CN1950499A - 黄病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了减毒的黄病毒疫苗以及制造和使用这些疫苗的方法。

Description

黄病毒疫苗
                     发明背景
黄病毒是主要由受感染蚊子或壁虱传播的小的、有包膜的、正链RNA病毒。几种黄病毒，例如黄热病、登革热、日本脑炎、壁虱传播的脑炎和西尼罗河病毒，构成了对全球公共健康的现时的或潜在的威胁。例如，黄热病病毒已经成为在非洲撒哈拉以南的某些丛林区域中、以及南美洲的某些部分中流行病的原因。尽管许多黄热病感染是轻微的，该疾病也可能导致严重的、危急生命的病情。疾病状态的初期或急性期的特征通常是高烧、寒战、头痛、背痛、肌肉疼痛、食欲不振、恶心和呕吐。在三到四天后，这些症状消失。在某些患者中，当疾病进入其所谓的毒性期时，然后症状重新出现。在这个阶段，高烧重新出现，可能引起休克、流血(例如，从口、鼻、眼和/或胃的流血)、肾衰竭和肝衰竭。实际上，肝衰竭引起黄疸，其是皮肤和眼白的黄色，因而其得名为“黄热病”。进入毒性期的患者的约一半在10到14天内死亡。然而，从黄热病痊愈的人具有针对再次感染的终身免疫性。过去二十年间感染黄热病病毒的人数已经增加了，现在每年有约200,000个黄热病病例，约30,000例死亡。因而黄热病病毒的重新出现成为了严重的公共健康关切。
登革热(DEN)病毒由于在其流行度上的惊人增长成为世界范围内增长的公共健康问题的原因。现在这种疾病在美国、南欧、亚洲和澳大利亚的超过100个国家中是地方性的。世界人口的五分之二、二十五亿人现在处在感染的风险中。每年记录了由于登革热的超过5千万感染和24,000例死亡。登革热病毒具有四种不同但是近相关的血清型，血清型1-4。一种血清型的感染一般诱导针对该血清型的终生免疫性，但仅给予针对另外三种的短暂保护。比仅提供短暂保护更糟的是，已经发现不同血清型的连续感染提高了登革热出血热(DHF)和登革热休克综合症(DSS)的风险，这是疾病的潜在性致命的并发症。因而，针对所有四种血清型的保护是必需的，因为针对一种或两种血清型的保护可能实际地增加随后感染其他血清型的风险，因而使受试者处在DHF/DSS的风险中。
黄病毒，包括黄热病病毒和登革热病毒，具有与它们在人类和动物中诱导疾病状态有关两种主要的生物学性质。这两种性质的第一种是趋神经性，其是病毒侵入和感染宿主的神经组织的倾向。趋神经性黄病毒感染可能引起脑和脊髓的炎症和损伤(即，脑炎)、损害意识、麻痹和惊厥。黄病毒的第二种生物学性质是趋内脏性，其是病毒侵入和感染重要的脏器，包括肝脏、肾和心脏的倾向。趋内脏的黄病毒感染可能引起肝脏(肝炎)、肾(肾)、和心肌(心肌炎)的损伤，引起这些器官的衰竭或功能障碍。趋神经性和趋内脏性似乎是黄病毒的不同的和独立的性质。
某些黄病毒主要是趋神经的(例如西尼罗河病毒)，一些主要是趋内脏性的(例如，黄热病病毒和登革热病毒)，还有一些展现两种性质(例如，森林病病毒)。然而，趋神经性和趋内脏性在所有黄病毒中一定程度地存在。在宿主内，由于内脏的感染在侵入中枢神经***之前发生，可能发生趋内脏性和趋神经性之间的相互作用。因而，趋神经性取决于病毒在神经外器官(内脏)中复制的能力。这种神经外复制产生病毒血症，其随后导致侵入脑和脊髓。
开发针对黄病毒的疫苗的一种方法是修改它们的致病性质，从而疫苗病毒丧失了对人类或动物的趋神经性和趋内脏性。对于黄热病病毒来说，已经开发了两种疫苗(黄热病17D和法国的趋神经的疫苗)(Monath，″Yellow Fever，″In Plotkin and Orenstein，Vaccines，3rded.，1999，Saunders，Philadelphia，pp.815-879)。通过在鸡胚组织中连续传代开发了黄热病17D疫苗，产生了具有显著降低的趋神经性和趋内脏性的病毒。通过小鼠脑组织中病毒的连续传代开发了法国的趋神经的疫苗，引起趋内脏性的丧失，但保持了趋神经性。神经病学事故的高发生率(接种后的脑炎)与法国疫苗的使用有关。对于许多具有趋内脏性质的医学上重要的黄病毒，例如尤其是登革热、西尼罗河和Omsk出血热病毒，当前没有可用的批准的疫苗。
黄病毒的完全加工的、成熟病毒含有三种结构蛋白，衣壳(C)、膜(M)和包膜(E)。在受感染细胞中产生七种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。病毒受体和融合结构域都存在于E蛋白内。进一步的，E蛋白也是黄病毒疫苗的希望的成分，因为针对这个蛋白的抗体能够中和病毒传染性并赋予宿主针对该疾病的保护。在受感染细胞中发现的不成熟黄病毒颗粒含有前膜(prM)蛋白，其是M蛋白的前体。通过翻译单个、长的开放阅读框产生聚蛋白(polyprotein)、随后通过聚蛋白的一系列复杂的翻译后蛋白水解裂解产生成熟的病毒蛋白，产生了黄病毒蛋白(Amberg et al.，J.Virol.73：8083-8094，1999；Rice，″Flaviviridae，″In Virology，Fields(ed.)，Raven-Lippincott，New York，1995，Volume I，p.937)。在聚蛋白中病毒结构蛋白质按照C-prM-E的顺序排列。
                     发明概述
本发明提供了包括一个或多个绞链区(例如，疏水口袋区)突变的黄病毒，所述突变通过例如降低它们的趋内脏性使病毒减毒。这些黄病毒可以是，例如，黄热病病毒(例如，黄热病病毒疫苗株)；选自由登革热病毒、西尼罗河病毒、Wesselsbron病毒、卡萨努森林病(Kyasanur Forest Disease)病毒和鄂木斯克出血热(OmskHemorrhagic fever)病毒构成的组；或嵌合的黄病毒。在嵌合黄病毒的一个实例中，嵌合体包括第一黄病毒病毒(例如，黄热病病毒)的衣壳和非结构蛋白和第二黄病毒(例如，日本脑炎病毒或登革热病毒(例如，登革热病毒1，2，3或4)的前膜(pre-membrane)和包膜蛋白，所述第二黄病毒包括降低嵌合黄病毒的趋内脏性的包膜蛋白突变。对登革热病毒来说，所述突变可以是，例如，在登革热包膜氨基酸位置202(登革热3)和/或204(登革热1，2和4)处的赖氨酸。这个氨基酸可以由例如精氨酸替代。在其他实施例中，所述突变可以在登革热包膜氨基酸252、253、257、258和261的任何一个或多个中，任选的与上述的202/204突变组合。以下提供了这些突变的细节。
本发明还提供了包括在此描述的任何病毒和药学上可接受的载体或稀释剂的疫苗组合物，以及通过向患者施用这种疫苗组合物在患者中诱导针对黄病毒的免疫反应的方法。使用这种方法的治疗的患者可能没有、但存在发生黄病毒感染的风险，或已经有黄病毒感染。
还包括在本发明中的是生产黄病毒疫苗的方法，包括向黄病毒(例如，嵌合病毒)中引入产生降低的趋内脏性的突变。进一步的，本发明包括鉴定黄病毒(例如，黄热病病毒或嵌合黄病毒)疫苗候选者的方法，包括(i)向黄病毒的绞链区(例如，疏水口袋区)中导入突变；和(ii)确定包括所述突变的黄病毒与缺乏该突变的黄病毒相比是否降低了趋内脏性。
本发明的黄病毒是有益的，因为具有降低的趋内脏性，当施用给患者时，与它们的非突变对应物相比，它们提供了增加的安全水平。这些病毒可以包括黄热病病毒株YF17D(例如，编码衣壳和非结构蛋白的序列)的序列的事实提供了它们的额外益处，所述病毒株(i)已经证明了它的安全性＞60年，在期间已经向人类施用了超过3500万剂，(ii)在单个剂量之后诱导了长时间的免疫性，和(ii)在接种的数天内快速地诱导免疫性。此外，本发明的疫苗病毒在治疗的患者中引起主动感染。由于免疫的个体的细胞因子环境和先天免疫反应类似于自然感染中的那些，抗原肿块在宿主中扩展，正确折叠的构象表位被有效地处理，适应性免疫反应是健壮的，建立了记忆。此外，在本发明的某些嵌合体中，来自目标病毒的prM和E蛋白含有保护性体液和细胞免疫的关键抗原。
根据以下的详细说明、附图和权利要求，本发明的其他特征和益处将是明显的。
                     附图的简要说明
附图1是显示YF-VAX和ChimeriVaxTM-JE构建体的存活率分布的图，有和没有E279处的突变(M→K)。用约0.7log10PFU(附图1A)、约1.7log10PFU(附图1B)和～2.7log10PFU(附图1C)通过脑内途径接种四天龄的乳鼠。
附图2是回归分析的图，死亡率对比病毒剂量，对于有(FRhL5)和没有(FRhL3)Met到Lys回复的病毒显示了类似的斜率和平行线，容许统计学的比较。FRhL5病毒比FRhL3更强(有毒力)18.52倍(p＜0.0001)。
附图3显示了在FRhL和Vero细胞中ChimeriVaxTM-JE病毒的独立的RNA转染和传代系列的结果。显示了按照传代水平在prME基因中突变的出现。
附图4是黄病毒包膜糖蛋白外部结构域的三维模型，显示了随着在FRhL或Vero细胞中的适应而发生的绞链区中突变的位置。JE包膜糖蛋白(株JaOArS982；Sumiyoshi et al.，Virology 161：497-510，1987)的序列与TBE结构模板(Rey et al.，Nature 375：291-298，1995)之一进行比对，作为通过SegMod的方法(片段匹配模型)使用LOOK软件(Molecular Application Group，Palo Alto，CA)用于自动化同源性建模的输入。
附图5是显示在HepG2细胞中，ChimeriVaxTM-DEN1 PMS(wtprME，P7)、ChimeriVaxTM-DEN1(含有包膜蛋白E中K到R的氨基酸替换(E204K到R)，P10)疫苗、WT DEN1 PU0359和YF-VAX的生长动力学的图。■：WT DEN1(亲本PU0359)，◆：ChimeriVaxTM-DEN1 P7，▲：ChimeriVaxTM-DEN1 P10和●：YF-VAX。
附图6是显示在IT接种的埃及伊蚊(Aedes aegypti)中病毒生长的图。在IT接种的埃及伊蚊中，ChimeriVaxTM-DEN1 PMS((wt prME，P7)、疫苗(含有在包膜蛋白E中K到R的氨基酸替换(E204 K到R)，P10)、YF-VAX、和WT DEN1(PU0359株，ChimeriVaxTM-DEN1病毒的PrME基因的供体)的生长。■：WT DEN1(亲本PU0359)，◆：ChimeriVaxTM-DEN1 P7，▲：ChimeriVaxTM-DEN1P10和●：YF-VAX。
附图7是显示ChimeriVaxTM-DEN1病毒的DEN1 E蛋白二聚体(氨基酸1-384)的结构的三维模型。A：通过CPK(显示的球体按照van der Waals(VDW)半径决定大小)呈现，显示了P7(PMS，204K)病毒的残基204处的带正电赖氨酸(K)氨基酸的位置。通过红色(结构域I)、黄色(结构域II)和蓝色(结构域III)定义了三个结构域。使用来自Accelrys Inc.(San Diego，CA)的同源建模软件(DS modeling1.1)，根据从Modis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(12)：6986-6991，2003保藏的蛋白数据库获得的DEN2病毒的原子坐标(1OKE.pdb)，构建该结构。B：在A和K氨基酸中标记区域的靠近以条状物表示来显示。C：在A中与突变DEN1病毒(P10，红色显示的204R)的E蛋白模型相同的区域。以埃单位显示了204K或204R的氮(N)与261H的N或252V(相对的链)的氧(O)之间的距离。以条状物表示显示了B和C中选定的氨基酸。灰色，碳(C)；蓝色，氮(N)；红色，氧(O)，以及黄色，硫(S)。
                     详细说明
