发明内容
本发明的秦皮香豆素组合物是通过以下方法得到的:取秦皮,加水煎煮提取3次,每次加水10倍量,提取1.5小时,合并提取液,滤过,滤液浓缩至相对密度约1.1(60℃热测),加入乙醇使含醇量达80%,静置,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,加水适量使溶解,加于已处理好的D101型大孔吸附树脂柱上,先以水冲洗,弃去水洗液,再用50%乙醇洗脱至无色,收集乙醇洗脱液,回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度约1.38(60℃热测),真空干燥,粉碎,过80目筛,混匀,即得。
本发明的秦皮香豆素组合物是由一定比例的秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮亭等组成的总香豆素混合物,以紫外吸收光谱法测定,含总香豆素50%以上,以高效液相色谱法测定,秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮亭4种成分的总含量在40%以上,4种成分的比例依次为4-6∶1-3∶2-4∶1,此比例与其在原药材中的比例基本一致。
研究发现,本发明的秦皮香豆素组合物中各成分具有明显的协同作用,同时具备抗痛风性关节炎和降低尿酸等多方面的药理活性。从该提取物中分离纯化出秦皮甲素,并与纯化前比较,活性大大降低。
本发明的秦皮香豆素组合物,可以直接或配伍后采用通常的制药方法,制成用于治疗痛风及高尿酸血症的各种剂型,包括胶囊剂、软胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸、注射剂和口服液剂型。
本发明用秦皮香豆素组合物制备的药剂,按照相关要求进行规范的动物实验研究及临床试验,证明药剂具有如下的明显优点和显著效果。
1、毒理实验表明秦皮香豆素组合物具有无毒性
本发明的秦皮香豆素组合物由中药秦皮提取,秦皮来源于天然资源,经长期入药使用证明,秦皮长期服用无毒副作用。用秦皮提取的秦皮香豆素组合物,富集药物的有效成份,经毒理学研究证明,无明显毒性。
(1)经小鼠急性毒性试验表明,用提取的秦皮香豆素组合物,小鼠灌胃给药的最大耐受量为24g总香豆素/kg/24h,最大耐受倍数为60kg体重成人临床口服日用药量的4000倍。
(2)经大鼠长期毒性试验表明,用提取的秦皮香豆素组合物,大鼠灌胃给药的最大耐受量为18g总香豆素/kg/24h,最大耐受倍数为60kg体重成人临床口服日用药量的3000倍。大鼠灌胃秦皮香豆素组合物给药,观察14天,大鼠无死亡,仅于给药后15min至18h可见动物活动减少,未见其他异常症状。处死大鼠后,肉眼观察重要器官(心、肝、脾、肺、肾等)均无异常发现。
(3)经Beagle犬长期毒性试验表明,秦皮香豆素组合物按300、150和75mg/kg三个剂量,分别相当于其临床口服剂量的50、25和12.5倍,连续对Beagle犬口服给药180天及停药30天,结果如下:(1)对动物生长发育和行为活动等无明显影响。(2)尿常规检查数值均在正常范围内。(3)肝功能检查数值均在正常值范围内,但有降低ALT、AST、T-Bil、ALP和/或升高ALT作用,停药后消失。(3)肾功能检查结果数值均在正常范围内,但高、中剂量组有升高肌酐和尿素氮作用,停药后消失。(4)有降低血清胆固醇作用。(5)心电图检查,结果数值均在正常范围内,但给药45天时中剂量组心率减慢;给药180天时高剂量组Q-T间期时间显著下降;停药30天,高、中、低剂量组的R波电压分别显著、明显和极显著下降。(6)活体动物骨髓检查,结果均在正常范围内。但给药180天,可见低剂量组早幼红细胞明显升高。停药30天,高剂量组明显升高中性粒细胞的杆状细胞;中、低剂量组明显降低淋巴细胞。(7)***尸解和脏器指数检查无明显异常。(8)病理组织学检查,仅发现在给药180天时高剂量组有1例动物出现轻微的肝局灶性炎症病理变化和1例动物出现轻微肾脏局灶性炎症变化,与对照组比较无明显差异(P>0.05)。其余均未见异常。
2、主要药效学实验研究证明秦皮香豆素组合物具有降低尿酸和抗痛风性关节炎作用
(1)秦皮香豆素组合物对小鼠Hypoxanthine型高尿酸血症形成的影响
单独使用,仅秦皮苷有一定强度抑制作用抑制Hypoxanthine所致小鼠血清尿酸浓度升高作用(P>0.05),而秦皮甲素、秦皮乙素或秦皮亭,均无明显抑制H。而以上述工艺获得的秦皮香豆素组合物30、60和120mg/kg分别能明显、显著和极显著抑制Hypoxanthine所致小鼠血清尿酸浓度升高(P<0.05,P<0.01和P<0.001),其最大尿酸生成抑制率为35.85%,在30~120mg/kg剂量范围内呈明显的量效关系(P<0.05)。其实验结果见表1。
表1秦皮香豆素组合物对小鼠Hypoxanthine型高尿酸血症形成的影响
组别 |
剂量×次数(mg/kg×c) |
鼠数(只) |
血清尿酸浓度(μmol/L,x±SD) |
尿酸生成抑制率(%) |
正常对照组模型对照组别嘌呤醇片组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮甲素秦皮甲素秦皮甲素秦皮乙素秦皮乙素秦皮乙素秦皮苷秦皮苷秦皮苷秦皮亭秦皮亭秦皮亭 |
