CN1909925A

CN1909925A - 一种免疫佐剂

Info

Publication number: CN1909925A
Application number: CNA2005800027003A
Authority: CN
Inventors: 王宾; 俞庆龄; 金华利; 康友敏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: GUANGDONG WENS DAHUANONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2005-01-19
Publication date: 2007-02-07
Anticipated expiration: 2025-01-19
Also published as: CN1909925B; WO2005079842A1

Abstract

本发明公开了一种免疫佐剂。本发明所提供的免疫佐剂是左旋咪唑，或左旋咪唑的衍生物，或左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与下述至少一种物质组成的组合物：白油、甘油、油酸、双十八烷基二甲基溴化铵或皂素。本发明的免疫佐剂能够有效地提高蛋白质疫苗，核酸疫苗，多肽疫苗和灭活疫苗激发机体完全免疫反应的能力，增强机体T细胞的免疫效果，延长保护期；本发明免疫佐剂的制备方法简单无需复杂的设备和操作步骤，易于实施，在医学领域中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。

Description

一种免疫佐剂

技术领域

本发明涉及一种免疫佐剂。

背景技术

提高机体免疫力是预防各种病原体感染的最主要的手段，一般可通过接种疫苗达到该目的，因而接种疫苗是预防各种病原体感染的有效措施之一。常见的病原体有病毒、微生物、真核细胞、寄生虫和环境因子等多种有机体和分子。目前已报道有多种方法可用来生产抗传染性病原体的疫苗，如灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗等，这些疫苗的基本作用原理是相同的，即借助与病原体结合的靶蛋白激发免疫反应，达到免疫个体不被传染性病原体感染的目的。当个体与传染性病原体接触时，其免疫***能够识别病原体蛋白而产生有效的保护反应抵抗传染。目前所用的多种疫苗就是由从病原体中分离出来的非传染性和低传染性的蛋白或核酸物质所组成。核酸疫苗的优点在于可以激活体液免疫反应和细胞免疫反应，而更有效地激发保护性和清除性的免疫反应，达到防治病原体感染，抗肿瘤，治疗自主免疫疾病和清除毒素引起的中毒症状等抵抗外来病源体的感染和内在病变，同时核酸疫苗因制备方便，成本低廉，安全性好等特点而备受推崇。但是核酸疫苗的缺点是在体内激活机体产生完全免疫反应的效率较低，单独使用还不能达到保护作用或保护性不稳定。补以激活、提高、调节核酸疫苗免疫反应的佐剂正是解决此问题的关键。

佐剂具有多种类型，按种类可分为溶性铝盐类佐剂（Glemiy, J. Path.

Bacteriol, 34, 267， 1926)、油水乳剂佐剂（如弗氏佐剂）、微生物及其代谢产物佐齐¹ J (R. Germanier, ed. , Bacterial Vaccines, Academic Press Inc. New York, 1984)、人工合成佐剂（Coughl in et al. , P. The Journal of Infectious Diseases, 171 : 1049-1052， 1995)、免疫刺激组合物（ISC0M)佐剂（Coughl in et al. , P. The Journal of Infectious Diseases, 171 : 1049-1052, 1995)、细胞因子类佐剂（Trinchieri G. Immunology 13 : 251 - 276, 1995)、核酸及其类似物佐剂（美国专利 6, 372, 227 ； Manmohan Singh & Derek 0' Hagan. Nature Biotechnology 17, 1075 - 1081， 1999 ; Virgi l EJC Schi jns. Current Opinion in I醒画 logy, 12 : 456 - 463, 2000)；按作用方式可分为三种： 1 ) 在接种部位形成抗原贮存库，使抗原缓慢释放，从而与免疫细胞较长时间接触并激发对抗原应答的佐剂； 2 ) 辅助抗原暴露并将能刺激特异性免疫应答的抗原表位提呈给免疫细胞的佐剂； 3 ) 诱导介导免疫应答的细胞因子释放的佐剂。

但是上述佐剂各存在一些问题，如其中大部分是针对提高抗体水平而开发设计的，但对机体的 T细胞免疫水平并没有促进；相反有的佐剂对 T细胞免疫还有较大抑制作用，从而使其在蛋白质、多肽和灭活疫苗应用上表现出免疫原性不强、细胞水平低下、保护期短等缺点，使得此类佐剂在应用上受到限制。发明公开

