CN1961068A - 骨髓基质细胞培养神经干细胞的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明包括促进神经干细胞生长的方法和组合物。本发明还包括调节神经干细胞(NSC)表面MHC分子表达的方法。图1描述了BMSC在BMSC培养基(DMEM－低葡萄糖、10％抽样试验的胎牛血清)或NSC培养基(DMEM－F12、N2－添加物、EGF 20ng/ml、bFGF 10ng/ml、肝素8μg/ml、青霉素－链霉素)中的增殖。

Description

骨髓基质细胞培养神经干细胞的方法和组合物

背景技术

骨髓包括至少两种干细胞：造血干细胞和非造血组织干细胞，后者有各种不同的提法：间充质干细胞、脊髓基质细胞(MSCs)或骨髓基质细胞(BMSC)，这些术语在本文中是同义的。脊髓基质细胞引起人们的兴趣是因为它们可以轻易从小骨髓抽吸物中分离，并容易生成单细胞衍生集落。单细胞衍生集落可以在10周内有50次的群体倍增，并分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(A.J.Friedenstein等人.1970 Cell Tissue Kinet.3：393-403；H.Castro-Malaspina等人.1980Blood 56：289-301；N.N.Beresford等人.1992 J.Cell Sci.102：341-351；D.J.Prockop 1997 Science 276：71-74)、肌细胞(S.Wakitani等人.1995 Muscle Nerve 18：1417-1426)、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元(S.A.Azizi等人.1998 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3908-3913；G.C.Kopen等人.1999 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10711-10716；M.Chopp等人.2000 Neuroreport 11，3001-3005；D.Woodbury等人.2000 Neuroscience Res.61：364-370)。

而且，脊髓基质细胞(MSCs)生成所有三个胚层的细胞(Kopen，G C.等人.1999 Proc.Natl.Acad.Sci.96：10711-10716；Liechty，K.W.等人.2000 Nature Med.6：1282-1286)；Kotton，D.N.等人.200lDevelopment 128：5181-5188；Toma，C.等人.20002 Circulation 105：93-98；Jiang，Y.等人.2002 Nature 418：41-49)。体内证据表明未分化的骨髓源细胞与MSCs纯细胞群一样都生成上皮细胞，包括肺的上皮细胞(Krause，等人.2001 Cell 105：369-377；Petersen，等人.1999Science 284：1168-1170)。而最近的几项研究表明MSCs的移植由于组织损伤而被增加(Ferrari，G.等人.1998 Science 279：1528-1530；Okamoto，R.等人.2002 Nature Med.8：1101-1017)。基于这些原因，目前正在考察脊髓基质细胞在多种人类疾病的细胞治疗和基因治疗中的应用(Horwitz等人.，1999 Nat.Med.5：309-313；Caplan，等人.2000 Clin.Orthoped.379：567-570)。

脊髓基质细胞构成了多能干细胞的一个选择来源。在生理条件下，脊髓基质细胞分别在不同的细胞粘附分子和细胞因子的帮助下维持骨髓组织结构和调控造血细胞的生成(Clark，B.R.&Keating，A.1995 Ann NY Acad Sci 770：70-78)。通过选择性吸附于组织培养塑料而在骨髓外生长的脊髓基质细胞能够被高效扩增(Azizi，S.A.，等人.1998 Proc Natl Acad Sci USA，95：3908-3913；Colter，D.C.，等人.2000Proc Natl Acad Sci USA 97：3213-218)，并可对其进行遗传操作(Schwarz，E.J.，等人.1999 Hum Gene Ther 10：2539-2549)。

脊髓基质细胞也被称为间充质干细胞，因为它们能够分化为多重中胚层组织，包括骨(Beresford，J.N.，等人.1992 J Cell Sci 102：341-351)、软骨(Lennon，D.P，等人.1995 Exp Cell Res 219：211-222)、脂肪(Beresford，J.N.，等人.1992 J Cell Sci 102：341-351)和肌肉(Wakitani，等人.1995 Muscle Nerve 18：1417-1426)。另外，已经报道了分化为表达神经元标志物的类神经元细胞(Woodbury，D.，等人.2000J Neurosci Res 61：364-370；Sanchez-Ramos，J.，等人.2000 Exp Neurol164：247-256；Deng，W.，等人.2001 Biochem Biophys Res Commun282：148-152)，表明脊髓基质细胞也许能够克服胚层定型。

干细胞是自我更新的多功能祖细胞，在特定时期的特定组织中具有最广泛的发育潜力(Morrison等人.1997 Cell 88：287-298).最近，神经***干细胞的研究引起了广泛兴趣，由于它们对理解神经发育的重要性和在治疗神经变性疾病中的治疗潜力。

分离和保持胚胎和其他干细胞系的现有方法依赖于使用鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层。已经发现，在培养液中使用血清替换物而使胚胎干细胞克隆的频率提高几倍(Amit等人.2000 Dev Biol 227：271-278)。无性系胚胎干细胞持续而无分化的繁殖需要有基本成纤维细胞生长因子的存在。目前用于分离、培养和扩增人类胚胎干细胞的方法都因依赖于鼠胚胎成纤维细胞滋养层而受到限制。依然需要证明的是：在缺乏滋养细胞时，干细胞能够无限制的保持一种未分化的状态。

为提高人类胎儿脑干细胞的生长速率，许多不同的研究团队在过去十年间使用了几种不同的方法和生长因子。已经表明人类胎儿神经细胞干(hNSC)的扩增和保持需要有基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。这些人类神经干细胞培养物以游离自由浮动细胞簇(神经球)的形式正常生长，但是在仅有bFGF和EGF存在时，神经球不能无限增殖。白血病抑制因子(LIF)表现出提高生长速率并延长FGF和EGF响应性神经干细胞的存活时间(Carpenter等人.，1999 and Wright等人.，2003)。除了调节生长速率，白血病抑制因子还积极调控几个基因，包括神经干细胞表面的主要组织相容性复合物分子(Wright等人.，2003)。

人胎儿脑干细胞被认为是用于损伤组织再生的干细胞移植的具有吸引力的候选。从胚胎或胎儿供体衍生来的干细胞需要同种移植。遗传上不同的个体之间的细胞移植常常伴有宿主排斥反应的危险。几乎所有细胞都表达主要组织相容性复合体产物，I类MHC分子。而且，许多种细胞在炎症性细胞因子的诱导下能表达II类MHC分子。同种异体移植的排斥反应主要由CD4和CD8亚类的T细胞介导。(Rosenberg等人.1992 Annu.Rev.Immunol.10：333)。同种异体反应性的CD4T细胞生成一些细胞因子，加剧了细胞溶解性的CD8对同种抗原的反应。在这些亚类中，竞争性细胞亚群形成于抗原刺激之后，所述抗原刺激具有所述亚类生成的细胞因子所赋予的特征。生成白细胞介素-2(IL-2)和免疫反应性纤维结合素-γ(IFN-γ)的Th1细胞主要与同种异体移植排斥反应有关(Mossmann等人.，1989 Annu.Rev.Immunol.7：145)。生成白细胞介素-4(IL-4)和生成白细胞介素-10(IL-10)的Th2细胞能够下调IL-10介导的Th1反应(Fiorentino等人.1989J.Exp.Med.170：2081)。事实上，已经进行了很多努力来使不希望发生的Th1反应转向Th2途径。对于病人体内T细胞对移植物的不良异体排斥反应，典型的治疗是采用免疫抑制剂药物，如波尼松、硫唑嘌呤和环胞素A。不幸的是，为了患者的生命通常需要使用这些药物，并且它们具有许多危险的副作用，包括全身性免疫抑制。

神经干细胞表达低(或可忽略不计)水平的I类MHC和/或II类MHC抗原(McLaren等人.2001J.Neuroimmunol.112：35)，但是这些细胞在移植入同种异体受者后通常受到排斥，除非使用免疫抑制药物。暴露于IFN这类炎症性细胞因子的细胞膜表面MHC分子水平被调高后，可能引发排斥反应。因此，非常需要培养条件的标准化，来使治疗用途的神经干细胞增殖和多种潜力最大化。另外，目前人们相信：一个成功的神经干细胞移植通过防止和/或降低不想要的免疫效应细胞介导的神经干细胞免疫反应，来转化神经干细胞的宿主排斥。

因此，长久渴望能抑制或防止遗传相异个体之间的神经细胞移植过程中不想要的免疫反应的方法，本发明则满足了这一需求。

发明内容

本发明包括培养神经干细胞的方法和组合物。本发明同时包括利用上述组合物和方法生成的细胞。

本发明包括一种组合物，该组合物包含一种分离的骨髓基质细胞(BMSC)和一种化学成分确定的培养介质，所述培养介质包含神经干细胞(NSC)生长培养基以及所述BMSC分泌的因子。

一个方面，所述培养介质不含外源性白血病抑制因子(LIF)。

另一个方面，BMSC分泌的因子选自生长因子、营养因子和细胞因子。

另一个方面，所述因子选自LIF、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子受体(EGF)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)、TIMP-2、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀(leptin)、干细胞因子(SCF)、***衍生因子-1(SDF-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。

本发明还包括在一种包含神经干细胞生长培养基的化学确定的培养介质中共培养BMSC和NSC。

一个方面，BMSC和NSC以一种依赖接触的方式培养，其中BMSC与NSC是物理接触的。

另一个方面，BMSC和NSC以一种非依赖接触的方式培养，其中BMSC与NSC不是物理接触的。

另一个方面，NSC来源于人中枢神经***。

另一个方面，BMSC来源于人。

另一个方面，将外源性遗传物质引入到本发明所述细胞中。

本发明还包括一种骨髓基质细胞条件培养介质(BMSC-CM)，包含一种化学确定的培养介质，其中包含神经干细胞生长培养基和分离的BMSC分泌的因子。

一个方面，BMSC-CM不包含外源性白血病抑制因子(LIF)。

另一个方面，BMSC-CM基本不含BMSC。

本发明的另外一个方面，BMSC-CM包含的因子选自生长因子、营养因子和细胞因子。

另一个方面，所述因子选自白血病抑制因子(LIF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子受体(EGF)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-lra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)、TIMP-2、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀(leptin)、干细胞因子(SCF)、***衍生因子-1(SDF-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。

本发明还包括一种主要组织相容性复合物分子在分离的NSC表面表达的调控方法。

一个方面，分离的BMSC和分离的NSC的共培养调节MHC分子在NSC表面的表达。

另一个方面，MHC分子在NSC上的表达能够通过用BMSC-CM培养NSC来调节。

本发明包括一种分离的NSC，经过共培养BMSC和NSC而制备。

本发明的一个方面，通过本发明方法生成的NSC表现出I类MHC分子的减少表达。

另一个方面，通过本发明方法生成的NSC表现出II类MHC分子的基线水平。

本发明也包括了一种神经细胞培养设备，其中含有分离的NSC、分离的BMSC、NSC生长培养基和一个防止NSC和BMSC之间物理接触的装置。

另一个方面，上述设备还包括一个过滤器或膜，使NSC和BMSC之间不产生物理接触。

另一个方面，上述过滤器或膜具有孔，来使所述BMSC分泌的因子通过所述过滤器或膜。

附图说明

为说明本发明，附图中描述了某些本发明的具体实施方式。但是，本发明不限于附图中描述的具体实施方式的安排和手段。

图1：描绘了BMSC在BMSC培养介质(DMEM-低葡萄糖、10％抽样试验的胎牛血清(FBS))或NSC培养基(DMEM-F12，N2-添加物、表皮生长因子(EGF)20ng/ml、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml、肝素8μg/ml、青霉素-链霉素(P/S))中的增殖。

