CN1920039A - 一个种子特异性启动子及其核心功能片段与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个种子特异性启动子及其应用，其目的是提供一个来源于马槟榔的种子特异性启动子及其在植物品质改良中的应用。该启动子是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：5的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №：5限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动基因转录功能及种子特异性的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明一方面有助于深入阐明MBL基因在马槟榔植物中的表达调控机理，并为MBL基因遗传转化常规作物奠定理论基础，将在植物的品质改良中发挥重要作用；另一方面，本发明对多肽药物类功能蛋白基因的表达也显示出独特优势和潜在的应用前景。

Description

一个种子特异性启动子及其核心功能片段与应用

技术领域

本发明涉及植物基因启动子及其应用，特别是涉及一个来源于马槟榔的种子特异性启动子及其在植物品质改良中的应用。

背景技术

不同基因在不同发育阶段和不同组织中特异表达是植物本身生长发育的需要。生物体内不同基因能够有条不紊地特异表达，关键在于其启动子中特异顺式作用元件及特异转录因子各不相同所致。研究表明，组织特异性启动子中一般同时存在多种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数量和相对位置等共同决定。在植物的基因工程改良中有目的地应用高效组织特异性启动子，可以克服组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异性、持续和高效表达所造成的浪费，甚至大量表达的异源蛋白会打破植物原有的代谢平衡，妨碍植物的正常生长发育，而且有时在需要大量表达的特定组织中又因表达量过低而达不到预期效果，因此，深入研究这些组织特异性启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、生理和代谢等基础理论，而且也具有广泛的应用前景，长期以来一直是植物基因工程研究中的重点和难点。

种子发育包含一系列基因的相继协调表达，原因在于这些基因的启动子相继被激活，因此研究这些基因及其启动子的表达调控机理具有重要的理论和现实意义。目前，研究较多的种子特异性启动子主要是单子叶植物中的胚乳特异性启动子和双子叶植物中的胚及子叶特异性启动子。

目前，双子叶植物的种子特异性启动子研究主要集中在油菜(Brassica)的napin基因启动子和豆类的11S、7S蛋白基因启动子。napin蛋白是广泛存在于芸薹属植物中的种子贮藏蛋白，又被称为1.7S蛋白。迄今为止，许多植物的napin蛋白基因，如napA、napB、BcNA1和pGNA等都相继得到克隆和测序(熊兴华等，油菜种子特异表达napin基因启动子的克隆及序列分析，生物技术，13(3)：4-5，2003)，分析它们的调控序列发现某些特定的核苷酸序列与种子特异性表达密切相关(Ellerstrom等，Functional dissection of a napin gene promoter：identification of promoterelements required for embryo and endosperm-specific transcription，PlantMolecular Biology，32：1019-1027，1996)。Zhang等从油菜H165的基因组DNA中分离到了napinB启动子的部分序列nap300(Zhang等，Identification ofseed-specific promoter nap300 and its comparison with 7S promoter，Pro.Nat.Acad.Sci，12(10)：737-741，2002)，把它与7S蛋白基因的启动子进行序列比对发现，napinB启动子中包含了一些在进化过程中高度保守的序列，如富AT序列、napin-motif保守序列、RY重复序列和G-box等，这些顺式作用元件也是核蛋白的结合位点(Wu等，Analysis of 5’region of glutelin genes from wild rice species，Bot Bull Acad Sin，37：41，1996)，可能对种子特异性表达起到重要的调控作用。

财音青格乐等克隆了大豆β-伴大豆球蛋白基因α亚基启动子片段BCSP666，把它与α’亚基基因的启动子进行比较，发现这些启动子之间的序列同源性虽然很低(30-40％)，但所含的启动子序列元件的数量和距离上却很相似，均具有多拷贝的RY重复序列元件，AGCCCA序列元件，napin-motif序列元件和富AT序列(财音青格乐等，中国农业科学，38(3)：454-461，2005)。Beachy等证明α’亚基基因的启动子具有较强的种子特异性，且上述这些启动子序列元件与种子特异性功能密切相关(Beachy等，Accumulation and assembly of soy-bean β-conglycinin in seads oftransfomed petunia plants，The EMBO，4(12)：3047-3053，1985)。Cahoon等利用α’亚基基因的启动子在大豆体细胞胚中成功地表达了脂肪酸脱氢酶基因，进一步证实了它的种子特异活性并展示了其广泛的应用前景(Cahoon等，Production offatty acid componcnts of meadow foam oil in somatic soybean embryos，PlantPhysiol.，124：243-251，2000)。