本发明提供了在包膜蛋白的绞链区(例如，疏水口袋)中具有一个或多个突变的黄病毒(例如，黄热病病毒和嵌合黄病毒)，制造这种黄病毒的方法，和使用这些黄病毒来预防或治疗黄病毒感染的方法。本发明部分地基于我们的发现：在这个区域中具有某些突变的病毒被减毒了。例如，我们发现，具有绞链区突变的病毒具有降低的趋内脏性(见下文)。以下进一步描述本发明的病毒和方法。
可以在本发明中使用的黄病毒的一个实例是黄热病病毒。可以在野生型传染性克隆，例如Asibi传染性克隆或另一种野生型的传染性克隆，强毒黄热病病毒的绞链区中进行突变，然后可以在动物模型***中(例如，在仓鼠和/或猴模型***中)测试突变体来鉴定影响趋内脏性(viscerotropism)的位点。通过，例如，检测到模型***中降低的病毒血症和/或肝脏损伤(对于其他细节见下文)来判断趋内脏性的降低。然后将发现降低野生型病毒的趋内脏性的一个或多个突变导入到疫苗株(例如，YF17D)中，在动物模型***中(例如，在仓鼠和/或猴模型***中)测试这些突变体来确定产生的突变体是否具有降低的趋内脏性。然后发现具有降低的趋内脏性的突变体可以用做新的疫苗株，由于降低的趋内脏性水平其提高了安全性。
可用于本发明的其他黄病毒包括其他蚊传播的黄病毒，例如，日本脑炎、登革热(血清型1-4)、墨累河谷脑炎(Murray Valleyencephalitis)、St.Louis脑炎、西尼罗河、Kunjin、Rocio脑炎，和Ilheus病毒；蜱传播的黄病毒，例如，中欧脑炎(Central Europeanencephalitis)、西伯利亚脑炎(Siberian encephalitis)、俄国春夏脑炎(Russian Spring-Summer encephalitis)、卡萨努森林病(KyasanurForest Disease)、鄂木斯克出血热(Omsk Hemorrhagic fever)、羊脑脊髓炎(Louping ill)、Powassan、Negishi、Absettarov、Hansalova、Apoi和Hypr病毒；以及来自Hepacivirus属的病毒(例如，肝炎C病毒)。所有这些病毒都有感染脏器的倾向。这些病毒的趋内脏性可能不引起重要脏器的功能障碍，但是病毒在这些器官中的复制会引起病毒血，因而促进对中枢神经***的侵入。通过诱变降低这些病毒的趋内脏性因而可以降低它们侵入脑并引发脑炎的能力。
除了以上所列的病毒以及其他黄病毒之外，在包膜蛋白绞链区(例如，疏水口袋)中包括一个或多个突变的嵌合黄病毒被包括在本发明中。这些嵌合体可以由黄病毒(即，主干黄病毒)组成，在其中结构蛋白质(或多个蛋白)已经被第二病毒(即，测试的或预定的病毒，例如黄病毒)的相应结构蛋白质(或多个蛋白)替换。例如，嵌合体可以由主干黄病毒(例如，黄热病病毒)组成，在其中所述黄病毒的prM和E蛋白已经被第二、测试病毒(例如，登革热病毒(1-4)、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒，或另一种病毒，例如，在此提及的那些的任一个)的prM和E蛋白替换，其E蛋白具有在此描述的铰链区突变。嵌合病毒可以从病毒的任何组合产生。优选的，寻求针对它的免疫性的病毒是***的结构蛋白质的来源。
可以包括在本发明的疫苗中的嵌合病毒的特定实例是黄热人类疫苗株YF17D，其中prM蛋白和E蛋白已经被另一个黄病毒，例如，登革热病毒(血清型1、2、3或4)、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、St.Louis脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒，或任何其他黄病毒，例如以上所列那些之一的prM蛋白和E蛋白(包括在此描述的铰链突变)替换。例如，以下嵌合黄病毒可以用于制造本发明的病毒，其根据布达佩斯条约的条款被保藏在Manassas，Virginia，U.S.A.的美国典型培养物保藏所(ATCC)并被授予1998年1月6日的保藏日：嵌合黄热病17D/登革热2型病毒(YF/DEN-2；ATCC登记号ATCC VR-2593)和嵌合黄热病17D/日本脑炎SA14-14-2病毒(YF/JEA1.3；ATCC登记号ATCC VR-2594)。例如，在国际申请PCT/US98/03894和PCT/US00/32821中，和在Chambers et al.，J.Virol.73：3095-3101，1999中提供了制造可以用于本发明的嵌合病毒的细节，它们的每一个都通过完全引用合并在此。
如以上指出的，包括在本发明的病毒中的突变通过例如降低病毒的趋内脏性使病毒减毒。这些突变可以存在于黄病毒包膜蛋白的绞链区中。包膜蛋白的多肽链折叠成三个不同的结构域：中心结构域(结构域I)、二聚化结构域(结构域II)和免疫球蛋白样模块结构域(结构域III)。绞链区存在于结构域I和II之间，在暴露于酸性pH值时，经历构象变化(因此定名“铰链”)引起包膜蛋白三聚物的形成，所述三聚物在通过受体介导的内吞作用的病毒摄取之后涉及病毒与内含体膜的融合。在构象变化之前，蛋白以二聚体的形式存在。
许多的包膜氨基酸存在于绞链区中，包括，例如黄热病病毒的氨基酸48-61、127-131和196-283(Rey et al.，Nature 375；291-298，1995)。这些氨基酸、或紧密围绕的氨基酸(和其他黄病毒包膜蛋白中的相应氨基酸)的任何一个，可以根据本发明进行突变，并测试减毒作用。特别感兴趣的是绞链区的疏水口袋内的氨基酸。作为特定的实例和以下进一步描述的，我们发现，在包括***到黄热病病毒载体中的登革热1序列的嵌合黄病毒中，替换绞链区的疏水口袋中的包膜蛋白氨基酸204(K到R)产生减毒作用。以下还描述的是我们的发现，即这种替换引起包膜蛋白的结构中的改变，从而在野生型蛋白中的一个包膜单体和另一个之间的分子间氢键被破坏，并被单体内新的分子内相互作用替代。我们认为，这种替换引起的减毒是由于这些新的相互作用，其改变了处在融合前构象中的蛋白的结构，很可能通过改变病毒膜与宿主细胞的融合所需的pH阈值。因此这项发现提供了设计进一步减毒的突变体的新的基础。特别地，可以使用其他的替换来提高疏水口袋中的分子内相互作用，引起减毒。根据本发明，可以在疏水口袋中进行的这种突变/替换的实例包括E202K、E204K、E252V、E253L、E257EE258G和E261H中的替换。
可以使用标准方法，例如定点诱变在绞链区中进行突变。存在于本发明的病毒中的突变类型的一个实例是替换，但是也可以使用其他类型的突变，例如删除和***。此外，如上所述，突变可以单独地存在或处在一个或多个其他突变的环境中。
本发明的病毒(包括嵌合体)可以使用本领域的标准方法制造。例如，相应于病毒的基因组的RNA分子可以导入到初级细胞、鸡胚或二倍体细胞系中，然后可以从其中(或其上清液中)纯化子代病毒。可用于生产病毒的另一种方法采用了异倍体细胞，例如Vero细胞(Yasumura et al.，Nihon Rinsho 21，1201-1215，1963)。在这种方法中，相应于病毒的基因组的核酸分子(例如，RNA分子)被导入到异倍体细胞中，从已经培养了细胞的培养基中收获病毒，用核酸酶(例如，降解DNA和RNA的核酸内切酶，如BenzonaseTM；美国专利No.5,173,418)处理收获的病毒，浓缩核酸酶处理的病毒(例如，通过使用超滤作用，其利用具有例如500kDa分子量截止的滤器)，以及配制浓缩的病毒用于疫苗接种的目的。在2002年1月15日提交的美国专利申请系列号No.60/348,565中提供了这种方法的细节，通过引用合并在此(还参见WO03/060088 A2)。
本发明的病毒可以在存在感染风险的成年人或孩子中作为初级预防性试剂来施用，或可以用做用于治疗感染的患者的次级试剂。可以使用本领域中标准的方法来进行本发明的病毒的配制。用于疫苗制备的许多药学上可接受的溶液是已知的，本领域的技术人员可以容易地修改用于本发明中(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(18th edition)，ed.A.Gennaro，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA.)。在两个特定的实例中，病毒被配制在含有7.5％乳糖和2.5％人血清白蛋白的最小基本培养基Earle′s盐(MEME)中，或含有10％山梨醇的MEME中。然而，病毒可以仅在生理学可接受的溶液，例如无菌盐水或无菌缓冲盐水中稀释。在另一个实例中，例如，可以按照黄热17D疫苗相同的方式施用和配制病毒，例如，作为感染的鸡胚组织的澄清悬浮液，或从感染嵌合黄热病病毒的细胞培养物收获的液体。
本发明的疫苗可以使用本领域公知的方法施用，施用的疫苗的合适数量可以由本领域技术人员容易地确定。例如，本发明的病毒可以配置为含有102到107之间的感染单位(例如，噬菌斑形成单位或组织培养感染剂量)、剂量体积0.1到1.0ml的无菌水溶液，通过例如肌肉内的、皮下的或皮内的途径施用。此外，由于黄病毒可能能够通过粘膜途径，例如口头途径(Gresikovaet al.，″Tick-borne Encephalitis，″In The Arboviruses，Ecology and Epidemiology，Monath(ed.)，CRCPress，Boca Raton，Florida，1988，Volume IV，177-203)感染人类宿主，病毒也可以通过粘膜途径施用。进一步的，本发明的疫苗可以按单次剂量施用，或任选的，施用可以包括使用激发剂量，例如，在由本领域技术人员确定为是合适的2-6个月以后，继之以施用的强化剂量。
任选的，本领域技术人员已知的佐剂可被用于本发明的病毒的施用中。可以用于增强病毒的免疫原性的佐剂包括，例如，脂质体制剂、合成的佐剂，例如(例如，QS21)、胞壁酰二肽、单磷酰基脂质A，或聚膦嗪(polyphosphazine)。尽管这些佐剂一般地用于给灭活疫苗增强免疫反应，它们也可以和活疫苗一起使用。对于通过粘膜途径，例如口头地递送的病毒来说，可以使用粘膜佐剂，例如E.coli的热不稳定毒素(LT)或LT的突变衍生物作为佐剂。此外，编码具有佐剂活性的细胞因子的基因可以***到病毒中。因而，编码细胞因子，例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因可以与外源抗原基因一同***，来产生引起增强的免疫反应的疫苗，或更特异性地针对细胞、体液或粘膜反应来调节免疫性。
针对登革热病毒的最佳疫苗接种可包括诱导针对所有四种登革热血清型的免疫性，对于登革热病毒来说，本发明的嵌合病毒可以用于配制四价疫苗。用于这种四价制剂的任何或所有嵌合体可以包括在此描述的降低趋内脏性的突变。可以在配制期间的任何时点混合嵌合体来形成四价的制剂，或可以顺序地施用。对于四价疫苗来说，可以施用相等数量的每种嵌合体。做为选择，在施用的疫苗中存在的每种不同嵌合体的数量可以变化。简要地，在这种制剂的一个实例中，相对于其他嵌合体使用了至少低于五分之一的登革热-2嵌合体(例如，10、50、100、200、或500分之一)。在这个实例中，登革热-1、登革热-3和登革热-4嵌合体的数量可以相等或可以变化。在另一个实例中，也可以降低登革热-4和/或登革热1病毒的数量。例如，除了使用较少的登革热-2嵌合体之外，相对于登革热-1和登革热-3嵌合体可以使用至少五分之一的登革热-4嵌合体(例如，10、50、100、200或500分之一)；相对于登革热-3和登革热-4嵌合体使用至少五分之一的登革热-1嵌合体(例如，10、50、100、200或500分之一)；或相对于登革热-3嵌合体使用至少五分之一的登革热-1和登革热-4嵌合体。特别期望的是，例如，当在此描述的E204/E202突变没有包括在嵌合体中时，相对于登革热-3和/或登革热-4嵌合体的数量，降低登革热-1嵌合体的数量。