----100×1120×160×130×1240×1120×160×1240×1120×160×1240×1120×160×1240×1120×160×1 |
101010101010101010101010101010101010 |
164.52±36.73445.29±75.18^^^252.36±51.75***285.64±62.14***337.69±65.52**361.70±71.24*423.53±70.55431.54±72.63436.32±70.53412.38±68.27429.14±66.75433.57±68.38358.74±69.14*389.52±67.63403.43±75.26392.29±65.37403.26±69.32412.37±70.75 |
--43.3335.8524.1618.774.893.092.017.393.632.6319.4411.909.4011.909.447.39 |
注:①模型对照组与正常对照组^^^P<0.001
②给药组与模型对照组比较 *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
(2)大鼠尿酸***试验
表2显示,单独使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭60~240mg/kg,均无明显促进大鼠尿液尿酸***作用(P>0.05)。而秦皮香豆素组合物60和120mg/kg能显著促进大鼠尿酸经尿液的***(P<0.01)。
表2秦皮香豆素组合物对大鼠尿液尿酸***的影响(x±SD)
组别 |
剂量×天数(mg/kg×d) |
鼠数(只) |
尿酸***量(mg/24h) |
尿酸***增加率(%) |
蒸馏水对照组丙磺舒片组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮甲素秦皮甲素秦皮甲素秦皮乙素秦皮乙素秦皮乙素秦皮苷秦皮苷秦皮苷秦皮亭秦皮亭秦皮亭 |
--500×5120×560×530×5240×5120×560×5240×5120×560×5240×5120×560×5240×5120×560×5 |
1010101010101010101010101010101010 |
4.59±1.157.52±1.45***7.85±2.35**7.47±2.055.59±1.004.78±1.334.72±1.114.68±1.294.96±1.274.86±1.324.81±1.294.96±1.544.92±1.224.87±1.445.16±1.425.10±1.535.03±1.19 |
--63.8371.0262.7521.794.142.831.968.065.884.798.067.196.1012.4211.119.59 |
注:给药组与蒸馏水对照组比较 *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
(3)尿酸钠诱发大鼠痛风性关节炎模型试验
表3显示,单独使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭60~240mg/kg,均无明显抑制尿酸钠所致大鼠痛风性关节肿胀作用(P>0.05)。而以上四个成分按比例依次为4-6∶1-3∶2-4∶1为主要组成成分的秦皮香豆素组合物能显著抑制尿酸钠所致大鼠痛风性关节肿胀(P<0.01),给药后1小时就有显著抑制作用(P<0.01),维持6h;30mg/kg给药后3h仍有显著抑制作用(P<0.01)。在120~30mg/kg剂量范围内呈明显的量效关系(P<0.05)。
表3秦皮香豆素组合物对尿酸钠诱发大鼠痛风性关节炎的影响
组别 |
剂量(mg/kg) |
鼠数(只) |
足正常容积(ml) |
致炎后足肿胀度(ml,x±SD)/肿胀抑制率(%) |
1h |
2h |
3h |
4h |
5h |
6h |
对照组秋水仙碱片组秦皮香豆素组秦皮香豆素组秦皮香豆素组秦皮甲素秦皮甲素秦皮甲素秦皮乙素秦皮乙素秦皮乙素秦皮苷秦皮苷秦皮苷秦皮亭秦皮亭秦皮亭 | --1.0120603024012060240120602401206024012060 | 1010101010101010101010101010101010 |
1.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.011.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.011.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.021.32±0.01 |
0.41±0.080.33*±0.05(19.51%)0.31**±0.07(24.39%)0.34±0.10(17.07%)0.36±0.09(12.20%)0.39±0.03(12.20%)0.39±0.04(12.20%)0.40±0.07(2.44%)0.40±0.06(2.44%)0.40±0.07(2.44%)0.40±0.10(2.44%)0.39±0.08(4.88%)0.40±0.10(2.44%)0.40±0.10(2.44%)0.39±0.09(4.88%)0.39±0.11(4.88%)0.40±0.13(2.44%) |
