CN1910275A - 包含胎儿肝细胞的组合物及其用于hcv感染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有在HCV感染后能有效产生HCV的细胞的组合物、用于培养该细胞的组合物、制备该组合物的方法、以及用HCV感染该组合物中的细胞的方法。本发明还提供测定HCV产生的方法和评价影响HCV产生的化合物的方法。
Description
本申请要求2003年12月1日提交的美国临时申请No.60/526,411的优先权。此专利申请的全部内容纳入本文作为参考。
技术领域
本发明总的涉及含有能有效再生HCV的细胞的组合物以及制备和使用该组合物的方法和组合物。
背景技术
虽然丙型肝炎病毒(HCV)能在感染的人体内强效复制,但在培养细胞内增殖此病毒的有效方法还未被优化。当用感染性血清来感染体内培养的人肝细胞时,只有少量的HCV被复制,它们只能用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)才能检测到。
试图用于HCV感染的培养细胞据报道有:外周血液单核细胞,人B细胞系和T细胞系,人肝细胞系,初期人胎细胞(primary human fetal cells)和成人细胞。然而,至今所报道的结果都令人失望。通常此病毒的复制如此之低,以至受感染细胞群所产生的HCV只能通过(如果有的话)逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)才能检测,而且也只看到少量的HCV RNA拷贝。而且,病毒的产生是散发性的,用相同病毒和细胞在同一天或不同天进行的孔和孔之间没有可重复性。另外,在接种病毒到观察到感染的峰值需要好几天,甚至多达一个月,例如,Iacovacci等人,Hepatology 26(5):1328-1337(1997)。这些问题阻挠了鉴定和快速筛选可能用于治疗HCV患者和/或HCV感染相关研究的化合物。
WO 02/077206报道了在培养细胞中增殖HCV的方法。然而,此方法有许多缺点。在WO02/077206披露的方法中,细胞分离后必须立即使用。这样,一名献血员提供的细胞只能做一次实验。从一名献血员中,可以得到一组细胞,然后可以做一次实验。而且,此方法中所用的培养基较为复杂。
因此,仍然需要在细胞培养物中进行HCV感染和复制HCV的方法。还需要一种快速有效的方法来测定抑制培养物中HCV产生的化合物。本申请通过以下方法解决了这些问题:提供含有能够有效复制HCV的细胞的组合物,制备该含细胞组合物的方法,培养细胞的培养基,用HCA感染细胞的方法,检测HCV感染的方法,和用本发明的组合物和方法评价化合物影响HCV产生的能力的方法。
发明概述
本发明提供了制备含有高HCV生产性能培养细胞的组合物的方法。在一个实施方案中,本发明提供含有细胞混合物的组合物,此细胞混合物含有分离自孕后三月龄或更大龄的人肝的细胞,所述细胞是低温冻存的,并能够有效地被HCV感染。本发明提供含有细胞混合物的组合物,此细胞混合物含有分离自孕后三月龄或更大龄的人肝的细胞,所述细胞能够在含有特定激素的简单培养基中被HCV有效感染。本发明还提供包含用本发明方法制备的细胞的组合物。在本发明的另一个实施方案中,所述细胞混合物中的细胞能通过尺寸约40-70微米的过滤器。在本发明的另一个实施方案中,所述组合物与饲养细胞结合使用,或所述组合物还含有饲养细胞。在本发明的另一个实施方案中,饲养细胞是STO(Reid-99)细胞。STO(Reid-99)细胞只是的饲养细胞的示例,其他这样的饲养细胞不难从“American Type Culture Collection”(“美国典型培养物保藏所”)得到。
本发明提供用于培养细胞的组合物。在本发明的一个实施方案中,用于培养细胞的组合物包含一种培养基,它包含:BSA、烟酰胺,表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。
本发明提供通过将HCV加入本发明组合物来感染细胞混合物的方法。根据本发明的一个实施方案,HCV是RNA898。在本发明的另一个实施方案中,HCV病毒先以大约0.52ml/平方厘米的量与该组合物(接种物)一起在约37℃下培养约4-24小时,然后洗涤组合物中的细胞或用细胞培养基置换接种物。
本发明提供检测HCV感染的方法,包括:将本发明的组合物与饲养细胞一起培养,使组合物中的细胞与HCV接触;测定与细胞相关和/或与细胞培养所用培养基相关的HCV。
另外,本发明提供一种评价某化合物影响HCV产生的能力的方法,所述能力即影响所述细胞组合物产生更多HCV的能力,所述方法包括以下步骤:将本发明的组合物与饲养细胞一起培育,使组合物中的细胞与HCV病毒接触,在与HCV病毒接触前或后加入该化合物。在一个实施方案中,用本方法筛选能抑制HCV产生的细胞。在另一个实施方案中,此方法用于同时筛选多种化合物以判定它们抑制HCV产生的能力。
在另一个实施方案中,HCV检测通过用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)定量检测HCV RNA来进行。在一个实施方案中,将样品中的HCV RNA与用作内部对照的第二种病毒中的RNA量进行对比。在另一个实施方案中,所述第二种病毒是牛病毒性腹泻病毒(“BVDV”)。
本发明的其他特点和优点通过下面的详细描述会变得很明显。但是,应理解,细节描述和具体的实例,虽然表明了本发明优选的实施方案,但只是用于说明,因为本领域技术人员知道从这种详述得到的各种变化和改进属于本发明的构思和范围内。
附图简述
以下的附图构成本说明书的一部分,用来进一步说明本发明的各方面。通过参考这些附图结合对本文具体实施方案的详细描述,可更好地理解本发明。
图1描绘解冻并附着于包被胶原的组织培养孔后的低温冻存的人胎肝细胞。解冻冻存的胎肝细胞,附着后,细胞在包被了胶原I的组织培养皿上在含有特定激素的培养基中培养5小时(图1A)或24小时(图1B)。显示的是代表性的显微镜视野,40x物镜,Hoffman差示镜片(Hoffman Differential optics)。
图2显示以病毒感染低温冻存的人胎肝细胞后与细胞相关的HCV RNA随时间增加的过程。
图3显示HCV NS3·4a蛋白酶抑制剂VX-950(见WO 02/18369)对HCV感染低温冻存人胎肝细胞的抑制。
优选实施方案的描述
仍然存在对适合用于HCV体外增殖的细胞的需求。最好,产生的肝细胞群能被HCV感染,并且是长期体外细胞培养物,从而无需在分离后立即使用。本发明通过提供如下细胞混合物解决了这个需求,该细胞混合物含有分离自孕后3月龄或更大龄的人肝脏的肝细胞和造血细胞。该混合物的细胞群制剂具有以下特征:4×104个所述细胞混合物中的细胞培养在含饲养细胞的生长培养基中,并被给予或以HCV病毒(如RNA898)感染72小时后,能在培养基中产生超过约5000个拷贝的丙型肝炎病毒(HCV)RNA。
本发明组合物包含细胞混合物,该混合物含有分离自孕后3月龄或更大龄人肝脏的细胞,所述细胞经低温冻存。
本发明还提供一种包含细胞混合物的组合物,该细胞混合物含有分离自孕后3月龄或更大龄人肝脏的细胞,它能在含有特定激素的简单培养基中有效地被HCV感染。
本发明还提供一种包含细胞混合物的组合物,所述细胞混合物含有经低温冻存的分离自孕后3月龄或更大龄人肝脏的细胞,它能含有特定激素的简单培养基中有效地被HCV感染。
按照一个实施方案,所述的人是孕后3月到出生后1岁之间的人。在本发明的另一个实施方案中,所述的人是孕后3-6月龄。在本发明的另一个实施方案中,所述的人是孕后18-22周龄的。在本发明的一个实施方案中,所述细胞包含胎肝细胞和造血细胞。按照本发明的一个实施方案,所述肝细胞和造血细胞能表达甲胎球蛋白、白蛋白和/或血型糖蛋白。按照一个优选的实施方案,如果所述人是成年人,则人肝脏是健康的。
本发明包括含有细胞的组合物,这些细胞显然是用于HCV病毒RNA898(以下称为“RNA898”)感染和复制的更好的宿主细胞。RNA898已按照布达佩斯条约的条件于2001年3月27日保藏于美国典型培养物保藏所(“ATCC”)(10801 UniversityBoulevard,Manassas,VA 20110-2209(ATCC保藏号:PTA-3237)。按照一个实施方案,本发明组合物如果含有4×104个细胞,则在接种丙肝病毒后72小时能在培养基中产生5000以上拷贝,10000以上拷贝,或50000以上拷贝的丙型肝炎病毒RNA。例如,按照本发明方法制备并按照本发明方法测试的组合物在接种病毒后72小时能够在培养基中产生5000以上,10000以上,或50000以上拷贝的丙型肝炎病毒RNA。
本领域技术人员应不难理解,如果该组合物中的细胞多于4×104,则产生的病毒RNA拷贝总数会随该组合物中细胞数的增加相应上升。类似地,本领域技术人员应不难理解,如果该组合物中的细胞数少于4×104,则产生的病毒RNA拷贝总数会随着组合物中细胞数的减少相应降低。因此,含有少于或多于4×104个细胞数的组合物可能会成比例地产生相同数量的HCV RNA拷贝。本发明的组合物在接种病毒72小时后可产生5000-55000个HCV RNA拷贝,10000-55000个HCV RNA拷贝,和25000-55000个HCV RNA拷贝。