以下提供了包括在本发明中的突变的一个实例的表征细节，其发生在黄热病/日本脑炎嵌合体的包膜蛋白的位置279。以下还提供的是涉及黄热病/登革热病毒嵌合体的细节，其中登革热病毒包膜蛋白包括降低趋内脏性的一个或多个突变。在这种突变的一个实例中，登革热-1、登革热-2或登革热-4的包膜蛋白的位置204的赖氨酸，或登革热-3的包膜蛋白的位置202的赖氨酸被替换或删除，登革热-3的包膜蛋白比其他登革热血清型的包膜蛋白短2个氨基酸。这个赖氨酸可以由，例如精氨酸替代。靠近包膜氨基酸204(对于登革热-3为202)的其他残基也可以被突变以实现降低的趋内脏性。例如，可以突变200-208的任何氨基酸或这些氨基酸的组合。特定的实例包括以下：登革热-1、登革热2和登革热4的位置202(K)和204(K)，和登革热3的位置200(K)和202(K)。这些残基可以由，例如精氨酸替代。
实验结果
I.包括绞链区突变的黄热病/日本脑炎嵌合体
概述
通过将来自减毒JESA14-14-2疫苗株的prM-E基因***到YF17D病毒的全长cDNA克隆中，来构建嵌合黄热病(YF)-日本脑炎(JE)疫苗(ChimeriVaxTM-JE)。在胎儿恒河猴肺(FRhL)细胞中的传代引起在E279处含有单个Met→Lys氨基酸突变的小噬菌斑病毒的出现，将这个残基从SA14-14-2回复到野生型氨基酸。通过定点诱变构建了类似的病毒。E279突变位于E蛋白的绞链区中的β折叠中，其与病毒从内涵体穿透到受感染细胞的细胞质内期间的pH值依赖性构象变化有关。在FRhL或Vero细胞的独立的转染-传代研究中，突变最经常地在铰链4(边界为氨基酸E266到E284)中出现，反映了在这个功能上重要的区域中的基因组不稳定性。根据在乳鼠中通过LD50和存活率分布，和通过恒河猴中的组织病理学所确定的，E279回复引起神经毒力的显著增加。根据在猴中获得的结果的敏感性和可比较性，乳鼠是关于趋神经性的黄病毒疫苗候选物安全测试的合适宿主。对于在猴中的神经外复制，E279 Lys病毒是受限的，因为与E279 Met病毒相比病毒血和抗体水平(趋内脏性的标记)显著地降低。
背景
嵌合病毒的研究已经提供了对致病力的分子基础的了解和疫苗开发的新前景。例如，已经通过***编码病毒包膜和涉及中和、细胞粘附、融合和内在化的决定因子的结构基因，修饰了正链alphaviruses(Morris-Downes et al.，Vaccine 19；3877-3884，2001；Xiong et al.，Science 243：1188-1191，1991)和黄病毒(Bray et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：10342-10346，1991；Chambers et al.，J.Virol.73：3095-3101，1999；Guirakhoo et al.，J.Virol.75：7290-7304，2001；Huang etal.，J.Virol.74：3020-3028，2000)的分子克隆。这些嵌合病毒的复制由非结构蛋白和亲本株表达的非编码末端控制，而来自供体基团的结构蛋白提供特异性免疫。嵌合病毒的生物学特征由供体和受体病毒基因决定。通过比较在供体基因间有核苷酸序列差异的构建体，有可能分析出单个氨基酸残基在致病力和减毒方面的功能性作用。
使用掺入了来自日本脑炎(JE)减毒株(SA14-14-2)的prM-E基因的嵌合黄热病(YF)病毒，对于区别减毒JE病毒和强毒野生型JE Nakayama病毒的10个氨基酸突变进行了详细的检查(Arroyo et al.，J.Virol.75：934-942，2001)。通过单独地或成簇地将每个突变回复成野生型序列，并测定对于用104个噬菌斑形成单位(PFU)脑内(IC)途径接种的年轻成年小鼠的神经毒力的影响，定义了致病因子。所有的单点回复突变病毒保持了高度减毒，在3或4个残基处的回复是还原神经毒力表型所需的。仅一个单点回复突变体(E279 Met→Lys)显示了致病力变化的证据，在IC接种之后8只动物中1只死亡。
为了进一步探索E279决定因子的功能作用，我们比较了在这个氨基酸残基处不同的嵌合YF/JE病毒在乳鼠和猴中引起脑炎的能力。猴的IC接种通常被用作黄病毒和其他活疫苗的安全性测试，脑和脊髓组织的定量病理检查提供了辨别神经毒力方面有微小差别的相同病毒的毒株的敏感方法(Levenbook et al.，J.Biol.Stand.15：305-313，1987)。乳鼠提供了与更老的动物相比更敏感的模型，因为对趋神经性黄病毒的敏感性是年龄依赖性的(Monath et al.，J.Virol.74：1742-1751，2000)。结果证实了在E279处的单独的Met→Lys氨基酸突变使得神经毒力增加。这个突变位于E蛋白的铰链区，其与从内涵体进入感染细胞的细胞质的病毒透过期间的pH值依赖性构象变化有关(Reed et al.，Am.J.Hyg.27：493-497，1938)。重要地，显示了乳鼠能预测在恒河猴中的致病力情况(profile)。根据检测由点突变赋予的神经毒力方面的变化，我们认为，乳鼠是黄病毒疫苗候选物趋神经性的安全测试的合适宿主。
虽然增强了神经毒力，根据在猴中降低的病毒血和抗体反应所测量的，E279突变看起来对于趋内脏性有相反的影响，病毒血和抗体反应是这种病毒性状的公认标记物(Wang et al.，J.Gen.Virol.76：2749-2755，1995)。
材料和方法
病毒
通过克隆YF 17D病毒(Chambers et al.，J.Virol.73：3095-3101，1999)的完整11千碱基基因组的cDNA拷贝，开始ChimeriVaxTM-JE疫苗的开发。为了实现这个，在两个质粒中增殖YF 17D基因组序列，其分别编码核苷酸(nt)1-2276和8279-10，861(质粒YF5′3′IV)，和1373-8704(质粒YFM5.2)的YF序列。通过连接来自这些质粒的合适的限制性片段产生全长cDNA模板。YF5′3′IV和YFM5.2质粒内的YF序列被相应的JE(SA14-14-2)pr-ME序列替换，引起YF5′3′IV/JE(prM-E′)和YFM5.2/JE(E′-E)质粒的产生。用限制性内切酶NheI和BspEI次序地消化这些质粒。用T4 DNA连接酶连接合适的片段，用XhoI酶消化cDNA以容许转录，从Sp6启动子产生RNA。用全长RNA转染二倍体胎儿恒河猴肺(FRhL)细胞，通过电穿孔进行。当观察到细胞病变效应时(一般第3天)收获含有病毒的上清液，通过低速离心澄清并在0.22μm无菌过滤。添加50％v/v终浓度的胎儿牛血清(FBS)作为稳定剂。如早先描述的(Monath et al.，Vaccine 17：1869-1882，1999)，在Vero细胞中通过噬菌斑分析来滴定病毒。以大约0.001的感染复数在FRhL或Vero细胞(Vero-PM，Aventis Pasteur，Marcy
Figure A20058001359300161
France)中使所述嵌合病毒连续传代。商业上的黄热病17D疫苗(YF-VAX)从Aventis-Pasteur(以前的Pasteur-Mérieux-Connaught)，Swiftwater，PA获得。
定点诱变
如所描述的通过oligo-指导的诱变产生在残基E279含有单点Met→Lys回复的病毒(Arroyo et al.，J.Virol.75：934-942，2001)。简要地，含有核苷酸1108到2472的JE SA-14-14-2 E基因区域的质粒(pBS/JE SA14-14-2)(Cecilia et al.，Virology 181：70-77，1991)被用做定点诱变的模板。使用Transformer定点诱变试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)和在Life Technologies(Grand Island，NY)合成的寡核苷酸引物进行诱变。对质粒进行跨越E区的测序来证实唯一的变化是工程化的突变。然后使用NheI和EheI(Kas I)限制性位点将包含E279突变的区域从pBS/JE质粒亚克隆入pYFM5.2/JE SA14-14-2(Cecilia et al.，Virology 181：70-77，1991)。如上所述进行全长DNA和SP6转录的装配，然而，使用Lipofectin(Gibco/BRL)进行Vero细胞的RNA转染。
测序
通过Trizol(Life Technologies)从感染的单层分离RNA。用Superscript II逆转录酶(RT)和长RT方案(Life Technologies)进行逆转录，继之以RNaseH处理(Promega)和长-PCR(XL PCR，Perkin-Elmer/ABI)。使用YF17D株序列(GeneBank登记号K02749)和JE-SA14-14-2株序列(GeneBank登记号D90195)作为参照设计RT，PCR和测序引物。PCR产物进行凝胶纯化(来自Qiagen的Qiaquick凝胶提取试剂盒)，并使用Dye-Terminator d Rhodamine测序反应混合物(Perkin-Elmer/ABI)进行测序。在310型遗传分析仪(Perkin-Elmer/ABI)上分析测序反应，使用Sequencher 3.0(GeneCodes)软件评估DNA序列。
噬菌斑分析和中和测试
在Vero细胞的单层培养的6孔板上进行噬菌斑分析。在37℃在1小时培养期间吸附病毒之后，在营养培养基中用琼脂糖覆盖细胞。在第4天，添加含有3％中性红的第二次覆盖。如早先描述的进行血清稀释、噬菌斑还原中和测试(Monath et al.，Vaccine 17：1869-1882，1999)。
断乳小鼠模型
每组8到10只雌性4周龄ICR小鼠的几个组(Taconic Farms，Inc.Germantown，N.Y.)用有(剂量4.0log10PFU)或没有(3.1log10PFU)E279突变的30μL嵌合的YF/JE SA14-14-2(ChimeriVaxTM-JE)构建体IC接种。用YF-VAX或稀释剂接种等数量的小鼠。跟踪小鼠的疾病和死亡21天。
乳鼠模型
在分娩期观察怀孕的雌性ICR小鼠(Taconic Farms)以获得各窝乳鼠的确切年龄。集中在48小时间隔内出生的多窝乳鼠，随机分配给多达121只小鼠的组中的母鼠。用20μL的病毒的连续十倍稀释物IC接种各窝，跟踪疾病的病征和死亡21天。回复滴定病毒接种物。通过Reed和Muench的方法(Morris-Downes et al.，Vaccine 19：3877-3884，2001)计算50％致死剂量(LD50)值。标绘单变量存活率分布并通过log rank检验来比较。
猴模型
如Levenbook et al.(Levenbook et al.，J.Biol.Stand.15：305-313，1987)所描述的进行猴神经毒力测试，YF 17D种子病毒(Wang et al.，J.Gen.Virol.76：2749-2755，1995)的安全性测试被WHO安全章程禁止。这个测试早先被用于评估ChimeriVaxTM-JE疫苗，描述了对FRhL3病毒的测试结果(Monath et al.，Curr.Drugs-Infect.Dis.，1：37-50；2001；Monath et al.，Vaccine 17：1869-1882，1999)。根据美国食品和药品管理局良好实验室实践(GLP)法规(21 C.F.R.，Part58)，在Sierra Biomedical Inc.(Sparks，NV)进行测试。在第1天体重3.0-6.5kg的十只(5只雄性，5只雌性)恒河猴接受0.25mL未稀释的有或没有E279 Met-Lys突变的ChimeriVaxTM-JE病毒或YF-VAX对脑部额叶中的单次接种。每天评估猴的临床征象并计分为0(无病征)、1(毛皮粗糙，不进食)、2(高音调的发声，不活动，缓慢移动)、3(摇晃的运动，颤动，不协调，肢无力)，和4(不能站立、肢麻痹，死亡)。每个猴的临床分值是动物的每天分值的平均值，治疗组的临床分值是单个临床分值的算术平均值。使用在第2-10天收集的血清在Vero细胞中通过噬菌斑分析来测量病毒血水平。在31天，对动物进行安乐死，用等渗盐水-5％乙酸继之以中性缓冲的10％***灌注，进行验尸。固定脑和脊髓，切片并用倍花青染色。通过中枢神经***的各种解剖形式中损害的存在和严重度来评定神经毒力。使用WHO规定的度量来对每个组织块内的严重度计分(Wanget al.，J.Gen.Virol.76：2749-2755，1995)：