图2：包括图2A-2C，是一系列描绘NSC成长为神经球的影像。图2B和2C描绘了在外源性白血病抑制因子(LIF)存在下生长的NSC。图2A描绘了缺乏LIF下生长的神经球。

图3：包括图3A-3D，是一系列描绘存在外源性LIF时(图3C和3D)和不存在外源性LIF时(图3A和3B)共培养BMSC和NSC的影像。

图4：包括图4A-4F，是一系列描绘NSC与BMSC共培养时巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达、预分化的影像(图4A-4F)。图4G和4H描绘了单独BMSC培养时缺少巢蛋白和GFAP的表达。

图5：包括图5A-5D，是一系列证明生长于BMSC上的NSC保留有分化成神经元和星形细胞的潜力的影像。图5A-5D描绘了分化的共培养物的MAP2-GFAP-DAPI染色。MAP2是一种神经细胞骨架蛋白。DAPI是用于细胞核染色的4′，6′-二脒基-2-苯吲哚盐酸。

图6：描绘分化的共培养物nestin-GFAP染色的影像，显示了分化后nestin的微量表达。

图7：描绘分化的NSC的GFAP-DAPI染色的影像。

图8：包括图8A和8B，是一系列描绘分化的BMSC的MAP2-GFAP-DAPI染色的影像，显示了神经元和星形细胞标志物的微量表达。

图9：包括9A和9B，是一系列荧光激活细胞分类器分析图谱(FACS)，描绘了BMSC缺失后的NSC的表型。图9A说明少于2％的细胞是CD-105阳性(BMSC的标记)。图9B说明多于90％是CD-133阳性。

图10：包括图10A和图10B，是一系列荧光激活细胞分类器分析图谱，描绘了BMSC的nestin表达缺失(图10A)和从BMSC共培养物中分离的NSC的nestin表达(图10B)。

图11：说明生长于BMSC上的NSC保留了其分化成神经元和星形细胞的多能性。

图12：描绘了存在或缺乏BMSC条件下，NSC在Transwell^TM中的生长。

图13：包括图13A和图13B，描绘了在Transwell中存在BMSC(图13A)或缺乏BMSC(图13B)条件下，NSC在未涂被平板上的生长的影像。

图14：包括图14A-14D，描绘了用骨髓基质细胞条件培养基(BMSC-CM)培养的NSC(图14A和14B)和在含有外源性LIF(图14C)或缺乏外源性LIF(图14D)的NSC-培养基中培养的NSC。

图15：比较了BMSC-CM与含有或不含外源性LIF的标准NSC培养基对NSC生长的效果。BMSC-CM1培养基来源于培养于含有EGF和FGF的NSC培养基中的BMSC。BMSC-CM2培养基源于培养于不含EGF和FGF的NSC培养基中的BMSC。

图16：包括图16A-16D，是一系列FACS分析图谱，描绘了从与两种不同的BMSC供体共培养中分离出来的NSC的表型曲线(图16A和16B)。图16C和图16D描绘了在分别在NSC培养基和含有外源性LIF的NSC培养基中不加入BMSC而培养出来的NSC的表型曲线。

图17：包括图17A-17D，是一系列FACS分析图谱，描绘了在含有和不含外源性LIF的NSC培养基中培养的NSC的表型，和在含有和不含生长因子的BMSC-CM培养基中培养的NSC的表型。图17A-17D分别描绘了CD56、CD133、II类MHC分子和I类MHC分子的曲线。

图18：包括图18A-18D，是一系列FACS分析图谱，描绘了在含有(图18B)和不含(图18A)外源性LIF的NSC培养基中培养的NSC的表型，和在完全NSC培养基(图18C和18D)中共培养的NSC的表型。图18描绘了在各种条件下培养的NSC的I类MHC分子和II类MHC分子的表达(黑色＝异型控制；灰色＝I类或II类)。

具体实施方式

本发明包括用于诱导和/或提高神经干细胞(NSC)增殖、同时保留其多能性的组合物和方法。本发明还包括用于调节NSC的MHC分子表达的组合物和方法。

本发明涉及一个发现，即骨髓基质细胞(BMSC)能够作为滋养层来支持NSC的增殖。这样，本发明包括用于诱导和/或提高NSC增殖、同时保持其多能性、用BMSC作为滋养层来培养NSC的组合物和方法。

另外，本发明公开说明：与在没有BMSC滋养层的、添加了用于提高扩增的外源性LIF的神经干细胞培养介质(NSC培养基)培养的其他相同的NSC相比，在BMSC滋养层上共培养NSC降低了NSC的MHC分子表达的上调和/或诱导。因此，本发明包括使用BMSC作为滋养层来培养和扩增NSC，用于降低和/或防止NSC的MHC分子表达的组合物和方法。

本文公开的数据也说明了BMSC分泌对NSC有用的生长因子、营养因子和/或细胞因子，同时保留了它们的多能性。BMSC分泌的因子能够通过如下方式收集：在一种培养基中培养BMSC一段时间并收集条件培养基备用。因此，本发明也包括一种骨髓基质细胞条件培养基(BMSC-CM)，对NSC的增殖并保持多能性是有用的。

本发明还涉及如下发现：由BMSC分泌的、存在于BMSC-CM中的因子降低了NSC的MHC分子表达的上调和/或诱导。因此，本发明包括，不存在和/或减少的NSC表面MHC分子表达上调时，使用BMSC-CM来扩增NSC的组合物和方法。

相应的，本发明包括用于生成医疗用途的NSC的方法和组合物。因此，本发明包括用于生成NSC的组合物和方法，所述NSC有助于治疗受中枢神经***疾病、失调或状态影像的患者。所述方法包括培养、扩增NSC和为患者给药NSC的步骤。

定义

本文使用的以下术语具有本节所述的含义。

“一个”在本文的使用是指其限定的目标物是一个或多于一个(即至少为“一个”)。例如，“一个元件”是指一个或多个元件。

术语“大约”可以被本领域普通技术人员所理解，并随在一定程度上根据其上下文有所变化。

这里使用的术语“自体同源的”意思是指从同一个体衍生而来并重新引入该个体的任何物质。

这里使用的术语“同种异体的”指从同一种的不同动物体中衍生出来的任何物质。

这里使用的术语“骨髓基质细胞”、“基质细胞”、“间充质干细胞”或“MSCs”相互间可以替换使用，指的是骨髓中的小部分细胞，能够作为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的干细胞样前体，并利用其粘附塑料平皿的能力而从骨髓中被分离。脊髓基质细胞可以来源于任何动物。在一些实施方式中，基质细胞优选的来源于灵长类。

“分化的”在这里用来指一种已经获得成熟的最终状态的细胞，这样的细胞发育完全并表现出生物专一性和/或对某种特定环境和/或功能的适应性。典型的，一种分化细胞的特征是在特定细胞中表达编码分化相关蛋白的基因。例如，在神经胶质细胞中髓鞘脂蛋白的表达和髓鞘的形成是神经胶质细胞终极分化的典型例子。当谈到一种细胞要“分化”，正如该术语在这里的使用，则所述细胞正处于一个分化过程。

“分化培养基”在这里用来指一种细胞生长培养基，包含或不包含一种添加剂，如：干细胞、胚胎干细胞、类似胚胎干细胞、神经球、NSC或其他类似的前体细胞，在培养介质中培养时没有完全分化，发展成一种具有一些或全部分化细胞特性的细胞。

“扩增能力”在这里用来指细胞的繁殖能力，例如，数目扩增或细胞群经历群体倍增的情况。

“滋养层”是要表示这样的细胞：生成生长因子、细胞因子、其他细胞衍生产品，并通过共培养中必要的接触来提供物理支持，以提高干细胞的增殖并保持干细胞未分化的多能性。

“滋养层”在这里用来描述一种第一组织类型的细胞，这些细胞与第二组织类型的细胞共培养，来提供一种第二组织类型细胞能够生长的环境。

这里使用的术语“生长培养基”意指一种促进细胞生长的培养介质。生长培养基一般会含有动物血清。在某些情况下，生长培养基可以不含动物血清。

这里使用的术语“NSC培养基”意指一种用于NSC培养和扩增的培养介质。典型的NSC培养基包括DMEM/F12，N2添加剂、EGF、bFGF和肝磷质。在一些情况下，NSC培养基可以不含生长因子(如EGF和bFGF)。

“骨髓基质细胞条件培养基”(BMSC-CM)在这里用来指利用培养BMSC而被限定条件的培养介质。基于本公开，BMSC-CM是通过在NSC培养基中培养BMSC而获得，因此，通过使BMSC向NSC培养基中分泌存在于其他化合物中的生长因子、营养因子和细胞因子的方式，BMSC-CM的条件被培养物中的BMSC所限定。能够用BMSC-CM培养NSC，来提高NSC的繁殖，同时保持NSC的多能性。另外，能够用BMSC-CM以一种调节MHC分子表达的方式来培养NSC。

“白血病抑制因子”(LIF)在这里用来指白介素-6家族中的一种22KDa的蛋白质，其具有多种生物学功能。已经证明LIF具有如下能力：诱导白血病细胞中的终极分化、诱导正常和髓细胞性白血病细胞中造血分化和刺激肝细胞中急性期蛋白的合成。在这里，LIF也显示出了提高未分化状态NSC的繁殖，同时保持NSC的多能性。

“外源性LIF”指从一种生物体、细胞或***引入或由其产生并排出的LIF。

这里使用的术语“多能性的”或“多能性”意指中枢神经***的一种干细胞分化成多种类型细胞的能力。例如，一种多能性的中枢神经***干细胞能够分化成，但不限于，神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。

“神经球”在这里用来指一种神经干细胞/祖细胞，其中能够检测到巢蛋白的表达，包括，尤其是通过免疫染色来检测细胞中的巢蛋白。神经球生殖神经干细胞的聚集物，而形成神经球是神经干细胞体内培养的特点。

“神经干细胞”在这里用来指一种未分化的、多能的、自我更新的神经细胞。神经干细胞是一种克隆原多能干细胞，能够分化并在适宜条件下具有自我更新能力，并且能够最终分化成神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。因此，神经干细胞是“多能的”，因为干细胞的子代具有多重分化途径。神经干细胞能够自我保持，意味着每次细胞***得到的子细胞一般也会是干细胞。

“神经细胞”在这里用来指一种与来源于中枢神经***和/或末稍神经***的神经胶质细胞和神经元具有相似形态、功能和表型特征的细胞。

“神经元样细胞”在这里用来指一种与神经元具有相似形态的细胞，它可探测性的表达神经元特异性标记，例如(但不限于)MAP2、神经纤丝200kDa、神经纤丝-L、神经纤丝-M、突触素、β-微管素(TUJI)、氨基乙磺酸(Tau)、N-乙酰神经氨酸(NeuN)、神经纤丝蛋白和联会蛋白(synaptic protein)。