0.53±0.140.39**±0.05(26.42%)0.38**±0.08(28.30%)0.41*±0.10(22.64%)0.46±0.11(13.21%)0.42*±0.10(20.75%)0.46±0.13(13.21%)0.49±0.12(7.55%)0.45±0.12(15.09%)0.46±0.14(13.21%)0.49±0.13(7.55%)0.46±0.11(13.21%)0.48±0.12(13.21%)0.49±0.13(9.43%)0.45±0.12(15.09%)0.47±0.12(11.32%)0.48±0.13(9.43%) |
0.75±0.120.48**±0.11(36.00%)0.47***±0.10(37.33%)0.53***±0.11(29.33%)0.58**±0.10(22.67%)0.61*±0.13(18.67%)0.63*±0.11(16.00%)0.70±0.12(6.67%)0.65±0.13(13.33%)0.68±0.12(9.33%)0.70±0.14(6.67%)0.66±0.16(12.00%)0.68±0.12(9.33%)0.69±0.14(8.00%)0.65±0.13(13.33%)0.69±0.11(8.00%)0.72±0.14(4.17%) |
0.68±0.110.50**±0.12(26.47%)0.47***±0.11(30.88%)0.51**±0.13(25.00%)0.56*±0.10(17.65%)0.60±0.12(11.76%)0.62±0.12(8.82%)0.64±0.11(5.88%)0.61±0.12(10.29%)0.63±0.15(7.35%)0.65±0.13(4.41%)0.62±0.13(8.82%)0.63±0.15(7.35%)0.63±0.12(8.82%)0.61±0.12(10.29%)0.62±0.13(8.82%)0.66±0.12(3.03%) |
0.49±0.100.42±0.10)(14.29%)0.38*±0.10(22.45%)0.41±0.08(16.33%)0.46±0.09(6.12%)0.46±0.10(6.12%)0.47±0.11(4.08%)0.47±0.12(4.08%)0.46±0.10(6.12%)0.47±0.13(4.08%)0.48±0.12(2.04%)0.47±0.10(4.08%)0.47±0.13(4.08%)0.48±0.11(2.04%)0.46±0.10(6.12%)0.48±0.14(2.04%)0.48±0.15(2.04%) |
0.39±0.070.34±0.11(12.82%)0.32*±0.02(17.95%)0.35±0.08(10.26%)0.37±0.10(5.13%)0.37±0.08(5.13%)0.37±0.09(5.13%)0.38±0.08(2.56%)0.36±0.08(7.69%)0.38±0.08(9.74%)0.38±0.07(9.74%)0.37±0.11(5.13%)0.38±0.08(9.74%)0.39±0.097(0.00%)0.36±0.08(7.69%)0.39±0.10(0.00%)0.39±0.11(0.00%) |
注:给药组与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
(4)尿酸钠诱发家兔痛风性关节炎模型试验
表4秦皮香豆素组合物对尿酸钠诱发家兔痛风性关节炎的影响
组别 |
剂量(mg/kg) |
鼠数(只) |
正常膝关节周长(cm) |
致炎后足肿胀度(cm,x±SD/肿胀抑制率(%) |
1h |
2h |
3h |
4h |
5h |
模型对照组秋水仙碱片组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮甲素秦皮甲素秦皮甲素秦皮乙素秦皮乙素秦皮乙素秦皮苷秦皮苷秦皮苷秦皮亭秦皮亭秦皮亭 | --1.0120603024012060240120602401206024012060 | 88888888888888888 |
6.20±0.246.25±0.246.17±0.226.19±0.196.18±0.196.18±0.206.21±0.186.22±0.176.20±0.236.23±0.246.19±0.266.22±0.276.20±0.2146.21±0.216.18±0.216.23±0.236.22±0.22 |
1.06±0.310.82±0.32(22.64%)0.77*±0.18(27.36%)0.86±0.35(18.87%)0.91±0.29(14.15%)0.92±0.28(13.21%)0.94±0.32(11.32%)1.02±0.34(3.77%)0.96±0.31(9.43%)0.99±0.34(6.60%)1.04±0.35(1.89%)0.95±0.37(10.38%)1.00±0.36(5.66%)1.03±0.31(2.83%)0.97±0.35(8.49%)1.02±0.35(3.77%)1.04±0.31(1.89%) |