本发明的目的是提供一种可提高 τ细胞免疫水平的免疫佐剂。

本发明所提供的免疫佐剂，是左旋咪唑，或左旋咪唑的衍生物，或左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与下述至少一种物质组成的组合物：白油、甘油、油酸、双十八垸基二甲基溴化铵或皂素。

本发明的免疫佐剂的具体组成如下：

所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物。

所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与白油的组合物。所述白油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 20: 1-1 :20，优选的质量比为 10: 1-1:1。

所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与甘油的组合物。所述甘油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 5 :1-1 :5，优选的质量比为 2: 1-1 :2。

所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与油酸的组合物。所述油酸与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 5:1-1:5，优选的质量比为 2:1-1:2。

所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与双十八垸基二甲基溴化铵的组合物。所述双十八垸基二甲基溴化铵与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 20:1- 1:20，优选的质量比为 10:1- 1:5。

所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与皂素的组合物。所述皂素与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 20: 1-1 :20，优选的质量比为 10: 1-1 :5。

其中，所述左旋咪唑衍生物可为盐酸左旋咪唑或磷酸盐酸左旋咪唑。所述白油为食品用白油或注射用白油。

本发明的佐剂可和疫苗组成免疫组合物。所述疫苗可为蛋白质疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗或灭活疫苗。

所述蛋白质疫苗和多肽疫苗是人工合成的或者通过生物体生产的作为疫苗的特异性抗原物质。所述生物体为大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌或真核细胞等可在人工培养条件下生产放大的生物体。

所述灭活疫苗是将病原体经公知的方法灭活后作为疫苗的抗原物质。

所述免疫组合物可通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

所述免疫组合物可通过以下方法得到：将蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或灭活疫苗溶于含有质量百分浓度为 0.1%至 10%的左旋咪唑（或左旋咪唑衍生物）的生理盐水中；或者溶于含有质量百分浓度为 0.1%至 10%的左旋咪唑（或左旋咪唑衍生物）和质量百分含量为 1%至 20%的白油的生理盐水中；或者溶于含有质量百分浓度为 0. 1%至 10%的左旋咪唑（或左旋咪唑衍生物）和质量百分浓度为 1%至 10%的甘油的生理盐水中；或溶于含有质量百分浓度为 0. 1%至 10% 的左旋咪唑（或旋咪唑衍生物）和质量百分含量为 0. 1%至 5%的油酸的生理盐水中；或溶于含有质量百分浓度为 0. 1%至 10%的左旋咪唑（或左旋咪唑衍生物）和质量百分浓度为 0. 1%至 10%的双十八垸基二甲基溴化铵的生理盐水中；或溶于含有质量百分浓度为 0. 1%至 10%的左旋咪唑（或左旋咪唑衍生物）和质量百分浓度为 0. 1%至 5%的皂素的生理盐水中，使蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或灭活疫苗的终浓度为 1至 200微克 I毫升。

本发明的免疫佐剂与相应疫苗一起使用，可增强机体对以下致病病原体的免疫应答能力：病毒、原核细胞、真核细胞。其中，真核细胞病原体包括单细胞致病病原体和多细胞寄生虫类。病毒性病原体包括但不局限于呼吸道病毒（流感和轮状病毒）、疮疹病毒（德国麻疹、水痘、牛痘、天花、带状疮疹等）、中枢神经***病毒（沅病毒）、免疫***病毒（艾滋病毒）、生殖***病毒（尖锐湿疣）、动物病毒（***病毒、猪瘟病毒、禽流感病毒、新城疫病毒）。附图说明