醇溶蛋白基因启动子和谷蛋白基因启动子是单子叶植物种子特异性启动子研究的重点和热点。研究较多的醇溶蛋白基因和谷蛋白基因包括玉米(Zea mays L.)19KD、22KD zein基因(Heideckerr等，Structural analysis of plant genes，Annual.Rev.Plant physiol，37：439-446，1986)、小麦glutenin、a/β-gliadin(Reeves andOkita，Analysis of a/β-gliadin genes from dipliod and hexaploid wheats，Gene，52：257-266，1987)、γ-gliadin基因，大麦B1-hordein基因(Forde等，Nucleotide sequence of B，hordein gene and the identification of possibleupstream regulatory elements in endosperm storage protein genes from barley，wheat and maize，Nucleic Acids Res.，13：7327-7339，1985)和水稻的4a基因(赵军等，水稻种子醇溶蛋白4a基因的表达受串联复合启动子调控，中国科学C辑，26(2)：156-163，1996)等。在所有谷蛋白基因的启动子中都含有GCN4基序、AACA基序和GCAA基序，而且它们的位置基本相同；在醇溶蛋白基因的启动子中除含有上述元件外，还含有Prolamin-box(醇溶谷蛋白框)。Wu等的研究认为GCN4基序是决定胚乳特异表达的重要元件，GCN4基序、AACA基序和ACCT基序的组合对于胚乳特异表达特性是充足的(Wu等，Analysis of 5’region of glutelin genes from wild ricespecies，The Plant J.，23(3)：415-421，2000)。

马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)，又名马金囊、马金南、太极子(云南中药别名)、山槟榔(云南西畴)、紫槟榔或水槟榔(广西百色)，山柑科(Capparidaceae)山柑属(Capparis)植物，主要分布于我国热带、亚热带地区，是产于我国广西、云南东南部和贵州南部等省区的高海拔(800-1600m)地区一种多年生常绿木质藤本、攀援灌木，高达数米至十数米，也是一种珍稀的濒危野生果树。马槟榔的种子去皮后可入药，是“上清丸”的重要药源。种仁性苦、甘、寒，具有催产、避孕、清热解毒、治咽喉肿痛、恶疮肿毒，生津润肺、助消化、去斑痧和醒酒等多种功效。其种仁食之还有经久甜味，是因富含甜蛋白mabinlin所致(Liu等，Purification，complete aminoacid sequence and structural characterization of the heat-stable sweet protein.mabinlin II，Eur.J Biochem.，211：281-287，1993)。

马槟榔的种子呈扁螺旋形，胚位于种仁中央，胚轴呈肥大的条状盘于子叶周围，胚轴是贮藏蛋白质和油脂的主要场所。马槟榔种子中的甜味成分为mabinlin(MBL)蛋白(称马宾灵或马槟榔甜蛋白)，它是马槟榔种子的主要贮藏蛋白，约占种仁干重的4％(胡忠等，马槟榔甜味蛋白的研究I，云南植物研究，5(2)：207-212，1983)，占全种子干重的1.4％(Liu等，Purification，complete amino acid sequence andstructural characterization of the heat-stable sweet protein，mabinlin II，Eur.J Biochem.，211：281-287，1993)，该蛋白是一种具有强碱性的清蛋白(albumin)，存在于胚轴细胞的蛋白体中，占蛋白体总蛋白含量的90％，其甜度约是蔗糖的375倍(以重量比较为基础)，甜味阈值约为0.1％。