级别1：最轻的：1-3个小的病灶炎症性渗透。少数神经元被改变或损失。
级别2：中度：更广泛的病灶炎症性渗透。神经元改变或损失影响不不超过三分之一的神经元。
级别3：严重的：神经元改变或损失影响33-90％的神经元；中度病灶或弥漫的炎性改变。
级别4：压倒性的；超过90％的神经元被改变或损失，有可变的但经常地为严重的炎症性渗透。
最经常地涉及病理过程和有最大严重度的结构被称为“目标区域”，而区分野生型JE病毒和ChimeriVaxTM-JE的那些结构被称为“辨别体区域”。黑质构成了“目标区域”，尾状核、苍白球、核、前/中丘脑的核、侧面丘脑的核、和脊髓(颈和腰部的膨大)构成了“辨别体区域”(Monath et al.，Curr.Drugs Infect.Dis.，1：37-50，2001)，如早先对于YF 17D显示的(Levenbook et al.，J.Biol.Stand.15：305-313，1987)。由对处理方式不了解的单个有经验的研究者进行所有神经病理评估。对每只猴确定目标区域、鉴别体区域、和目标+鉴别体区域的独立分值，根据平均分值比较测试组。还检查了脑干(除了黑质之外中脑的核；桥；髓质；和小脑)和柔脑膜的其他区域。通过Student′s t检验、2-尾进行平均神经病理分值(对于目标区域、鉴别体区域，和目标+鉴别体区域)的统计比较。除了神经病理检查之外，通过光学显微镜检查肝脏、脾脏、肾上腺、心脏和肾脏的病理改变。
基因组稳定性
为了确定YF/JE嵌合病毒的遗传稳定性，和查找疫苗基因组中对突变敏感的“热点”，进行了多次实验，其中RNA用于转染细胞，子代病毒在体外连续传代，在低和高的传代水平进行部分或完整的基因组测序。从FRhL或Vero-PM细胞的转染步骤开始进行传代系列。在生长于T25或T75烧瓶中的细胞培养物中以低MOI进行病毒的连续传代。在选定的传代水平，提取病毒基因组RNA的双份样品，逆转录，通过PCR扩增，测定prM-E区域或完整基因组的序列。
结果
经验性传代的单点突变病毒的产生
从转染的FRhL细胞(FRhL1)回收嵌合的YF/JESA14-14-2(ChimeriVaxTM-JE)病毒，以约0.001的MOI在这些细胞的液体培养物中连续地传代。如下所述，在第4代我们注意到噬菌斑形态学上的改变，这随后被证明与核苷酸1818处的T→G颠换相关，其产生E蛋白的位置279处的氨基酸变化(Met→Lys)。
在每个传代水平表征噬菌斑，根据在第6天测量的大小分成3类(大，L～＞1.0mm，中，M～0.5-1mm，和小的，S～＜0.5mm)。通过计数100个噬菌斑确定噬菌斑大小分布。FRhL3(3rd传代)病毒含有80-94％的L和6-20％的S噬菌斑。在FRhL5(5th传代)，检测到噬菌斑大小的变化，出现包含了＞总噬菌斑群体85％的S噬菌斑。FRhL4病毒是中间的，具有40％大的和60％小的噬菌斑。FRhL5病毒完整基因组测序表明了E279处的单个突变。FRhL5嵌合体的完整基因组共有序列，通过仔细检查密码子异质性，证实了这是病毒中存在的唯一可检测的突变。FRhL3病毒的完整基因组共有序列揭示了与亲本YF/JESA14-14-2嵌合病毒相比没有可检测的突变(Arroyo et al.，J.Virol.75：934-942，2001)(表1)。
从FRhL3、-4和-5挑出十个大、中和小的噬菌斑，在FRhL细胞的液体培养物中通过传代扩增。扩增之后，上清液在Vero细胞上形成噬菌斑。从FRhL3分离S噬菌斑表型的尝试失败了，所有分离的L或S大小的噬菌斑在FRhL细胞中的一轮扩增之后产生了大多数的L噬菌斑。在下一个传代(FRhL4)，60％的噬菌斑是小的，可能通过在FRhL细胞中扩增来分离这些噬菌斑。在FRhL5，大多数噬菌斑(85-99％)是小的，L和S单个噬菌斑的扩增都产生大多数的S大小。对来自FRhL的S和L噬菌斑表型的prM-E基因测序，揭示了与用于构建ChimeriVaxTM-JE的亲本SA14-14-2基因相同的序列，而分离自FRhL4或FRhL5病毒的S噬菌斑揭示了E279处的突变(Met→Lys)。
动物方案
涉及小鼠和非人灵长类的所有研究都根据USDA动物福利法(9C.F.R.Parts 1-3)、如在“实验动物的照料和使用指南”中描述的进行。
对断乳小鼠的致病力
在独立的实验中，十只4周龄雌性ICR小鼠用大约3.0log10PFU的FRhL3、-4或-5病毒IC接种；在每个研究中，10只小鼠接受等剂量(大约3.3log10PFU)的商业的黄热病疫苗(YF-VAX，AventisPasteur，Swiftwater PA)。用嵌合病毒接种的小鼠都没有显示疾病的迹象或死亡，而用YF-VAX接种的对照小鼠的70-100％发生了麻痹或死亡。在另一个实验中，用FRhL5(3.1log10PFU)或YF/JE单点E279回复突变体(4.0log10PFU)IC接种8只小鼠，9只小鼠接受YF-VAX(2.3log10PFU)。用嵌合构建体接种的小鼠都没有生病，而用YF-VAX接种的6/9(67％)的小鼠死亡。
对乳鼠的致病力
进行两个独立的实验，其中有或没有E279突变的YF/JESA14-14-2嵌合病毒以分级的剂量IC接种到乳鼠(表2)。YF-VAX被用做这些实验中的参考对照。对每个病毒测定LD50和平均存活时间(AST)。
在使用8.6天龄小鼠的第一实验中，在E279含有单点回复(Met→Lys)的FRhL5病毒是神经毒性的，log10LD50为1.64，而缺少这个突变的FRhL3病毒是几乎无毒的，在最高剂量组中10只小鼠仅1只死亡(表2)。在最高剂量(约3log10PFU)，与FRhL3病毒的(15天)相比，FRhL5病毒的AST更短(10.3天)。
随后进行第二实验以统计学地证实E基因中的单点突变是可由乳鼠中的神经毒力测试检测的。在这个实验中，4天龄的远亲繁殖小鼠用分级剂量的ChimeriVaxTM-JE FRhL3(无突变)、ChimeriVaxTM-JEFRhL5(E279Met→Lys)，或其中通过定点诱变导入了单个突变E279(Met→Lys)的YF/JE嵌合体(Arroyo et al.，J.Virol.75；934-942，2001)IC接种。含有E279突变的两个病毒的LD50值低于无突变的FRhL3构建体的十分之一(表2)，表明E279 Met→Lys突变提高了嵌合病毒的神经毒力。在病毒之间在存活率分布上存在统计学上显著的差异(附图1)。在最低剂量(～0.7log10PFU)，与YF-VAX相比，YF/JE嵌合病毒显著是更低毒力的(log rank p＜0.0001)。具有E279 Met→Lys突变的病毒具有不同于无突变FRhL3病毒的类似的存活曲线，但差异没有达到统计显著性(log rank p＝0.1216)。然而，在更高的剂量(～1.7和～2.7log10PFU)，E279突变病毒的存活率分布显著不同于FRhL3病毒。
病毒剂量的死亡率分析揭示了类似的斜率和平行回归线(附图2)。FRhL5病毒比FRhL3更强(有毒力)18.52倍(95％置信界限3.65和124.44，p＜0.001)。
猴神经毒力测试
用ChimeriVaxTM-JE FRhL3或FRhL5病毒接种的20只猴都没有发生脑炎的病征，而用YF-VAX接种的4/10只猴子在第15-29天发展出级别3的病征(颤动)，其在发作的6天内消退。与在两个ChimeriVaxTM-JE组中相比，在YF-VAX组中平均和最大平均临床分值显著地更高。在接受有和没有E279突变的ChimeriVaxTM-JE病毒的组之间不存在临床分值的差异(表3)。
在治疗组之间在实验期间在体重变化方面没有差异。病理检查揭示了没有可归因于病毒的肝脏、脾脏、肾脏、心脏或肾上腺的改变，在治疗组之间没有差异。
与ChimeriVaxTM-JE病毒FRhL3和FRhL5相比，脑和脊髓的病理组织学检查揭示了用YF-VAX接种的猴子的显著更高的损害分值(表3)。对于YF-VAX的组合的目标+鉴别体分值(±SD)是1.17(±0.47)。ChimeriVaxTM-JE FRhL3(E279Met)和FRhL5(E279Lys)的分值分别是0.29(±0.20)，(p＝0.00014 vs.YF-VAX)和0.54(±0.28)，(p＝0.00248 vs.YF-VAX)。
与ChimeriVaxTM-JE FRhL3的相应分值相比，在E279含有Met→Lys回复的ChimeriVaxTM-JE FRhL5的鉴别体区域分值和组合的目标+鉴别体区域分值显著更高(表3)。
用YF-VAX接种的猴中主要症状是颤抖，其可以反映小脑、丘脑核或苍白球的病变。在小脑皮层、N.dentatus、或其他小脑核中没有发现清楚的组织学病变，而在所有阳性猴中在丘脑核和苍白球中存在炎症性病变。
有趣地，如由病毒血所反映的，在E279回复突变体的神经毒力和趋内脏性之间存在反比关系。WHO猴神经毒力测试包括病毒血的定量作为趋内脏性的度量(世界卫生组织，“黄热病疫苗的要求”，生物物质的要求No.3，1995年修正，WHO Tech.Rep.Ser.872，Annex 2，Geneva：WHO，31-68，1998)。根据脑内接种立即产生神经外组织的播种(seeding)的观察结果(Theiler，″The Virus，″In Strode(ed.)，Yellow Fever，McGraw Hill，New York，New York，46-136，1951)，这是合理的。用YF-VAX接种的10只猴子中的9只(90％)以及用ChimeriVaxTM-JE FRhL3接种的10只猴子中的8只(80％)在IC接种后成为病毒血的。与在ChimeriVaxTM-JE FRhL3组中相比，在YF-VAX组中病毒血的水平倾向于更高，在第4天达到显著。相反，仅2只(20％)给予FRhL5病毒(E279 Met→Lys)的动物具有可检测的、低水平的病毒血(表4)，在第3天和第4天平均病毒血显著低于FRhL3病毒(在第5天几乎是显著的)。因而，与FRhL3病毒相比，FRhL5回复突变病毒显示了提高的神经毒力，和降低的趋内脏性。检查来自用ChimeriVaxTM-JE FRhL3和FRhL5接种的猴的血清中噬菌斑大小变体的存在。在来自用FRhL3接种的猴的血清中仅观察到L噬菌斑，而在用FRhL5接种的猴血液中的病毒具有合适的S噬菌斑形态。
免疫原性
在接种后31天在三个组中的所有猴子都发展出针对黄热病(YF-VAX组)或ChimeriVaxTM-JE(ChimeriVaxTM组)的同源的中和抗体，1个动物(FRhL5，RAK22F)除外，其由于样品损失没有被测试。然而，与FRhL5相比(GMT 169，p＝0.0386，t-测验)，在用FRhL3接种的猴子中(GMT 501)几何平均抗体滴度(GMT)显著更高。
基因组稳定性
在两个细胞株FRhL和Vero的每一个中，进行ChimeriVaxTM-JERNA的两次独立转染，如附图3所示的对子代病毒传代。如上所述，FRhL传代系列B产生FRhL4的E279回复的出现。有趣地，在FRhL细胞中独立的传代系列(A)也在E281处的邻近残基中产生突变(Thr→Lys)的出现，在Vero细胞中的传代系列之一产生E271处的Val→Lys突变。在Vero细胞中选择的其他突变在于结构域III中或跨膜结构域内。在成年小鼠神经毒力测试中评估了附图1所示含有突变的所有病毒，发现是无毒的。
II.包括绞链区突变的黄热病/登革热嵌合体
概述