“星形样细胞”在这里用来指一种具有与星形细胞具有相似表型的细胞，它表达星形细胞特异性标记，例如(但不限于)GFAP。

“少突神经胶质细胞样细胞”在这里用来指一种具有与少突神经胶质细胞相似的少突神经胶质细胞特异性标记，例如，但不限于，O-4。

“细胞周期的进程”在这里用来指一个细胞准备和/或进入有丝***和/或减数***的过程。细胞周期的进程包括G1期、S期、G2期和M-期。

“繁殖”在这里用来指相似类型(特别是细胞)的复制或倍增。即繁殖包括更大量细胞的生成，能够通过简单计算细胞数目、检测3H-胸腺嘧啶核甙整合入细胞等类似方法而得到测定。

本文适用的术语“外源性”指从一种生物体、细胞或***引入的或由它们排出的任何物质。

“编码”指的是一种多聚核苷酸中特定核苷酸序列的固有性质，例如基因、cDNA或mRNA，作为模板在生物过程中合成其他具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或氨基酸序列以及由此产生的生物学性质的聚合物和大分子。因此，如果细胞或其他生物***中的一个基因的相应mRNA转录并翻译生成一种蛋白，那么该基因就编码该蛋白。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常以序列列表的形式提供)和非编码链(作为基因或cDNA的转录模板)都可以被指为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

除非有其他规定，一种“编码一种氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有相互间是变性形式的核苷酸序列，它们编码同一种氨基酸。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。

“分离的核酸”指的是从天然存在的位于其两侧的序列中分离出来的核酸片断，例如一种DNA片断从与其正常相邻的序列上去除，例如从基因组中与该片断相邻的序列上自然分离。该术语也指从其他天然伴随的成分中大量纯化的核酸，细胞中与其天然伴随的成分如RNA、DNA或蛋白质。该术语因此包括，例如，整合入载体、自我复制的质粒或病毒、或原核或真核基因组DNA中的重组DNA，或作为单独分子存在、独立于其他序列重组DNA(例如通过PCR或限制性酶切而产生的cDNA、基因组片断或cDNA片断)。该术语还包括一种重组DNA，作为杂合基因的一部分并编码额外的多肽序列。

在本发明的上下文中，适用了下述代表普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺嘌呤，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟嘌呤，“T”指的是胸腺嘧啶，“U”指的是尿嘧啶。

“载体”是一种物质组合物，包括一个分离的核酸并能用来将该分离的核酸送入细胞内部。现有技术中已知的大量载体包括，但不限于，线性多聚核苷酸、与离子化合物或两性化合物结合的多聚核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括一种自我复制的质粒或病毒。该术语也应该解释为包括促进核酸转入细胞的非质粒和非病毒化合物，如多聚赖氨酸化合物、脂质体和类似物。病毒载体的例子包括，但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和类似物。

“表达载体”指的是一种包含重组多聚核苷酸的载体，所述重组多聚核苷酸含有调控序列，该调控序列被连接到想要表达的核苷酸序列。一个表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件，其他用于表达的元件能够由宿主或体外表达***提供。表达载体包括所有那些现有技术已知的载体，例如Cos质粒，质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和整合重组多聚核苷酸的病毒。

描述

本发明包括一种提高NSC的繁殖，同时保持其多能性的方法。该方法包括采用现有技术已知的方法分离NSC，将NSC与BMSC共培养来提高NSC的繁殖并同时保持NSC的多能性。两种细胞类型的培养可以采取NSC与BMSC有物理接触的接触依赖的方式，或者NSC与BMSC没有物理接触的非接触依赖方式。

本发明涉及这样一个发现：NSC的扩增能力(NSC自我复制多次的能力)可以通过与BMSC的共培养而得到提高。即，本发明的一个实施方式涉及这样一个发现：BMSC在共培养体系中能够作为支持细胞服务于NSC的扩增。熟悉现有技术的人员可以认识到：依据本发明公开的内容，BMSC可以作为NSC的滋养层并提供包括-但不限于-生长因子、营养因子和细胞因子在内的因子，来支持NSC的培养，同时保持NSC的多能性。BMSC滋养层也可以作为一单层，NSC能够在上面生长。

熟悉现有技术的人员将认识到，基于本发明公开的内容，BMSC和NSC也可以在其他现有技术已知的因子存在的条件下共培养，来提高NSC的繁殖。

本发明中，BMSC和NSC可以在缺乏外源性LIF的条件下共培养，来提高NSC的繁殖，同时保持NSC的多能性。本发明公开的内容表明所述NSC的繁殖和扩增水平显著高于单独培养于含有外源性LIF的涂布平板(即多鸟氨酸/纤维蛋白连接素涂布平板)上的NSC的扩增水平。因此，本发明提供了一种不需要使用涂布平板和/或外源性LIF的培养NSC的方法。

本发明的另外一个实施方式包括一种从BMSC和NSC共培养物中排除或分离BMSC的方法。本发明涉及这样一个发现，BMSC能够通过如下方法从共培养物中分离：在共培养物中培养一种与BMSC结合的抗体，随后附加一个分离步骤，包括、但不限于磁性分离。结合BMSC的抗体的一个例子是抗CD13抗体。磁性分离过程伴随使用磁珠，包括、但不限于Dynabead(Dynal Biotech，Brown Deer，WI)。关于Dynabead的使用，可以使用MACs分离溶剂(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)将BMSC从共培养物中去除。分离步骤的一个结果是获得了纯的NSC。FACS也可以用来去除BMSC，或者，正向选择NSC。

在本发明的NSC培养/扩增方法中，NSC保持了其多能性(分化成不同细胞类型的能力，如神经元、星形细胞、少突神经胶质细胞和其他)。在本反明的另一实施方式中，相对于采用现有技术方法扩增或培养的NSC，采用本发明的方法扩增的NSC保持了更大程度(即更大的比例)的分化能力。

这里描述的NSC培养/扩增方法解决了应用NSC治疗人类疾病中的一个重要问题，即，在本公开之前，很难从培养物中分离和扩增NSC(即很难诱导它们繁殖充足的数量)。这里公开的内容说明NSC能够被大量培养并分离，满足治疗用途。

本发明也涉及这样的发现：NSC的MHC分子表达可以通过共培养BMSC和NSC来进行调节。这里公开的内容说明，除了提高NSC的繁殖并保留其多能性外，与采用现有技术中已知方法培养的NSC相比较，共培养BMSC和NSC还减少了NSC的MHC分子表达的上调和/或诱导。就是说，本发明提供了一种培养NSC的方法，该方法提供了比提高培养物中NSC繁殖的标准方法更多的好处。

共培养体系提供了一种培养NSC的方法，其好处明显优于在涂布平板或含有外源性LIF的涂布平板上单独培养NSC。正如本文其他地方讨论的，共培养体系第一次提供了一种不需要使用涂布平板或外源性LIF而生成大量NSC的方法。另外，共培养体系的方法与现有技术中使用标准NSC培养基单独培养NSC的方法相比，具有额外的好处和/或更大的好处。这些好处包括(但不限于)：提高NSC的繁殖并保持NSC的多能性和调节NSC的MHC分子表达。

在本发明的另外一个实施方式中，NSC能够在缺乏外源性LIF的条件下与BMSC共培养，来减少NSC的MHC分子表达的上调和/或诱导。亦即，本发明提供了一种不需要使用外源性LIF的培养NSC的方法。这里公开的内容说明共培养体系中的BMSC能够作为滋养层来给共培养的NSC提供因子，包括(但不限于)生长因子、营养因子和细胞因子。相信，BMSC提供的因子为共培养的NSC提供的、在扩增和MHC分子表达方面的有益效果要超出在NSC培养基的涂布平板上单独培养NSC的益处。

使用本文公开的方法能够调节MHC分子表达的这样一个发现，提供了一种繁殖NSC的方法，NSC在治疗、诊断、实验性使用等方面都是有用的。例如，与现有技术中已知方法相比，利用本文公开的方法而降低了的NSC的MHC分子表达提供了一种降低NSC免疫原性的方法。优选的，NSC的降低了的MHC分子表达提供了一种增加NSC移植入受体成功率的方法。

共培养NSC和BMSC提供了一种以两种细胞的接触依赖或非依赖方式来调节NSC的MHC分子表达的方法。在本发明的一个实施方式中，NSC能够以接触依赖方式与BMSC共培养。不希望受任何特定理论的束缚，BMSC和NSC的物理接触为NSC的繁殖和扩增带来了有益效果。两种细胞的物理接触也促成了NSC的MHC分子表达的调节。优选的，与其他使用添加外源性LIF的标准NSC培养基而没有BMSC的涂布平板培养的同样的NSC相比，以两种细胞接触依赖的方式来共培养NSC和BMSC减少了NSC的MHC分子表达的上调和/或诱导。

在本发明的另外一个实施方式中，NSC能够以非依赖接触的方式与BMSC共培养，来调节NSC的MHC分子表达。本发明涉及这样的发现：NSC和BMSC可以在Costar Transwell^TM中共培养，通过一种可透过的膜过滤器来分离两种细胞并防止NSC和BMSC之间的物理接触。所述可透过的膜过滤器允许BMSC分泌的因子透过膜并因此有效促成NSC的表型，例如提高NSC的繁殖并保持其多能性和调节NSC的MHC分子表达。

使用Transwell^TM的实验证明，本发明公开的内容表明：通过将BMSC补加入培养介质中(BMSC分泌的因子也进入培养介质)，BMSC能够在两种细胞之间缺少直接接触的条件下支持共培养体系中NSC的生长和扩增。不希望受任何特定理论的束缚，BMSC分泌的因子促成了NSC的表型。因此，本发明提供了一种共培养BMSC和NSC的方法，不需要将BMSC作为NSC直接生长在其上的滋养层。本发明提供了一种以接触非依赖方式共培养BMSC和NSC的方法，其中，NSC通过吸收共培养体系中BMSC分泌的因此而获得来自BMSC的益处。

本领域技术人员基于本发明公开的内容将认识到任何防止NSC和BMSC形成物理接触的方法都能够用于共培养体系。例如，可以使用不同于Transwell^TM的任何***/设备，以接触非依赖的方式共培养细胞。这样的***/设备包括(但不限于)过滤器和膜，其具有的孔径将防止两种细胞的直接接触，但允许一些因子通过过滤器/膜。使用这样的***/设备来共培养BMSC和NSC的好处是能够提供一种在一个体系内培养NSC的方法，所述体系具有连续的、用于NSC增殖的因子来源。这样，本发明包括一种组合体，包含：一种神经干细胞培养设备，其中含有分离的NSC、分离的BMSC、NSC生长培养基和由所述分离的BMSC分泌的因子；一种防止NSC和BMSC相互接触的装置。

基于这样的发现，即BMSC能够通过分泌因子进入培养介质来以接触非依赖方式支持共培养体系中NSC生长，来评价BMSC条件培养基是否能够以提高NSC繁殖并保持其多能性和调节NSC的MHC分子表达的方式来支持NSC的生长。本发明公开的内容说明BMSC条件培养基能够支持NSC的生长，并且具有显著的有益效果，尽管没有接触依赖方式的共培养更有效。因此，本发明提供了一种使用骨髓基质细胞条件培养基(BMSC-CM)来培养NSC方法，且没有使用共培养体系。使用BMSC-CM来培养NSC，也提供另外一种繁殖NSC的方法，该方法生成的NSC与采用共培养体系培养的NSC具有等同的性质。

另外，本公开内容说明BMSC-CM能够替代补加了外源性LIF的NSC培养基用于培养NSC。本公开内容说明依照在BMSC-CM中培养NSC的方法生成细胞数目与使用添加了外源性LIF的NSC培养基所生成的细胞数目相当。因此，本发明提供了一种使用BMSC-CM作为一些有益于诱导NSC繁殖的因子来源的方法，使NSC的繁殖速度相当于或大于使用添加了外源性LIF的NSC培养基来繁殖NSC的速度。