马槟榔是全世界6种产甜味蛋白的植物之一，且是我国独有、唯一的植物甜蛋白资源植物。马槟榔甜蛋白mabinlin有4种同工蛋白，分别为MBL I-1、II、III、IV，这些蛋白基因的cDNA序列都已被克隆和测序，其中MBL II的分子量为10.4KD，等电点为11.3，在酸性条件下比较稳定，且在100℃保温48h仍可保持其甜味活性(Liu等，Purification，complete amino acid sequence and structural characterizationof the heat-stable sweet protein，mabinlin II，Eur.J Biochem.，211：281-287，1993)。与其它甜蛋白相比，mabinlin蛋白的甜度虽不是很高(如甜蛋白thaumatin的甜度约为蔗糖的3000倍)，但其耐酸性好，热稳定性高，且是所有甜蛋白中热稳定性最高的(Faus等，Recent developments in the characterization andbiotechnological production of sweet-tasting proteins，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53(2)：145-51，2000)，因此最有希望成为新型的食品添加剂，甚至成为甜味剂蔗糖的部分替代品，因此对马槟榔及其甜蛋白mabinlin进行深入研究具有重要意义。

作为占胚轴蛋白体总蛋白含量90％的马槟榔甜蛋白mabinlin，其基因的启动子可能是种子特异性表达的强启动子，而且作为一种清蛋白，其基因的启动子可能具有与已知种子特异性启动子(如legA、napA、napB和Zein等基因的启动子)不同的应用价值，因此mabinlin基因(MBL)启动子的克隆具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一个具有繁殖器官，特别是种子特异性的mabinlin基因的启动子。

本发明所提供的繁殖器官特异性启动子，名称为MBL-P695，来源于山柑属植物马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)，其核心功能片段是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

4)与序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID NO：2由300个碱基组成；序列表中的SEQ ID NO：3由424个碱基组成；序列表中的SEQ ID NO：4由510个碱基组成。

所述具有上述核心功能片段的种子特异性启动子MBL-P695，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID NO：5限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动基因转录功能及种子特异性的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：5由695个碱基组成。

含有本发明启动子及其核心功能片段的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增MBL-P695及其核心功能片段中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明提供了种子特异性启动子MBL-P695及其核心功能片段，该启动子是采用GenomeWalking法从山柑属马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)中克隆的种仁甜蛋白mabinlin基因的启动子。拟南芥转基因试验证明MBL-P695及其核心功能片段能赋予GUS报告基因在植物植物繁殖器官(特别是种子)中高水平表达，具有较强的组织特异性。本发明一方面有助于深入阐明MBL基因在马槟榔中的表达调控机理，并为MBL基因遗传转化常规作物，如大豆、玉米、水稻、咖啡和各种瓜果蔬菜等奠定了理论基础，将在植物(包括单子叶和双子叶植物，尤其是种子植物)的品质改良中发挥重要作用；另一方面，由于MBL是一种清蛋白，而许多功能蛋白(如酶)和生理活性成分等都是清蛋白，因此本发明MBL基因的启动子MBL-P695及其核心功能片段对多肽药物类功能蛋白基因的表达也显示出独特优势和潜在的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1A为第一轮巢式PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图1B为第二轮巢式PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为含有启动子MBL-P695序列的DNA片段的序列分析结果

图3为植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA的物理图谱

图4为PCR扩增的MBL-P779系列缺失片段及对照LegA-P的琼脂糖凝胶电泳检测结果及融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段、LegA-P的植物表达载体的双酶切鉴定结果

图5A为MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd转基因拟南芥根、茎、叶的GUS组织化学染色结果

图5B为MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd转基因拟南芥花的GUS组织化学染色结果

图6为MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd转基因拟南芥种子的GUS组织化学染色结果

图7为MBL-Pb转基因拟南芥开花后第6、10、12、14、16、18、20天种子的GUS原位组织化学染色结果

图8为MBL-Pb转基因拟南芥种子不同部位的GUS原位组织化学染色结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，所用马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)采自广西百色地区靖西县旧州境内海拔1500m左右的山坡灌木丛，当地人叫水槟榔。

实施例1、含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695的DNA片段的克隆

一、含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695序列的DNA片段的克隆

用Clontech Laboratory Inc公司的Universal GenomeWalker试剂盒克隆含有马槟榔MBL基因启动子(命名为MBL-P695)序列的DNA片段，具体过程如下：

1、引物设计

根据马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)MBL基因的cDNA序列(GI：1817545)及上述试剂盒说明书的要求设计2条MBL基因的特异嵌套引物，引物序列如下：

pM1：5’-acctcgataacggtggtctggatgga-3’

pM2：5’-ggtctggatggaggcgttcgctagga-3’，

再将pM1和pM2分别与试剂盒自带的接头引物AP1、AP2组成2对引物pM1/AP1和pM2/AP2。

2、巢式PCR扩增含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695序列的DNA片段

1)GenomeWalker文库的构建

用常规方法提取马槟榔叶片的基因组DNA，并参照上述试剂盒说明书用Dra I、EcoR V、Pvu II和Stu I四种平末端内切酶对提取的马槟榔叶片基因组DNA进行酶切消化，连接接头得到四种GenomeWalker文库。