图 1为 PCR扩增的 FMDV VP1基因的 1 %琼脂糖凝胶电泳图谱

图 2为对重组表达载体 SuperY/VPl进行酶切鉴定的电泳图谱

图 3为 VP1基因表达产物的 SDS- PAGE图谱

图 4为 Western- blot实验检测 VP1蛋白的表达图谱

图 5为 VP1 蛋白与不同佐剂形成的免疫组合物免疫小鼠产生的抗体滴度变化曲线

图 6为 146S抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生 T细胞特异性扩增的影响

图 7 为猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生的抗体滴度比较

图 8 为猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠的 T 细胞特异性扩增活性比较

图 9 为猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠的迟发性免疫反应的比较

图 10为 146S抗原免疫过的 BABL/C小鼠 T细胞增殖的结果

图 11为 146S抗原免疫过的 C57BL/6小鼠 T细胞增殖的结果

图 12为猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ) 抗原免疫过的 BABL/C小鼠 T细胞增殖的结果图 13 为猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ) 抗原免疫过的 C57BL/6小鼠 T 细胞增殖的结果

图 14为在 HPRT看家基因定量调节后 cDNA浓度的电泳图

图 15为免疫过 146S抗原的 BABL/c小鼠表达 IL- 4、 IL-10、 IL-2和 IFN- γ 的电泳图

图 16为 Bio- Rad Image 软件分析免疫过 146S抗原的 C57BL/6小鼠的 IL - 4、 IL-10、 IL- 2和 IFN- γ表达的结果

图 17为 Bio-Rad Image 软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的 BABL/c小鼠的 IL- 4、 IL- 10、 IL- 2和 IFN-γ表达的结果

图 18为 Bio-Rad Image 软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的

C57BL/6小鼠的 IL- 4、 IL_10、 IL- 2和 IFN- γ表达的结果

图 19为免疫过 146S 抗原的 BABL/c小鼠表达 MHC、共刺激分子的电泳图图 20为 Bio- Rad Image软件分析免疫过 146S抗原的 C57BL/6小鼠的 MHC、共刺激分子表达的结果

图 21 为 Bio- Rad Image 软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的

BABL/c小鼠 MHC；、共刺激分子表达的结果

图 22 为 Bio- Rad Image 软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的 C57BL/6小鼠的 MH (：、共刺激分子表达的结果

图 23为 Bio-Rad Image软件分析免疫过 146S抗原的 BABL/c小鼠的 S0CS1 和 S0CS3表达的结果

图 24为 Bio-Rad Image软件分析免疫过 146S抗原的 C57BL/6小鼠的 S0CS1 和 S0CS3表达的结果

图 25 为 Bio- Rad Image 软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的 BABL/c小鼠的 S0CS 1 和 S0CS3表达的结果

图 26 为 Bio- Rad Image 软件分析免疫过猪生殖与呼吸综合征病毒抗原的

C57BL/6小鼠的 S0CS1 和 S0CS3表达的结果

图 27为鸡新城疫病毒抗原免疫过的 BABL/C小鼠 T细胞增殖的结果

实施发明的最佳方式

下述实施例中所提到的实验方法如无特别说明，均为常规方法；所提到的百分含量如无特别说明均为质量百分含量。

实施例 1、牛*** （FMDV) VP1蛋白疫苗的制备

一、牛*** VP1的 cDNA克隆

感染牛***病毒的口腔病变组织，利用 RNA提取试剂盒（购自上海生物工程公司）采用异硫氰酸胍一步法按照试剂盒的说明提取病毒总 RNA，具体步骤如下：取病变组织破碎分离细胞，加入 0.5mL异硫氰酸胍溶液， 0.5mL的苯酚 / 氯仿 /异戊醇（25: 24： 1) 溶液， 4V 12000rpm离心 5分钟，将上清液移至一新的 1.5毫升塑料离心管中，加等量的异丙醇， - 20°C放置 30分钟， 12000rpm 离心 10分钟，弃去上清液，沉淀用 70%乙醇清洗，沉淀干燥后溶于 30u LDEPC 处理水中，变性琼脂糖凝胶电泳检测结果表明得到病毒 RNA。

在如下反应条件下合成第一链 cDNA: 2μ g牛***病毒 RNA， 50mmol/L Tris-HCl (pH8.3) ， 75議 ol/LKCl, lOmmol/L DTT ， 3mmol/L MgCl₂, 500 μ mol/L dNTPs, 100 μ g随机六聚体引物， 500单位匪 LV反转录酶，总体积 20 L， 37 °C保温 lh。以第一链 cDNA产物为模板，在引物 1: 5' -AAG_

