CN1927415A - 一种用于脑损伤修复的生物材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于脑损伤修复的生物材料及其制备方法。它是以透明质酸为原料，在碳二亚胺盐酸盐(EDC)的介导下，用己二酸二酰肼(ADH)进行交联的方法制备透明质酸凝胶，作为接枝抗体的载体材料，用抗体固化技术将轴突生长抑制因子MAG、OMgp和Nogo－A的受体(NgR)的抗体接枝到透明质酸水凝胶上，制成携带特异抗体、对pH值敏感的抗体输送***，用于封闭髓鞘相关的神经轴突再生抑制因子，促进神经组织损伤后的再生。

Description

一种用于脑损伤修复的生物材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于脑损伤修复的生物材料及其制备方法。
背景技术
脑损伤后的再生修复是当代医学的一个难点。研究发现，脑神经再生困难的一个原因是，神经元损伤后发生轴突变性和髓鞘崩解，髓鞘崩解后产生的Nogo蛋白(Nogo-A)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)等物质有抑制神经轴突生长的作用，被称为抑制轴突生长因子。这些抑制轴突生长因子在体内与其受体NgR相结合而产生抑制神经轴突生长的作用。医学研究还发现，以特异抗体阻断Nogo-A、MAG和OMgp与NgR结合就可以消除抑制轴突生长因子对神经再生的抑制作用，增加皮质脊髓束的塑形能力。然而，如何使用这种特异抗体成为一个新的技术难题：常规用药途径不能通过血脑屏障；在脑内埋植产生抗体的杂交肿瘤细胞的方法，无法有效的控制抗体的释放，而且存在很大的致瘤风险；将纯化的抗体通过埋植在体内的泵输送到损伤部位，能够使抗体的持续供给达到数周至数月，但在抗体用完之后，需要二次手术将泵取出。所以，当代医学需要一种有效而合理的方案将NgR的抗体用于脑损伤的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在脑损伤后用以植入脑实质的生物材料，它携带神经轴突生长抑制因子受体的抗体，与脑组织有较好生物相容性，其抗体释放符合脑组织再生修复的需要。
采用组织工程技术，以透明质酸(Hyaluronic acid，HA)为原料，将神经轴突生长抑制因子受体(NgR)的抗体与透明质酸进行交联所得的产物即为本发明用于脑损伤修复的生物材料。所述轴突生长抑制因子包括髓鞘相关糖蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白和Nogo蛋白。本发明所涉及的组织工程技术其实质是在非蛋白质分子上接枝蛋白质分子。它是以透明质酸为原料，在碳二亚胺盐酸盐(EDC)的介导下，用己二酸二酰肼(ADH)进行交联的方法制备透明质酸凝胶，作为接枝抗体的载体材料，用抗体固化技术将轴突生长抑制因子MAG、OMgp和Nogo-A的受体(NgR)的抗体接枝到透明质酸水凝胶上，制成携带特异抗体的生物材料。具体方法为，
1)以去离子水配制质量百分比为0.8～1.2％的透明质酸溶液，以盐酸溶液调溶液pH为酸性，最适宜的pH值为4.75；先后加入己二酸二酰肼(ADH)和碳二亚胺盐酸盐(EDC)，搅拌均匀。之后以氢氧化钠溶液调pH值为6～8，得透明质酸水凝胶。将水凝胶用去离子水在超声波中清洗2～3次，冰冻后放入冻干机内冰冻干燥。
2)用动物免疫方法制备：轴突生长抑制因子受体NgR的抗体。以步骤①方法制备的透明质酸凝胶作为接枝抗体的载体材料，用抗体固化技术将轴突生长抑制因子MAG、OMgp和Nogo-A的受体(NgR)的抗体接枝到透明质酸水凝胶上，制成携带特异抗体的生物材料，植入脑损伤部位，促进脑组织的修复。按本发明方法制作的携带抗体的透明质酸水凝胶称为抗体输送***。
其中，在制备透明质酸凝胶过程中加入己二酸二酰肼越多，凝胶的硬度越高。因此，以加入己二酸二酰肼的量控制凝胶的硬度，即成品生物材料的硬度。适宜的己二酸二酰肼用量重量比为，己二酸二酰肼∶透明质酸＝1∶4～10；最佳重量配比为，己二酸二酰肼∶透明质酸＝1∶6。所用碳二亚胺盐酸盐用量重量比为，碳二亚胺盐酸盐∶透明质酸＝1∶2.5～5.0。
按本发明方法制作的生物材料，携带有抑制轴突生长因子的封闭抗体，同时具有一种生物化学特性：所携带的抗体与透明质酸之间腙键的断裂速度随环境pH的变化而变化，接枝抗体在酸性环境中较快释放，在中性和碱性环境下释放速度减缓。实验表明，共价交联到透明质酸水凝胶中的抗体，在37℃环境中，在pH为5.0的溶液中，60％～80％的抗体在8小时内释放；在pH为6.0的溶液中，60％～80％的抗体在70小时内释放；在pH为7.4的缓冲液中，抗体释放相当缓慢，能够持续释放400小时。
另一方面，脑组织在受损伤时pH值会降低到6.2～6.8。当出现高血糖症或低氧症时，pH值会降到6.0。脑组织的酸中毒是一个短暂的过程，一般持续几分钟到数小时，而后恢复到正常的生理值。
本发明生物材料的上述特性正适应了脑组织损伤后pH变化的过程，抗体的释放速度由快而慢，克服了物理方法制备的抗体“爆发”式释放的弊病。
本发明生物材料所用的抗体载体透明质酸凝胶来源于天然高分子，无毒无害，细胞相容性好，疏松多孔，适合神经组织生长，具备和神经组织相似的流变学性能，可以生物降解，无需取出。这种生物材料经体外细胞培养和体内移植实验证实与神经细胞组织有良好的相容性，能够促进神经轴突的再生、血管的长入，对损伤后神经组织的再生、功能的恢复有明显的促进作用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1  制备透明质酸水凝胶
以去离子水配制质量百分比为1％的透明质酸溶液，将1M盐酸溶液逐滴加入透明质酸溶液，同时搅拌，使二者充分混和，直至其pH值达到4.75；按“己二酸二酰肼∶透明质酸＝1∶4～10”比例称取己二酸二酰肼加入透明质酸溶液中，充分搅拌；再按“碳二亚胺盐酸盐∶透明质酸＝1∶2.5～5.0”比例称取碳二亚胺盐酸盐加入透明质酸溶液中，搅拌10min～20min；再以氢氧化钠溶液调pH值为6～8，得透明质酸水凝胶；将水凝胶用去离子水在超声波中清洗2～3次，冰冻后放入冻干机内进行冰冻干燥。
实施例2  制备轴突生长抑制因子受体NgR的抗体
在Protein database中查得大鼠NgR的全长氨基酸序列，序列分析显示有高抗原性的数个区域充当免疫源区。根据序列的抗原性、特异性及亲水性能，选取氨基酸残基位于163～176的肽段DNNLQALPDNTFRD为抗原片断；采用固相合成的方法合成DNNLQALPDNTFRD序列，高效液相色谱纯化，完全福氏佐剂交联，少量多次免疫家兔。免疫6周后颈动脉取血，4℃自然析出血清，4000r/min离心20min得到轴突生长抑制因子受体NgR的抗体血清。
实施例3  NgR抗体的氧化接枝
将高碘酸钠加入抗体磷酸盐缓冲液中，浓度为10mg/ml，轻微搅拌30分钟，在生理盐水中透析3小时，然后用滤菌器滤菌，得无菌抗体溶液；将交联的水凝胶在75％酒精中消毒三次，再用无菌的磷酸盐缓冲液清洗三次，将无菌的抗体与之混合，在超净台中反应10～20小时，得到携带有轴突生长抑制因子受体抗体的透明质酸水凝胶，称为交联的抗体释放体系。
实施例4  水凝胶检验
在碳二亚氨盐酸盐的介导下，己二酸二酰肼中的酰肼基团与透明质酸中糖分子中的羧基反应，形成HA-ADH和HA-ADH-HA。通过红外图谱检测发现，经过交联后的水凝胶，分别在3310和3228cm-1处产生了两个新峰，该峰分别为N-H基团的对称伸缩和非对称伸缩谱带。证明在温和的条件下，己二酸二酰肼即可共价交联透明质酸的分子骨架上，并能形成游离的酰肼基团。
实施例5  体外抗体释放规律观察
在三个比色皿中各置放3ml醋酸缓冲液，它们的pH值分别为：pH＝5，pH＝6，pH＝7.2，模拟脑损伤后的脑内pH不断变化的趋势。取三份等量按实施例3方法制备的携带有抗体的透明质酸水凝胶分别置入三个比色皿中，使用紫外分光光度计测量释放到溶液中的抗体浓度和释放速率。结果表明，pH值由低而高，抗体的释放速度由快而慢。
实施例6  抗体活性检测
经过对接枝了抗体的水凝胶进行体外和体内实验，用免疫荧光技术检测释放的抗体的活性，发现经过接枝的抗体释放后能够保持抗体的活性，经过鸡胚背跟神经细胞培养后，发现接枝了抗体的凝胶促进神经细胞的贴附和轴突的再生，同时释放的抗体能诱导周围的神经节向着材料的方向长出纤维。对大鼠脑缺血模型的组织再生和功能重建进行检测，证实本发明抗体输送***释放的抗体能显著促进组织再生和功能恢复。