本发明还说明BMSC-CM能够替代涂布平板，例如多鸟氨酸/纤维蛋白连接素涂布平板，用于采用NSC培养基来培养和扩增NSC。这里公开的内容说明NSC能够利用BMSC-CM在未涂布的平板上扩增。可以观察到，NSC利用BMSC-CM在未涂布的平板上的扩增至少相当于或大于在NSC培养基，甚至是含有外源性LIF的NSC培养基的涂布平板上单独培养的NSC的扩增。因此，本发明包括一种不需要涂布平板和外源性LIF而利用BMSC-CM来培养NSC的方法。

BMSC-CM的使用还提供了一种培养NSC的方法，其方式是在共培养体系中不使用BMSC而为NSC提供益处。本公开内容说明BMSC-CM能够支持NSC的培养并为其提供相当于使用包含BMSC和NSC的共培养体系所观察到的益处。这样，本发明包括一种使用BMSC-CM来培养NSC以提高NSC的繁殖并保持其多能性和调节NSC的MHC分子表达的方法。如这里证明的，BMSC能够用来产生骨髓基质细胞条件培养基(BMSC-CM)。BMSC-CM是一种由培养物中的BMSC条件化的培养介质，通过在NSC培养基中培养BMSC并使BMSC在NSC培养基中分泌生长因子、营养因子和/或细胞因子。BMSC-CM包括由BMSC分泌的生长因子、营养因子和/或细胞因子，还包括(但不限于)：LIF、脑源性神经营养因子(BDNF)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-lra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)、TIMP-2、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀(leptin)、干细胞因子(SCF)、***衍生因子-1(SDF-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。

BMSC-CM对NSC的繁殖和扩增并保持其多能性是有益的。BMSC-CM的使用提供了一种将由BMSC分泌的生长因子、营养因子和/或细胞因子等引入NSC，用于NSC的繁殖和扩增。

BMSC-CM的使用提供了一种诱导NSC以相当于或大于使用添加了外源性LIF的NSC培养基培养时的速度繁殖，甚至是在未涂布的平板上。因此，本发明提供了组合体和方法，用于使用BMSC-CM生成大量的、用于治疗使用的NSC。

除了BMSC-CM用于支持NSC繁殖并保持其多能性外，本公开内容还说明：在BMSC-CM中培养NSC提供了一种调节NSC的MHC分子表达的方法。优选的，与在含有外源性LIF的NSC培养基中培养的其他相同的NSC相比，在BMSC-CM中培养NSC减少了NSC的MHC分子表达。使用BMSC-CM来调节NSC的MHC分子表达是基于这样的发现：在用于检测II类MHC分子的条件下，与其他培养于含有外源性LIF的NSC培养基中的同样的NSC相比，在BMSC-CM中生长的NSC不表达II类MHC分子并展现出较低水平的I类MHC分子。这一发现与依照BMSC和NSC共培养方法(以接触依赖或接触非依赖方式)使NSC的MHC分子表达减少的发现相一致。无论以接触依赖还是非接触依赖的方式，是采用BMSC作为滋养层还是在BMSC-CM中培养NSC，都提供了一种减少NSC的MHC分子表达的方法。使用本发明公开的方法能够调节MHC分子表达的发现提供了一种有助于治疗用途的NSC繁殖方法。使用本发明公开的方法而降低的NSC的HMC分子表达还提供了一种增加NSC移植入受体成功率的方法。

基于本公开内容，本发明包括使用BMSC-CM来培养和扩增NSC并减少NSC的MHC分子表达。即，本发明基于这样的发现：与培养于含有外源性LIF的NSC培养基的其他相同的NSC相比，使用BMSC-CM扩增NSC减少和/或防止了NSC表面MHC分子表达的上调。这样，本发明包括一种有助于治疗用途的繁殖细胞的方法。

已经广泛确定：遗传上不同的个体(同种异体)之间的细胞移植常常伴随移植排斥的危险。几乎所有细胞都表达组要组织相容性复合体(MHC)I类分子。另外，许多类型细胞在暴露于炎症性细胞因子时都能够被诱导表达II类MHC分子。同种异体移植的排斥反应主要由识别I类和II类MHC分子的T细胞CD4和CD8亚类来介导。移植中的主要目标是供体移植物的永久植入，同时没有诱导产生于受体的移植排斥免疫反应。这样，本发明包括减少和/或消除受体细胞针对移植入的受体体内的NSC的免疫反应的方法，通过在移植前使用这里公开的方法来培养NSC，目的是减少NSC的MHC分子表达。不希望受任何特定理论的束缚，应用这里公开的方法，使NSC的MHC分子表达减少，可以减少展现在NSC细胞膜上的MHC分子的量，从而减少受体体内NSC的免疫原性。

本发明也可以用来获得表达外源基因的NSC，所以NSC能够用于细胞治疗或基因治疗。即，本发明考虑到了表达外源基因的NSC的大量生产。外源基因可以是一个内源基因的外源版本(即，相同基因的野生型版本可以用来置换含有突变的缺陷型等位基因)。外源性基因可以包括用于中枢神经***(CNS)再生的营养因子或靶向癌症的细胞毒基因。外源性基因通常(但非必须)与一个或多个其他基因共价连接(即，“融合(fused with)”)。示例的“其他”基因包括：应用于“阳性”筛选来选取整合了外源基因的细胞的基因和应用于“阴性”筛选来选取将外源基因整合入内源基因同一染色***点的细胞的基因，或者两者都有。

本发明方法获得的NSC能够被诱导而分化成神经元、星形细胞、少突胶质神经细胞等，通过现有技术已知的培养条件进行选择性培养来使NSC分化成一种选定类型的细胞。

本公开内容所述的经培养或扩增的NSC，在分化成所选择的细胞类型之前或之后，能够被用来治疗多种现有技术已知可用NSC来治疗的病症。在这些治疗方法中有用的NSC可以包括含有***的外源基因的NSC，和不含***的外源基因的NSC。所述病症包括(但不限于)脑外伤、亨廷顿舞蹈病(Huntington’disease)、阿耳茨海默病(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、脊髓损伤、中风、多发性硬化症、癌症、CNS溶酶体贮存病和头部创伤。

NSC和BMSC的分离

NSC能够从哺乳动物，优选为人类，的中枢神经***中获得。这些细胞能够从多种组织中获得，包括(但不限于)前脑、后脑、整脑和脊髓。NSC能够使用本文其他地方详述的方法或现有技术的已知方法而被分离和培养，例如使用美国专利5958767中公开的方法，因此在这里以引证的方式将其全部内容并入本文。其他现有技术中公知的用于分离NSC的方法能够由技术人员容易的使用，包括将来开发出来的方法。本发明绝非限于这些或任何其他获得相关细胞的方法。

能够从许多不同类型的组织中分离NSC，例如：供体组织，通过从该组织的连接细胞外基质分离个体细胞；或者从NSC的商业来源。一个实施例中，采用无菌操作剥离脑源组织，然后采用现有技术已知的任何方法来离解细胞，包括酶处理方法，如胰蛋白酶、胶原酶等等，或者采用物理离解方法，如采用钝器研磨或处理。神经细胞和其他多能干细胞的离解可以在无菌组织培养液中进行。离解细胞经低速离心(在200rpm和2000rpm之间)，吸取上清液，然后用培养液悬浮细胞。

现有技术已经描述了BMSC的来源和从这些来源中获得BMSC的方法。BMSC能够从任何骨髓中大量获得，包括例如从人类供体的髂嵴中抽吸获得的骨髓。从供体获得骨髓的方法是现有技术公知的，并在如美国专利6653134和WO96/30031中被说明，因此在这里并入它们的全部内容作为参考。人类间充质干细胞可以从Cambrex公司(Walkersville，MD.)购买，

分离的神经干细胞的应用

分离的神经干细胞在多个方面都有应用。这些细胞可以用于重新构建哺乳动物体内的细胞，所述哺乳动物的细胞因疾病或损伤而失去。基因疾病可以得到治疗，通过自体同源或异体同源神经干细胞的基因修饰来修正基因缺陷或防御疾病。与缺乏特定分泌产物(如荷尔蒙、酶、生长因子等)相关的疾病也可以使用NSC来治疗。中枢神经***紊乱包括很多疾病，如神经变性疾病(例如阿耳茨海默病和帕金森病)，急性脑损伤(例如中风、脑损伤、脑性麻痹、肿瘤切除、化疗和放疗支持疗法)和许多中枢神经***机能障碍(例如抑郁、癫痫和神经***)。包括(但不限于)阿耳茨海默病、多发性硬化症(MS)、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s Chorea)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和帕金森病在内的一些疾病都与神经***特定位置的神经细胞退化有关，细胞退化导致这些细胞或大脑没有能力执行其预期的功能。这里所述经分离和培养的NSC能够被用作祖细胞来源，用于特定细胞来治疗这些疾病。NSC能够被用作营养因子源，来刺激内源性干细胞和神经***的再生。这里所述经培养的NSC可以在液氮温度下冷冻并长期保藏，解冻后能够再次使用。所述细胞通常保存于10％DMSO和90％NSC的介质中。一经解冻，可以使用本文他处描述的方法来扩增所述细胞。

基因修饰

本发明的细胞能够通过外源遗传物质的导入而被基因修饰，来生成营养因子、生长因子、细胞因子、神经营养因子及其他类似因子，这对NSC的培养是有益处的。例如，与未经基因修饰的BMSC相比，BMSC能够通过基因修饰来表达并分泌高水平的EGF。不希望受任何特定理论的束缚，经过基因修饰而表达和分泌EGF的BMSC将以比未经基因修饰的相同的BMSC增加的水平上分泌同一因子。

在共培养体系中使用工程BMSC的作用是使修饰后的BMSC持续提供外源性因子于共培养体系中。外源性因子可为培养的BMSC或NSC或两者带来益处。被导入BMSC的外源性遗传物质还可以有助于工程BMSC中其他内源性因子的分泌。另外，基因修饰的BMSC可以有助于相邻细胞中内源性因子的分泌。因此，本发明包括使用基因修饰的BMSC来为共培养体系持续供应内源性因子，在一些实例中，被导入BMSC的外源性遗传物质有助于基因修饰的BMSC和/或相邻细胞中内源性因子的分泌。无论如何，BMSC分泌的外源性因子和/或内源性因子为NSC的培养和增殖提供了有益因子。

而且，经基因修饰而表达和分泌一种因子(如EGF)的BMSC还能够用于生成具有增加的EGF水平的BMSC-CM。除了为BMSC-CM提供增高水平的外源性因子外，基因修饰的BMSC还有助于工程BMSC和/或相邻细胞中内源性因子的分泌。所述因子包括(但不限于)：LIF、脑源性神经营养因子(BDNF)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-lra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)、TIMP-2、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀(leptin)、干细胞因子(SCF)、***衍生因子-1(SDF-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。

使用基因修饰的BMSC来生成BMSC-CM的益处是提高外源性因子的水平，例如EGF，使EGF从工程BMSC分泌入培养基，而不是从其他相同但未经基因修饰的BMSC中分泌。随着从基因修饰细胞分泌的EGF水平的提高，更多的EGF出现于BMSC-CM。另外，工程BMSC分泌的提高的EGF水平可能有助于工程BMSC和/或相邻细胞中其他内源性因子的分泌。具有提高的EGF和/或其他因子水平的BMSC-CM能够用于NSC的培养和扩增。