在某些示例性的实施方案描述了具有本发明组成的细胞混合物按以下步骤制备:获得放在含有EGTA的缓冲液中的孕后三月龄或更大龄的人肝脏,将切碎的肝脏培养在能使细胞从肝中分离出来的组合物中。处理分离的细胞以除去40微米或更大的物体。此外,还除去了分离细胞中的红血细胞。然后将分离的细胞重悬在含0.1mM-0.6mM钙、牛血清白蛋白、烟酰胺、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松的无血清培养基中,并在无血清培养基中培养。在这最后的重悬和培养步骤之前可以但非必须有一个步骤,该步骤包括将分离的细胞重悬于含10%DMSO和10%胎牛血清的组合物中并低温冻存。由此本发明的优选细胞群被制备成如下组合物:该组合物含有分离自孕后三月龄或更大龄人肝中的肝细胞和造血细胞,含有4×104个所述细胞混合物中的细胞、饲养细胞和生长培养基的制品在接受HCV病毒RNA898接种72小时后,产生大约5000个以上HCV病毒RNA拷贝。该制品可以但非必须低温冻存。制备和使用所述组合物的方法和组合物在下文详细描述。
制备本发明细胞群和组合物的起始步骤包括获得合适的肝细胞群。优选该肝细胞群包括灵长类细胞,最优选包括人细胞。人细胞以分离自孕后3月龄或更大龄人的为佳。按照一个实施方案,所述人包括孕后3月龄到出生后1岁之间的人。在本发明的另一个实施方案中,所述人年龄是孕后3-6个月。在另一个实施方案中,所述人年龄在孕后18-22周之间。在本发明的一个实施方案中,所述细胞包含胎肝细胞和胎造血细胞。按照本发明的一个实施方案,所述肝细胞和造血细胞能表达甲胎球蛋白、白蛋白和/或血型糖蛋白。按照一个优选的实施方案,如果所述人是成年人,则人肝脏是健康的。
用于本发明的各种来源的肝脏的切碎通常在乙二醇二(β-氨基乙基-醚)-N,N,N’,N’-四乙酸酯(EGTA)缓冲液中进行。在本发明的一个实施方案中,EGTA缓冲液含0.1mM-1.0mM的EGTA。在本发明的另一个实施方案中,EGTA浓度是0.5mM。在冷的(4℃)的一份该缓冲液中将器官材料切碎。该缓冲液最好含有能促进器官组织解聚的试剂。加蛋白酶可促进解聚。蛋白酶溶液可以是温热的或冷的。通常用胰蛋白酶。胰蛋白酶消化的一个缺点是,组织可能因高温(如室温或更高)下长时间接触胰蛋白酶而受到损伤。因此,通常在用温热胰蛋白酶培育的30分钟内收获细胞。但是,充分解聚组织一般需要3-4小时,因此常常希望在低温(如4℃)进行胰蛋白酶消化。这对细胞的伤害最小,同时允许组织充分浸泡在蛋白酶中。以这种方式,组织可在4℃含0.25%胰蛋白酶的EGTA缓冲液中浸泡10分钟到18小时。然后将组织从含蛋白酶的缓冲液中取出,放在37℃水浴中2-30分钟。然后按每100毫克原始组织加入1毫升培养基,优选温热的培养基,使细胞从组织聚集体中分离出来。轻轻地吹吸鼓动混合物以促进组织解聚,使细胞分散在培养基中。
可在胰蛋白酶之外联用,或者改用其他蛋白酶促进组织解聚。在优选实施方案中,用胶原酶实现解聚。可用粗制胶原酶(例如2000单位/毫升)。胶原酶优于胰蛋白酶是因为许多组织对胶原酶不如对胰蛋白酶那样敏感,所以胶原酶不大可能损伤组织的完整性。在优选的实施方案中,解聚方法包括两步肝灌注,第一步用EGTA培养,然后第二步用含有胶原酶的含钙缓冲液培养(Seglen,P.O.Methods Cell Biol 13:29,1976)。在EGTA缓冲液中将组织切碎。然后除去EGTA缓冲液并代之以含有胶原酶和钙但不含螯合剂(例如EGTA或与之相当者)的其他缓冲液或培养基,其含有200单位胶原酶/毫升。然后将组织在此溶液中在例如37℃下不搅拌培养10分钟到48小时。如果组织在其培养所在容器底部糜散,可视之为有效的解聚。组织解聚后,以50-100g的速度离心混合物3分钟。除去上清液,将细胞重悬于适当的培养基中,培养以扩增细胞。在特定的优选实施方案中,用含有0.1-0.5毫克/毫升胶原酶的缓冲液进行解聚。在本发明的另一实施方案中,胶原酶的浓度是2毫克/毫升(供应商:GIBCOINVITROGEN,如,肝灌注培养液获自GIBCO Cat.No.17701)。在优选的解聚方法中,组织用EGTA培养10分钟。让组织沉降,除去含有EGTA的上清液。沉积的组织随后在含胶原酶的缓冲液(即GIBCO肝灌注培养液Cat.No.17701)中培养30分钟。
其他可用的蛋白酶包括细菌蛋白酶例如,链霉蛋白酶(Schaffer等人,Am.J.Physiol.,273(3,1)G686-G695,1997;Glavin et al.,J.Pharmacol.Exp.Therapeut.276:1174-1179,1996)和分散酶(Compton等人,J.Cell.Physiol.,177:274-281,1998;Inamatsu等人,J.Invest.Dermatol.,111:767-775,1998)。另外,还可用其他酶如透明质酸酶和神经氨酸苷酶。
一旦完成了解聚步骤,可进一步加工细胞悬浮液以除去某些物质。在特特定的优选实施方案中,本发明的细胞群可通过约40微米尺寸的滤膜。因此本发明细胞群制备步骤之一包括从解聚的组织中除去超过40微米的物体。本发明的该尺寸排除步骤意味着除去不能通过40微米滤膜的诸如组织、碎屑、和细胞凝聚物等物质。因此,例如,本发明可采用大约40微米到100微米(如50,60,70,80,或90微米)尺寸的滤膜以及其方法除去超过40微米尺寸的碎屑。在一个实施方案中,该过滤步骤可除去不能通过孔径约40微米以上滤膜的物体。可采用多重过滤步骤,例如,先用较大孔径滤膜的过滤,然后用较小孔径的过滤步骤。本发明滤膜的例子包括尼龙滤膜(如Falcon的”Cell Strainer”(分类号2034,2350或2360))。
除去细胞群中超过40微米的物体之外,本发明的分离方法也包括除去细胞混合物中红血细胞的步骤。应理解,去除红血细胞可在制备过程中从肝脏中分离出细胞之后的任何阶段进行。除去红细胞的方法是本领域公知的。按照本发明的一个实施方案,红血细胞通过连续低速离心除去。例如,可将通过了滤膜的分离细胞以50xg(450rpm)速度离心4分钟,可将沉淀细胞重悬并重复以上过程多次。
有此得到如下细胞群:它是孕后三月龄或更大龄人肝细胞的悬浮液,该肝细胞悬液包含小于40微米的肝细胞。较好的是,该悬浮液基本上不含红血细胞。
本发明细胞群富含表达甲胎球蛋白、白蛋白和/或血型糖蛋白的细胞。较好的是,这些细胞是不表达CD34(因此称为CD34-)的细胞。本领域技术人员知道鉴定细胞群的细胞是否含有一种或几种这些细胞标记的技术。这类技术可包括免疫染色。例如,可用DAKO公司(Carpinteria,CA)的抗甲胎球蛋白抗体、PharMingen(San Diego,CA)公司的抗血型糖蛋白抗体(32591)、PharMingen(San Diego,CA)公司的抗人CD34抗体(34371A)、和Accurate Chemical公司.(Westbury,NY)的抗白蛋白抗体(YM5024)。
除了用上述抗体检测分离细胞群中细胞表面是否存在这些标记外,本领域技术人员知道还可以用这些抗体通过分离技术分离所需的细胞群。因此,在一例实施方案中,将如上所述将孕后3月龄或更大龄人肝脏切碎分离得到的原代细胞在单独或与饲养细胞系以前在培养物中扩增,在扩增后的培养物中富集可用于本发明的细胞。这类富集技术可利用例如免疫学为基础的技术,这些技术包括但不限于:免疫粘附、荧光激活流式细胞计数、免疫学为基础的柱层析、抗体偶联的琼脂糖凝胶珠(或其他惰性珠)、或其他基于免疫学的方法(如免疫-磁分离)。但是,这些技术不定义肝细胞群,而只是分离肝细胞。
可在抗原纯化之前或之后使用其他物理分离方法。这些方法包含但不限于:等密度离心、速度沉降、或逆流离心淘析。此外,还可用其他抗源标记的阳性或阴性进一步定义这些细胞。这些抗原包括但不限于:动物主组织相容性基因座(特别是HLA-DRA)抗原、造血抗原(如CD33,CD8,CD10,CD14,CD9,CD20),或其他肝蛋白。
本发明肝细胞可通过细胞的等密度离心来富集。细胞的等密度离心可提供在适当细胞中富集的低密度细胞。可采用Ficoll或Percoll密度梯度。在一个实施方案中,等密度离心可在免疫亲和步骤之前进行。在该实施方案中,在具有所需密度的肝细胞上进行抗体纯化步骤。在另一个实施方案中,等密度离心可在细胞的抗体纯化以后进行。或者,等密度离心纯化步骤可进行两次,一次在抗体纯化之前,一次在抗体纯化步骤之后。
另一方面,可通过贴附塑料来富集肝细胞群。本发明优选的细胞群是具有塑料贴附性的肝细胞。此肝细胞群可通过除去存在于分离的细胞群中的非贴附性细胞而富集。除去这些非贴附性细胞可通过使肝细胞群接触贴附性表面,通常是组织培养塑料表面或玻璃表面来实现。贴附性肝细胞贴附在组织培养塑料或玻璃表面上,而非贴附性细胞则留在悬液中。悬液中的细胞通过除去上清液并洗涤贴附性细胞即可去除。可在免疫纯化步骤之前或之后除去非贴附性细胞。较好的是,在免疫纯化步骤之前除去基质细胞(stromal cell)。利用固体表面如组织培养塑料或玻璃表面是本领域熟知的。组织培养塑料或玻璃可用例如硅酮、硝基纤维素、镍、赖氨酸等处理,以促进或抑制细胞贴附。处理或未处理的表面都可买到。
另一方面,富集的细胞群按大小进一步分级。在一个优选的实施方案中,大小分级可荧光激活细胞分选法(FACS)来完成,例如用FACScan流式细胞计(BectonDikinson)进行。本发明细胞的平均直径小于40微米,优选直径10-35微米的。
FACS能够根据细胞通过激光束时的光散射特征而分离细胞亚群。前向光散射(FALS)与细胞大小有关,直角光散射(又称侧散射特性(SSC))与细胞密度、细胞内容物和核质比,即细胞的复杂性有关。由于细胞可用荧光偶联抗体标记,可用抗体(荧光)强度进一步对其进行特征鉴定。在实施例中,可设定FACS仪来分离CD34-(低荧光)和CD34+(高荧光)细胞。
为了用抗体(如CD34+单克隆抗体)标记肝细胞,可如实施例1所述的通过切碎肝脏分离细胞并用蛋白酶处理来制备细胞。将细胞制剂分成等份,每份含例如约1×105到1×106个细胞/毫升,装在离心管中。然后用台式或其他离心机离心该细胞悬液。将产生的细胞沉淀重悬在含有所选单克隆抗体的合适的缓冲液中,并培育一段合适的时间。洗涤标记的细胞,将一份标记细胞与荧光素标记的抗小鼠免疫球蛋白一起培育。洗涤细胞悬液并重悬在合适的缓冲液中用于细胞分选。