2)巢式PCR扩增

以步骤1)构建的GenomeWalker文库为模板，分别在pM1/AP1和pM2/AP2两对引物的引导下进行2轮巢式PCR，第一轮PCR反应条件为：先94℃2s，72℃3min，7个循环；然后94℃2s，67℃3min，37个循环；最后67℃4min；第二轮PCR反应条件为：先94℃2s，70℃3min，5个循环；然后94℃2s，65℃3min，30个循环；最后65℃4min。每轮反应结束后，均对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，第一轮巢式PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1A所示(泳道M：DNA MarkerDL2000+15000，泳道S：以Stu I GenomeWalker文库为模板的PCR扩增产物，泳道P：以PvuII GenomeWalker文库为模板的PCR扩增产物，泳道E：以EcoRV Genome Walker文库为模板的PCR扩增产物，泳道D：以Dra I GenomeWalker文库为模板的PCR扩增产物)，第二轮巢式PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1B所示(泳道M：DNAMarker DL2000+15000，泳道P：以PvuII GenomeWalker文库为模板的PCR扩增产物，泳道E：以EcoRV GenomeWalker文库为模板的PCR扩增产物，泳道D：以Dra IGenomeWalker文库为模板的PCR扩增产物)，回收并纯化Dra I文库泳道上的四条带和PvuII文库泳道上的一条带，将回收DNA片段连接至载体pMD18-T购自(Takara公司)中，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序，结果由Dra I文库中扩增的其中3个DNA片段的长度分别为337bp、672bp和885bp，这3个DNA片段都是MBL基因上游的特异目的片段，且前2个片段都被包含在最长的第3个片段中，将最长片段去掉接头引物后的长度为851bp，其3’端长72bp的序列与MBL基因cDNA5’端序列的同源性达到100％，表明已成功克隆到含有MBL基因5’上游区启动子的序列，即序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，由779个碱基组成，将该片段命名MBL-P779。用Biology WorkBench 3.2软件对该序列进行酶切位点分析，结果发现该片段中具有7个Dra I酶切位点，这便是由Dra I文库扩增出多条带的原因。

二、含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695序列的DNA片段的序列分析

用NCBI网站的Blastn程序对步骤一获得的含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695序列的DNA片段MBL-P779进行比对分析，结果没有找到序列同源性信息，表明所分离的马槟榔MBL基因的启动子MBL-P695是一个新的启动子。用在线软件NNPP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)对其保守序列元件进行预测和分析，结果如图2所示，自5’端第220-270位碱基为核心启动子区域I，自5’端第677-727位碱基为核心启动子区域II，发现在该启动子序列里除含有转录起始位点(自5’端第260位和第717位碱基)、TATA-box(自5’端第230-238位碱基，自5’端第310-318位碱基，自5’端第685-691位碱基)、和ACGT-box(自5’端第544-552位碱基，自5’端第677-684位碱基)基本启动子元件外，还含有RY-repeat(自5’端第663-668位碱基)、napin-motif(自5’端第625-631位碱基)、E-box(自5’端第36-41位碱基，自5’端第652-657位碱基)、I-box(自5’端第170-175位碱基，自5’端第544-548位碱基，自5’端第568-572位碱基)和CAAT重复序列(自5’端第275-278位碱基，自5’端第297-300位碱基，自5’端第361-364位碱基，自5’端第455-458位碱基)等大量种子特异表达相关的保守序列元件，暗示MBL基因可能受种子发育阶段的调控，其启动子是一个种子特异表达的启动子。

实施例2、马槟榔MBL基因启动子MBL-P695及其核心功能片段的获得及马槟榔MBL基因启动子MBL-P695的组织化学分析

一、融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段、LegA-P的植物表达载体的构建

先设计四对引物以用PCR的方法对实施例1获得的含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695的DNA片段MBL-P779进行系列缺失，并在缺失片段的两端分别添加限制性内切酶Sac I和BamH I识别位点，引物序列如下：