通过用从嵌合cDNA转录的RNA转染Vero细胞产生嵌合的黄热病-登革热病毒(ChimeriVaxTM-DEN1)。使细胞培养物上清液经历噬菌斑纯化来鉴定没有突变的疫苗候选物。十个噬菌斑纯化的克隆中，选择唯一不含有任何突变(克隆J)的用于疫苗病毒的生产。然而，在这个克隆的细胞培养传代以生产疫苗期间，在E204发生了单个氨基酸替换(K到R)。在另一个克隆(克隆E)观察到了相同的突变。对于通过脑内途径接种的4天龄乳鼠，发现这个突变使病毒减毒，在通过皮下或脑内途径接种的猴中降低了病毒血/趋内脏性。在用两种病毒的任一种接种的猴脑中病变的临床分值都统计学地低于对照病毒YF-VAX的。在人类肝癌细胞系HepG2中，突变体和亲本(非突变体)病毒都比YF-VAX显著更低水平地生长。当胸内地接种到蚊子中时，两种病毒都生长到与YF-VAX类似的水平，这显著地低于它们的野生型DEN1亲本病毒。亲本和突变病毒的包膜蛋白质结构的比较揭示了在突变病毒中204R、261H和257E之间新的分子内键的出现。
材料和方法
细胞和病毒
从有资格的细胞库(Aventis Pasteur，France)获得用于疫苗生产的Vero细胞。HepG2购自美国典型培养物保藏所(Manassas，VA)。通过用体外RNA转录产物和随后的噬菌斑转染Vero细胞，制备了三次噬菌斑纯化的ChimeriVaxTM-DEN1病毒(克隆E，Vero P6；和克隆J，Vero P7)。如所描述的通过在cGMP工厂三次传代从Pre-MasterSeed(PMS；克隆J，Vero P7)病毒储库在P10生产ChimeriVaxTM-DEN1疫苗lot(VL)病毒。在C6/36细胞中制备野生型(WT)DEN1亲本(株PU0359，ChimeriVaxTM-DEN1病毒的prME基因的供体)的储库病毒(stock virus)。YF-VAX(疫苗株17D)购自AventisPasteur(France)，没有任何稀释或进一步传代而使用。在表5中提供了各种未克隆的和克隆的ChimeriVaxTM-DEN1病毒的表征的其他细节。
动物研究
所有研究都根据USDA动物福利法(9 CFR Parts 1-3)、如在“实验动物的照料和使用指南”中描述的、在IACUC批准的方案下进行。
小鼠
在乳鼠中评定DEN1嵌合体的不同克隆的神经毒力表型。怀孕的ICR小鼠购自Taconic Farm(Germantown，NY)。在2-3天龄集中乳鼠，随机分配给母鼠(9-12只小鼠/母鼠)。在3-4天龄通过IC途径用0.02ml各种稀释度的病毒接种小鼠。观察小鼠21天，记录死亡率。对Vero细胞的噬菌斑分析中通过接种物的反滴定测定施用给每组动物的病毒浓度。
猴
在恒河猴中进行两项实验(在Sierra Division，Charles River实验室，Inc.，Sparks，Nevada)以评定有或没有E204突变的ChimeriVaxTM-DEN1病毒的趋内脏性(实验1)和神经毒力(实验2)。在第一实验中，通过SC途径用嵌合的DEN1病毒接种恒河猴(Macacamulatta)，而在第二实验中通过IC途径接种猕猴(Macacafascicularis)。因为两个物种是***发生上相关的，和由于恒河猴的不可得性，选择猕猴用于第二实验。在之前用ChimeriVaxTM-DEN1-4病毒以及YF-VAX进行先导试验来确保猕猴作为恒河猴的替换的适合性。
实验1
总共12只(6只雄性以及6只雌性)实验上幼稚的(naive)、黄病毒血清反应阴性的恒河猴，雄性年龄2.7到4.3岁，雌性年龄2.6到5.2岁，在给予剂量之前的一天，雄性体重3.6到4.3kg，雌性体重3.4到4.6kg，分配到3个治疗组(n＝4)。每个动物通过SC注射接受单次剂量(在含有50％胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(MEM)中的～5log10PFU/0.5ml病毒)的三种病毒之一：组1：ChimeriVaxTM-DEN1(未克隆的病毒，Vero P4)；组2：ChimeriVaxTM-DEN1(克隆E，Vero P6)；和组3：ChimeriVaxTM-DEN1 PMS(克隆J)。给予剂量的那天称为第1天。在第1天给予剂量前和第2到11天采集血液样品用于病毒血分析，在第31天采集用于中和抗体分析。在分配用于研究之前，动物已经进行了完整的身体检查，包括腹部触诊和对皮肤、呼吸和心血管***状况的观察、以及评估血清化学和血液学参数的标准组(panel)。在整个研究中，观察动物在一般的外观和行为(每天至少2次)、体重(每周)和采食量(每天)的变化。在第31天最后一次样品采集之后，所有动物回到SBi动物群体。
实验2
通过注射入预先筛选为对黄病毒血清反应阴性的18只实验上幼稚的、黄病毒血清反应阴性的猕猴的左侧额叶中(n＝6/组)，来施用(0.25mL)ChimeriVaxTM-DEN1 PMS(克隆J，P7)和ChimeriVaxTM-DEN1 VL(P10)(各5log10PFU)以及YF-VAX对照疫苗(4.7log10PFU)。在接种后观察猴子30天，然后进行安乐死和验尸。从所有动物移出选定的组织，在组织病理学评估之前加工成载玻片。
在观察期期间，评估猴的临床征象(每天两次)、体重(每周)和采食量(每天)的变化。根据世界卫生组织(WHO)对黄热病病毒疫苗的要求(世界卫生组织，“Requirements for yellow fever vaccine″Requirements for Biological Substances No.3，revised 1995，WHOTech.Rep.Ser.872，Annex 2，Geneva：WHO，31-68，1998)，根据临床计分***对临床征象分配分值。在研究前和第1天接种前，以及在第3、5、7、15和31天采集血液样品用于临床病理学分析(血清化学和血液学参数)。在第1天接种前和第2-11天采集额外的血液样品用于病毒血分析，在第1天(剂量给药前)和31天采集用于中和抗体反应的测量。
在验尸时，记录总的病理发现，收集和保存组织的完整列表。从选定的组织的子集制备载玻片，由研究病理学家检查组织病理学发现(肝脏、脾脏、心脏、肾脏和肾上腺)。根据WHO对YF疫苗的要求由神经病理学家进行脑和脊髓的组织病理学研究。以盲目(blinded)的方式进行组织病理学评估。根据以下观察结果，使用0-2的数值对脑膜和脑/脊髓物质中的病变进行计分：级别0：无可见的病变；级别1(最小的)，1-3个小的和/或一个大的渗透，主要是血管周围的，更为弥漫的渗入的几个小病灶，不与血管连接；和级别2：(轻微的)，超过3个小的和/或2个或更多大的血管周围的渗透，细胞浸润的几个病灶，不与血管连接(某些神经元可能涉及这些炎症的病灶)。对目标和鉴别体区域评估神经毒力的程度。对于猕猴，脊髓的黑质以及颈部和腰部膨大代表目标形成，而基底神经节和丘脑核被认为是鉴别体区域。单独地和作为组合的分值计算目标和鉴别体区域的单独的和组平均病变分值。
噬菌斑分析
对感染后第2-11天获得的血清(未稀释或1∶2和1∶10稀释度稀释)使用Vero细胞进行标准噬菌斑分析。病毒血滴度表示为PFU/ml。利用Vero细胞的噬菌斑还原法被用于测量对同源病毒(嵌合体或YF-VAX)中和抗体反应。在这个测试中，恒定的病毒输入(～50-100PFU)被不同的血清稀释物(热钝化的)中和，滴度被表示为抑制50％的噬菌斑(PRNT50)的最高血清稀释度。
HepG2细胞中的生长动力学
HepG2细胞在补充有8％FBS(Hyclone)和Antibiotic/Antimycotic(Sigma)的Eagles MEM(Vitacell)中在T25烧瓶中在37℃ 5％CO2生长到汇合，用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS、ChimeriVaxTM-DEN1VL、或亲本病毒(YF-VAX和WT DEN1株PUO359以0.001的MOI感染1小时。除去接种物，用PBS洗涤细胞三次以除去未结合的病毒，向培养物添加生长培养基。除去每日样品(10天)，添加FBS到终浓度50％以保持病毒传染性，将样品保存在-70℃。利用琼脂糖双覆盖和中性红对Vero细胞通过噬菌斑分析来测定病毒滴度。
蚊子传播
来自波多黎各的埃及伊蚊(Aedes aegypti)的实验室建立的群落的F4代，用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS(P7)、ChimeriVaxTM-DEN1VL(P10)或对照亲本(YF 17D和WT DEN1，PUO359株)病毒接种。将蚊子冷麻痹，胸内地(IT)接种来排除在中肠中与口服饲喂相关的可能的感染障碍，使用利用Narishige(Tokyo)针拉器拉尖的毛细管针。将标准化为6.0log10PFU/ml的大约0.34μl病毒注入每个蚊子中(2.5log10PFU/蚊子)。接种的蚊子维持在饲育盒中，27℃、80％湿度、5％糖水。以48小时的间隔从每个感染移出三只蚊子持续10天；其余的蚊子在接种后14天收集，冷冻在-70℃直到被分析。通过实时RC-PCR(TaqMan)测定传染性的病毒滴度。用PrimerExpress软件包(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)设计引物和探针。在5′端用FAM报告染料以及在3′端用黑淬火(dark quencher)染料标记TaqMan探针。每种ChimeriVaxTM-DEN引物都是血清型特异性的，而YF 17D引物检测ChimeriVaxTM-DEN和YF 17D病毒两者。
统计分析
使用Product-Limit Survival Fit分析在用DEN1克隆或YF-VAX接种的乳鼠的组之间平均存活时间(AST)中的差异的显著性。使用Oneway Anova测试进行两个组之间或动物组之间显著性水平的所有其他可能性分析。所观察到的0.050或更低的显著性概率常被认为是变量模型的分析适合数据的证据。所有的分析用JMP软件版本5.1进行。
结果
乳鼠中DEN1的各种克隆的神经毒力性质
在DEN1嵌合体的PMS生产过程中的噬菌斑纯化期间，对10个不同的克隆(A-J)测序来鉴定没有任何氨基酸替换的克隆。除了1个克隆(J)之外所有的都含有包膜蛋白E内的1或2个替换。使用通过IC途径接种的4天龄乳鼠评估代表性克隆的神经毒力(表6)。除了克隆E之外，所有的克隆展现出类似的神经毒力，AST为8.5到11.3天，其显著地高于YF-VAX(8.3天)。克隆E，其含有2个突变(在1590一个核苷酸从A变到G，产生K到R的替换，在3952一个核苷酸从A变到T，其是沉默的)，具有比所有其他DEN1克隆显著更低的毒性，AST为13-15天。有趣地，在原始的、未克隆的DEN1嵌合体中鉴定的E-蛋白唯一的氨基酸变化也是E204 K到R替换。当通过SC途径接种入猴时，这个病毒显示了引起低水平的病毒血(平均峰值滴度0.7log10PFU/ml)1.3天(Guirakhoo et al.，J.Virol.75(16)：7290-7304，2001)。克隆J不含有任何突变，显示了在4天龄小鼠中(参见表6中的统计)比YF-VAX显著更低的毒性，被选择用于cGMP疫苗病毒的生产。为了确定克隆E对于婴儿小鼠的减毒是否与猴中更低程度的趋内脏性/病毒血和/或免疫原性相关，通过SC途径将这个克隆和克隆J(PMS)接种到猴中(见下文)。
实验1.在通过SC途径接种的猴中有或没有E204突变的ChimeriVaxTM-DEN1病毒的病毒血/趋内脏性和免疫原性
将十二只恒河猴黄病毒血清反应阴性的猴子分成3个组(n＝4)。如表7所示，每个组中的动物通过皮下(SC)注射接受3种病毒的一种的单次剂量(～5log10PFU病毒/0.5ml)。在1个月的观察期中，在临床征象、采食量或体重方面没有发现与测试物品相关的变化。病毒血和中和抗体反应