在用FACS分选细胞时,设置低SSC和中间尺寸(FALS)窗口(即电子意义的一个区域(electronically defined region))。该窗口内的细胞通过抗体-荧光活性可进一步区分。对FACS设定进行调校以采集特定抗原阳性和阴性的细胞。
在本发明具体的实施方案中,可用FACS鉴定肝细胞。采用特异性抗体(如上面举例的那些)重复上述鉴定和分离CD34-细胞的技术,从而检测其他抗原决定簇。以这种方式,本领域技术人员能够产生本发明高度富集的细胞群。
作为FACS的一种替代方法,可用免疫-分离法来分离细胞。由于针对感兴趣的特定抗原的抗体易于获得,我们能够特异性地分离感兴趣的肝细胞。在此类实施方案中,将CD34+细胞与CD34-细胞分开,然后可根据细胞上是否存在其他抗原决定簇在CD34-细胞中进一步分离(如,使用抗甲胎球蛋白抗体、抗血型糖蛋白抗体、抗白蛋白抗体等等)。纯化技术是本领域技术人员熟悉知的。这些技术涉及采用标准的免疫学方法(例如但不限于,免疫磁学、免疫粘附等等)对肝脏的细胞微境进行分割和分离,从而将含有所需细胞的肝细胞组份与混合物的其他成分分开。如上所述分离获得所需的肝细胞组份后,可用各种分离方法进一步纯化这些细胞。特别适合制备纯细胞表面抗原的分析方法采用层析法。
亲和层析是一种依赖于所要分离的物质与能够特异性地与其结合的分子之间的特异性亲和力的层析方法。这是一种受体-配体型的相互作用。层析柱材料通过将结合伴侣之一(在本例中是抗体)共价偶联于不溶性基质上来制备。该柱材料于是能够特异性地吸附溶液中该物质。改变条件市的结合无法发生(如改变pH、离子强度、温度等等)即为洗脱。
最常用的亲和层析之一是免疫亲和层析。产生适用于本发明的抗体见以下所述。将抗体或抗原连接在不溶性惰性基质上。将所要分离的细胞群加到该基质上,由此发生特异性抗体-抗原相互作用。通过接触温和的变性溶剂,如低pH缓冲液、高盐浓度等,使结合的抗体/抗原从吸附剂上洗脱下来。
在具体的实施方案中,用免疫磁性层析分离本发明的细胞。例如,将抗-CD34或其他抗体连接在磁珠上。这些抗体标记的磁珠用作亲和纯化的基础。将本文产生的抗体标记的全肝细胞制剂加到例如含抗-CD34抗体的磁性亲和柱上。收集不贴附细胞,通过除去磁场从磁性柱中除去贴附细胞。在另一个实施方案中,细胞先用抗体(如CD34抗体)标记,然后用带有磁珠或磁球的第二抗体标记。
可用于纯化含糖化合物的另一种亲和层析是凝集素亲和层析,该类层析可用于去除CD34+细胞。凝集素是一类与多种多糖和糖蛋白结合的物质。凝集素通常用溴化氰偶联在琼脂糖上。偶联于琼脂糖凝胶上的伴刀豆球蛋白A(Conconavalin A)是第一个被采用的此类材料,现已广泛用于多糖和糖蛋白的分离。其他已经使用的凝集素包括小扁豆凝集素(1entil lectin)、小麦芽凝集素(它已用于纯化N-乙酰基葡糖胺基残基)、和罗马蜗牛(helix pomatia)凝集素。凝集素本身可用糖配体通过亲和层析纯化。已有用乳糖来从蓖麻籽和花生中纯化凝集素;用麦芽糖提取小扁豆(lentil)和刀豆中的凝集素;N-乙酰基D-半乳糖胺被用于纯化大豆中的凝集素;N-乙酰基葡糖胺基能与麦芽凝集素结合;D-半乳糖胺被用来获得蛤的凝集素;L-岩藻糖能与莲花凝集素结合。
采使用磁珠的免疫选择法所用的珠是预先包被了所需单克隆抗体的珠。细胞被单克隆抗体预先包被,然后通过连接在珠上的第二抗体即抗小鼠免疫球蛋白连接到该磁珠上。结合在珠上的细胞然后用磁铁除去。这是一个快速的方法,可得到所需细胞的高得率。
在免疫粘附中,用包被的塑料表面来分离混合物中的细胞。表面(如培养皿)用能选择具有所需表型细胞的抗体包被。将细胞放在包被的平皿上,培育适当的时间,使细胞和平皿上的包被抗体发生相互作用。培育后,不粘附细胞用合适的缓冲液温和洗涤除去。对于仍然粘附在平皿上的抗体-粘附细胞,然后进行培育和/或用胰蛋白酶消化,或用本领域熟知的其它细胞收集技术回收。
本发明所需的肝细胞群能与针对甲胎球蛋白、白蛋白、和血型糖蛋白的抗体起免疫反应(即,该群细胞对这些标记物为阳性即含有这些标记物),但与抗CD34抗体无免疫反应性的(即,不含CD34)。因此可用这些抗体来富集肝细胞群。随着肝细胞鉴定的深入,本领域普通技术人员可生产出能与肝细胞发生免疫反应的其他抗体。本发明包括这些能与肝细胞抗原决定簇起免疫反应的其他抗体的采用。
在另一个实施方案中,采用第二抗体来富集肝细胞群,该第二抗体能与对肝细胞上决定簇具有免疫反应性的抗体发生免疫反应。第二抗体的采用是本领域公知的。通常,第二抗体是与第一抗体的恒定区域起免疫反应的抗体。优选的第二抗体包括:抗兔、抗小鼠、抗大鼠、抗山羊和抗马免疫球蛋白,这些均可买到。在优选的实施方案中,将第二抗体偶联于固相基质(包括组织培养皿、琼脂糖、聚丙烯酰胺和磁性颗粒。在该实施方案中,肝细胞表面决定簇特异性抗体先与待分离肝细胞群发生免疫反应。然后含有这些抗体附着细胞的肝细胞群与偶联于固相基质上的第二抗体接触。因为只有被抗体标记的细胞能与第二抗体起免疫反应,由此实现了细胞的富集。有提供与磁性颗粒偶合的第二抗体的商品化试剂盒。在该***中,被适当标记从而提呈某抗体的肝细胞可通过接触磁场而纯化。
在具体的实施方案中,本发明的细胞被低温冻存。低温冻存肝细胞的方法是本领域技术人员公知的,例如,见Mitry等人,Cell & Developmental Biology,13,463-467(2002);美国专利5723282;美国专利6521402,特别是美国专利6136525(其内容纳入本文作参考)记载了用于低温冻存肝细胞的低温保护介质。在本申请中,将要低温冻存的细胞悬浮在含有最终浓度为10%DMSO和10%胎牛血清的培养基中。然后将细胞分装入耐冷冻安全容器中,将容器在一定的条件下(例如液态氮或氮蒸汽)冷冻一定时间,储存所属容器,当用前解冻所述细胞。一般说来,冻存保护剂是一种用来尽可能减少低温冻存损害(如冷冻过程中形成胞内冰晶)的化合物。为了说明而非限制,可用DMSO、聚乙二醇、氨基酸、丙二醇等作为冷冻保护剂。
优选的肝细胞培养基能够让细胞耐受液态氮储存过程中的极端温度变化而细胞降解最少。在某些实施方案中,这种培养基是含有特定激素的DMEM培养基,含有BSA、烟酰胺、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松(HDM2),并还可以含有一种或多种补充剂,如胸腺嘧啶、精氨酸、胰岛素、***、谷氨酰胺和哺乳动物血清。下表例举了可用的培养基的浓度及其变化。
HDM2 | 来源,替代品,浓度范围 | |
培养基 | DMEM | DMEM,高葡萄糖(JRH Biosciences,cat.No.51444是优选的DMEM,但是,也可使用RPMI1640或别的类似缓冲液 |
补充了游离脂肪酸的BSA | 500微克/毫升 | 使用不含脂肪酸的BSA(Sigma cat.no.A8806),按照Cheesebauf和Padieu,In Vitro 20:780,1984补充7.6uM游离脂肪酸。游离脂肪酸的范围约200微克BSA/毫升到约2000微克/毫升 |
烟酰胺 | 2.5mM | Sigma,Cat.No.N0636.烟酰胺的范围约0.5mM到5mM |
EGF | 100纳克/毫升 | 在优选制剂中,使用重组人EGF(Peptrotech,cat no 100-15)。EGF的优选范围约10纳克/毫升到约500纳克/毫升 |
胰岛素 | 10纳克/毫升 | (Sigma,cat.no.I5500)。胰岛素的优选范围约1纳克/毫升到10微克/毫升 |
转铁蛋白 | 5微克/毫升 | 所使用的优选的转铁蛋白组合物是人完全转铁蛋白(购自Sigma cat.no.T0665)。转铁蛋白的优选范围约2微克/毫升到20微克/毫升 |
氢化可的松 | 10-6M | 氢化可的松购自Sigma,氢化可的松21半琥珀酸酯,cat.no.H4881。氢化可的松的优选约10-5M到10-7M |
哺乳动物血清可包括胎牛血清、胎马血清(fetal calf serum)和猪血清,其浓度范围为10%-90%。在特别优选的实施方案中,培养基还添加有DMSO(约10-15%)、白蛋白(约3.5-15%)和甘油(约10-20%)。在具体的实施方案中,用于低温冻存的培养基包含胎牛血清(以下称为FBS)和二甲基亚砜(以下称为DMSO)。更具体说,该冻存保护培养基含约5-20%的FBS和约5-15%的DMSO。最优选的冷冻保护剂含10%FBS和10%DMSO。
制备如上定义的分离的肝细胞群,将它们以特定密度分装在耐冷冻的容器中以备低温冻存。此类容器包括但不限于:小瓶、袋、罐等。优选塑料袋,最优选容量为约250毫升-500毫升的Cryocyte商标的Baxter塑料袋。
将细胞分装在容器中,容器用例如机械铝封条、热脉冲热封条、路厄(luer)锁栓等密封。最优选热封。如此密封的容器宜保持在0-4℃直到全部要冻存的容器都被装满并密封,以便它们可同时冻存。
待冻存的细胞密度可以不同。例如,细胞可以约5×106个细胞/毫升到40×106个细胞/毫升的密度低温冻存。约10-50毫升的量可保存在250毫升冷冻容器中,50-150毫升体积可保存在500毫升冷冻容器中。此外,可在细胞中加入晶种,以在已冷却到冻结点以下的溶液产生受控制的结晶或冰形成。加晶种的方法是本领域技术人员所知道的,包括在冷冻容器中***冷的金属棒,在冷冻容器中导入一股强液氮流等等。
优选均匀冷冻细胞,这可以使用冷冻板,将要冷冻的容器安放在冷冻板之间而实现。
将肝细胞分装到冷冻容器中后就可将容器放置到冷冻箱里了。虽然可考虑使用任何能够在约4℃到约-90℃冷冻的冷冻箱,但优选冷冻速度可控的冷冻箱。当使用不可控速的冷冻箱时,将装有细胞的要冷冻的容器放在耐冷冻箱的安全容器中,优选放在聚苯乙烯泡沫盒中,再放在冷冻箱里约2-24小时。然后把这些容器拿出冷冻箱,立即在液氮中降温,以便长期保存。在准备使用时,将细胞在37-42℃水浴中解冻,然后洗去残存的冷冻保护剂。
