基取代单磷酸基导入到基质蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基中。然后，可通过用标记荧光物或标记酶做标记，检测导入到基质蛋白质的一硫代磷酸基的硫原子，从而测定CDK活性。

因此，基质蛋白质只要含有丝氨酸或苏氨酸残基即可。测定CDK1和CDK2时，推荐使用组朊H1，测定CDK4和CDK6时推荐使用Rb(成视网膜细胞瘤蛋白、Retinoblastoma protein)等。

关于本来分子内含有半胱氨酸残基的基质蛋白质、如Rb，一般使用将其残基置换为不含丙氨酸等硫醇基的氨基酸残基的基质蛋白质。这是为了防止当用标记荧光物或标记酶对在活性型CDK的作用下引入了来源于ATP-γS的硫代磷酸基的基质蛋白质中的硫代磷酸的硫原子做标记时，本来存在于基质蛋白质内的半胱氨酸残基的硫醇基同时被标记，产生测定误差。作为获得置换了氨基酸残基的基质蛋白质的方法，使用普通的基因工程的手法即可，美国专利申请公报第2002/0164673号说明书上记载的方法特别适用。

回收从如上注入柱内的基质溶液中析出的流出液，检测流出液中的反应生成物。

反应生成物可以使用以往酶反应测定法中通用的方法进行检测。比如，反应生成物如果为过氧化氢等，可以通过测定电化学的变化检测，如果为对硝基苯酚、核甙酸、低聚肽(Oligopeptide)等，可通过测定紫外线吸收、荧光、折射率的变化来检测。

如果所测定的酶是CDK，则反应生成物的检测可以用美国专利申请公报第2002/0164673号说明书上记载的方法。

在上述各步骤中，向层析柱添加各种溶液和悬浮液的工作可以用注射器手动操作，最好用泵按一定流速操作。

根据本发明的酶活性测定方法，只要是可以得到其抗体的酶，都可测定，即使试样中的酶浓度很低，抗体也可以捕捉酶，并在微小的空间内进行酶反应，因此反应效率高。而且，通过使用向层析柱加入液体的手法，简化了过去多道工序的酶反应步骤。又因为可以使用容量很小的层析柱，从而实现了在柱内温度分布小而均匀的条件下进行酶反应。

具体实施例

下面通过实例，对本发明进行更详细的阐述。但是这些实施例并不限定本发明。

实施例1：使用层析柱测定CDK1和2的活性

(1)试样的制备

在1×10⁷细胞/5ml的条件下，在增溶剂(0.1w/v％NP-40(表面活性剂乙基苯基聚乙二醇)、50mM Tris-HCl、pH7.4、5mM EDTA、50mM氟化钠、1mM正钒酸钠、100μg/ml蛋白酶抑制剂混合物(SIGMA公司产品))中，用带有23G针的5ml注射器在冰浴中吸排来源于慢性骨髓性白血病的细胞株K-562，反复吸排10次，增溶溶解细胞。再以15000rpm转速4℃离心5分钟，除去不溶物质，即制备出试样。使用DC蛋白质盒(BIO-RAD公司产品)以牛IgG为标准测定上清中所含全蛋白质的量。

(2)层析柱的制备

在500μl缓冲液1(0.1％NP-40、50mM Tris-HCl、pH7.4)中加入20μl朊A琼脂糖凝胶FF(Amersham公司产品；琼脂糖凝胶作为抗体结合物与朊A结合的产物)作为底物，用泵以100μl/分的流速向内径1.13mm、长度20mm的柱内(容积20.05mm³)装填底物。此时，层析柱仅在图1显示的底部3的连接部5装有滤膜(微孔滤膜(密理博公司生产))，填充完成后在畜液器1的连接部4安装同样的滤膜。将畜液器1和底部3装到柱体2后柱全长为31.5mm。

(3)酶反应

以50μl/分的流速向层析柱加入用缓冲液1稀释为含2μg蛋白质的多克隆抗CDK1或2抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品)溶液100μl，使抗体分别固定于底物。固定所需时间约6分钟。

将(1)中制备的含50μg蛋白质的试样100μl以50μl/分的流速注入层析柱，让抗体捕捉试样中的CDK。这一阶段所需时间约6分钟。

接着，以50μl/分的流速添加400μl清洗剂(100mM Tris-HCl、100mMNaCl、pH7.4)，清洗层析柱。清洗所需时间约13分钟。

以10μl/分的流速向此柱注入100μl基质混合液(10μg组朊H1、5mMATP-γS、20mM MgCl、0.1％TritonX-100、50mM Tris-HCl、pH7.4)，回收流出液。此阶段所需时间约8分钟。

(4)反应生成物的检测

在36μl流出液中加入含150mM三羟甲基氨基甲烷-HCl、pH9.2、5mMEDTA的结合缓冲液30μl，再添加50mM PEO-碘乙酰生物素(Pierce公司)、20μl溶液(50mM磷酸缓冲液pH6.0)后，在暗处室温下培养90分钟。然后，加入等量(86μl)的SDS-上样缓冲液(0.125mM三羟甲基氨基甲烷-HCl、pH6.8、4％SDS、10％β-巯基乙醇、25％丙三醇、溴酚蓝)，100℃处理5分钟。