AATTCGGAGGTACCACCTCTGCGGGTGAG-3 ' ；和引物 2:

5， -AATCTAGACCTCCGGAACCCAGAAGCTGTTTTGCGGG-3' , (在引物 1和引物 2，分别引入 EcoRl识别位点和 ¾ l识别位点）的引导下 PCR扩增牛***病毒 VP1的 cDNAo反应体系： 5μ L第一链 cDNA产物，引物 1和引物 2各 lOpmol, 500mM KCl, lOOmM Tris-HCl (pH8.4) ， 1.5mM MgCl₂, 100 μ g/mL BSA， ImM dNTPs, 2.5U Taq DNA聚合酶，总体积为 50 L。反应条件为： 94Ό 变性 30秒， 54°C 复性.30秒， 72 °C 延伸 1分钟，共 30个循环。 PCR 扩增的 FMDV VP1基因的 1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1所示（泳道 M为 DNA Marker; 泳道 1为 PCR产物），图中箭头所指为目的条带的位置，表明目的片段的大小为 639bp,与 VP1基因片段大小一致，用低熔点胶回收该扩增片段。

二、表达载体 SuperY/VPl的构建与鉴定

用限制性内切酶 οΛΊ和 ¾al酶切步骤一获得的*** VP1 cDNA片段，电泳，回收后，将 VP1基因片段克隆入穿梭质粒 SuperY (在购自美国 Invitrogen 公司的质粒 pGAPZa的 Sphl和 Hpal位点上加入卡那霉素抗性基因（Kan ^r) 得到 SuperY的 EcoRl和 al酶切位点之间，再用 EcoRl和 ¾al限制性内切酶对重组载体进行酶切鉴定，将酶切产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图 2所示（泳道 M为 DNA Marker; 泳道 1为酶切产物），其中的小片段大小为 639bp，与 VP1基因片段大小一致，表明 VP1已正确克隆至 SuperY上，并将该重组载体命名为 SuperY/VPl，然后将 SuperY/VPl转化大肠杆菌 ToplO F '感受态细胞，筛选鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行序列分析，结果表明扩增产物的核苷酸序列与 VP1基因一致，并已成功克隆至 SuperY质粒中。

三、 VP1基因在酵母中的表达及其表达产物的检测

将步骤二构建的重组表达载体 SuperY/VPl采用电击法转化酵母 SMD1168，筛选鉴定阳性克隆，挑取单菌落 30°C摇瓶培养 48-96小时后（同时设酵母 SMD1168和转化有 SuperY的酵母 SMD1168为对照），取上清变性后进行 SDS- PAGE 电泳，经考马斯亮蓝 G250染色后，用凝胶成像***照相，结果如图 3所示（泳道 1 : 酵母 SMD1168上清；泳道 2: 转化有 SuperY的酵母 SMD1168的表达上清；泳道 3: 转化有 SuperY/VPl的酵母 SMD1168表达上清；泳道 M: 低分子量蛋白标准），由泳道 3可知 VP1的表达产物为两种，分子量分别为 66kD和 43kD，表明 SuperY/VPl中的 VP1基因在酵母细胞中获得表达。再将该重组表达载体 SuperY/VPl的表达产物进行 Western blotting分析，具体方法为：将表达的蛋白变性后，用 SDS-PAGE 分离蛋白质，再将其电转移至 NC膜，用 5%脱脂牛奶作封闭剂，然后依次用牛抗***病毒高免血清（购于新疆建设兵团兽医总站）、羊抗牛 IgG- HRP酶标抗体（美国 Sigma公司购买处）孵育，最后在 DAB/H₂0₂下显色，结果如图 4所示（泳道 M: 低分子量蛋白标准；泳道 1 : 转化有 SuperY/VPl 的酵母 SMD1168表达上清；泳道 3: 酵母 SMD1168上清；泳道 4: 转化有 SuperY 的酵母 SMD1168的表达上清），泳道 1在 66kD和 43kD附近出现了特异性的显色带，而泳道 2和 3均未出现条带，表明表达的蛋白能与抗 FMDV血清反应产生特异性反应带，表达的蛋白产物具有 FMDV的免疫原性。表达的上清经脱盐纯化后保存在一 20°C，可作为牛*** VP1蛋白疫苗。