当使用控速冷冻箱时,对冷冻过程进行编排以确保冷冻均匀。所有冷冻过程都必须在样品温度达到-4℃时立即启动。这种可控温度的冷却速度是本领域技术人员所知道的,美国专利6136525提供了这种冷却速度的例子。较好的是,控速冷冻箱的冷冻程序包括注入一股强氮气流,用来抵消潜热的释放。潜热的抵消降低了在细胞低温冻存期间造成细胞损伤的可能性。该有计划的强冷气流还有助于使得同一冷冻循环中所有冷冻容器内的外源冰晶种晶同步发生。这是特别有利的,因为冻存细胞的关键时刻在于结冰形成阶段。结冰从晶核形成部位开始,这些部位可能是液相中随机散在出现的分子簇。成核冰晶核形成冰沿,然后在整个液体中扩展,直到完全固化。
低温冻存细胞的优选方法是以2×106个细胞ml的密度将细胞悬浮在含10%DMSO和10%FCS的培养基中,然后将细胞悬液分装到2毫升的冻存小瓶中,每瓶1毫升。然后把小瓶***Nalgene cryo 1℃冷冻容器(Cat No.5100-0001)中,然后将该容器放在-70℃冷冻箱中过夜,从而以受控的速度冷冻小瓶。然后将小瓶转移到氮蒸汽保存罐中长期保存。
一旦细胞通过上述冷冻技术冷冻,可将它们放在冻存盒中长期保存在氮储存冷冻箱中。长期保存可理解为细胞在重新悬浮之前可保存数周、数月、甚至数年。冷冻容器可存放在氮蒸汽或液氮中。
使用前,必须解冻细胞,必须除去DMSO。解冻可用37-42℃水浴完成。细胞呈融泥状时将其从容器中取出。然后把细胞倾入含有冷培养基的离心管中。在离心管中加入5-10倍于细胞原体积的新鲜冷培养基将细胞体积稀释。然后以7-15g速度离心细胞悬液2-5分钟。吸弃上清液以除去含有残余DMSO的培养基。然后,将约2-4倍的新鲜培养基加入细胞沉淀中。
本发明细胞在低温冻存之前,或之后,或之前和之后,都能在细胞培养中生长并扩增。但应注意,制备本发明细胞群的方法可以省略低温冻存和解冻步骤。
在优选的实施方案中,细胞在本文所述的含有特定激素的培养基中生长。在本发明的一个实施方案中,本发明的组合物是培养物(co-culture),并与饲养细胞联合使用,或还含有饲养细胞。饲养细胞提供肝细胞生长和扩增所需的胞内基质和可扩散因子如生长因子。在一个实施方案中,所述饲养细胞几乎或完全不能被HCV感染。在一实施方案中,所述饲养细胞是成纤维细胞。在另一个实施方案中,所述饲养细胞是胚胎间充质成纤维细胞。
本发明的饲养细胞的例子是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),如STO细胞和大鼠胚胎成纤维细胞,例如,Hogen等人,
操作小鼠胚胎:实验室手册(Manipulating The Mouse Embryo:A Laboratory Manual),第二版,Plainview,N.Y.:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1994;Robertson,E.J.(1987)
畸胎瘤和胚胎干细胞:实用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach),RobertsonE.J.编(IRS,Oxford),pp.71-112。STO(Reid-99)细胞是可用的饲养细胞之一。STO(Reid-99)细胞于2001年3月27日按照布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条件保藏在美国典型培养物保藏所中(American Type Culture Collection,10810 University Boulvard,Manassas,VA 20110-2209)(ATCC保藏号:PTA-3236)。培养和维持饲养细胞的方法是本领域已知的。例如,见
组织工程方法(Methods for Tissue Engineering),Robert Lanza编,Academic Press,NY(2002),.151-202页。
饲养细胞可以是已按已知方法被休止生长的。例如,可经2-48小时使STO细胞在培养板上贴附。然后,除去培育STO细胞的培养基,换以含2微克/毫升丝裂霉素C的培养基。然后,37C培育STO细胞约2小时。培育后,除去含丝裂霉素C的培养基。洗涤细胞2次,在加入本发明的细胞混合物之前,STO细胞培养物需维持0-48小时。
在一个实施方案中,用于重悬本发明细胞的培养基是包含游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)和微量元素的培养基。
动物或人的原代细胞(primary cell)、细胞系和组织可用本发明培养基培养。在一个实施方案中,所述培养基包含无血清培养基、钙、FFA、HDL、烟酰胺、微量元素、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。按照另一个实施方案,所述培养基还包含以下组分之一、它们的组合或全部:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。在另一个实施方案中,所述培养基不含低密度脂蛋白(LDL)。
按上述过程制得细胞混合物后,应将细胞培养在适合维持该细胞的培养基和可能需要的饲养细胞中。按照本发明的一个实施方案,针对待用于HCV感染的细胞混合物对培养基进行了优化。用于该目的的一种培养基包含无血清培养基(如Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)),其中包含钙、牛血清白蛋白(BSA)、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松,并任选地包含以下组分的之一、它们的组合或全部:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺、和促甲状腺素释放因子。按照本发明的一个实施方案,所述培养基不含低密度脂蛋白(LDL)。
可用于本发明目的的另一种培养基包含无血清培养基,其中包含牛血清白蛋白(BSA)、烟酰胺、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。
在一个实施方案中,所述培养基不含低密度脂蛋白(LDL)。在另一个实施方案中,所述培养基不含游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)或微量元素。在另一个实施方案中,所述培养基不含任何一种以下组分:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。在另一个实施方案中,所述培养基不含低密度脂蛋白(LDL)、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、微量元素、胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。在另一个实施方案中,所述培养基是无血清的。
在一个实施方案中,培养基中钙的浓度在0.1mM-0.6mM之间。在另一个实施方案中,钙浓度为约0.5mM。在一个实施方案中,BSA的浓度为500微克/毫升。在另一个实施方案中,烟酰胺的浓度为5mM。在一个实施方案中,胰岛素的浓度为10纳克/毫升。在一个实施方案中,游离脂肪酸的浓度为7.6uEq/L。在一个实施方案中,EGF的浓度是100纳克/毫升。在一个实施方案中,肝生长因子的浓度为20微克/毫升。在一个实施方案中,乙醇胺的浓度是10-6M。在一个实施方案中,促甲状腺素释放因子的浓度为106M。在一个实施方案中,HDL的浓度为5微克/毫升。在一个实施方案中,氢化可的松的浓度是10-6M。
在一个实施方案中,该培养基是IM-HDM培养基,含有DMEM(高葡萄糖)、500微克/毫升BSA、7.6uEq/L游离脂肪酸(FFA)、5微克/毫升HDL、5mM烟酰胺、1×微量元素[1×10-7M铜、5×10-11M锌、3×10-10M硒]、100纳克/毫升EGF、10纳克/毫升胰岛素、5微克/毫升转铁蛋白、10-6M氢化可的松、2微克/毫升胰高血糖素、20微克/毫升肝生长因子、10-6M乙醇胺、10-6M促甲状腺素释放因子。在一个实施方案中,7.6uEq的总FFA包含如下组分的混合物:2.36μM棕榈酸(16∶0)、0.21μM棕榈油酸(顺16∶1n-7)、0.88μM硬脂酸(18∶0)、1.02μM油酸(顺-18∶1n-9)、2.71uM亚油酸(顺-18∶2n-6)、和0.43μM亚麻酸(顺-18∶3n-3)。该培养基还可含抗生素以防细菌生长,如1×青霉素/链霉素。
在另一个实施方案中,培养基含无血清培养基,其中包含牛血清白蛋白(BSA)、烟酰胺、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、转铁蛋白、和氢化可的松。
可将本发明组合物中的细胞混合物接种在涂布有细胞外基质的塑料基板上。细胞外基质组分的例子包括但不限于:胶原,如I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、或贴附蛋白质、纤连蛋白和层连蛋白、或Matrigel(ICN Biochemicals Inc.)。采用胶原蛋白时,可单用,或与纤连蛋白和层连蛋白联用,或与蛋白聚糖联用,或与富集了细胞外基质材料的组织提取物联用。细胞外基质也可由前述饲养细胞提供。这样的细胞混合物和细胞外基质组合可用于本发明的HCV试验。