用于扩增缺失片段MBL-Pa的引物：

Pa1：5’-ctg gagctcatcaaaatgctaaccgcct-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I识别位点)

Pm：5’-cat ggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；

用于扩增缺失片段MBL-Pb的引物：

Pb1：5’-ctg gagctctaaaagaatctacaaaac-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I识别位点)

Pm：5’-cat ggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；

用于扩增缺失片段MBL-Pc的引物：

Pc1：5’-ctg gagctcttatacaggtatagactcaat-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I识别位点)

Pm：5’-cat ggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)；

用于扩增缺失片段MBL-Pd的引物：

Pd1：5’-ct ggagctctttagtcatgtatgggacac-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Sac I识别位点)

Pm：5’-cat ggatccgggtgagtgtgtgttcttgt-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)。

以实施例1获得的含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695的DNA片段MBL-P779为模板，分别在上述4对引物的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道M：DNA Marker DL2000+15000，泳道a：MBL-Pa，泳道b：MBL-Pb，泳道c：MBL-Pc，泳道d：MBL-Pd)，结果用上述4对引物进行PCR扩增分别获得了长度约为300bp、424bp、510bp和695bp的DNA片段，回收这4个DNA片段并将回收片段分别连接至载体pMD18-T中，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序，测序结果表明上述4个DNA片段确实为实施例1获得的含有马槟榔MBL基因启动子MBL-P695DNA片段MBL-P779的系列缺失片段，且序列两端分别添加有限制性内切酶Sac I和BamH I识别位点，将这4个缺失片段分别命名为MBL-Pa(300bp)、MBL-Pb(424bp)、MBL-Pc(510bp)和MBL-Pd(695bp)。然后用限制性内切酶Sac I和BamH I对上述4个缺失片段进行双酶切，再将4个酶切片段分别与经相同酶双酶切的植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA(Hyg^r，13.29kb，物理图谱见图3)连接，使酶切片段取代pVKH-35S-GUS-pA中GUS基因上游的CaMV35S启动子，先对重组载体进行PCR鉴定(检测引物为上述PCR扩增各MBL-P779缺失片段的引物)，结果经PCR扩增获得了大小分别为300bp、424bp、510bp和695bp的DNA片段，与预期结果相符，再用限制性内切酶Sac I和BamH I对重组载体进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示(泳道M：DNA Marker DL2000+15000，泳道A：pVKH-35S-GUS-Pa的Sac I和BamH I双酶切产物，泳道B：pVKH-35S-GUS-Pb的Sac I和BamH I双酶切产物，泳道C：pVKH-35S-GUS-Pc的Sac I和BamH I双酶切产物，泳道D：pVKH-35S-GUS-Pd的Sac I和BamH I双酶切产物)，PCR及Sac I和BamH I双酶切鉴定结果均与预期结果相符，表明获得了***序列及位置均正确的分别含有融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段MBL-Pa(300bp)、MBL-Pb(424bp)、MBL-Pc(510bp)和MBL-Pd(695bp)的植物表达载体，依次命名为pVKH-35S-GUS-Pa、pVKH-35S-GUS-Pb、pVKH-35S-GUS-Pc和pVKH-35S-GUS-Pd。对四种植物表达载体进行测序，测序结果表明MBL-Pa具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由300个碱基组成；MBL-Pb具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列，由424个碱基组成；MBL-Pc具有序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列，由510个碱基组成；MBL-Pd具有序列表中SEQ ID NO：5的核苷酸序列，由695个碱基组成。