如表7所示，用DEN1 PMS病毒接种的所有4只猴子(克隆J，组3)成为病毒血的，而用克隆E或未克隆的DEN1病毒接种的3/4和2/4的猴子分别成为病毒血的。在组3的所有4只动物中检测到病毒血直到样品采集的最后一天(第11天)，而在组1和2中在第5天后没有动物是病毒血的(检测的水平1log10PFU/ml)。对于组1-3，平均峰值病毒滴度分别为0.75(病毒血的动物为1.5)、1.3(病毒血的动物为1.7)和2.5log10PFU/ml。对于组1-3，病毒血的平均持续时间分别为1(对于病毒血的动物为2)、1.5(对于病毒血的动物为2)和8.5天。在组3的猴子中病毒血的数量和持续时间显著地高于组1和2(参见表8中的统计)的动物。尽管在一些猴中没有病毒血，但所有的动物发展出针对同源病毒的中和抗体(表7)。对于组1-3，中和抗体滴度的几何平均数(GMT PRNT50)分别是538、3620和8611。与病毒血的水平一致，在用PMS病毒免疫的猴中(组3，没有突变)中和滴度显著地高于其他2组(组1和2，有突变)(参见表7中的统计)。组1的猴(用在包膜蛋白上有2个氨基酸替换M39 H＞R和E204 K＞R的DEN1嵌合体免疫的)的血清显示了最低的中和滴度。
实验2.在通过IC途径接种的猴中有或没有E204突变的ChimeriVaxTM-DEN1病毒的安全性/神经毒性
用含有包膜蛋白E上单个氨基酸替换K到R的克隆E接种乳鼠，已经表明了这个位点涉及DEN1嵌合体对于婴儿小鼠的神经毒力。随后，当通过SC途径将这个克隆接种到猴中时，与非突变病毒(克隆J PMS，P7)相比，就数量和持续时间而言，它诱导了显著降低的病毒血。有趣地，当克隆J在Vero细胞中传代在P10生产cGMP VL时，它获得了与克隆E所观察到的相同的核苷酸变化(核苷酸1590A到G，引起K到R替换)。当在婴儿小鼠中测试时，这个疫苗病毒(P10)类似地毒性比PMS(P7)更低。由于DEN1疫苗(P10)的减毒取决于E蛋白上的单个氨基酸替换(E204R)，其在理论上可以在接种的个体中回复到WT序列(E204K)，因此必须确定当直接注射到脑组织中时非突变病毒(WT包膜)的安全性分布型(profile)。
通过IC途径用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS(P7，E204K)、ChimeriVaxTM-DEN1 VL(P10，E204R)或YF-VAX(作为对照)接种三组猴子(n＝6)。监视动物的临床征象31天，然后处死用于病理评估。
病毒血
用ChimeriVaxTM-DEN1，PMS病毒接种的所有6只猴子(组1)成为病毒血的。病毒血的持续时间一般为4-5天，峰值滴度范围1-3.3log10PFU/ml(表9)。平均峰值病毒血是2.5log10PFU/ml，平均持续时间4.2天(表10)。用ChimeriVaxTM-DEN1VL病毒(组2)接种的6只猴中的5只成为病毒血的。病毒血的持续时间一般地是1-4天，峰值滴度范围1-2.1log10PFU/ml(表9)。平均峰值病毒血是1.4(对于病毒血的动物为1.6)log10PFU/ml，平均持续时间2.5天(对于病毒血的动物为3天)(表10)。
用YF-VAX(组3)接种的所有6只猴子成为病毒血的。病毒血的持续时间一般为2-4天(一个例外，其中1log10PFU/ml的病毒滴度在接种后9天观察到，之前是4天的不可检测的滴度)，峰值滴度范围1-3log10PFU/ml(表9)。平均峰值病毒血是2.2log10PFU/ml，平均病毒血天数是2.8天(表10)。组1中的病毒血的峰值滴度和持续时间显著地高于组2。当组1(P7)与组3(YF-VAX)相比时，在2个组之间仅病毒血的持续时间是显著的，而不是病毒血的数量(magnitude)。P10疫苗病毒(组2)的病毒血和持续时间类似于YF-VAX(关于统计参见表10)。
对于所有的组，猴病毒血滴度低于500和100小鼠IC LD50值(对于YF-VAX，估计分别等于～20,000和～4,000Vero细胞PFU/0.03mL(Guirakhoo et al.，Virology 257：363-372，1999))，对于单独的猴子和组(即，存在于不超过10％的猴子中)滴度它们分别是最大可接受滴度，如在WHO对黄热病17D疫苗的要求下所确定的。
免疫原性
在用YF-VAX处理后所有的猴子血清转变了。在第31天，针对YF病毒的PRNT50范围为640到2560。在第31天在PRNT50分析中，YF-VAX处理的猴子之一具有与异源DEN1的交叉反应性。在黄病毒中这种抗体交叉反应性不是出乎意料的。然而，不能排除研究前的抗体筛选未能检出这个猴子对于异源黄病毒的久远的暴露。
在用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS或ChimeriVaxTM-DEN疫苗病毒(表9)处理之后，所有的猴子血清转变了。在ChimeriVaxTM-DEN1PMS和ChimeriVaxTM-DEN疫苗处理的组中，PRNT50范围分别是1280-5120和2560-10240，没有猴子具有与YF-17D病毒交叉反应的抗体。对于ChimeriVaTM-DEN1处理的两个组，抗体水平与病毒血水平成反比(参见表9中的统计)。
组织病理学
在用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS病毒接种的1/6的猴子中，和在用ChimeriVaxTM-DEN1 VL接种的3/6的猴子中发现了最小的病变(表11)。病变存在于用YF-VAX接种的5/6的猴子中。所有这些病变都是炎症性的，有最小的和轻微的严重度，包括组织细胞和淋巴细胞。在脑膜中的浸透主要可见于接种位点的周围。在阳性猴的脑和/或脊髓中注意到主要为血管周围的少量渗透。在任何动物中没有涉及神经元。在ChimeriVaxTM-DEN1处理的组中的病变一般是最小的(级别1)，仅在接受ChimeriVaxTM-DEN1 VL的猴的F22205M的一个脑切片中发现级别2的病变。在YF-VAX处理的组中，级别2病变存在于4只猴的多个脑切片中。目标和鉴别体区域的单独的和组平均病变分值和组合的分值在表11中示出。
在非中枢神经***(CNS)组织中，分别在用ChimeriVaxTM-DEN1(P7)、ChimeriVaxTM-DEN1(P10)或YF-VAX处理的4/6、3/6和6/6动物中，唯一与疫苗相关的组织病理学发现是最小到轻微的脾脏的淋巴增生。在这项研究中淋巴增生被认为是免疫刺激继发性的。
分别在用ChimeriVaxTM-DEN1(P7)、ChimeriVaxTM-DEN1(P10)或YF-VAX接种的1/6、5/6和5/6的猴子中观察到CNS病变。所有这些病变都是炎症性的，有最小和轻微的严重度(级别1或2)。在有病变的那些猴子的脑和/或脊髓中注意到主要为血管周围的少量的渗透。在任何动物中没有涉及神经元。在ChimeriVaxTM-DEN1处理的组中的病变一般是最小的(级别1)，而接受ChimeriVaxTM-DEN1 VL(P10)的一个猴子的一个脑切片有轻微的(级别2)病变。在YF-VAX处理的组中，级别2病变存在于4只猴的多个脑切片中。ChimeriVaxTM-DEN1 PMS病毒和ChimeriVaxTM-DEN1 VL处理的组，目标区域、鉴别体区域和组合的病变分值比参考YF-VAX处理的组低得多(参见表11中的统计)。对于两个ChimeriVaxTM-DEN1处理的组，在目标和鉴别体区域病变分值中的差异不是统计学上显著的(表11)。
有或没有E204突变的ChimeriVaxTM-DEN1病毒在HepG2肝细胞瘤细胞中的生长动力学
与YF 17D病毒相比，ChimeriVaxTM-DEN1和亲本WT DEN1病毒都生长更慢，并达到显著更低的滴度。对于WT DEN1、ChimeriVaxTM-DEN1 PMS(E204K)、ChimeriVaxTM-DEN1 VL(E204R)和YF17D病毒，峰值滴度分别在第9、8、7和5天。对于WT DEN1、ChimeriVaxTM-DEN1 PMS、ChimeriVaxTM-DEN1 VL和YF 17D病毒，峰值水平的病毒浓度分别是～3.2、3.6、4.1和7.8log10PFU/ml(附图5)。
有或没有E204突变的ChimeriVaxTM-DEN1病毒在蚊子中的生长
这个实验的基本原理是要确保即使在接种的个体中回复到WT序列，ChimeriVaxTM-DEN1突变体疫苗将在人类宿主中保持安全并且将不会在蚊子中复制。在蚊子中评估ChimeriVaxTM-DEN1病毒的复制和传播。用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS(E204K P7)、ChimeriVaxTM-DEN1 VL(E204R，P10)、WT DEN1(株PUO359)或YF 17D病毒通过IT途径接种Aedes aegypti蚊子，并比较复制速率。在两种嵌合病毒和YF 17D之间没有显著差异。WT DEN1滴度比两种ChimeriVaxTM-DEN1病毒都高约0.5-2.5logs(附图6)。
突变204在DEN1 E蛋白的晶体结构上的位置
根据DEN2病毒的已知结构(Modis et al.，Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(12)：6986-6991，2003)使用来自Accelrys的同源性建模软件，对DEN1 E蛋白外部结构域(株PUO 359，代表ChimeriVax-DEN1(PMS，E204K，wt，p7)的E蛋白)的394残基的结构进行建模(附图7A和7B)。位置204的K残基被突变成R，对突变体病毒重复建模来表现ChimeriVaxTM DEN1(E204R，突变体，VL，P10)病毒的E蛋白结构(附图7C)。残基204位于连接结构域II的2个β链f和g的短环内(附图7A)，在2个α-螺旋，α-A和α-B的附近。结构域II在它的尖端还带有保守的融合肽。这个短环位于围绕有残基的疏水口袋内，所述残基影响神经毒力或病毒融合的pH阈值(Modis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(12)：6986-6991，2003)。附图7B是附图7A中相应区域的特写，氨基酸204K以条状物表现。204K和261H侧链的氮(N)原子分别与252V(相隔2.7A)和253L(相隔2.65A)侧链的氧(O)原子形成H键(附图7B)。相比之下，204从K到R的突变引起构象变化，其中204R和261H到252V和253L的距离分别增加到5.10和8.11。这个移动引起这些残基之间分子间(在2个E单体之间)H键的损失。为了补偿这2个H键的损失，突变体病毒中204R侧链的N原子产生了三个新的分子内的(在相同的E单体内)键；在204R的N和261H和257E的N和O原子之间(分别相隔3.01、3.07和2.78)(图7C)。R和E氨基酸之间的相互作用可能是盐桥而不是H键，因为它们在中性pH值下都带电。另一个有趣的观察结果是，突变体病毒中261H的侧链与它在WT结构中的位置相比被翻转(比较附图7B和7C中的261H位置)。
表1.ChimeriVaxTM-JE FRhL3和ChimeriVax-JE FRhL5病毒与JE SA14-14-2疫苗、野生型JE株、亲本SA14和Nakayama病毒的公开序列中氨基酸差异的比较。
ChimeriVaxTM-JE FRhL3和FRhL5病毒在它们的完整基因组上被测序，在E279处的突变是所发现的唯一差异。
  病毒   E107   E138  E176   E177   E227   E244   E264   E279   E315  E439
  ChimeriVaxTM-JE FRhL3E279 MetChimeriVaxTM-JE FRhL5E279 LysJE SA14-14-2 PDK1JE SA14-14-2 PHK2JE SA141，3JE Nakayama4   FFFFLL   KKKKEE  VVVVII   AATATT   SSSSSP   GGGGGE   HHQHQQ   MKMMKK   VVVVAA  RRRRKK
1Nitayaphan，et al.，Virology 177：541-552，1990.