本发明的细胞组合物可用来提可被HCV感染的体外培养物,因此为鉴定和快速筛选可用于治疗HCV感染病人和/或可用于HCV感染相关研究的化合物提供有用的体外培养***。因此,在优选的实施方案中,可将本发明的细胞组合物与RNA898或与之相当的HCV感染性等价物接触。RNA898感染性等价物指不同于RNA898的HCV株,在使按照本发明方法制备的组合物中的4×104个细胞与所述的HCV病毒接触之后72小时,它能够产生超过约5000拷贝,超过约10000拷贝,或超过50000拷贝的HCV RNA。按照一个实施方案,通过使本发明组合物在约37℃与RNA898或其感染性等价物接触约24小时来感染细胞,接触量为0.52毫升/平方厘米。按照本发明的一个实施方案,用细胞外基质培养接受HCV感染的细胞。在本发明的另一个实施方案中,所述细胞外基质由饲养细胞(如STO(Reid-99)细胞)提供。
本发明组合物中细胞产生的HCV量可通过测定例如HCV蛋白或核酸的产生来确定。例如,可定量测定与细胞相关的(即在细胞中或贴附在细胞上)和/或在培养该细胞的培养基中的HCV RNA的拷贝数。观察HCV蛋白质或核酸分子是否已经产生的技术是本领域已有的。例如,用针对HCV蛋白质的抗体检测蛋白质的免疫印迹法(Western blot)或检测与HCV核酸序列互补的核酸分子的凝胶印迹法。从细胞和细胞培养基提取蛋白质和核酸的方法是本领域熟知的,并且用于此目的的试剂盒可以买到。
为了更精确地定量按照本发明方法所产生的HCV颗粒拷贝数,可用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)。按照本发明的一个实施方案,对RT-PCR方法进行改进,以便通过以下方法测定HCV RNA的拷贝数:将它的值与已知量的第二核酸分子(以第二病毒或第二核酸分子的形式加入到待测定的细胞、细胞提取物和/或培养基样品中)进行比较。较好的是,第二病毒是与HCV密切相关或者第二核酸与HCV RNA密切相关(即,长度、核酸组成或病毒衣壳结构类似)。在一个实施方案中,第二核酸分子在黄病毒衣壳内。在一个实施方案中,第二RNA核酸分子是牛病毒性腹泻病毒(“BVDV”)的RNA,如BVDV NADL株(ATCC保藏号:VR-534)。
存在第二病毒或第二核酸分子的优点在于,它可用作内部对照用来定量测定第一核酸分子。该内部对照可监测和纠正随机发生的偏差和试验的变差。
例如,本发明提供的方法包括以下步骤:
1.将所述的HCV和已知量的牛病毒性腹泻病毒(“BVDV”)与本发明组合物混合,其中所述的BVDC含有第二核酸分子;
2.从该组合物的细胞或培养细胞的培养基中提取衍生自HCV的第一核酸和衍生自BVDV的所述第二核酸,形成混合核酸提取物;
3.在所述的混合核酸提取物中加入对所述第一核酸特异性的第一可检测探针和对所述第二核酸特异性的第二可检测探针;
4.用PCR方法扩增所述的混合核酸提取物;
5.定量测定所述扩增过程中不同轮次循环的分别由所述第一可检测探针和第二可检测探针释放的可检测信号量;
6.外推步骤(e)的结果,计算所述HCV中所述的第一核酸分子的量和BVDV中所述的第二核酸的量;
7.评价步骤(f)中所述第一核酸分子计算量的精确度:将步骤(f)中第二核酸的计算量与步骤(a)中第二核酸的已知量进行比较。
按照本发明的另一个实施方案,上述方法还包括:用一个系数调校步骤(f)中测定的所述第一核酸的计算量,该系数通过将步骤(f)中所述第二核酸的计算量与步骤(a)中所述第二核酸的已知量进行比较来确定。
按照另一个实施方案,本发明提供测定某化合物对HCV产生的影响的方法,包括以下步骤:在将HCV接种于本发明组合物之前或之后加入化合物,然后检测与组合物中细胞和/或培养受感染细胞的培养基相关的HCV。如果希望在HCV与组合物接触之后给予化合物,则最好在HCV与组合物接触后10天内给予该化合物。待用本发明方法测试的化合物可能抑制或激活HCV的产生。因此,化合物可能抑制HCV生命周期的任何阶段而发挥其作用。这类化合物的例子包括但不限于:合成的或纯化的化学化合物、蛋白质和核酸分子。可将加入了该化合物的样品与用相同条件处理但没有接触过该化合物或已接触过已知对HCV的产生极少或没有影响的另一种化合物的其他样品进行比较。
预计,本发明的细胞群将用于体外筛选试验,用来监测可能影响HCV感染肝细胞的化合物。此类方法可在多孔(如96-孔)板中进行。这些试验包括在合适的生长培养基和合适的容器中培养本发明的细胞群,任选地与饲养细胞层一起培养。然后使细胞与上述适当的HCV接触。评价在被测化合物存在或不存在情况下细胞受HCV感染的情况。可将不同浓度的被测化合物加到有或没有病毒的细胞共培养物中。而且,可在病毒生长周期的任何给定阶段使细胞接触测试化合物。例如,在某些实施方案中,可能需要在病毒感染细胞开始的同时(即,加入病毒的同时)使病毒粒子与化合物接触。或者,可能在病毒生命周期的较晚阶段(即,细胞已被病毒感染)加入化合物较适宜。在另一些实施方案中,可在加入病毒之前使细胞与测试化合物接触,以便测定测试化合物是否能预防病毒感染。病毒生命周期特定阶段的测定可用本领域技术人员熟知的方法进行。
选择被化合物的浓度,要求包括观察不到毒性作用的一些浓度,以及可观察到毒性作用的至少2个或多个更高浓度。例如,对0-300微摩尔范围多个测试化合物浓度进行试验可满足以上要求。在高于300微摩尔的浓度进行试验不仅可能,甚至更好,例如350微摩尔,400微摩尔,450微摩尔,500微摩尔,600微摩尔,700微摩尔,800微摩尔,900微摩尔,甚至在毫摩尔浓度。据估计,某化合物的治疗有效浓度可为试验浓度的上限提供初步指导。
在一例试验中,试验所用的测试化合物浓度范围包括在试验用培养基中产生以下被测混合物最终试验浓度的加样溶液:0.05微摩尔,0.1微摩尔,1.0微摩尔,5.0微摩尔,10.0微摩尔,20.0微摩尔,50.0微摩尔,100微摩尔和300微摩尔。如上所述,这些是示例性范围,任一项试验应进行至少4种不同的浓度,更优选包括4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15个或更多个被测化合物浓度。这些浓度可在被测组合物中产生以下培养基内纳入:例如0.05微摩尔,0.1微摩尔,0.5微摩尔,1.0微摩尔,2.0微摩尔,3.0微摩尔,4.0微摩尔,5.0微摩尔,10.0微摩尔,15.0微摩尔,20.0微摩尔,25.0微摩尔,30.0微摩尔,35.0微摩尔,40.0微摩尔,45.0微摩尔,50.0微摩尔,55.0微摩尔,60.0微摩尔,65.0微摩尔,70.0微摩尔,75.0微摩尔,80.0微摩尔,85.0微摩尔,90.0微摩尔,95.0微摩尔,100微摩尔,110.0微摩尔,120.0微摩尔,130.0微摩尔,140.0微摩尔,150.0微摩尔,160.0微摩尔,170.0微摩尔,180.0微摩尔,190.0微摩尔,200.0微摩尔,210.0微摩尔,220.0微摩尔,230.0微摩尔,240.0微摩尔,250.0微摩尔,260.0微摩尔,270.0微摩尔,280.0微摩尔,290.0微摩尔,300微摩尔。
待测化合物可包括天然化合物的片段或某些部分,或者是某些已知化合物的药物设计所得衍生物。提议用从天然来源例如动物、细菌、真菌、植物(包括叶和树皮)和海洋样品分离的化合物作为侯选化合物进行测试,寻找潜在的有用的药学化合物。或者,也可合成要进行毒性筛选的药用化合物(即人造化合物)。
待检测的化合物可以是抗病毒化合物、抗生素、消炎化合物、抗抑郁剂、镇痛剂、抗组胺药、利尿剂、抗高血压化合物、抗心律不齐药、治疗癌症的化疗化合物、抗微生物化合物等。
不论待测试细胞毒性的化合物是何类型或来源,可能需要检测化合物的生物活性以提示某一具体化合物或一组化合物的疗效。当然,具体的此类试验取决于所测试的具体治疗适应症。适应症包括例如HCV或其他病毒感染。
在优选的实施方案中,本发明的试验可用作新药开发的组成部分,用来鉴定具有更高抗HCV感染疗效的潜在治疗化合物。新药开发从鉴定大量表现为有望具备某方面目标疗效的候选物质开始。在示例性的实施方案中,可将示例性的核心或模板结构如VX-950用于后继的药物开发工作。其他结构也可能具有类似的用途,尤其是通过药物设计得出的抗HCV药物类结构。一旦选定了模板,为了提高化合物的效能,需进行进一步的化学和结构活性分析。这个过程可产生先导化合物(lead compound)。可在研究过程的这个阶段采用本发明方法进行筛选,以提供这些先导化合物的药效数据。选出顶尖的先导化合物进入临床前动物试验。在开发过程的早期采用本发明的选择方法可大大减少后期淘汰化合物数量。
使用本发明细胞群的体外筛选可应用于新药开发的任何阶段,但在早期特别有价值。从这类分析中得到的信息可向化学家提供适当的信息以便获得新模板的最大效力和药效。使用这些方法,可根据化合物的相对结合能力对候选疗效化合物进行评级或排序,并与相同治疗和相同化学类型的已知药物进行比较。例如,可将VX-950用作抗HCV新药的参比化合物。
VX-950的结构
本发明尤其关注用本发明细胞群进行大量化合物药效筛选的高通量试验。在某些实施方案中,高通量筛选是自动化的。在高通量筛选试验中,使多组化合物接触包含已被HCV感染的本发明细胞的细胞培养物和未被HCV感染的类似培养物。这些化合物组可用先前单独制备并保存在化合物库中的化合物集合来组建,可以是随机组建,也可以是用于形成类似结构的类似度程序所引导的组建。
此外,定向制备化合物和化合物库和/或化合物列阵的使用也越来越多。每个化合物库都含有大量经某一生物学靶(例如酶或受体)筛选的化合物。当发现某一生物学事件时,就可鉴定参与引起该事件的化合物。这样的化合物或先导化合物在筛选中通常显现相对弱的活性,但构成了进行更传统的药物化学程序以提高活性的基础。可利用发展迅猛的组合化学技术或通过平行合成来制备这些化合物库(DeWitt等人,ProcNatl Acad Sci,90,6909,1993;Jung等人,Angew Chem Int Ed Engl,31:367-83,1992;Pavia,Bioorg Med Chem Lett,3:387-96,1993)。