同时，以来自豌豆(Pisum sativum)的种子特异表达的leguminA(legA)基因的启动子LegA-P(Genbank号：GI：20777)作为阳性对照，该启动子的克隆方法为：用CTAB方法提取豌豆苗基因组DNA，然后以提取的豌豆苗基因组DNA为模板，在引物A1(5’-gt ggatcctttagaattatttttttag-3’，带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)和A2(5’-ta ttcgaaattctcttacaaccaacta-3’，带下划线碱基为限制性内切Hind III识别位点)的引导下进行PCR扩增，得到长度为1245bp的legA基因的启动子LegA-P序列，并在序列两端分别添加上限制性内切酶BamH I和Hind III识别位点。用限制性内切酶BamH I和Hind III对PCR产物进行酶切，并与经相同酶双酶切的克隆载体pBluescript II(购自Takara公司)连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序，测序结果表明***序列与legA基因的启动子LegA-P序列的同源性为100％，将该含有LegA-P的重组克隆质粒命名为pBS-legA。以pBS-legA质粒为模板，在引物P1：5’-cat ggatccgaatgttggttgtgatgcgg-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)和引物P2：5’-ctg gagctcttggcgtctcattgattgac-3’(带下划线碱基为限制性内切酶SacI识别位点)的引导下PCR扩增legA启动子的LegA-P，同时在扩增片段的两端分别添加上限制性内切酶Sac I和BamH I的识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道M：DNA Marker DL2000+15000，泳道e：LegA-P)，经PCR扩增获得长度约为1245bp的DNA片段，再用限制性内切酶Sac I和BamH I对扩增的LegA-P片段进行双酶切，再将酶切片段与经相同酶双酶切的植物表达载体pVKH-35S-GUS-pA连接，先用引物P1和P2对该重组载体进行PCR进行鉴定，再用限制性内切酶Sac I和BamH I对重组载体进行双酶切鉴定，鉴定结果如图4所示(泳道M：DNA Marker DL2000+15000，泳道E：pVKH-35S-GUS-LegA-P的Sac I和BamH I双酶切产物)，PCR及Sac I和BamH I双酶切鉴定结果均与预期结果相符，表明获得了***序列及位置均正确的含有融合GUS基因的LegA-P的植物表达载体，命名为pVKH-35S-GUS-LegA-P。

二、分别转化有融合GUS基因的MBL-P779系列缺失片段、LegA-P的植物表达载体的拟南芥的组织化学分析

1、转基因拟南芥的获得

在农杆菌LBA4404的介导下，用真空渗入转化法将步骤一构建的5个植物表达载体和具有35S启动子的载体pVKH-35S-GUS-pA(用作组成型表达的阳性对照)分别转化Columbia生态型的拟南芥(Arabidopsis thaliana)，筛选阳性转基因拟南芥植株。

2、MBL-P779系列缺失片段驱动GUS基因表达情况的组织特异性分析

对步骤1获得的T₂代转基因拟南芥的根、茎、叶和花用GUS原位组织化学活性分析方法对MBL-P779及其系列缺失片段驱动GUS基因表达情况的组织特异性进行检测，其中，根、茎和叶中GUS基因的表达情况如图5A所示(a：pVKH-35S-GUS-Pa转化植株，b：pVKH-35S-GUS-Pb转化植株，c：pVKH-35S-GUS-Pc转化植株，d：pVKH-35S-GUS-Pd转化植株，e：pVKH-35S-GUS-LegA-P转化植株，o：pVKH-35S-GUS-pA转化植株，ck：阴性对照)，花中GUS基因的表达情况如图5B所示(a：pVKH-35S-GUS-Pa转化植株，b：pVKH-35S-GUS-Pb转化植株，c：pVKH-35S-GUS-Pc转化植株，d：pVKH-35S-GUS-Pd转化植株，e：pVKH-35S-GUS-LegA-P转化植株，o：pVKH-35S-GUS-pA转化植株，ck：阴性对照)，MBL基因启动子MBL-P779各缺失片段MBL-Pa、MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd都不能驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎、叶中表达(图5A中的图a-图d)，但MBL-Pd可驱动GUS基因在花中较强表达(图5B中的图d)，而MBL-Pa、MBL-Pb和MBL-Pc的花表达活性很弱或不明显。

3、MBL-P779系列缺失片段启动活性的强度分析

对步骤1获得的T₂代(和/或T₃代也可)转基因拟南芥的种子用GUS原位组织化学活性分析方法对MBL-P779系列缺失片段启动活性的强度进行检测，GUS基因的表达情况如图6所示(a：pVKH-35S-GUS-Pa转化植株，b：pVKH-35S-GUS-Pb转化植株，c：pVKH-35S-GUS-Pc转化植株，d：pVKH-35S-GUS-Pd转化植株，e：pVKH-35S-GUS-LegA-P转化植株，o：pVKH-35S-GUS-pA转化植株，ck：阴性对照)，MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd转基因植株种子的显色都比MBL-Pa转基因植株的种子深，而MBL-Pb、MBL-Pc和MBL-Pd转基因植株种子间的显色深浅差异不显著，MBL-Pa转基因植株种子与legA-P转基因植株种子的颜色深浅接近，表明MBL-Pa驱动GUS表达的能力与种子特异性启动子legA-P基本相当，而MBL-Pb、MBL-Pc、MBL-Pd的驱动能力都比MBL-Pa的强。上述结果说明MBL-Pd即为马槟榔MBL基因的启动子MBL-P695，是一个具有繁殖器官特异性，特别是种子特异性的强启动子，MBL-Pa、MBL-Pb和MBL-Pc是启动子MBL-P695的必需序列，即核心功能片段。