2Ni et al.，J.Gen.Virol.75：1505-1510，1994；PDK＝初级狗肾
3Aihara et al.，Virus Genes 5：95-109，1991；PHK＝初级仓鼠肾
4McAda et al.，Virology 158：348-360，1987.
表2.有或没有E279处的突变的ChimeriVaxTM-JE病毒和YF17D疫苗对乳鼠的神经毒力
  实验   小鼠年龄(天)   病毒，传代和E279氨基酸   脑内剂量(Log10PFU)   死亡率(％)   平均存活时间(天)   LD50(Log10PFU)
  1   8.6   YF-VAX   1.15   10/10(100)   8.4   0.11
  0.15   5/10(50)   10
  0-0.85   1/10(10)   14
  ChimeriVaxTM-JE，FRhL3.E279 Met   2.60   1/10(10)   15   ＞2.6
  1.6   1/10(10)   13
  0.6   0/10(0)   N/A
  -0.45   0/10(0)   N/A
  ChimeriVaxTM-JE，FRhL5，E279 Lys   3.0   10/10(100)   10.3   1.64
  2.0   8/10(80)   11.25
  1.0   2/10(20)   14.5
  0   2/10(20)   16
2 4 YF-VAX   0.95   11/11(100)   8.4   -0.3
  -0.05   9/11(82)   8.8
  -1.05   2/12(17)   10
  ChimeriVaxTM-JE，FRhL3，E279 Met   2.69   7/12(58)   10.6   2.5
  1.69   4/12(33)   11.5
  0.69   0/12(0)   NA
  ChimeriVaxTM-JE，FRhL5，E279 Lys   2.88   10/12(83)   9.3   1.45
  1.88   11/12(92)   10.3
  0.88   4/12(33)   12.2
  -0.11   2/12(17)   14
  -1.11   0/12(0)   NA
  YF/JE278 site-specificrevertant，E279 Lys   3.55   12/12(100)   9.4   1.15
  2.55   11/12(92)   10.1
  1.55   11/12(92)   10.2
  0.55   3/12(25)   10.7
  -0.44   2/12(17)   14
表3.用ChimeriVaxTM-JE FRhL3、FRhL5或黄热病17D(YF-VAX)IC接种的猴子的神经病理评估和接种后第30天的尸检
  测试病毒   猴子   性别   剂量1log10PFU/0.25mL   临床分值2最大分值/平均每日分值           单个和组平均组织病理学分值
  目标3区域   鉴别体4区域   目标+鉴别体区域
  YF-VAXConnaughtLot#0986400   RT702MRT758MRT653MRT776MRT621MRAH80FRAL02FRT698FRAI12FRP942F   MMMMMFFFFF   4.054.284.074.254.344.144.133.784.114.05   1/01/01/03/13/23/11/13/11/11/0   2.000.252.002.001.001.502.001.502.002.00   0.510.010.391.290.460.710.800.641.450.81   1.260.131.201.650.731.101.401.071.731.41
  MeanSD   4.120.16   11   1.630.59   0.710.42   1.170.47
  ChimeriVaxTM-JE，FRhL3Lot#1031299A   RT452MRR257MRT834MRT820MRT288MRAJ98FRAR08FRV481FRT841FRT992F   MMMMMFFFFF   3.553.523.713.713.763.793.523.523.713.76   1/01/01/01/01/01/11/01/01/01/0   0.501.000.501.000.500.000.000.000.500.50   0.080.140.380.140.180.110.130.060.050.07   0.290.570.440.570.350.050.070.030.280.29
  MeanSD   3.660.11   00   0.450.37   0.140.10   0.290.20
  P-value(t Test5)vs.YF-VAX   0.037/0.025   0.00008   0.00191   0.00014
  ChimeriVaxTM-JE.FRhL6Lot#99B01   RT628M    M 4.20RT678M    M 4.19RT581M    M 4.17RR726M    M 4.32RR725M    M ND6RAJ55F    F 4.27RT769F    F 4.44RAK22F    F 4.24RT207F    F 4.49RT490F    F 4.34   1/01/01/01/01/00/01/01/01/11/0   0.501.001.001.001.001.001.000.001.000.00   0.570.120.460.660.330.140.580.120.220.04   0.540.600.730.830.670.570.790.060.610.02
  Mean        4.30SD          0.11   00   0.750.42   0.320.23   0.540.28
  P-value(t Test)vs.YF-VAX   0.024/0.025   0.00154   0.02436   0.00248
  P-value(t Test)vs.ChimeriVaxTM-JE FRhL3   0.343/1.00   0.10942   0.03223   0.03658
1反滴定
2临床分值：0＝无病征；1＝皮毛粗糙，不进食；2＝高音调的发声，不活动，缓慢移动；3＝颤动，不协调，摇晃的运动，肢无力；4＝不能站立，麻痹，垂死或死亡。显示了任何一天的最大分值和30天的观察期中的平均分值。
3黑质
4纹状体和丘脑，右侧和左侧(尾状核、苍白球、核、前/中丘脑的核、侧面丘脑的核N；脊髓的颈部和腰部膨大(6 levels)
5Student′s t测试，two-sided，异方差的(heteroscedastic)，比较YF-VAX和ChimeriVaxTM-JE病毒。
6未进行
表4.病毒血，用YF-VAX或ChimeriVaxTM-JE FRHL3和FRHL5病毒IC接种的恒河猴(对于接种的剂量，参见表3)。
YF-VAX对照
  动物                               血清病毒滴度(Log10PFU/mL)，天
  1   2   3   4   5   6   7   8   9
  RT702M   -   -   1.6   3.0   -   -   -   -   -
  RAH80F   -   -   -   3.3   2.5   -   -   -   -
  RT758M   -   -   2.1   3.2   2.8   -   -   -   -
  RAL02F   -   -   -   1.3   -   -   -   -   -
  RT653M   -   -   -   2.7   -   -   -   -   -
  RT698F   -   1.0   2.3   3.7   2.5   -   1.0   -   -
  RT776M   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RAI12F   -   -   -   2.0   2.5   2.5   2.0   -   -
  RT621M   -   1.0   2.0   3.3   2.0   -   -   -   -
  RP942F   -   1.0   2.6   3.6   2.0   -   -   -   -
  平均滴度2   0.8   1.4   2.7   1.7   0.9   0.9
  SD   0.1   0.8   1.0   0.9   0.6   0.4
ChimeriVaxTM-JE FRHL3 E279 Met
  动物                               血清病毒滴度1(Log10PFU/mL)天
  1   2   3   4   5   6   7   8   9
  RAJ98F   -   -   1.9   1.3   -   -   -   -   -
  RT452M   -   1.3   2.1   1.6   -   -   -   -   -
  RAR08F   -   -   1.3   2.2   2.2   1.8   -   -   -
  RR257M   -   -   1.9   2.2   1.8   -   -   -   -
  RV481F   -   -   2.1   1.8   1.5   -   -   -   -
  RT834M   -   -   2.5   1.3   -   -   -   -   -
  RT841F   -   -   2.4   1.7   -   -   -   -   -
  RT620M   -   -   1.6   1.0   -   -   -   -   -
  RT392F   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RT288M   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  平均滴度   0.8   1.7   1.5   1.0   0.8
  SD   0.2   0.6   0.5   0.6   0.3
  P-值3   0.696   0.386   0.003   0.065   0.745
ChimeriVaxTM-JE FRhL5 E279 Lys
  动物                                  血清病毒滴度1(Log PFU/mL)，天
  1   2   3   4   5   6   7   8   9
  RT628M   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RAJ55F   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RT678M   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RT769F   -   -   -   2.0   -   -   -   -   -
  RT581M   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RAK22F   -   -   -   -   -   -   1.8   -   -
  RR726M   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RT207F   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RR725M   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  RT490F   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  平均滴度   0.7   0.7   0.8   0.7   0.7   0.8
  SD   0.0   0.0   0.4   0.0   0.0   0.4
  P-值4   0.331   ＜0.000   0.010   0.076   1.0   1.0
1＝没有可检测的病毒血；在大多数测试中测试了纯净的血清，截止是1.0log10PFU/mL)；在某些情况下，纯净的(neat)血清对细胞是有毒的，使用了1∶2或1∶5稀释的血清(截止是1.3或1.7log10PFU/mL)。
2对于计算平均滴度和标准偏差，在＜1.0的地方使用0.7，在＜1.3的地方使用1.0，在＜1.7的地方使用1.4。
3通过t-测验、2尾(2-tailed)与YF-VAX比较
4通过t-测验、2尾与ChimeriVaxTM JE FRhL3比较
表5.未克隆的和各种克隆的ChimeriVax-DEN1病毒的核苷酸和氨基酸序列以及它们的体外(Vero传代)遗传稳定性。
  病毒   传代   基因   Nt.Noa   Nt.改变/异质性   AA改变/异质性   AANob   评论
  未克隆的   P2   -   -   -   -   -   无突变