或者,待筛选的化合物可能来自以共同的模板或核心结构(如上述的VX-950结构)为基础的化合物库。这类技术地描述见例如,WO 95/32184(噁唑酮和阿米地纳(aminidine)模板)、WO 95/30642(二氢苯并吡喃模板)和WO 95/35278(吡咯烷模板)。该模板可有多个(例如3个)官能性位点,可以分步骤地让其中每个位点与多种(例如5种)不同的试剂反应,从而引入5×5×5种不同的替代项组合,产生一个125组分的库。该库通常含有全部或基本上全部可能的替代项的排列组合。模板可以是“有倾向性的(biased)”模板,例如包含已知药效团(如苯并二氮杂环)的模板,或是“无倾向性的”模板,即此类模板的选择更多地受化学考虑的影响,较少受生物学考虑的影响。
因此,本发明的细胞群和方法可用于在新药开发中鉴定先导化合物。除了上述化合物库筛选外,这类先导化合物也可以通过以下方式产生:对实验室中分别制备的单个合成化合物进行随机交叉筛选,或筛选从天然产物资源(如微生物代谢产物、海洋海绵(marine sponge)、植物)得到的提取物。
或者,可通过基于已知生物活性化合物的结构和/或他们的生物作用位点的药物设计来产生化合物,目前先进的计算机辅助药物设计技术为此提供了有力的技术支持。药物设计的目的是产生感兴趣的生物活性分子的结构类似物。这类技术可针对某一适应症或指示产生数千化合物,然后可在其中可用本发明方法进行抗HCV活性筛选。
按照一个实施方案,上述方法被用于同时筛选多种化合物对HCV产生的影响。例如,96-孔板的每个孔各含有一种有待用本发明方法筛选的不同化合物。在另一个实施方案中,本发明方法被用来鉴定能抑制HCV产生的化合物。
在一个实施方案中,用于本发明方法的引物和探针是根据HCV毒株最具保守性的区域设计的。也可以根据以下的附加标准来构建探针:a)探针的解链温度比引物高8-10℃;b)5’端没有G串;c)没有超过4个的G串;和/或d)探针不形成高解链温度的内部结构,也不自身或与任何引物形成双链。在一个实施方案中,整个PCR区域长约150个碱基对。
针对BVDV的5’UTR的引物和探针可根据上述标准组设计。此外,必须确保HCV的引物或探针与BVDV的引物或探针尽可能没有同源性。引物和探针可从合成和制备修饰的核酸分子的供应商处获得(如,Oligo and PE Applied Biosystem)。BVDV可通过感染MDBK细胞来维持。
本发明的一个实施方案使用了两种不同的双标记荧光(fluorogenic)探针,各自分别只对HCV核酸分子和第二核酸分子之一具有特异性。在另一个实施方案中,各荧光探针在5’端有一个报道染料(reporter dye),在3’端有一个猝灭染料(quencher dye)。选择这样两种不同的荧光探针使得它们能够各自产生可被检测到的不同荧光峰,且两峰之间没有交叉干扰。例如,如上所述,第一可检测探针的5’端可用诸如6羧基荧光素(“6FAM”)的报道染料标记,而第二可检测探针的5’端可用诸如VIC的报道染料标记。这两个可检测探针的3’端可用诸如6羧甲基若丹明(“6TAMRA”)的猝灭染料标记。这样,当结合于第一核酸和第二核酸时,探针5’端的报道染料与3’端的猝灭染料靠近而导致荧光衰减。在扩增过程中,当Tth聚合酶沿着该核酸序列移动时,其5’3’外切活性(action of 5’3’exo)切除了探针的猝灭染料,并将荧光探针降解。这导致荧光的发射,该荧光发射被作为扩增循环的函数而记录下来。这样,监测荧光发射为测定实时扩增动力学提供了基础。
可用于HCV基因型1的引物和探针的例子有:(SEQ ID NO:1)5’CCATGAATCACTCCCCTGTG3’(前向引物),(SEQ ID NO:2)5’CCGGTCGTCCTGGCAATTC3’(逆向引物),和HCV探针,(SEQ ID NO:5)5’6FAM-CCTGGAGGCTGCACGACACTCA-TAMRA3’。BVDV的探针和引物包含前向引物,(SEQ ID NO:3)5’CAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCG3’,逆向引物,(SEQ IDNO:4)5’GGCCTCTGCAGCACCCTATC3’,和探针,5’VIC(SEQ ID NO:6)-CCCTCGTCCACGTGGCATCTCGA-TAMRA3’。
RT和PCR反应可在带盖的96孔板透光托盘(PE Applied Biosystem,Foster City,CA)上相同的孔中进行。本发明的一个实施方案使用多重RT-PCR反应(即,在同一试管内同时扩增并测定两种不同RNA分子(例如HCV RNA和BVDC RNA)的RT-PCR反应)。该多重反应具有如下优点:使实验员能够确定HCV阴性结果是由于培养物真的是阴性还是由于在提取或RT-PCR步骤中的技术失误所致。可在50微升RT-PCR反应中扩增10或20微升病毒RNA或RNA标准品,反应系包含:1x Taqman EZ缓冲液(PE Applied Biosystem),3mM乙酸锰,dATP、dCTP、dGTP和dUTP各300mM,5单位Tth聚合酶(Epicentre),4.0%增强剂(Epicentre),一定浓度的探针和引物。TaqmanRT-PCR试验在60℃(RT)进行25分钟,在95℃5分钟,接着进行45轮的两步PCR反应(60℃1分钟,95℃15秒钟)。对于采用HCV和另一种核酸的试验(多重Taqman试验),HCV和BVDV引物的量可用这两组引物各种浓度构成的混合物矩阵(matrixmixture)来优化。最后的试验条件包括200nM的6-FAM-标记的HCV探针和VIC-标记的BVDV探针,400nM的两种HCV引物,45nM的两种BVDV引物。
在整个说明书和权利要求书中,词语“包含”或其变化形式“包括”或“含有”应理解为包括所述的整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。
2001年3月27日提交的美国临时申请60/279174和美国专利申请20020142449和本文引用论文的内容均纳入本文作参考。
虽然已提供了本发明的许多实施方案,但显然可以改变其基本结构来提供其他利用本发明组合物和方法的实施方案。因此,应理解,本发明的范围由权利要求书和说明书而不是本文所举例的具体实施方案来限定。
关于实施本发明的一般方法可在WO 02/077206找到。肝细胞分离和低温冻存的通用方法见Miltry,R.R.,Hughes,R.D.,和Dhawan,A.(2002).Progress in humanhepatocytes:isolation,culture & cryopreservation(人肝细胞进展:分离,培养和低温冻存),Cell & Developmental Biology 13,463-467。(大鼠)胎肝细胞分离的详细方法见:Arahyetes,R.M.,Sierra,E.,Codesal,J.,Barrutia,M.S.G.,Arza,E.,Cubero,J.,Ortiz,A.,和Magnanto,P.(2001).Optimization of the technique to isolate fetal hepatocytes,andassessment of their functionality by transplantation(分离胎肝细胞技术的优化及通过移植来评价其功能)。Life Sciences 68,763-772。
一旦筛选试验鉴定到适当的抗HCV药物后,可将该药物配制成药物组合物,并可进一步在HCV感染体内模型中进行测试。
在本发明的某些方面,可将进行选择和筛选试验所必需的所有组分包装在试剂盒中。具体说,本发明提供用于这种试验的试剂盒,该试剂盒包括包装好的用于进行该试验的一套试剂及测试或参比化合物,与这些试剂一起包装的关于用这些试剂进行本发明试验的一种或多种方式的说明书。该说明书可固定于各种有形介质,如印刷用纸张或计算机可读磁盘或光盘,或者,说明书指示一远程计算机数据源,例如互连网上的网页。
所有本文引用的文献内容都纳入本文作为参考。
实施例
以下实施例用来说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解,以下实施例所公开的技术代表了本发明人所发现的,在实施本发明中发挥良好功能的技术,因此可认为构成了实施本发明的优选模式。但是,本领域技术人员应知道,对本发明所公开的内容,所公开的具体实施方案可以作出许多改变,仍然可得到类似的结果,但这些均属于本发明的构思和范围内。
实施例1低温冻存
通过胶原酶消化,70微米过滤器过滤、然后三次低速离心,分离得人胎肝细胞。将细胞悬浮在DMEM(含10%FCS和10%DMSO)中,浓度为2×106/毫升,然后通过控速冷冻将细胞冷冻。将一小瓶细胞浸没在37℃水浴中解冻,悬浮在含10%FCS的DMEM中,低速离心沉降,重悬在10毫升含10%FCS的DMEM中,经一夜使细胞贴附在胶原包被的塑料板上。温和淋洗细胞单层从而将未贴附的细胞除去,然后用含有特定激素的培养基替换原培养基。用10x物镜和Hoffman Modulation Contrast optics摄取显微相片。见图1。
实施例2时间过程分析