实施例 2、动物免疫实验

抗原及佐剂的配制：

1、 146S抗原的制备：去除牛*** 0型灭活疫苗（购自兰州兽医研究所）中的矿物油， 4°C保存。

2、猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV) 抗原的制备：去除购自哈尔滨兽医研究所的生殖与呼吸综合症病毒灭活疫苗中的矿物油， 4°C保存。

3、灭活的 Lasota新城疫病毒抗原购自于北京生物制品厂， 4°C保存。

4、 VP1蛋白：纯化后的 VP1蛋白质溶于 0. 9%生理盐水中， 4°C保存。

5、灭活禽流感病毒 H5N1疫苗（购买于哈尔滨兽医研究所）除去乳剂， 4°C 保存。

6、注射用白油购自中国石化集团杭州炼油厂。

7、皂素（Saponin)购自美国 Sigma公司。

8、左旋咪唑衍生物盐酸左旋咪唑、或磷酸左旋咪唑（南京白敬义制药厂）。以上抗原，用 Bradford 法进行蛋白定量。

使用时，以上抗原和本发明的佐剂均溶于 0. 9°/。的 NaCl水溶液（生理盐水）中。

一、小鼠免疫实验

1、小白鼠抗***抗体时效的检测

将盐酸左旋咪唑溶于 0. 9% NaCl溶液中，配置成以下浓度的佐剂： 0. 5%盐酸左旋咪唑、 1%盐酸左旋咪唑、 1%注射用白油 + 1%盐酸左旋咪唑、 5%注射用白油 + 1%盐酸左旋咪唑、 1%甘油 + 1%盐酸左旋咪唑、 5%甘油 + 1%盐酸左旋咪唑、 0.5%油酸 +1%盐酸左旋咪唑、 0.5%双十八垸基二甲基溴化铵 + 1% 盐酸左旋咪唑、 1%双十八垸基二甲基溴化铵 + 1%盐酸左旋咪唑、 0.5%皂素 + 1%盐酸左旋咪唑、 1%皂素 + 1%盐酸左旋咪唑。将 6-8周龄 BALB/c(H- 2^d)雌性小鼠（14组，每组 6只，含空白对照组和阴性对照组），阴性对照组组肌肉注射 1%注射用白油和含 20微克 146S抗原的组合物 100微升，空白对照组注射 0.9% NaCl溶液 100微升，其余 12组分别肌肉注射含 20微克 146S抗原与上述不同佐剂的组合物 100微升，第一次免疫后第 14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第 14、 28、 56和 80天取血清用 ELISA法测定其抗体滴度，检测方法为：将 96孔酶标板用 8ug /ml抗原包被， 4°C过夜， 3%小牛血清 37°C 封闭 1 h; PBST (0.05% Tween20 溶于 PBS) 洗涤 3次，每次 5分钟；加入不低于 1:100稀释度的免疫动物（小鼠）血清，以未免疫的小鼠血清作对照， 37°C 孵育 2小时； PBST洗板三次后，每孔辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG (二抗， Sigma, St. Louis) ΙΟΟμΙ, 37Ό孵育 1小时后弃去， PBST洗涤 3次， .每次 5分钟； PBST洗三次，加入底物 TMB液 100μ1，室温显色反应 30分钟， 2Μ硫酸中止反应，用酶标仪测定 0D₄₅。_/62。光密度值，实验孔的 0D值达到对照孔 0D值的两倍时认为是阳性。结果如表 1所示：