  未克隆的   P5   EEEE   1590173019122282   A/GG/TG/tC/a   K/RV/FE/DU/I   204251311435   核苷酸异质性核苷酸异质性刚刚可检测的突变体在某些样品中无法检测到的突变体
  未克隆的   P15   ENS2BNS4ANS4A   1590424868887237   A to GG to TC/TA/G   K to RG to VA/VI/M   204 核苷酸异质性核苷酸异质性
  未克隆的   P15REPEATfrom P2   EENS4ANS4B   1590173072377466   A to GG/TA/GC/t   K to RV/FI/MP/S   20425126352 核苷酸异质性核苷酸异质性刚刚可检测的突变体
  克隆A   P3，P7   EE   17302282   G to TC to A   V to FL to I   251435   结构域II，i链，锚定前未分配功能；D2和YF中分别为L和I，(有一空缺，nt7080-7220)
  克隆B   P3，P7，P10   E   1730   G to T   V to F   251
  克隆C   P3，P6   E   1912   G to T   E to D   311   结构域III，a链，未分配功能
  克隆D   P3，P6   E   1730   G to T   V to F   251
  克隆E   P3，P6   E   1590   A to G   K to R   204   结构域II，f-g环，未分配功能
  克隆F   P3   ME   7881590   C to TA to G   -K to R   -204
  克隆G   P3   E   1730   G to T   V to F   251
  克隆H   P3   EE   19122030   G to TG to T   E to DV to L   311351 结构域III，d链(在D2和D3中L；D4中I)
  克隆I   P3   E   1590   A to G   K to R   204
  克隆J(J-2)   P3，P6，P7，P10   -   -   -   -   -
  克隆J(J-2)   P6(cGMP MS)P10 from(cGMP MS)   EE   15901590   A to G(a/G)A to G   K to RK to R   204204   某些母体(a)核苷酸仍然存在
  克隆J(J-2)   P10 REPEATfrom P7   E   1590   A to G   K to R   204
  克隆J(J-2)   P20 FromP10 repeat   ENS4ANS4A   159069667190   A to GG/TG/a   K to RS/IV/I   204171246
a：从基因组的开始处。b：从标明的蛋白的N末端；编号根据Rice etal.，Science 229：726-733，1985。有204突变的克隆用粗体字显示。
表6.在通过IC途径接种的4天龄小鼠中ChimeriVaxTM-DEN1病毒的各种克隆的神经毒力。
组   ChimeriVaxTM-DEN1   AA改变   稀释   剂量(BT)b   无死亡/总数(％死亡)   ASTc天数
123456统计字(概率)a组1，2，3，5vs.组6组1，2，3，5vs.组4组5vs.组6   未克隆的克隆B克隆C克隆E克隆JYF-VAX   无E251(V＞F)E311(E＞D)E351(V＞L)E204(K＞R)无NA   纯净的1∶10纯净的1∶10纯净的1∶10纯净的1∶101∶100纯净的1∶101∶1001∶20   5.04.15.85.05.84.95.94.84.03.63.01.82.5   11/11(100)11/11(100)10/11(91)11/11(100)11/11(100)11/11(100)3/11(27)1/11(9)1/11(9)11/11(100)11/11(100)9/11(82)12/12(100)   9.110.29.810.28.59.513141510.811.311.38.30.0010.00010.001
a：以粗体数字显示的P值被认为是统计学上显著的。
b：反滴定。
c：平均存活时间。
表7.用5log10PFU/0.5ml的每种ChimeriVaxTM-DEN1病毒SC接种的猴中的病毒血和中和抗体反应
组   猴子   病毒(AA改变)                                病毒血(log10PFU/ml)b，免疫后天数b：   PRNT50天31
  2   3   4   5   6   7   8   9   10   11
1GMT2GMT3GMT统计学(概率)a组1vs.组2组1vs.组3组2vs.组3   R18265MR175110FF17572MF171114FR182103MR17098FR18261MR175118FR182104MR175108FR182111MR175104F   未克隆的(M39H＞R，E204K＞R)克隆E(E204K＞R)克隆J，PMS，P7(无)   -c-1.3---1.7-1.0-2.3-   --1.0--1.72.5-1.91.73.02.4   ------1.31.01.72.83.31.3   -1.71.0---2.0-1.72.22.82.0   -------1.81.01.72.3   -------1.72.01.71.7   -------1.01.7-1.7   -------1.02.0-2.2   -------1.72.2-3.0   ---------1.7-3.1   64064032064053851202560256051203620512010240102401024086110.00450.00080.0130
a：以粗体数字显示的P值被认为是统计学上显著的。
b：在第1天免疫猴子。
c：＜1.0log10PFU/ml.
表8.表7中所示病毒血的概述
  组   病毒(AA改变)   病毒血数目/测试的数目(％)              平均值
  峰值滴度Log10PFU/ml   持续时间(天数)
  123统计学(概率)a组1vs.组2组1vs.组3组2vs.组3   未克隆的(M39 H＞R和E204 K＞R)克隆E(E204 K＞R)克隆J，PMS，P7(无)   2/4(50)3/4(75)4/4(100)   0.75(1.5)b1.3(1.7)b2.50.450.0090.053   1(2)b1.5(2)b8.50.670.00040.001
a：以粗体数字显示的P值被认为是统计学上显著的。
b：仅病毒血的动物。
表9.用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS或ChimeriVaxTM-DEN 1VL病毒(各5log10PFU/0.25ml)或用YF-VAX(4.7log10PFU/0.25ml)IC接种的猴子中的病毒血和中和抗体反应。
组   猴子   病毒(AA改变)                    病毒血(log10PFU/rr.，)by免疫后天数b：   PRNT5031
2 3 4 5 6 7 8 9 0 11
1GMT502GMT503GMT50统计学(概率)a组1vs.组2组1vs.组3组2vs.组3   F22220MF22236MF22240MF22276FF22282FF222106FF22203MF22205MF22246MF22287FF222112FF222115FF22200MF22239MF22256MF22280FF22291FF22292F   ChimeriVaxTM-DEN1，PMS，P7(无)ChimeriVaxTM-DEN1，VL，P10(E204K＞R)YF-VAX   -c3.32.12.21.71.612.11.8-1-1.91--11.3   1-2.51.83.1--1.81.8---2.31.3-11.73   12.21.912.92.71.71.31.31.6--2.61.31.82.8-   1.32.31.712.52.81.51.31---1.72.21--   1.31---2.61.3--1-------   1-----------------   ------------------   ------------------   -------------1----   ------------------   128051201280128012801280161310240256010240256010240256051201280640256012801280256016000.0160.6640.021
a：以粗体数字显示的P值被认为是统计学上显著的。
b：在第1天接种猴子。
c：＜1.0log10PFU/ml。
表10.表9中所示病毒血的概述
组   病毒(AA改变)   病毒血数目/测试的数目(％)              平均值
  峰值滴度Log10PFU/ml   持续时间(天数)
123统计学(概率)a组1vs.组2组1vs.组3组2vs.组3   ChimeriVaxTM-DEN1，PMS，P7(无)ChimeriVaxTM-DEN1，VL，P10(E204K＞R)YF-VAX   6/6(100)5/6(83)6/6(100)   2.51.4(1.6)b2.20.0210.470.081   4.22.5(3)b2.80.0470.0250.71
a：以粗体数字显示的P值被认为是统计学上显著的。
b：仅病毒血的动物
表11.用ChimeriVaxTM-DEN1 PMS或ChimeriVaxTM-DEN 1 VL病毒(各5log10PFU/0.25ml)或用YF-VAX(4.7log10PFU/0.25ml)IC接种的猴子中脑和脊髓的组织病理学评估(病变分值)
  组(病毒)   猴子编号   目标区域   鉴别体区域   组合的分值
  1(ChimeriVaxTM-DEN1，PMS)平均值(SD)2(ChimeriVaxTM-DEN1，VL)平均值(SD)3(YF-VAX)平均值(SD)统计学(概率)a组1vs.组2组1vs.组3组2vs.组3   F22220MF22236MF22240MF22276FF22282FF222106FF22203MF22205MF22246MF22287FF222112FF222115FF22200MF22239MF22256MF22280FF22291FF22292F   00000.0300.01(0.01)00.0800.1700.200.075(0.091)00.170.720.220.530.610.38(0.28)0.0920.0090.034   00000.0600.01(0.02)0.060.310.060000.072(0.120)00.691.540.500.251.130.69(0.57)0.250.0160.027   00000.04500.01(0.02)0.030.1950.030.08500.100.073(0.070)00.431.130.360.390.870.53(0.4)0.00550.0100.021
a：以粗体数字显示的P值被认为是统计学上显著的。

Claims (18)

1.一种黄病毒，包含使所述黄病毒减毒的绞链区突变。
2.权利要求1的黄病毒，其中所述突变降低所述黄病毒的趋内脏性。
3.权利要求1的黄病毒，其中所述黄病毒包含黄热病病毒疫苗株；是选自由登革热病毒、西尼罗河病毒、Wesselsbron病毒、卡萨努森林病病毒和鄂木斯克出血热病毒构成的组的亲内脏的黄病毒；或是嵌合的黄病毒。
4.权利要求3的黄病毒，其中所述嵌合黄病毒包含第一黄病毒的衣壳和非结构蛋白以及第二黄病毒的前膜和包膜蛋白，所述第二黄病毒包含使所述嵌合黄病毒减毒的包膜蛋白突变。
5.权利要求4的黄病毒，其中所述第二黄病毒是日本脑炎病毒或选自由登革热-1、登革热-2、登革热-3和登革热-4病毒构成的组的登革热病毒。
6.权利要求1的黄病毒，其中所述突变处于包膜蛋白的绞链区的疏水口袋中。
7.权利要求6的黄病毒，其中所述第二黄病毒是登革热病毒，和所述突变处在登革热包膜氨基酸位置202或204的赖氨酸、以及登革热包膜氨基酸252、253、257、258和261的任何一个或多个中。
8.权利要求7的黄病毒，其中所述突变是替换赖氨酸。
9.权利要求8的黄病毒，其中所述赖氨酸被精氨酸替换。
10.一种疫苗组合物，包含权利要求1的黄病毒和药学上可接受的载体或稀释剂。
11.在患者中诱导针对黄病毒的免疫反应的方法，所述方法包括向所述患者施用权利要求10的疫苗组合物。
12.权利要求11的方法，其中所述患者不具有黄病毒感染、但存在发生黄病毒感染的风险，或已经被黄病毒感染。
13.生产包含黄病毒的疫苗的方法，所述方法包括向所述黄病毒中引入产生降低的趋内脏性的突变。
14.权利要求13的方法，其中所述突变处于所述黄病毒的包膜蛋白的绞链区中。
15.权利要求14的方法，其中所述突变处于所述黄病毒的包膜蛋白的疏水口袋中。
16.鉴定黄病毒疫苗候选物的方法，所述方法包括步骤：
向黄病毒的绞链区中引入突变；和
确定包含所述绞链区突变的黄病毒与缺乏该突变的黄病毒相比是否具有降低的趋内脏性。
17.权利要求16的方法，其中所述突变处于所述黄病毒的包膜蛋白的绞链区中。
18.权利要求16的方法，其中所述黄病毒是黄热病病毒或嵌合黄病毒。
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