4、MBL基因启动子MBL-P695驱动基因表达的时序分析

在步骤1获得的MBL-P695核心功能片段MBL-Pb T₂代转基因拟南芥开花后第6、10、12、14、16、18、20天对其种子进行GUS原位组织化学染色，以分析启动子MBL-P779驱动基因表达的时序，不同时间的GUS染色结果如图7所示，开花后第12天开始，启动子MBL-P695开始在种子中驱动GUS基因表达，约到第16天表达水平达到最高峰(蓝色最深)，之后种子的GUS显色一直维持在较高水平，表明启动子MBL-P695驱动基因表达受发育阶段的调控，启动子MBL-P695主要在种子成熟的中后期驱动GUS基因表达，表达时间与拟南芥种子自身贮藏蛋白mabinlin的积累同步，从而也更进一步证明MBL基因启动子MBL-P695是种子特异性启动子。

5、MBL基因启动子MBL-P695在种子中的表达定位

在步骤1获得的MBL-P695核心功能片段MBL-Pb T₂代转基因拟南芥的种子的不同部位进行GUS原位组织化学染色，以对启动子MBL-P695在种子中启动基因的表达部位进行定位，结果如图8所示，启动子MBL-P695主要在转基因拟南芥种子的胚中驱动GUS基因表达，在种皮中GUS基因没有表达，其中在胚根、胚轴中的表达活性强于子叶；与此相呼应的是，马槟榔种子胚的胚轴长而膨大，子叶较小，胚轴是贮藏蛋白mabinlin的主要贮藏场所(胡忠等，马槟榔甜味蛋白的研究II，云南植物研究，7(2)：187-195，1985)，因此在上述转基因拟南芥种子的胚轴中观察到GUS基因最强表达。

                               序列表

<160>5

<210>1

<211>779

<212>DNA

<213>山柑属马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)

<400>1

ttggcatttt taaattttta ttttatgttt ttatacaaat gtttttcaaa aagtaaatat    60

aaaattcact tttttagtca tgtatgggac acaaatttta aattcatttt cgaccctctt    120

caaaggtttt cttatttaaa atttttttaa aaaaaattat agacatatag ataaggacct    180

attttttatt ttattttttt atctaaatta agatccaact tgatccacat ataaaataaa    240

cccgatagaa aatttattta tacaggtata gactcaattc ataccaagcc aaaaaccaat    300

ccgcaccatt atataaataa attaaagtta gtggttacaa ctttaaaaga atctacaaaa    360

caattttatt ttaatatata tagaatttaa aatattaaat cgaagttatt tttttacaaa    420

aaaaaaccta gtaaattatg aaattatttt tgtgcaatta tgcaaaaatc aaaatgctaa    480

ccgcctaatt tataagtata ccttacaaaa ggttatagat ctccctctct ctttaaattt    540

ttcgataacg ttaaaacccg caacttcgat aatgtctcct gctcaacacg caacatattg    600

cgtgtattat tatttgatca ttgttacaca taatcatctc atctattctt acacgtgatc    660

gccatgcaaa gtcctcaacg ttcgtataaa tatacccacc aaataatccc ctcgtcacct    720

cactcatcac ccaacaaaac cctaataaca agaacacaca ctcacccaaa accttagca     779

<210>2

<211>300

<212>DNA

<213>山柑属马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)

<400>2

atcaaaatgc taaccgccta atttataagt ataccttaca aaaggttata gatctccctc    60

tctctttaaa tttttcgata acgttaaaac ccgcaacttc gataatgtct cctgctcaac    120

acgcaacata ttgcgtgtat tattatttga tcattgttac acataatcat ctcatctatt    180

cttacacgtg atcgccatgc aaagtcctca acgttcgtat aaatataccc accaaataat    240

cccctcgtca cctcactcat cacccaacaa aaccctaata acaagaacac acactcaccc    300

<210>3

<211>424

<212>DNA

<213>山柑属马槟榔(Capparis masaikai lévl.)