抗***抗体滴度的时效变化

免疫佐剂组 14天 28天 56天 80天未免疫 0 0 0 0

1%注射用白油 2000 4000 8000 4000

0.5%盐酸左旋咪唑 4000 4000 8000 4000

1%盐酸左旋咪唑 4000 4000 8000 8000

1%注射用白油 + 1%盐酸左旋咪唑 4000 4000 8000 8000

5 %注射用白油 + 1 %盐酸左旋咪唑 4000 4000 8000 16000

1%甘油+ 1%盐酸左旋咪唑 4000 4000 8000 8000

5%甘油 + 1%盐酸左旋咪唑 4000 4000 16000 16000

0.5%油酸 + 1%盐酸左旋咪唑 4000 4000 8000 8000

0.5%双十八烷基二甲基溴化铵 + 1%盐酸左旋咪唑 4000 8000 32000 16000

1%双十八烷基二甲基溴化铰 + 1%盐酸左旋咪唑 4000 8000 32000 32000

0.5%皂素 + 1%盐酸左旋咪唑 4000 8000 16000 16000 1 %皂素 + 1 %盐酸左旋咪唑 4000 8000 32000 16000 表 1 表明，利用盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑 +注射用白油、盐酸左旋咪唑 +甘油、盐酸左旋咪唑 +双十八垸基二甲基溴化铵、盐酸左旋咪唑 +皂素为佐剂，与传统的矿物油佐剂（注射用白油）相比抗体滴度在时效上明显提高，且抗体滴度出现早。

2、比较 SuperY/VPl 重组质粒表达产物 VP1抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生抗体滴度的变化

将 24只 6-8周龄 BALB/c (H-2^d )雌性小鼠均分两组，一组肌肉注射含 1 %盐酸左旋咪唑与实施例一获得的牛*** VP1蛋白（20微克）的组合物 100微升，另一组肌肉注射含 1 %注射用白油和 20微克牛*** VP1蛋白的组合物 100微升进行免疫，第一次免疫后第 14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第 14、 28、 42和 56天取血清用 ELISA法测定其抗体滴度，检测方法与步骤 1相同，结果如图 5所示（◊: 牛*** VP1蛋白 + 1 %注射用白油，〇： VP1 蛋白 +1 %盐酸左旋咪唑），表明盐酸左旋咪唑或油佐剂与 VP1 蛋白的组合疫苗均能刺激特异性抗体产生，但以盐酸左旋咪唑为佐剂的疫苗抗体滴度较高。

3、比较*** 146S抗原与不同佐剂组成的免疫组合物免疫小鼠产生 T细胞特异性扩增的影响

将 60只 6-8周龄 BALB/c (H-2d)雌性小鼠均分两组，第一组肌肉注射含 50 %注射用白油和 20微克 146S抗原的疫苗组合物 100微升；第二组肌肉注射含 20微克抗原 146S和 1 %盐酸左旋咪唑的组合物 100微升。第一次免疫后第 14 天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第 14天取脾脏 T细胞测定其 T细胞扩增活性，具体方法为：在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用 PBS 液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到 1 X 10⁶个 /ml,将每组细胞悬液分三份加入 96孔培养板中。其中一份加入 ΙΟΟμΙ刀豆蛋白（Con-A)至终浓度为 5 g/ml，一份加入相应的特异性抗原（146S 抗原）作为刺激物至终浓度为 2 g/ml，另一份不加刺激物， 24 小时后，每孔加入 ΙΟΟμΙ ΜΤΤ至终浓度为 5mg/ml， 48h后，每孔加入 ΙΟΟμΙ SDS- DMSO (20% SDS 溶于 50%DMS0， pH2. 0)，使其完全溶解，孵育 4h后，在酶标仪上读取 570nm处的 0D值，计算刺激指数（SI =实验刺激数 _÷非刺激数）。结果如图 6所示，表明利用盐酸左旋咪唑作为***病毒灭活疫苗的佐剂，与其相应的油佐剂疫苗相比，其 T细胞扩增活性明显提高于其油佐剂灭活疫苗。图 6中， ConA表示阳性对照。

4、比较猪生殖与呼吸综合征病毒抗原与不同佐剂形成免疫组合物后免疫小鼠产生抗体的影响将 60只 6-8周龄 BALB/c(H- 2^雌性小鼠均分为五组，每组分别肌肉注射含 20微克猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)抗原和下述佐剂之一的组合物 100微升进行免疫，所述佐剂为： 50%注射用白油、 0.5%盐酸左旋咪唑、 1%盐酸左旋咪唑、 2%盐酸左旋咪唑或 1%盐酸左旋咪唑 + 0.5%甘油。第一次免疫后第 14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第 28、 42、 56、 63、 77和 84天取血清用 ELISA法测定其抗体滴度，检测方法与步骤 1相同，结果如图 7 所示，表明利用不同浓度的盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑 +甘油为佐剂，与传统的注射用白油佐剂相比抗体滴度在时效上明显提高。