1.92±0.451.35*±0.54(29.69%)1.25*±0.33(34.90%)1.49*±0.30(22.40%)1.53±0.36(20.31%)1.51*±0.31(21.35%)1.57±0.44(18.23%)1.68±0.46(12.5%)1.67±0.41(13.02%)1.71±0.44(10.94%)1.82±0.48(5.21%)1.70±0.42(11.46%)1.75±0.44(8.85%)1.85±0.46(3.65%)1.72±0.38(10.42%)1.73±0.44(9.90%)1.82±0.46(5.21%) |
2.74±0.521.78**±0.39(35.04%)1.71***±0.32(37.59%)1.93**±0.40(29.56%)2.04*±0.42(25.55%)2.13*±0.42(22.26%)2.20*±0.51(19.71%)2.28±0.47(16.79%)2.24*±0.44(18.25%)2.28±0.47(16.78%)2.33±0.49(14.96%)2.27*±0.40(17.15%)2.31±0.47(15.69%)2.37±0.44(13.50%)2.21*±0.40(19.34%)2.26±0.41(17.52%)2.35±0.44(14.23%) |
2.39±0.471.71*±0.53(28.45%)1.52**±0.34(36.40%)1.78*±0.44(25.52%)1.85*±0.46(22.59%)1.92±0.39(17.15%)2.02±0.47(15.48%)2.14±0.43(10.46%)2.07±0.40(13.39%)2.16±0.47(9.62%)2.19±0.43(8.37%)2.10±0.42(12.13%)2.20±0.42(7.95%)2.21±0.43(7.53%)2.07±0.45(13.39%)2.14±0.43(9.21%)2.23±0.43(6.69%) |
1.52±0.461.21±0.37(20.40%)1.15*±0.27(24.34%)1.25±0.48(17.76%)1.32±0.44(13.16%)1.31±0.32(13.82%)1.38±0.35(9.21%)1.43±0.41(5.92%)1.39±0.34(8.55%)1.40±0.33(7.85%)1.46±0.38(3.95%)1.39±0.38(8.55%)1.44±0.36(5.26%)1.48±0.34(2.63%)1.35±0.38(11.18%)1.40±0.37(7.85%)1.45±0.34(4.61%) |
注:给药组与模型对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表4显示,单独使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭,仅240mg/kg剂量组有明显抑制尿酸钠所致家兔痛风性关节肿胀作用(P<0.05),120~60mg/kg剂量组均无明显作用(P>0.5)。而以上四个成分按比例依次为4-6∶1-3∶2-4∶1为主要组成成分的秦皮香豆素组合物120mg/kg剂量组给药后1小时出现明显抑制尿酸钠所致家兔痛风性关节肿胀作用(P<0.05),作用维持5h以上;30mg/kg仍有明显抑制作用(P<0.05),在120~30mg/kg剂量范围内呈明显的量效关系(P<0.05)。
表5秦皮香豆素组合物抑制尿酸钠刺激家兔滑膜液生成的作用
组别 |
剂量(mg/kg) |
鼠数(只) |
滑膜液量(ml,x±SD) |
滑膜液生成抑制率(%) |
正常对照组模型对照组秋水仙碱组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮甲素秦皮甲素秦皮甲素秦皮乙素秦皮乙素秦皮乙素秦皮苷秦皮苷秦皮苷秦皮亭秦皮亭秦皮亭 |
--1.0120603024012060240120602401206024012060 |
888888888888888888 |
1.07±0.343.96±0.56^^^3.00±0.30**2.89±0.46**3.09±0.56*3.53±0.553.32±0.47*3.45±0.493.63±0.523.38±0.45*3.49±0.473.67±0.553.29±0.41*3.43±0.473.55±0.463.21±0.52*3.29±0.453.44±0.42 |
--24.2427.0221.9710.8616.1612.888.3314.6511.877.3216.9213.3811.5518.9416.9213.13 |
注:①模型对照组与正常对照组比较^^^P<0.001