Claims (5)

1.一种用于脑损伤后修复的生物材料，其特征在于，其为以透明质酸为原料，将轴突生长抑制因子受体的抗体与透明质酸进行交联所得的产物；所述神经轴突生长抑制因子包括髓鞘相关糖蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白和Nogo蛋白。
2.权利要求1所述生物材料的制备方法，其特征在于，它包括如下工艺步骤：
①以去离子水配制质量百分比为0.8～1.2％的透明质酸溶液，以盐酸溶液调透明质酸溶液pH值为酸性，先后加入己二酸二酰肼和碳二亚胺盐酸盐，再以氢氧化钠溶液调pH值为6～8，得透明质酸水凝胶；将水凝胶用去离子水在超声波中清洗2～3次，冰冻干燥；
②将用动物免疫方法制备的轴突生长抑制因子受体NgR的抗体置于磷酸盐缓冲液中，按10mg/ml加入高碘酸钠，轻微搅拌30分钟，在生理盐水中透析3小时，然后用滤菌器滤菌，得无菌抗体溶液；将步骤①制备的交联的水凝胶在75％酒精中消毒三次，再用无菌的磷酸盐缓冲液清洗三次，将无菌的抗体溶液与之混合，在超净台中反应10～20小时，得到交联的抗体释放体系。
3.根据权利要求2所述生物材料的制备方法，其特征在于，以盐酸溶液调透明质酸溶液pH值为4.75。
4.根据权利要求2所述生物材料的制备方法，其特征在于，在制备透明质酸凝胶工序中己二酸二酰肼的用量重量份为，己二酸二酰肼∶透明质酸＝1∶4～10。
5.根据权利要求2所述生物材料的制备方法，其特征在于，在制备透明质酸凝胶工序中己二酸二酰肼的用量重量份为，己二酸二酰肼∶透明质酸＝1∶6。
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