5、比较猪生殖与呼吸综合征病毒抗原与不同佐剂形成免疫组合物后免疫小鼠 T 细胞特异性扩增的影响

将 72只 6-8周龄 BALB/c(H- 2d)雌性小鼠均分为七组，分别肌肉注射含 20 微克生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV) 抗原和下述其中一种佐剂的组合物 100微升，所述佐剂为：无佐剂， 50%注射用白油， 0.25%盐酸左旋咪唑， 0.5%盐酸左旋咪唑、 1%盐酸左旋咪唑、 2%盐酸左旋咪唑、 1%盐酸左旋咪唑 + 0.5%甘油。第一次免疫后第 14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第 14 天取脾脏 τ细胞测定其 T细胞扩增活性，具体方法除刺激物为猪生殖与呼吸综合征病毒抗原外，其它与步骤 3相同，结果如图 8所示，表明用不同浓度的盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑 +甘油为佐剂，与传统的注射用白油佐剂相比 T 细胞扩增活性明显提高。图 8 中， BSA表示阴性刺激物对照， none表示无佐剂， oil表示 50%注射用白油， LMS表示盐酸左旋咪唑。

6、比较猪生殖呼吸综合征病毒抗原与不同佐剂形成免疫组合物后免疫小鼠迟发性免疫反应的影响

将 60只 6-8周龄 BALB/c(H- 2d)雌性小鼠均分为五组，每组分别肌肉注射含 20 微克猪生殖与呼吸综合症病毒（PRRSV) 抗原和下述其中一种佐剂的组合物 100微升进行免疫，所述佐剂为： 50%注射用白油、 0.5%盐酸左旋咪唑、 1%盐酸左旋咪唑、 2%盐酸左旋咪唑、 1%盐酸左旋咪唑 + 0.5%甘油。第一次免疫后第 14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第 7天在小白鼠左脚掌内注射 20微克猪生殖呼吸综合征病毒抗原，右脚掌内注射生理盐水，于脚掌注射后 0， 24, 36和 72小时测定其脚掌厚度，结果如图 9所示，表明利用不同浓度的盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑 +甘油为佐剂，与传统的矿物油佐剂相比其迟发性免疫反应相当，但比注射生理盐水对照明显提高。

7、抗体效价的检测、不同佐剂的免疫组合物对小鼠 T 细胞特异性扩增的影响、免疫小鼠细胞因子的表达

实验分 BALB/c小鼠（126只）和 C57BL/6小鼠（126只）两大组，所用小鼠免疫抗原分别为***（FMD) 灭活病毒抗原 146S和猪生殖与呼吸综合征病毒 ( PRRSV ) 抗原。每大组再分为 1， 2， 3， 4， 5， 6和 7组共七个处理组，每组 18只小鼠，其中 9只免疫 146S 抗原， 9只免疫猪生殖与呼吸综合征（PRRS)病毒抗原， 1组为对照组，只注射 100微升含 20微克小鼠免疫抗原的 0. 9% NaCl溶液； 2组注射含 20微克小鼠免疫抗原和 50 %注射用白油组合物 100微升； 3组肌肉注射含 20微克小鼠免疫抗原和 0. 25 %盐酸左旋咪唑组合物 100微升； 4组肌肉注射含 20微克小鼠免疫抗原和 0. 5 %盐酸左旋咪唑组合物 100微升； 5组肌肉注射含 20微克小鼠免疫抗原和 1 %盐酸左旋咪唑组合物 100微升； 6组肌肉注射含 20微克小鼠免疫抗原和 2 %盐酸左旋咪唑组合物 100微升； 7组肌肉注射含 20微克小鼠免疫抗原和 1 %盐酸左旋咪唑 + 1 %甘油组合物 100微升。第一次免疫后第 14天再以同等剂量加强免疫一次，每组取 3只进行小白鼠抗口蹄疫抗体和猪生殖与呼吸综合征灭活病毒抗体效价的检测；每组再取 3 只小鼠测定以上组合物对 T 细胞特异性扩增的影响；对每组余下的 3只小鼠用 RT- PCR方法检测细胞因子、 MHC、共刺激分子和 S0CS的表达，具体方法如下：