将低温冻存的人胎肝细胞解冻,经一夜让它们贴附于胶原包被的96-孔板诸孔。除去未贴附的细胞,用含有特定激素的培养基(含DMEM、BSA、烟酰胺、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松)(HDM2)替换原培养基。各孔用HCV病毒接种,37℃培育8小时。除去未吸附的病毒,用HDM2洗培养物2次,然后加入新鲜的HDM2。在培养了一定时间(从开始接种起算)后,4个孔用PBS洗涤2次,然后用离液缓冲液(chaotropic buffer)溶解细胞,用Qiagen 96-孔Rneasy程序分离RNA。用多重RT-PCR方法定量HCV RNA,显示一式四份样品的平均值和标准误差(每孔的HCV拷贝数)。Dunnett试验结果的分析表明,接种后46和56小时收获的样品比早在22小时时间点收集的样品含有显著更多的HCV RNA。见图2。
实施例3HVC感染的抑制
将低温冻存的人胎肝细胞解冻,经一夜让它们贴附于胶原包被的96-孔板诸孔。除去未贴附细胞,用含有特定激素的培养基(含DMEM、BSA、烟酰胺、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松)(HDM2)替换原培养基。在不同浓度的VX-950的存在下,各孔用HCV病毒接种,37℃培育15小时。除去未吸附的病毒,用DMEM洗培养物2次,然后加入新鲜的含相同浓度VX-950的HDM2。再培育47小时后,各孔用PBS洗涤2次,然后用离液缓冲液溶解细胞,用Qiagen 96-孔Rneasy程序分离RNA。用多重RT-PCR方法定量HCV RNA,显示在每种抑制剂浓度下一式三份样品的平均值和标准误差(每孔的HCV拷贝数)。0.2微摩尔或更高的VX-950浓度表现为几乎完全抑制HCV的复制。见图3。
按照本发明公开内容,可以制备和实施本文公开的和主张的所有组合物和/或方法而无需过多的实验。虽然本发明的组合物和方法已经通过优选实施方案作了叙述,但本领域技术人员显然知道,可对本文叙述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤和步骤的顺序进行改变但不脱离本发明的构思和范围。更具体说,显然,可用化学和生理学相关的某些制剂代替本文所述的试剂,而可得到相同的或相似的结果。所有这些本领域技术人员知道的类似代用品和修改都属于本发明的构思、范围和概念内,如以下的权利要求书所限定的那样。
本文所引用的参考文献,就其对本文所述的内容所提供的示例性程序或其他补充内容的程度而言,都具体地纳入本文引为参考。
序列表
<110>威特克斯医药股份有限公司
<120>包含胎肝细胞的组合物及其用于HCV感染的方法
<130>063330
<150>US 60/526,411
<151>2003-12-01
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成引物
<400>1
ccatgaatca ctcccctgtg 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成引物
<400>2
ccggtcgtcc tggcaattc 19
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成引物
<400>3
cagggtagtc gtcagtggtt cg 22
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成引物
<400>4
ggcctctgca gcaccctatc 20
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成引物
<400>5
cctggaggct gcacgacact ca 22
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>合成引物
<400>6
ccctcgtcca cgtggcatct cga 23
Claims (56)
1.一种组合物,包含低温冻存的细胞混合物,该细胞混合物含有从孕后三月龄或更大龄人肝分离的肝细胞和造血细胞,含有4×104个所述冻存细胞混合物的解冻细胞,饲养细胞系和生长培养基的制品在接种HCV病毒RNA898的72小时后在培养基中产生约5000个以上拷贝的丙型肝炎病毒RNA即HCV RNA。
2.如权利要求1所述的组合物,其中,在含有4×104个细胞的制品中接种HCV病毒RNA898的72小时后,所述组合物产生约10000个以上拷贝的HCV RNA。
3.如权利要求1或2所述的组合物,其中,在含有4×104个细胞的制品中接种HCV病毒RNA898的72小时后,所述组合物产生约50000个以上拷贝的HCV RNA。
4.如权利要求1所述的组合物,其中,所述饲养细胞是STO(Reid 99)细胞,2001年3月27日保存在美国典型培养物保藏所10801 University Boulevard,Manssas,VA20110-2209;ATCC保藏号:PTA-3236。
5.一种通过以下步骤制备的包含细胞混合物的组合物:
(a)用蛋白酶处理孕后三月龄或更大龄的人肝细胞从而获得含于EGTA缓冲液中的肝细胞悬液,其中所述肝细胞悬液已经处理除去了40微米或更大的物体,并且所述肝细胞悬液不含红细胞;
(b)将肝细胞悬液重悬在10%DMSO和10%胎牛血清中;
(c)低温冻存步骤b的组合物;
(d)将步骤c的组合物解冻;
(e)将步骤(d)的细胞重悬在无血清培养基中,该培养基含有钙、游离脂肪酸、高密度脂蛋白、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松,并任选地含有选自以下的组分:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子;
(f)在步骤e的无血清培养基中培养所述细胞。
6.一种通过以下步骤制备的包含细胞混合物的组合物:
(a)用蛋白酶处理孕后三月龄或更大龄人肝细胞从而获得悬浮在含EGTA的缓冲液中的肝细胞悬液,其中所述肝细胞悬浮液已经处理除去了40微米或更大的物体,并且所述肝细胞悬液不含红细胞;
(b)将步骤(a)的细胞重悬在培养基中,该培养基含有BSA、烟酰胺、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松,并任选地含有选自以下的组分:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子;
(c)在步骤(b)的无血清培养基中培养所述细胞。
7.如权利要求6所述的方法,还包括:
(d)在步骤(b)之前,将步骤(a)的细胞低温冻存在含10%DMSO和10%胎牛血清悬液中;
(e)在步骤(b)重悬之前,解冻步骤(d)的组合物。
8.如权利要求5或6所述的组合物,所述肝细胞悬液的获得是通过将孕后三月龄或更大龄的人肝脏在含EGTA的缓冲液中切碎。
9.如权利要求8所述的组合物,其中所述含有EGTA的缓冲液用含有选自胶原酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶和分散酶的蛋白酶的缓冲液补充或替代。
10.如权利要求8所述的组合物,其中所述含有EGTA的缓冲液用含有选自胶原酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶和分散酶中的两种或多种蛋白酶的混合物的缓冲液补充或替代。
11.如权利要求9或10所述的组合物,其中所述含有EGTA的缓冲液还含有一种用来分解组织的糖成分的酶,所述酶选自透明质酸酶和神经氨酸酶(neuraminadase)。
12.一种通过以下步骤制备的包含细胞混合物的组合物,:
a)在含EGTA的缓冲液中切碎孕后三月龄或更大龄的人肝脏;
b)在含胶原酶的缓冲液中培育该切碎的肝脏,分离肝中的细胞;
c)除去分离细胞中的40微米或更大的物体;除去分离细胞中的红细胞;
e)将细胞重悬在10%DMSO和10%胎牛血清中;
f)低温冻存步骤5的组合物;
g)解冻步骤6的组合物;
h)将步骤(f)的细胞重悬在无血清培养基中,该培养基含有钙、游离脂肪酸、高密度脂蛋白、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松,并任选地含有选自以下的组分:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子;
i)在步骤e的无血清培养基中培养所述细胞。
13.一种通过以下步骤制备的包含细胞混合物的组合物:
a)在含EGTA的缓冲液中切碎孕后三月龄或更大龄的人肝脏;
b)在含胶原酶的缓冲液中培育该切碎的肝脏,分离肝中的细胞;
c)除去分离的细胞中的40微米或更大的物体;
d)除去分离的细胞中的红细胞;
e)将步骤(d)的细胞重悬在培养基中,该培养基含有BSA、烟酰胺、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松,并任选地含有选自以下的组分:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子;
f)在步骤(e)的无血清培养基中培养所述细胞。
14.如权利要求13所述的组合物,在步骤(d)和(e)之间还包含:
(g)将步骤(d)的细胞重悬在10%DMSO和10%胎牛血清中;
(h)低温冻存步骤(g)的组合物;
(i)解冻步骤(h)的组合物。
15.如权利要求5-14中任一项所述的组合物,其中该组合物还含STO(Reid 99)细胞。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物,其中,所述细胞混合物中的细胞能通过40微米过滤器。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物,其中,所述细胞混合物中包含以下细胞:表达甲胎球蛋白的细胞、表达白蛋白的细胞、和表达血型糖蛋白的细胞,但基本上不含表达CD34蛋白的细胞。