在另外一个方面中，BMSC可以被基因修饰来表达HSV-胸腺嘧啶核苷激酶或绿色荧光蛋白(GFP)这样的蛋白，这些蛋白能够用于BMSC共培养物中的NSC扩增后的分离，分别通过Gancyclovir处理或在流式细胞仪上分离。

除了基因修饰BMSC，本发明还包括基因修饰的NSC。基因修饰的NSC能够用于取代个体中有缺陷的细胞。本发明还可以用于表达被分泌的想要的蛋白质。就是说，NSC能够被分离并导入一种目标蛋白质的基因，然后被导入个体，目标蛋白质将在该个体中生成并发挥或产生治疗效果。本发明的这个方面涉及基因治疗，其中，通过将基因修饰的NSC引入个体来为该个体注入治疗性蛋白质。基因修饰的NSC经过本文公开的方法培养、分离并植入个体，该个体将在所述蛋白被体内NSC表达和分泌后而受益。

根据本发明，含有编码异源蛋白的核苷酸序列的构建基因被导入NSC中。即NSC细胞被基因改变而引入一种基因，该基因的表达在个体中具有治疗作用。根据本发明的一些方面，来源于一个个体或另外一个个体或非人类动物的NSC可以被基因改变来取代缺陷基因和/或引入一种其表达在个体中具有治疗作用的基因。

所有情况下，构建基因都是被转染入细胞的，外源基因被可控连接到细胞内基因表达所需的调控序列。这样的调控序列包括启动子和多腺苷酸化信号。

所述构建基因优选的被提供为表达载体，包括与基本的调控序列可控连接的外源蛋白的编码序列，当该载体被转染入细胞后，编码序列将被细胞所表达。编码序列与在细胞内表达该序列所必需的调控元件相连。编码所述蛋白的核苷酸序列可以是cDNA、基因组DNA、合成DNA或其杂合体、或诸如mRNA的RNA分子。

构建基因包括编码有益蛋白的与调控元件可控连接的核苷酸序列，它可以作为功能性细胞质分子、功能性游离分子存在于细胞中，也可以整合入细胞同源染色体DNA中。外源遗传物质可以被导入细胞，以独立的遗传物质形式(如质粒)存在。或者，可以将能够整合入同源染色体中的线性DNA导入细胞。在将DNA导入细胞中时，可以加入一些促进DNA与同源染色体整合的试剂。DNA分子中还可以包括用于促进整合的DNA序列。或者，可以将RNA导入细胞中。

用于基因表达的调控元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。优选的，这些元件在本发明细胞中是可操作的。另外，优选的，这些元件与编码蛋白质的核苷酸序列可控连接，这样核苷酸序列能够在细胞中表达，从而生成蛋白质。起始密码子和终止密码子一般被认为是编码蛋白的核苷酸序列的一部分。但是，优选的，这些元件在细胞中是功能性的。同样，使用的启动子和多腺苷酸化信号必须在本发明细胞中是功能性的。用于实施本发明的启动子包括(但不限于)在许多细胞中都有效的启动子，如细胞巨化病毒启动子、SV40启动子和反转录病毒启动子。其他用于实施本发明的启动子包括(但不限于)：组织特异性启动子，即在某些组织中有功能而在其他组织中没有功能的启动子；正常表达于细胞中的启动子，具有或没有特异或普通的增强子序列。在一些实施方式中，使用了带有或没有增强子序列的启动子，在细胞中持续表达基因。当适当或需要时，在这些实施方式中提供增强子序列。

本发明的细胞能够通过本领域普通技术人员容易获得的已知技术被转染。可以通过将构建基因导入细胞的标准方法将外源基因导入细胞中，所述细胞将表达所述基因编码的蛋白质。在一些实施中，细胞通过以下方法被转染：磷酸钙沉淀转染、二乙氨基乙基葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、脂质体介导转移、化学介导转移、配基介导转移或重组病毒载体转移。

在一些实施方式中，重组腺病毒载体用于将带有所要序列的DNA导入细胞中。在一些实施方式中，重组逆转录病毒载体用于将带有所要序列的DNA导入细胞中。在一些实施方式中，使用标准CaPO4、二乙氨基乙基葡聚糖或脂质载体介导转染技术将所要DNA整合入分离细胞。能够使用标准的抗生素抗性筛选技术来识别和选取被转染的细胞。在一些实施方式中，DNA通过显微注射被直接导入细胞。类似的，已知的电穿孔或粒子轰击技术也能用来将外源DNA导入细胞中。一种第二基因通常与治疗性基因共转染或连接于治疗性基因。所述第二基因经常是一种可选择的抗生素抗性基因。被转染细胞能够通过抗生素培养被选出，所述抗生素将杀灭没有接收所述可选择基因的细胞。多数情况下，这两种基因是分离的并被共转染，经抗生素处理后存活的细胞同时具有这两种基因并表达它们。

下述实施例是为了更完整的描述本发明的优选实施方式。这些实施例绝不应该被解释为对权利要求所限定的本发明范围的限制。

实施例

实施例1：BMSC作为滋养层细胞用于NSC的培养和扩增

NSC的培养是具有挑战性的，因为它们需要生长因子和特殊的基质来提高其生长速率和扩增。对于生长因子，在包含FGF和/或EGF的血清不确定培养基中加入外源性LIF，能够显著提高NSC的扩增。如本文其他部分讨论的，外源性LIF的结合及对培养皿的包被进一步提高了NSC的扩增水平，同时保持了其多能性。

骨髓基质细胞(BMSC)能够在培养中轻易获得并扩增至实质同源的细胞群。另外，BMSC还分泌几种可以促进NSC生长的营养因子。因此，本实施例说明BMSC能够在共培养体系中作为支持细胞用于NSC的扩增。

现在，将本实施例中实验所使用的材料和方法说明如下：

人胎儿神经干细胞(NSC)的建立、维持和鉴定

人脑(来自11-14周大的胎儿)由Advanced Bioscience Resources公司(Alameda，CA)提供。脑组织在冷PBS中研磨。细胞经离心沉淀后悬浮于10mlNSC生长培养基(DMEM/F12、8mM葡萄糖、谷氨酰胺酶、20mM碳酸氢钠、15mM HEPES、8μg/ml肝素、N2添加物、10ng/ml bFGF、20ng/ml EGF)。将上述细胞置于经多鸟氨酸和纤维结合素包被的T-25cm²型盒上，于5％CO₂培养箱中37℃培养。培养液每2天使用新鲜培养基更换50％，每14天通过胰蛋白酶消化来传代。细胞于含有10％DMSO的NSC培养基中液氮冷藏。细胞经解冻并于存在bFGF和EGF下初始培养1-2代，之后置于补加了10ng/ml LIF的完全生长培养基中。

其他NSC生长培养基能够用于本文公开的方法。例如，细胞能够在Neurobasal培养基中培养，其中添加了L-谷氨酰胺、bFGF、EGF和B27，但不含维甲酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)。另外一种NSC培养基是NeuroCult，其中添加了生长因子(StemCell Technologies，Vancouver BC，Canada)。不希望受任何特定理论的束缚，任何培养基都能够用于培养NSC。但是，适宜的培养基使细胞能够生长并扩增，同时保持它们分化成多种细胞类型的能力。

为了鉴定，处于不同代的NSC被置于包被的细胞培养玻片(chamber slide)上，使用4％多聚甲醛固定并对巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色。通过撤回bFGF、EGF和LIF，以及使用Neurobasal培养基、B27添加物和BDNF处理，NSC被分化大约14天。其他分化条件可以用来使细胞分化为特定谱系。细胞被固定并对微管相关蛋白染色(MAP2；神经元的生成者)和GFAP(星形细胞的生成者)。为识别神经元亚型，细胞用抗γ氨基丁酸(GABA)和抗酪氨酸羟化酶(TH)染色。使用的主要抗体是人特异性巢蛋白，1∶10(R&D Systems)；MAP2，1∶500(Sigma)；GFAP，1∶1000(DAKO)；O4，1∶100；NG-2(1∶200)(Chemicon)。这些实验中使用的第二抗体是Alexa Fluor488鸡抗鼠1∶500(Molecular Probes)和Alexa Fluor 594鸡抗兔，1∶500(Molecular Probes)。

用流式细胞仪分析NSC的几种标志物表达，包括造血细胞标志物CD45和CD14，干细胞标志物CD34、CD133和CD56以及免疫原性/刺激标志物CD80、CD86、I类MHC和II类MHC。

巢蛋白表达细胞的定量分析也通过流式细胞仪来测定。进行这一分析使用了抗巢蛋白(R&D)和与Alexa-fluor488交联的山羊抗鼠Ig。使用Becton-Dickinson公司的Cytofix/Cytoperm试剂盒和仪器，经过小的改进，来固定NSC。

骨髓基质细胞(BMSC)的建立、维持和鉴定

BMSC通过现有技术已知方法来生产。例如，通过针头抽吸收集人骨髓。对骨髓的有核细胞计数。骨髓经PBS稀释后与羟乙基淀粉混合。羟乙基淀粉/细胞混悬液静置45分钟-1小时。在此期间，红细胞沉积，使有核细胞存在于上清液层。去除红细胞后，洗涤有核细胞并计数。

在组织培养处理容器(如聚苯乙烯)中培养有核细胞，DMEM-低葡萄糖，10％FBS。原代培养持续12-17天，每3或4天更换培养基。当具有足够数目的粘附素、纺锤状细胞时，使用胰蛋白酶传代培养物来除去粘附细胞。细胞被重新涂板并培养大约1周，后续每代更换一次培养基。

流式细胞仪使用特定标记物来检测细胞纯度。在共培养实验中使用了CD45阴性以及90％以上CD90和CD13阳性的第1或2代(P1或P2)BMSC。

在NSC生长培养基中培养BMSC

BMSC以不同密度置于6孔板中，使之于BMSC培养基(DMEM-低葡萄糖，10％抽样试验的FBS)中粘附过夜。第二天，一个板的培养基替换为NSC培养基(DMEM-F12、N2-添加物、EGF、20ng/mL、bFGF、10ng/mL、8μg/mL肝素、P/S)，另一个板接受新鲜的BMSC培养基。每三天为细胞补充新鲜的BMSC或NSC培养基。一组培养物经胰蛋白酶处理，7天后计数细胞。另一组细胞被收集并于12天后计数。如表1和图1，BMSC在BMSC培养基中增殖比在NSC培养基中多很多。在NSC培养基中，细胞数目的初始增加相对于在BMSC培养基中比较少。但是，在NSC培养基中培养7天后，BMSC的细胞数目没有显著增加。在BMSC培养基中，细胞在12天内持续增殖并在该末期高度汇合。在NSC培养基中，BMSC没有形成汇合细胞的任何涡旋，而表现形态正常，没有可见的细胞死亡；在BMSC培养基中观察的细胞形态正好相反。

                         表1

培养基	初始细胞	7天细胞数目	12天细胞数目
				NSC培养基	50,000	210,000	240,000
NSC培养基	100,000	300,000	460,000
				NSC培养基	200,000	615,000	650,000
BMSC培养基	50,000	310,000	1,300,000
				BMSC培养基	100,000	683,000	1,200,000
BMSC培养基	200,000	855,000	2,200,000