用所得样品在20μl/rain的条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(第一化学药品、预制凝胶、4～20％梯度、10mm×10mm)。SDS-PAGE的条件按照第一化学药品的指示(60mA、40分)。SDS-PAGE后，将在凝胶内展开的蛋白质电转印到PVDF膜(10V、30分、免疫印迹法)。将所得薄膜用4w/v％的BSA封闭30分钟，再用TBS-T洗涤5分钟。然后在抗生朊FITC(Pierce公司)(用TBS-T稀释1000倍)溶液中37℃反应30分钟。反应后，将薄膜用TBS-T洗涤2次、水洗涤1次，干燥。用MolecularImager(伯乐生命医学产品有限公司(Bio-Rad公司)产品)使荧光带显像，以条带的强度为RFU(相对荧光单位)进行测定。

比较例1：使用免疫沉降法测定CDK1和2的活性

(1)试样的制备

与实施例1的(1)同样制备试样。

(2)免疫沉降反应

在(1)中制备的含50μg蛋白质的试样100μl中加入2μg多克隆抗CDK1或2抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品)和20μl朊A琼脂糖凝胶FF(Amersham公司产品)，在4℃下免疫沉降60分钟。

然后，将琼脂糖凝胶用缓冲液1洗涤2次、洗涤剂1次、缓冲液2(100mM Tris-HCl、pH7.4)1次，共洗涤4次。洗涤所要时间为10分钟。

(3)酶反应

添加基质混合液50μl，在37℃下振荡10分钟进行酶反应。

(4)反应生成物的检测

与实施例1(4)同样测定酶活性。

图2显示了用实施例1和比较例1的方法测定所得CDK2活性值的比较图。从图2中可以看出，使用层析柱的本发明酶活性测定法检测出的CDK2酶活性与使用免疫沉降法的酶活性测定法检测出的CDK2活性大致相同。如以下表1所示，使用层析柱的酶活性测定法比使用免疫沉降法的酶活性测定法所花时间缩短了一半以上。

[表1]

	实施例1	比较例1
			捕捉酶/免疫沉降	12分钟	60分钟
洗涤	13分钟	10分钟
			酶反应	8分钟	10分钟
合计	33分钟	80分钟

实施例2和比较例2

将实施例1的(1)制备的试样分别稀释为蛋白质含量为10μg、20μg和50μg，然后，用与实施例1同样的方法测定CDK1和2的活性(实施例2)。将该试样稀释为蛋白质含量为10μg、20μg、50μg和100μg，用与比较例1同样的方法测定CDK1和2的活性(比较例2)。

从实施例2和比较例2获得的相对于各蛋白质含量的CDK2活性如图3和图4所示。

从图3和图4可以看出，使用层析柱的酶活性测定法与过去使用免疫沉降法的酶活性测定法同样具有定量性。

另外，关于蛋白质含量为20μg的试样，用与实施例1同样的方法测定的CDK1和2的活性如图5所示。

因蛋白质含量为20μg的试样其CDK1活性低于检测界限，用与比较例1同样的方法无法测定，而如图5所示，使用层析柱的酶活性测定法则可以检测，从而测定CDK1活性的检测下限得以提高。

实施例3：使用层析柱测定CDK1和2的活性

在实施例1(2)的柱制备阶段，预先在软管内将底物朊A琼脂糖凝胶FF(Amersham公司产品)和多克隆抗CDK1或2抗体(Santa CruzBiotechnology公司产品)溶液混合培养，制成填充剂后，填充到层析柱，其他操作与实施例1相同，测定CDK1和2的活性。

本实施例也与实施例1一样，可以缩短酶活性测定所需时间。测定本实施例所得CDK2活性的值，可以得出与在图2所得的值基本相同的结果。

本申请是根据日本国专利申请第2004-163367号(2004年6月1日申请)申请要求优先权，本专利权利要求的范围、说明书、附图和摘要的全部内容均作为参考，列入本说明书中。

产业上的实用性

本发明的酶活性测定法是能够快速有效地测定酶活性的方法。以此方法测定CDK活性，可以诊断胃癌、肠癌、乳癌、肺癌、食道癌、***癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫癌、脑瘤、骨肉瘤和骨髓瘤等癌症。

Claims (8)

1.一种酶活性测定方法，包括以下步骤：(1)在填充有由不溶于水的底物和固定于该底物中、能识别待测酶的抗体构成的填充剂的柱内，加入含待测酶的试样，用上述抗体捕捉酶；

(2)在上述柱内加入上述酶的基质，使被上述抗体捕捉的酶与上述基质反应，以及

(3)检测上述反应所得生成物。

2.一种酶活性测定方法，包括以下步骤：(1)在填充有不溶于水的底物的柱内加入识别待测酶的抗体，将上述抗体固定于上述底物中；

(2)在上述柱内加入含有待测酶的试样，以上述抗体捕捉该酶；

(3)在上述柱内加入上述酶的基质，使其与上述抗体捕捉的酶发生反应；以及

(4)检测上述反应的生成物。

3.如权利要求1或2所述的酶活性测定方法，其特征在于：底物是粒子。

4.如权利要求1～3的其中1项所述的酶活性测定方法，其特征在于：待测酶为磷酸化酶。

5.如权利要求4所述酶活性测定方法，其特征在于：磷酸化酶为周期素依赖性激酶。

6.一种填充了填充剂的酶活性测定用柱，该填充剂由不溶于水的底物和固定于上述底物、能识别磷酸化酶的抗体构成。

7.如权利要求6所述的酶活性测定用柱，其特征在于：所述磷酸化酶为周期素依赖性激酶。

8.如权利要求6或7所述的酶活性测定用柱，其特征在于：直径为0.3～30mm，全长为5～100mm。

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