18.一种组合物,其包含分离自孕后三月龄或更大龄人肝脏的肝细胞和造血细胞的扩增混合细胞群,其中,所述混合细胞群经选择而不包含表达CD34+的细胞,但包含表达甲胎球蛋白、白蛋白和血型糖蛋白的细胞。
19.如权利要求18所述的组合物,其中,所述混合细胞群如下制备:用荧光活化扫描从孕后三月龄或更大龄人肝脏制得的细胞组合物中分离细胞群,所述FACS选择CD34-细胞。
20.如权利要求19所述的组合物,其中,所述混合细胞群如下制备:用荧光活化扫描从孕后三月龄或更大龄人肝脏制得的细胞组合物中分离细胞群,所述FACS选择白蛋白+细胞。
21.如权利要求19或20所述的组合物,其中,所述混合细胞群如下制备:用荧光活化扫描从孕后三月龄或更大龄人肝脏制得的细胞组合物中分离细胞群,所述FACS选择甲胎球蛋白+细胞。
22.如权利要求19-21中任一项所述的组合物,其中,所述混合细胞群如下制备:用荧光活化扫描从孕后三月龄或更大龄人肝脏制得细胞组合物中分离细胞群,所述FACS选择糖蛋白+细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物,其中,还包含含有以下成分的培养基:BSA、烟酰胺、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松。
24.如权利要求21所述的组合物,其中,所述培养基不含低密度脂蛋白;和/或所述培养基不含钙、FFA、HDL、微量元素胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺、或促甲状腺素释放因子;和/或所述培养基不含血清。
25.如权利要求1-24中任一项所述的组合物,其中,还包含细胞外基质。
26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物,其中,通过选自免疫荧光或免疫过氧化物酶染色的程序检测CD34蛋白的存在。
27.如权利要求1-26中任一项所述的组合物,还包含HCV。
28.如权利要求27所述的组合物,其中HCV是RNA898。
29.一种组合物,其包含培养基、BSA、烟酰胺、EGF、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松,并任选地不含有低密度脂蛋白,并任选地不含有选自以下的成分:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子。
30.一种分离和培养细胞混合物的方法,包括以下步骤:
(a)用蛋白酶孕后三月龄或更大龄人肝细胞从而获得悬浮在含EGTA的缓冲液中的肝细胞悬液,其中所述肝细胞悬液已经处理除去了40微米或更大的物体,并且所述肝细胞悬液不含红细胞;
(b)将步骤(a)的细胞悬液低温冻存在含10%DMSO和10%胎牛血清的组合物中;
(c)将步骤b的组合物解冻;
(d)将步骤(c)的细胞重悬在无血清培养基中,该培养基含有钙、游离脂肪酸、高密度脂蛋白、烟酰胺、微量元素、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白和氢化可的松,并任选地含有选自以下的组分:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子;
(e)在步骤(d)的无血清培养基中培养所述细胞。
31.一种分离和培养细胞混合物的方法,包括以下步骤:
(a)用蛋白酶孕后三月龄或更大龄人肝细胞从而获得悬浮在含EGTA的缓冲液中的肝细胞悬液,其中所述肝细胞悬液已经处理除去了40微米或更大的物体,并且所述肝细胞悬液不含红细胞;
(b)将步骤(a)的细胞重悬在包含BSA、烟酰胺、EGF、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松的培养基中;
(c)在步骤(b)的无血清培养基中培养所述细胞。
32.如权利要求31所述的方法,在步骤(a)和(b)之间还包括:
(d)将步骤(a)的细胞悬液低温冻存在含10%DMSO和10%胎牛血清的组合物中;
(e)在步骤(b)之前解冻步骤(d)的低温冻存细胞。
33.如权利要求30或31所述的方法,其中所述肝细胞悬液如下制得:在步骤(a)中将孕后三月龄或更大龄的人肝脏在含EGTA的缓冲液中切碎。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述的含EGTA的缓冲液用含有蛋白酶的缓冲液补充或替代,所述蛋白酶选自:胶原酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶和分散酶。
35.如权利要求33所述的方法,其中所述含EGTA的缓冲液用含有蛋白酶的缓冲液补充或替代,所述缓冲液含有选自胶原酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、和分散酶中的两种或多种蛋白酶的混合物。
36.如权利要求34或35所述的方法,其中所述EGTA的缓冲液还含有用来分解组织中糖成分的酶,所述酶选自透明质酸酶和神经氨酸酶。
37.如权利要求30-36中任一项所述的方法,其中如下除去红细胞:将悬浮的细胞在低速(50xg)离心约3-4分钟,使较大的细胞沉淀,洗涤沉淀细胞,并重复离心和洗涤步骤。
38.如权利要求30-37中任一项所述的方法,其中所述培养基不含低密度脂蛋白;和/或培养基不含钙、FFA、HDL、或微量元素;和/或培养基不含胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子;和/或培养基不是无血清培养基。
39.用HCV感染细胞的一种方法,包括以下步骤:使权利要求1-29中任一项所述的组合物或按照权利要求30-38中任一项制备的细胞混合物与HCV病毒RNA898或其感染性等价物接触。
40.如权利要求39所述的方法,其中以0.52毫升/平方厘米的量将HCV病毒加入到组合物中,在约37℃培育约24小时,然后洗涤组合物中的细胞。
41.一种测定HCV感染的方法,包括以下步骤:
(a)将权利1-29中任一项的组合物或权利要求30-36中任一项的细胞混合物与饲养细胞一起培育;
(b)使组合物中的细胞与RNA898或其感染性等价物接触;
(c)测定与组合物的细胞、培养该细胞的培养基、或细胞和培养基二者相关的HCV RNA的存在。
42.如权利要求41所述的方法,其中,所述饲养细胞是STO(Reid 99)细胞。
43.如权利要求41或42所述的方法,其中,如下测定HCV RNA的量:(a)将与细胞或培养该细胞的培养基相关的HCV RNA存在量与(b)用作内部对照的第二病毒的RNA量进行比较。
44.如权利要求43所述的方法,其中,所述第二病毒RNA得自牛病毒性腹泻病毒。
45.一种评价某化合物影响HCV产生的方法,包括如下步骤:
(a)将权利要求1-29中任一项的组合物或权利要求30-36中任一项的细胞混合物与饲养细胞一起培育;
(b)使组合物中的细胞与RNA898接触;
(c)在细胞与RNA898或其感染性等价物接触之前或之后,向该组合物中给予所述化合物;
(d)测定与细胞、培养该细胞的培养基、或细胞和培养基二者相关的HCV。
46.如权利要求45所述的方法,其中所述化合物能抑制HCV产生。
47.如权利要求45或46所述的方法,其中同时筛选多种化合物抑制HCV产生的能力。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法,还包括如下步骤:将步骤(d)的测定结果和与对照细胞、培养该对照细胞的培养基、或对照细胞和培养基二者相关的HCV量进行比较,其中使对照细胞也经历步骤(a)-(d),但是不给予化合物或给予已知无活性的化合物。
49.如权利要求45-48中任一项所述的方法,其中所述饲养细胞是STO(Reid 99)细胞。
50.如权利要求45-49中任一项所述的方法,其中通过测定与细胞或培养该细胞的培养基相关的HCV RNA的量来测定HCV的存在。
51.如权利要求45-50中任一项所述的方法,其中通过逆转录酶聚合酶链式反应来测定HCV RNA的量。
52.如权利要求45-51中任一项所述的方法,其中如下测定HCV RNA的量:将(a)与细胞或培养该细胞的培养基相关的HCV RNA量与(b)用作内部对照的第二病毒的RNA量进行比较。
53.如权利要求45-52所述的方法,其中所述第二病毒是牛病毒性腹泻病毒。
54.一种制备混合的肝细胞群的方法,包括:
(a)用蛋白酶处理孕后三月龄或更大龄人肝细胞从而获得悬浮在含EGTA的缓冲液中的肝细胞悬液,其中所述肝细胞悬液已经处理除去了40微米或更大的物体,并且所述肝细胞悬液不含红血细胞;
(b)分离所述肝细胞悬液中的CD34-/甲胎球蛋白+/糖蛋白+/白蛋白+细胞;
(c)将步骤(b)的细胞重悬在含BSA、烟酰胺、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松,并任选地含有选自以下组的组分的培养基中:胰高血糖素、肝生长因子、乙醇胺和促甲状腺素释放因子;
(d)将步骤(c)所述细胞在含饲养细胞的培养基中共培养以扩增所述肝细胞群。
55.如权利要求54所述的方法,包括将步骤(a)的细胞悬液或按照步骤(b)分离的细胞低温冻存在含10%DMSO和10%胎牛血清的组合物中;并在步骤(c)之前解冻所述低温冻存的细胞。
56.如权利要求54所述的方法,其中分离所述肝细胞悬液中的CD34-/甲胎球蛋白+/糖蛋白+/白蛋白+细胞的步骤包括用FACS分选肝细胞。
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