这些结果说明，当NSC与BMSC在NSC培养基中共培养时，BMSC没有与NSC竞争并过渡生长。

BMSC和NSC的共培养；NSC在BMSC包被平板上的存活和扩增

人BMSC(hBM-03-016，P1)经解冻、洗涤、计数后置于12孔板，75,000细胞/孔。并行的，另外一个12孔板经15μg/ml多鸟氨酸及随后的10μg/ml人纤维结合素包被过夜。第二天，收集培养基中生长的hNSC并再次悬浮于含有EGF和FGF的NSC培养基中。使用的NSC是hHB-007，P7，在含有EGF、FGF和LIF的NSC培养基中培养。这些细胞的大部分生长为神经球。在把这些细胞置于BMSC或包被板孔时，神经球被尽可能的打碎成单细胞。3份NSC在下述条件下置于BMSC或包被平板上。

1.25000NSC+NSC培养基，无LIF

2.25000NSC+NSC培养基+LIF

3.50000NSC+NSC培养基，无LIF

4.50000NSC+NSC培养基+LIF

每隔一天对培养物更换50％新鲜培养基。在不同时间拍摄了细胞的相差图片。培养12-13天后，使用胰蛋白酶收集细胞。即，使用0.05％胰蛋白酶培养细胞5分钟或直至所有细胞脱离培养皿。然后使用大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)中和胰蛋白酶。细胞经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后使用台盼蓝染色在血球计数器中计数。显微镜下观察到两种不同大小的细胞，较大的BMSC和较小的NSC。分别计数这两种细胞群。第一次计数在第12天，通过将3个复制式培养物的两个混合。

置于BMSC上的NSC粘附于聚集区并铺展为单细胞层。这些细胞上改变培养基并不困难。另一方面，NSC，特别是在外源性LIF存在下生长为神经球的NSC(图2)，并非很有粘附性，因此在更换培养基时要非常小心。有时需要对通气培养基进行离心来防止神经球的流失。同时，当NSC密度较低时不会存活，除非它们与BMSC共培养。

形态上，共培养中的NSC在铺展的较大BMSC上形成了小圆到椭圆形的网络。NSC形成了分离的NSC集落，有时被成纤维的BMSC环绕(图3)。在每个增加的集落中，NSC集落的NSC数目变多。单独培养的NSC只有在外源性LIF存在并有较高接种密度下才能存活并增殖；然而，在共培养中，即使没有LIF，NSC也发生显著扩增。因此，BMSC似乎能够作为滋养层而为NSC提供营养支持。与在添加了外源性LIF的包被(即多鸟氨酸/纤维结合蛋白)培养皿上生长的NSC相比，共培养中的NSC获得了显著扩增。表2描述12天后培养物中收集到的NSC和BMSC的数目。

                表2

       与BMSC共培养的NSC的扩增

初始#NSC	LIF	+BMSC	没有BMSC
				2.5e4	-	8.8e4	1.3e4
2.5e4	+	10e4	7.5e4
				5.0e4	-	25e4	11e4
5.0e4	+	24e4	33e4

在BMSC上培养的NSC的特征鉴定：巢蛋白的表达

为了通过免疫染色来评价与BMSC共培养的NSC的巢蛋白表达，培养物于盖玻片上生长。如本文其他地方所述，置于24孔培养皿中的盖玻片(10mm)被多鸟氨酸和人纤维结合蛋白包被。一组盖玻片被BMSC铺盖(35,000/盖玻片)，使细胞粘附过夜。第二天，收集培养物(THD-015+LIF，P12)中生长的NSC并计数。25000/孔的NSC铺盖于BMSC上或直接于包被盖玻片上。一些有BMSC的孔在没有NSC条件下单独培养。所有不同培养物在NSC培养基或NSC培养基+LIF中生长。每个一天为细胞更换50％新鲜培养基，持续10天。10天后，一些培养物被固定并准备巢蛋白染色。其他培养物被允许分化2周。

为了固定培养物，该培养物经PBS洗涤一次。然后加入4％多聚甲醛，室温培养15分钟，PBS洗涤3次。这时，将固定的培养物贮存于4℃PBS中或立即染色。

后续培养物的巢蛋白染色通过抗巢蛋白抗体+抗GFAP抗体的染色而实现。培养物包括BMSC+NSC、BMSC+NSC+LIF、单独BMSC、BMSC+LIF、单独NSC和NSC+LIF。一个复制样品作为对照(没有初始抗体)

在含有或不含外源性LIF的NSC培养基中单独培养的NSC表达了巢蛋白。当培养于NSC培养基+LIF中时，除了表达巢蛋白，NSC还共表达GFAP。

所有共培养物表现出大量巢蛋白阳性细胞，铺展于BMSC之上(图4A-4F)。BMSC本身只表现模糊的背景染色(图4G-4H)。巢蛋白阳性细胞的形态是异源的。许多巢蛋白阳性细胞也对GFAP呈阳性，而其他是巢蛋白阳性和GFAP阴性。一些巢蛋白阳性细胞是小的圆形或椭圆形，具有或没有一种或两种丝状伸展。一些巢蛋白-GFAP双阳性细胞是大的、扁平的类似星形细胞。在添加和未添加外源性LIF的共培养之间没有明显差别。

共培养物的分化

在NSC培养基中培养10天后，共培养物进行2周的分化。分化安排包括2次加液，每次是1)添加了N2但没有EGF或FGF的DMEM/F1，2)DMEM/F12+B27添加物，和3)DMEM/F12+B27+BDNF中的一种。分化的培养物被固定于多聚甲醛中，然后使用下述抗体组合进行染色：例如巢蛋白/GFAP、MAP2、GFAP和O4/GFAP。在所有条件下，GFAP通过红荧光(Alexa 594)来检测，而巢蛋白、MAP2或O4通过绿荧光(Alexa 488)检测。使用DAPI对培养物复染来对所有细胞核进行绿荧光标记。

生长在BMSC上的NSC保持了其分化成神经元和星形细胞的能力(图5A-5D)。经过分化培养基的培养，几种细胞表达了神经标志物MAP-2。这些细胞是具有椭圆细胞核和双极或多级细胞体的小细胞。这些突起是扩展性的并在BMSC上或GFAP染色细胞上形成了复杂的神经元网络。GFAP阳性的星形细胞也存在于整个培养物中。这些细胞与神经元相比是大的、多边形的、扁平的。根据近似值，神经元的数目与星形细胞相当或更多，准确的测定是不可能的，因为神经元的广大网络形成了一个三维的细胞网。在所用稀释下，O4抗体染色显示没有细胞分化成少突胶质细胞。可能需要更长的分化时间来产生少突胶质细胞。但是，当使用NG2(在少突胶质细胞前体表面发向的一种硫酸软骨素蛋白多糖)作为少突胶质细胞分化的标志物来估计少突胶质细胞的存在时，发现很少的细胞对NG2呈阳性。分化的共培养物的巢蛋白染色显示了一些GFAP阳性星形细胞对巢蛋白呈弱阳性，但是这些细胞表现出与分化前看到的小丝状细胞在形态上的不同(图6)。生长过程中外源性LIF的存在或缺乏对于NSC在共培养物中的分化没有带来差异。当单独培养的NSC如上所述被分化时，观察到它们分化成神经元(MAP2阳性)和星形细胞(GFAP阳性)(图7)。

当BMSC独自接受相同的分化条件时，它们表现出弱的、弥散的巢蛋白和GFAP染色，GFAP一定程度上在附加外源性LIF培养的细胞中的染色更浓。细胞形态保持与BMSC相同，而不同于星形细胞。培养物中很少的细胞具有表明分化成NSC或神经元谱系的高度的巢蛋白或MAP2阳性(图8)。

实施例2：从BMSC和NSC共培养物中去除BMSC

BMSC和NSC共培养物中的细胞能够通过使用鼠抗人CD13抗体(在BMSC上呈阳性而在NSC上呈阴性)来培养共培养物而得到分离。利用与pan鼠IgG相连的磁珠，BMSC能够从NSC中分离。代表NSC的未结合细胞通过FACS分析或放回培养液中。对于FACS分析，使用不同的BMSC标记抗体(鼠抗人CD105)来检测受染BMSC，而使用鼠抗人CD133来检测NSC。

BMSC被放入6孔培养皿中，150,000细胞/孔，并使之在BMSC培养基中粘附过夜。收集生长于培养物中的NSC(THD-hWB-015+LIFP17)并再次悬浮，来打碎神经球。从BMSC培养物中去除BMSC培养基并将收集的NSC置于NSC培养基(含有EGF和FGE，含有或不含LIF)中的BMSC上(75,000细胞/孔)。共培养物在NSC培养基中培养13天。每隔一天或在周末为细胞更换新鲜培养基。

在第13天，使用胰蛋白酶收集共培养物，随后使用大豆胰蛋白酶抑制剂。细胞混合物重新悬浮于含有0.1％BSA的PBS中。用抗CD13冰上培养细胞混合物30分钟。使用PBS(0.1％BSA)对细胞进行离心洗涤。同时，用PBS(0.1％BSA)对Dynal珠-Pan鼠IgG洗涤3次，每次通过磁性颗粒集中器(Dynal-MPC).对它们进行分离。经洗涤的细胞与洗涤过的磁珠PBS(0.1％BSA)中在倾斜/旋转装置(Dynal样品混合器)上4℃培养30分钟。含有细胞-珠混合物的试管于MPC中放置2-3分钟。磁珠与附着其上的细胞粘附于靠近磁体的试管一侧。收集上清液并置于一个单独试管中。

上清液中的一部分细胞被用于FACS分析，一部分细胞被置于包被了多鸟氨酸和纤维结合蛋白的细胞培养玻片中。使用抗CD105和抗CD133(识别NSC)进行FACS分析。置于细胞培养玻片上的细胞在NSC培养基中培养1-2天后被固定，用于巢蛋白/GFAP的免疫染色。

在2周的时间内，NSC在BMSC层上扩增。其上观察到一些大的集落，推测其产生于小的神经元。单细胞或几个细胞形式的其他NSC在2周内生长为几个较小的NSC集落。

在磁性排除BMSC之后，分离的NSC经FACS分析。超过90％的细胞呈CD133阳性(图9B)。

低于2％是CD105阳性(图9A)。在细胞培养玻片上的细胞粘附于培养皿，形态上与NSC相似。巢蛋白免疫染色被用于证实NSC的存在。培养物中的BMSC-珠混合物形态学上与BMSC相似，其结合了大量磁珠并附着于组织培养瓶。结果表明，BMSC能够通过与结合于BMSC的抗体简单培养以及随后的磁性分离而从共培养物中得到分离，留下浓缩的NSC细胞群。

实施例3

共培养放大和使用最低量BMSC作为滋养层而提高的NSC扩增

在本实验中，共培养物被扩增至T75组织培养瓶中。BMSC(供体BM-022，P1和BM-024，P1)以大约2.5e5或5.0e5/瓶的两个不同的接种密度置于BMSC培养基中。两天后，细胞经NSC培养基洗涤，5.0e5NSC(THD-015，P14)被置于15ml完全NSC培养基中BMSC之上。细胞共培养15天，每隔一天或两天为细胞更换50％的新鲜培养基。15天后，通过胰蛋白酶消化来收集细胞。较大BMSC和较小NSC在血球计数器上计数。如本文其他地方所述，如实施例2，去除BMSC。悬浮细胞至5×10e7/ml，与抗人CD13抗体在冰上培养15分钟。洗涤细胞一次，然后与洗涤过的Pan鼠IgG Dyna-珠一起培养30分钟。珠结合细胞在磁性颗粒集中器中被分离。包含NSC的上清液用NSC培养基洗涤，计数回收的NSC数目。一些细胞经FACS分析，另一些细胞经过分化和免疫细胞化学分析。