②给药组与模型对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表5显示,单独使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭,仅240mg/kg剂量组有明显抑制尿酸钠刺激家兔滑膜液的生成作用(P<0.05),120~60mg/kg剂量组均无明显作用(P>0.05)。而以上四个成分按比例依次为4-6∶1-3∶2-4∶1为主要组成成分的秦皮香豆素组合物120和60mg/kg分别能显著和明显抑制尿酸钠刺激家兔滑膜液的生成(P<0.01和P<0.05),30~120mg/kg范围内呈明显的量效关系。
表6秦皮香豆素组合物抑制尿酸钠刺激家兔滑膜液中WBC数升高的作用(x±SD)
组别 |
剂量(mg/kg) |
鼠数(只) |
滑膜液中WBC |
总数(×106个) |
抑制率(%) |
正常对照组模型对照组秋水仙碱组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮甲素秦皮甲素秦皮甲素秦皮乙素秦皮乙素秦皮乙素秦皮苷秦皮苷秦皮苷秦皮亭秦皮亭秦皮亭 |
----1.0120603024012060240120602401206024012060 |
888888888888888888 |
11.42±3.2456.21±10.15^^^37.35±7.13***36.75±8.52***40.53±10.38**47.28±11.5643.52±12.14*49.35±11.7451.03±12.0745.62±10.39*49.32±10.5450.39±11.8440.11±9.63*47.95±10.7251.03±11.5242.09±12.02*48.31±12.0553.06±13.18 |
----33.5534.6227.9015.8922.5812.201.3418.8412.2610.3528.6414.699.2225.1214.055.60 |
注:①模型对照组与正常对照组比较^^^P<0.001
②各给药组与模型对照组比较 **P<0.01 ***P<0.001
表6显示,单独使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭,仅240mg/kg剂量组有明显抑制尿酸钠刺激家兔滑膜液的生成作用(P<0.05),120~60mg/kg剂量组均无明显作用(P>0.05)。而以上四个成分按比例依次为4-6∶1-3∶2-4∶1为主要组成成分的秦皮香豆素组合物120和60mg/kg组分别能极显著和显著抑制尿酸钠刺激家兔滑膜液中WBC的游走(P<0.001和P<0.05),30~120mg/kg范围内呈明显的量效关系。
表7秦皮香豆素组合物对尿酸钠所致家兔滑膜病理的影响
组别 |
剂量(mg/kg) |
鼠数(只) |
兔膝关节滑膜病理变化程度(分,x±SD) |
充血水肿 |
纤维化 |
结晶沉着 |
模型对照组秋水仙碱片组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮香豆素组合物组秦皮甲素秦皮甲素秦皮甲素秦皮乙素秦皮乙素秦皮乙素秦皮苷秦皮苷秦皮苷秦皮亭秦皮亭秦皮亭 |
--1.0120603024012060240120602401206024012060 |
88888888888888888 |
3.33±0.522.17±0.89**2.00±0.73***2.50±0.55**2.67±0.52*2.71±0.53*2.97±0.623.02±0.752.66±0.51*2.89±0.682.97±0.712.73±0.58*2.82±0.722.90±0.862.52±0.48*2.71±0.592.86±0.81 |
3.17±0.752.00±0.89*1.83±0.98**2.17±0.98*2.83±0.752.38±0.81*2.64±0.932.98±0.942.32±0.76*2.53±0.872.86±0.902.36±0.71*2.62±0.922.91±0.952.38±0.66*2.61±0.792.92±0.86 |
3.33±1.031.89±0.75**1.67±0.82**1.83±0.41**2.33±0.822.16±0.98*2.76±0.863.03±0.942.16±0.98*2.76±0.863.03±0.942.16±0.98*2.76±0.863.03±0.942.25±0.86*2.58±0.892.96±0.91 |
注:与模型对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表7显示,单独使用秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷或秦皮亭,仅240mg/kg剂量组有明显抑制尿酸钠所致兔膝关节滑膜充血水肿、结晶沉着和滑膜纤维化病理变化作用(P<0.05),120~60mg/kg剂量组均无明显作用(P>0.05)。而以上四个成分按比例依次为4-6∶1-3∶2-4∶1为主要组成成分的秦皮香豆素组合物120~60mg/kg剂量组具有显著抑制尿酸钠所致兔膝关节滑膜充血水肿、结晶沉着和滑膜纤维化病理变化作用(P<0.01),在30~120mg/kg范围内呈明显的量效关系。