<400>3

taaaagaatc tacaaaacaa ttttatttta atatatatag aatttaaaat attaaatcga    60

agttattttt ttacaaaaaa aaacctagta aattatgaaa ttatttttgt gcaattatgc    120

aaaaatcaaa atgctaaccg cctaatttat aagtatacct tacaaaaggt tatagatctc    180

cctctctctt taaatttttc gataacgtta aaacccgcaa cttcgataat gtctcctgct    240

caacacgcaa catattgcgt gtattattat ttgatcattg ttacacataa tcatctcatc    300

tattcttaca cgtgatcgcc atgcaaagtc ctcaacgttc gtataaatat acccaccaaa    360

taatcccctc gtcacctcac tcatcaccca acaaaaccct aataacaaga acacacactc    420

accc                                                                 424

<210>4

<211>510

<212>DNA

<213>山柑属马槟榔(Capparis masaikai Lévl.)

<400>4

ttatacaggt atagactcaa ttcataccaa gccaaaaacc aatccgcacc attatataaa    60

taaattaaag ttagtggtta caactttaaa agaatctaca aaacaatttt attttaatat    120

atatagaatt taaaatatta aatcgaagtt atttttttac aaaaaaaaac ctagtaaatt    180

atgaaattat ttttgtgcaa ttatgcaaaa atcaaaatgc taaccgccta atttataagt    240

ataccttaca aaaggttata gatctccctc tctctttaaa tttttcgata acgttaaaac    300

ccgcaacttc gataatgtct cctgctcaac acgcaacata ttgcgtgtat tattatttga    360

tcattgttac acataatcat ctcatctatt cttacacgtg atcgccatgc aaagtcctca    420

acgttcgtat aaatataccc accaaataat cccctcgtca cctcactcat cacccaacaa    480

aaccctaata acaagaacac acactcaccc                                     510

<210>5

<211>695

<212>DNA

<213>山柑属马槟榔(Capparis masaikai lévl.)

<400>5

tttagtcatg tatgggacac aaattttaaa ttcattttcg accctcttca aaggttttct    60

tatttaaaat ttttttaaaa aaaattatag acatatagat aaggacctat tttttatttt    120

atttttttat ctaaattaag atccaacttg atccacatat aaaataaacc cgatagaaaa    180

tttatttata caggtataga ctcaattcat accaagccaa aaaccaatcc gcaccattat    240

ataaataaat taaagttagt ggttacaact ttaaaagaat ctacaaaaca attttatttt    300

aatatatata gaatttaaaa tattaaatcg aagttatttt tttacaaaaa aaaacctagt    360

aaattatgaa attatttttg tgcaattatg caaaaatcaa aatgctaacc gcctaattta    420

taagtatacc ttacaaaagg ttatagatct ccctctctct ttaaattttt cgataacgtt    480

aaaacccgca acttcgataa tgtctcctgc tcaacacgca acatattgcg tgtattatta    540

tttgatcatt gttacacata atcatctcat ctattcttac acgtgatcgc catgcaaagt    600

cctcaacgtt cgtataaata tacccaccaa ataatcccct cgtcacctca ctcatcaccc    660

aacaaaaccc taataacaag aacacacact caccc                               695

Claims (10)

1、种子特异性启动子的核心功能片段，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的核心功能片段，其特征在于：所述核心功能片段是序列表中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的DNA序列。

3、含有权利要求1或2所述核心功能片段的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

4、权利要求1或2所述的种子特异性启动子的核心功能片段在植物品质改良中的应用。

5、含有权利要求1所述核心功能片段的种子特异性启动子。

6、根据权利要求5所述的启动子，其特征在于：所述启动子是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID NO：5限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动基因转录功能及种子特异性的核苷酸序列：

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

7、根据权利要求6所述的启动子，其特征在于：所述启动子是序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列。

8、含有权利要求5或6或7所述启动子的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

9、权利要求5或6或7所述的种子特异性启动子在植物品质改良中的应用。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

Images