这里公开的内容说明较少数目的BMSC滋养层上培养NSC比在较多数目BMSC滋养层上培养生成更多的NSC扩增。通过改变BMSC与NSC接种密度的比例，发现当BMSC在大约30％的低汇合下，产生较高的NSC倍增，相对于50-60％或更高的汇合。例如，如表3所示，可以看到当T75瓶中的BMSC接种密度在大约2.5e5下而NSC接种密度在5.0e5下时，NSC倍增82倍，而相同数目的NSC置于双倍数目的BMSC上时，NSC倍增47倍。与之比较，其他实验中当NSC培养于缺乏BMSC的包被培养皿的添加了外源LIF的标准NSC培养基中时，获得的NSC最大倍增大约为20-25倍。在BMSC存在下的NSC扩增之后，使用抗BMSC抗体和免疫磁性珠有效去除了共培养物中的BMSC，回收率为83-93％(表3)。

                                  表3

                       在BMSC滋养细胞上hNSC的扩增

BMSC供体(接种密度)	起始#NSC	#NSC第15天时	NSC倍增	BMSC去除后的回收率％	#回收的NSC(倍增)
						BM-03-022(大约2.5e5)	5.0e5	41.1e6	82.2倍	93％	38.3e6(76.5倍)
BM-04-024(大约5.0e5)	5.0e5	23.5e6	47倍	83％	19.4e6(39倍)

共培养扩增并分离的NSC被观察到继续表达祖细胞的标志物，包括(但不限于)巢蛋白(图10)。分离的NSC还保持了其分化成神经元和星形细胞的能力(图11)。现有技术人员基于本发明公开内容将能够认识到用于扩增NSC的本方法能够被进一步放大并适合于已经被验证用于生产BMSC的封闭***的生产过程。

实施例4：BMSC和NSC在Transwell^TM中的共培养(不依赖接触的共培养)

本文已经证明了BMSC能够作为出色的滋养/支持层用于人神经干细胞(hNSC)的繁殖和扩增。在本实施例中，实验被设计来说明是否需要两种细胞之间的物理接触或者BMSC是否能通过提供可溶解的营养因子来支持NSC繁殖和扩增的非依赖接触的方式来支持NSC的繁殖和增殖。

BMSC，指定为hBM-03-016-P1和hBM-012-P2，经解冻、BMSC培养基洗涤，置于Transwell^TM中。Transwell^TM中的实验在6板孔Costar培养皿中进行。BMSC被置于Transwell^TM中，而NSC被置于板孔底部。两种细胞都采用相同的NSC培养基培养。Transwell^TM的应用能够实现在两种类型细胞之间没有物理接触的条件下培养不同类型的细胞，例如BMSC和NSC。

大约30,000个BMSC置于Transwell^TM的可移动的多孔过滤器之上。在使细胞在BMSC培养基中对Transwell^TM表面粘附过夜后，细胞经血浆自由培养基冲洗后培养于完全NSC培养基(DMEM/F12+N2添加物+EGF+FGF)中。NSC(指定为THD-hWB-015-P13)经解冻、洗涤并以40,000细胞/孔的密度置于多鸟氨酸/纤维结合蛋白包被的6孔培养皿上。然后将含有BMSC的Transwell^TM置于含有NSC的6孔板上。对照为Transwell^TM包括NSC而没有BMSC。Transwell^TM和孔底部加入足量培养基。每隔一天更换大约50％的培养基。培养两周之后，从每个板孔中收集NSC并计数。细胞经过流式细胞仪来分析NSC标志物的表达。

结果说明在Transwell^TM中与BMSC共同培养的生长于包被孔上的NSC的繁殖要好于培养在没有BMSC的包被孔板上的NSC(图12)。发现BMSC支持了NSC的生长和增殖，甚至在没有两种细胞直接接触的情况下。不希望受任何特定理论的束缚，相信从BMSC分泌的因子可以用来补充NSC培养基，从而帮助支持NSC的繁殖和增殖。对生长于含有BMSC或不含BMSC的Transwell^TM中的NSC进行FACS分析，说明NSC的表型相似。例如，在两种条件下生长的NSC都具有大约100％的CD133阳性。

重复上述实验，除了6孔培养皿没有包被多鸟氨酸/纤维结合蛋白。大约有50,000个BMSC被置于Transwell^TM中。NSC(指定为THD-hWB-015-P12)经解冻后被置于6孔的Falcon或Costar板中。生长在Transwell^TM上的BMSC被置于6孔板中，培养2周。作为对照，NSC单独培养于含有或不含外源性LIF的NSC培养基中。Transwell^TM中与BMSC共培养的NSC的生长方式与单独培养于含有外源性LIF的NSC培养中的NSC相似，而其增殖显著好于在不含外源性LIF下单独培养的NSC(图13)。还发现Costar培养皿在细胞繁殖数量上提供了比Falcon培养皿更好的结果。

实施例5：NSC在BMSC条件培养基中生长

实施例的实验结果说明BMSC生成了支持NSC生长的可溶性因子。接下来进行的一组实验使用了来源于经培养的BMSC的条件培养基，来进一步说明BMSC分泌的因子对NSC生长的作用。这里公开的实验说明了BMSC分泌的生长和/或其他因子是否能支持和提高NSC生长和增殖。本实验设计是要评价1)由培养物中BMSC限定的培养基是否能够替代添加有外源性LIF的NSC培养基而对培养物中的NSC带来促进生长的效果2)由培养物中BMSC限定的条件培养基是否能够为NSC的培养带来类似于在多鸟氨酸/纤维结合蛋白包被的培养基上培养NSC的有益效果。

为生成BMSC-CM，首先将BMSC置于T-80瓶中，于BMSC培养基中培养。培养一段时间后，用NSC培养基取代BMSC培养基。由此获得BMSC-CM，用含有bFGF和EGF的完全NSC培养基培养BMSC获得的是BMSC-CM1，用不含bFGF和EGF的NSC培养基培养获得的是BMSC-CM2。每48小时为BMSC更换新鲜NSC培养基。此时，培养基被移出并离心去除颗粒物质，用来培养NSC或于-80℃冷冻用于细胞因子的评价。对于BMSC-CM实验，NSC使用含有大约25-50％BMSC-CM的NSC生长培养基来培养，所述BMSC-CM是从BMSC新收集的或者是于4℃贮存2周的。BMSC-CM经Cytokine Arrays(RayBiotech Inc.)或ELISA分析各种细胞因子的存在。

为评价NSC是否能在BMSC-CM中增殖，NSC被置于多鸟氨酸/纤维结合蛋白包被的培养皿上，每隔一天更换50％培养基，使用的替换培养基为a)BMSC-CM1，b)BMSC-CM2，c)含有外源性LIF的完全NSC培养基，或d)不含外源性LIF的完全NSC培养基。开始的两次BMSC-CM1和BMSC-CM2的更换，每种BMSC-CM中添加了新鲜的EGF和FGF，而这种EGF和FGF的添加稍后停止。

实验结果说明NSC在BMSC-CM或完全NSC培养基中的生长同样良好。图14描述了不同条件下培养的NSC的代表性区域。在BMSC-CM1存在下，可以看到NSC形成了大的粘性神经球，并有细胞长出了神经球。还可以看到BMSC-CM1存在下培养的一些NSC形成了单细胞层。在BMSC-CM2中培养NSC的情况下，也可以看到NSC形成了神经球，但是与BMSC-CM1下培养的NSC相比，很少有大的神经球形成，且很少出现单细胞层。在完全NSC培养基存在下，NSC长成几个相互连接的神经球，并展现出从神经球中过度生长的细胞。无论怎样，每一培养组中的细胞在培养10天后都被收集并计数细胞数目，来比较不同培养条件对NSC繁殖的影响。从BMSC-CM1中收获的细胞(大约3.4e6个细胞)与从含有外源性LIF的完全NSC培养基中收获的细胞(大约3.3e6个细胞)数目相当。在BMSC-CM2中获得的细胞数目大约为2.85e6。

下一组实验测试了NSC是否能够在BMSC-CM中增殖，甚至是在未包被的培养皿上。4组NSC如下：1)培养于BMSC-CM1中的NSC；2)培养于BMSC-CM2中的NSC；3)培养于含有外源性LIF的完全NSC培养基中的NSC；和4)培养于不含外源性LIF的完全NSC培养基中的NSC。细胞培养2周，通过胰蛋白酶消化传代并在相同条件下处理另一个2周的时间。发现在第一个2周，NSC在BMSC-CM1中有最大的增殖，其次是BMSC-CM2，然后是NSC培养基+LIF(柱状图表示为P1，图15)。传代后，BMSC-CM1和NSC培养基+LIF的NSC增殖相似(表示为P2，图15)。经BMSC-CM2处理的细胞继续繁殖，比用不含LIF的NSC培养基处理的细胞表现的好。因此，现有数据表明BMSC-CM对hNSC来说是一种良好的生长因子来源，能够诱导NSC的繁殖，繁殖速度与添加了外源性LIF的NSC培养基相当或更高。另外，使用BMSC-CM培养的NSC能够通过胰蛋白酶消化传代，并进一步增殖来增加细胞数量。

BMSC-CM的细胞因子芯片分析

BMSC培养于完全NSC培养基中。在48小时收集培养基，使用细胞因子芯片测定细胞因子曲线。RayBio人细胞因子抗体芯片C系列1000(芯片VI和VIT的结合)购买自RayBiotech公司(Norcross，GA)。使用生产商的说明书中描述的样品来处理芯片膜。使用ECL-Plus***(Amersham，Piscataway，NJ)进行细胞因子的最终检测。信号显现于X射线胶片上(Amersham，Piscataway，NJ)。

细胞因子曲线的结果说明各种细胞因子/其他因子存在于BMSC-CM中，其信号强度高于同一芯片上的阴性对照。细胞因子/其他因子包括(但不限于)LIF、脑源神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子受体(EGF)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、肝细胞生长因子(HGF)、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-lra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、单核吞噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经营养因子(NT3)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)、TIMP-2、肿瘤坏死因子(TNF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体(uPAR)、骨形态发生蛋白(BMP4)、IL1-a、IL-3、来普汀(leptin)、干细胞因子(SCF)、***衍生因子-1(SDF-1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGFBB)、转化生长因子β(TGFβ-1)和TGFβ-3。

不希望受任何特定理论的束缚，BMSC-CM包含几种因子，包括存在于含有EGF和bFGF的培养基中的因子，除了由BMSC分泌的因子或由培养基诱导的因子之外。上面列出的因子是检测芯片上的120个细胞因子中信号评价高于芯片上阴性对照的那些因子。

经检测高于背景水平的细胞因子包括(但不限于)EGF和bFGF。其他清楚表达的细胞因子是HGF(肝细胞生长因子)、M-CSF(单核吞噬细胞集落刺激因子)和TIMP-1、TIMP-2(分别是金属蛋白酶1和2的组织抑制剂)。神经营养因子包括(但不限于)BDNF、NT3、GDNF和GNTF。IGFBPs和FGF-6被展示。许多化学增活素、致炎细胞因子和血管生成因子，如VEGF，也会生成。ELISA还证实了BMSC也生成LIF。在ELISA试验中，通过从BMSC-CM中观察到的水平减去对照培养基水平而评估了BMSC分泌的每一个检测因子的实际数量。

从这里公开的内容能够得出：BMSC产生促进NSC生长的可溶性因子。NSC与BMSC的直接接触不是必须的，因为BMSC条件培养也能够支持NSC的生长和增殖。本公开内容显示依赖接触的共培养产生了NSC的最大增殖，表明了BMSC或BMSC产品和BMSC生成的可溶性因子与NSC的物理接触对NSC增殖的协同效果。

实施例6：在BMSC或BMSC-CM中培养的NSC表现出降低的MHC分子表达水平，但是保持了与标准条件下单独生长的NSC相同的表型。

流式细胞仪分析实施例3中增殖的NSC的各种BMSC和NSC标志物的表达。与BMSC共培养的NSC保持着与在添加了外源性LIF而不含BMSC的NSC培养基中培养的NSC相同的表型特征(例如对CD56和CD133阳性，对CD105阴性)，除了与BMSC共培养的NSC表现出不可检测到的II类MHC分子表达(图16)。当外源性LIF加入NSC生长培养基中时，可以观察到II类MHC分子被诱导产生于NSC上。相反，没有观察到与BMSC共培养的NSC表达高于基线的II类MHC分子，这类分子可能对移植来说是有益的。另外，从共培养物中分离的NSC没有表达高于基线的BMSC标志物CD105，说明BMSC从共培养物中有效去除。

类似的，用BMSC-CM培养的NSC也保持了与标准NSC培养基+LIF培养的NSC相同的表型特征，除了它们表现出基线水平的II类MHC和减少的I类MHC(图17)。4组NSC接受了FACS对CD133、II类MHC分子、I类MHC分子和CD56表达的分析(图17)。结果证实了之前的观察，即在外源性LIF存在下生长的NSC表达了II类MHC分子并表现出I类MHC分子增加的平均荧光强度。但是，生长于BMSC-CM的NSC没有观察到其表达II类MHC分子，且具有较低的I类MHC分子表达水平。在所有4组NSC中，CD133的表达相似。所有检测细胞表达了CD56，尽管在外源性LIF存在下培养的细胞表现出CD56降低的平均荧光强度。

实施例7：通过在BMSC上增殖对NSC的I类和II类MHC分子表达的调控

进行了另外的实验来评价共培养的NSC的I类和II类MHC分子的表达。NSC从胎儿脑中分离并在NSC培养基中培养13代(THD-WB-015，P13)。然后在下述4个条件下对NSC培养12天，每隔一天更换培养基。

1.62,500 NSC在完全NSC培养基的包被T25瓶中单独培养

2.62,500 NSC在完全NSC培养基+LIF的包被T25瓶中单独培养

3.62,500 NSC在完全NSC培养基中的250,000BMSC(供体-012)滋养层上培养

4.NSC在完全NSC培养基中的250,000 BMSC(供体-016)滋养层上培养

细胞于12天后通过胰蛋白酶消化而被收集。计数细胞并用流式细胞仪分析CD133、CD105、I类MHC和II类MHC分子的表达。在共培养中，需要所有的细胞并基于光散射和CD133表达来门控NSC。图18显示了在各种条件下培养的NSC的I类MHC和II类MHC分子表达(黑色＝同种型对照；灰色＝I或II类)。结果表明所有NSC都表达了I类MHC。但是，在外源性LIF存在下培养NSC时，细胞上I类MHC分子表达显著增加，正如反映在与不含外源性LIF下培养的NSC比较时Log平均荧光强度(Log Median FluorescenceIntensity)的增加。与在LIF下扩增的NSC相比，共培养的NSC表达了明显低水平的I类MHC分子(表4)。

                     表4

培养条件	Log MF I类MHC同种型对照	细胞倍增
			NSC单独，不含LIF	209	8.16X
NSC单独+LIF	469	13.5X
			NSC+BMSC-012	323	16X
NSC+BMSC-016	366	26.7X

NSC没有组成性表达II类MHC分子。但是，LIF诱导了38％细胞的II类MHC分子表达。用BMSC培养的NSC与在不含LIF下培养的NSC相似，不能表达高于基线的II类MHC分子。

上述结果说明在BMSC上增殖NSC的优点是减少和/或防止免疫调节的I和II类MHC分子在NSC上的表达，使它们更适合于临床移植。

这里引用的每个专利、专利申请和公布及其公开的内容全部以参考文献的方式并入本文。

显然，对现有技术人员来说，在不偏离本发明构思或范围下，可以对本发明方法和组合物做出各种调整和变化。因此，本发明涵盖了在权利要求及等同范围内所提供的调整和变化。

Claims (43)

1.一种组合物，包括：(a)一种分离的骨髓基质细胞；和(b)一种化学确定的培养介质，所述培养介质包含神经干细胞生长培养基和所述骨髓基质细胞分泌的因子。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述培养介质不含外源性白血病抑制因子。

3.权利要求1所述的组合物，其中所述因子选自：生长因子、营养因子和细胞因子。

4.权利要求1所述的组合物，其中所述因子选自：白血病抑制因子、脑源神经营养因子、表皮生长因子受体、基本的成纤维细胞生长因子、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子、粒细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白、单核吞噬细胞集落刺激因子、神经营养因子、TIMP-1、TIMP-2、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体、骨形态发生蛋白、IL1-a、IL-3、Leptin、干细胞因子、***衍生因子-1、PDGFBB、TGFβ-1和TGFβ-3。

5.权利要求1所述的组合物，还包括一种分离的神经干细胞。

6.权利要求5所述的组合物，其中所述神经干细胞与所述骨髓基质细胞是物理接触的。

7.权利要求5所述的组合物，其中所述神经干细胞与所述骨髓基质细胞不是物理接触的。

8.权利要求5所述的组合物，其中所述神经干细胞来源于人中枢神经***。

9.权利要求1所述的组合物，其中所述骨髓基质细胞来源于人。

10.权利要求5所述的组合物，其中外源性遗传物质被导入所述神经干细胞。

11.权利要求1所述的组合物，其中外源性遗传物质被导入所述骨髓基质细胞

12.一种骨髓基质细胞条件培养基，包括一种化学确定的培养介质，所述培养介质包含神经干细胞生长培养基和由分离的骨髓基质细胞分泌的因子。

13.权利要求12所述的骨髓基质细胞条件培养基，其中所述骨髓基质条件培养基不包含外源性白血病抑制因子。

14.权利要求12所述的骨髓基质细胞条件培养基，其中所述因子选自：生长因子、营养因子和细胞因子。

15.权利要求12所述的骨髓基质细胞条件培养基，其中所述因子选自：白血病抑制因子、脑源神经营养因子、表皮生长因子受体、基本的成纤维细胞生长因子、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子、粒细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白、单核吞噬细胞集落刺激因子、神经营养因子、TIMP-1、TIMP-2、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体、骨形态发生蛋白、IL1-a、IL-3、Leptin、干细胞因子、***衍生因子-1、PDGFBB、TGFβ-1和TGFβ-3。

16.一种调节主要组织相容性复合物分子在分离的神经干细胞上表达的方法，所述方法包括共培养细胞，所述细胞包括分离的骨髓基质细胞和分离的神经干细胞。

17.权利要求16所述的方法，其中所述细胞在缺乏外源性白血病抑制因子条件下共培养。

18.权利要求16所述的方法，其中所述神经干细胞与所述骨髓基质细胞是物理接触的。

19.权利要求16所述的方法，其中所述神经干细胞与所述骨髓基质细胞不是物理接触的。

20.权利要求16所述的方法，其中所述神经干细胞来源于人的神经中枢***。

21.权利要求16所述的方法，其中所述骨髓基质细胞来源于人。

22.权利要求16所述的方法，其中外源性遗传物质被导入所述神经干细胞。

23.权利要求16所述的方法，其中外源性遗传物质被导入所述骨髓基质细胞。

24.一种调节主要组织相容性复合物分子在分离的神经干细胞上表达的方法，所述方法包括用骨髓基质细胞条件培养基培养所述神经干细胞，其中所述骨髓基质细胞条件培养基包含神经干细胞培养基和由所述骨髓基质细胞分泌的因子。

25.权利要求24所述的方法，其中所述骨髓基质细胞条件培养基不包含外源性白血病抑制因子。

26.权利要求24所述的方法，其中所述骨髓基质细胞条件培养基基本不含骨髓基质细胞。

27.权利要求24所述的方法，其中所述因子选自：生长因子、营养因子和细胞因子。

28.权利要求24所述的方法，其中所述因子选自：白血病抑制因子、脑源神经营养因子、表皮生长因子受体、基本的成纤维细胞生长因子、FGF-6、胶质细胞衍生的神经营养因子、粒细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子、IFN-γ、胰蛋白酶样生长因子结合蛋白、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白、单核吞噬细胞集落刺激因子、神经营养因子、TIMP-1、TIMP-2、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、VEGF-D、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体、骨形态发生蛋白、IL1-a、IL-3、Leptin、干细胞因子、***衍生因子-1、PDGFBB、TGFβ-1和TGFβ-3。

29.权利要求24所述的方法，其中所述神经干细胞来源于人的神经中枢***。

30.权利要求24所述的方法，其中外源性遗传物质被导入所述神经干细胞。

31.一种分离的神经干细胞，经过共培养分离的骨髓基质细胞和分离的神经干细胞的方法而制备。

32.权利要求31所述的分离的神经干细胞，其中所述神经干细胞表现出I类MHC分子的减少表达。

33.权利要求31所述的分离的神经干细胞，其中所述神经干细胞表现出II类MHC分子的基线水平。

34.权利要求31所述的分离的神经干细胞，其中所述神经干细胞来源于人的神经中枢***。

35.权利要求31所述的分离的神经干细胞，其中外源性遗传物质被导入所述神经干细胞。

36.一种分离的神经干细胞，经过在骨髓基质细胞条件培养介质中培养分离的神经干细胞而制备，其中所述骨髓基质细胞条件培养介质包含一种化学确定的培养介质，包含神经干细胞生长培养基和分离的BMSC分泌的因子。

37.权利要求36所述的分离的神经干细胞，其中所述神经干细胞表现出I类MHC分子的减少表达。

38.权利要求36所述的分离的神经干细胞，其中所述神经干细胞表现出II类MHC分子的基线水平。

39.权利要求36所述的分离的神经干细胞，其中所述神经干细胞来源于人的神经中枢***。

40.权利要求36所述的分离的神经干细胞，其中外源性遗传物质被导入所述神经干细胞。

41.一种神经细胞培养设备，含有

(a).分离的神经干细胞；

(b).分离的骨髓基质细胞；

(c).神经干细胞生长培养基，其中所述神经干细胞生长培养基包括从所述分离的骨髓基质细胞分泌的因子；和

(d).防止所述神经干细胞和所述骨髓基质细胞之间物理接触的装置。

42.权利要求41所述的设备，还包括一个过滤器或膜，使所述神经干细胞和所述骨髓基质细胞之间不产生物理接触。

43.权利要求42所述的设备，所述过滤器或膜具有孔来使所述骨髓基质细胞分泌的因子通过所述过滤器或膜。

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