于第一次免疫后第 28、 42、 56、 70和 84天，分别从每组中取出 3只小鼠的血清用 ELISA法测定其血清 IgG水平，检测方法与步骤 1相同，结果如表 2 所示- 抗体效价结果

免疫抗体效价

疫苗小鼠组别 28天 42天 56天 70天 84天

146S BALB/C 1 8000 8000 4000 2000 400

2 16000 32000 16000 4000 800

3 4000 8000 4000 2000 400

4 8000 16000 8000 2000 400

5 16000 32000 16000 2000 800

6 32000 64000* 4000 4000 1600

7 8000 2000 16000 8000* 1600

146S C57BL/6 1 4000 8000 2000 800 200

2 8000 16000 16000 1600 800

3 4000 8000 4000 800 200

4 4000 8000 4000 800 200

5 16000 16000 8000 1600 400

6 16000 32000* 8000 1600 800

7 8000 16000 8000 3200* 800

PRRS BALB/C 1 4000 8000 4000 1000 400

2 8000 16000 8000 4000 800 3 4000 8000 4000 2000 400

4 8000 16000 8000 2000 400

5 8000 16000 16000 4000 400

6 16000 32000* 16000 4000 800

7 8000 16000 16000 8000* 16000

PRRS C57BL/6 1 2000 4000 2000 400 100

2 4000 8000 8000 1600 800

3 2000 4000 2000 400 100

4 4000 8000 2000 400 200

5 4000 8000 4000 800 400

6 8000 16000 * 4000 1600 800

7 4000 8000 8000 3200* 1600

表中的 *表示 p<0.05。

表 2表明 2%盐酸左旋咪唑组和 1%盐酸左旋咪唑 + 1%甘油组合物组抗体滴度显著地高于注射用白油佐剂组，同时在 1%盐酸左旋咪唑 + 1%甘油组合物组抗体延长时间最长。而其它浓度盐酸左旋咪唑组的抗体滴度与注射用白油组佐剂组相当。

于加强免疫后第 7天每组分别取 3只免疫 146S 抗原、 3只免疫猪生殖与呼吸综合征（PRRS)病毒抗原的小鼠，取脾脏 T细胞测定其 T细胞扩增活性，具体方法除刺激物为猪生殖与呼吸综合征病毒或 6S抗原外，其它与步骤 3相同，结果如图 10-图 13所示，表明用不同浓度的盐酸左旋咪唑作佐剂组与传统的注射用白油组佐剂组相比， T 细胞扩增活性明显提高。图 10-图 13 中的 *表示 p<0.05。

于第二次免疫后第 7天取脾脏，提取总 RNA (TRIZ0L, 鼎国生物公司），反转录为 cDNA,反转录依照大连宝生物公司 RNA RT- PCR操作指南，取纯化的 1μ_§ 总 RNA置 250μί 离心管中，然后依次加入相关试剂： 4μ1 MgCl₂， 2μ1 10X缓冲液， 8.5μ1 DEPC水， 2μ1 dNTP 混合物， 0.5μ1 RNase inhibitor, 0.5μ1 M-MLV 反转录酶 (Promage) , 0.5 μΐ Oligo (dT) _ι2引物; 反应条件为 42 °C 30min, 99 °C 5min, 5°C 5min。用看家基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT) 为内源表达标准，将各组 cDNA浓度调为一致，如图 14所示（泳道 1-7分别为 1-7处理组），然后取 2μ1的 cDNA进行 PCR扩增以下四种细胞因子基因： IL-2基因， IFN- γ 基因， IL-4基因和 IL-10基因。其中，反应所需引物和 PCR反应条件如表 3所示。（由于看家基因 HPRT在体内恒定表达，以它为内源表达标准的模板对照）表 3.HPRT, IL-2, IFN-γ, IL- 4和 IL- 10的引物序列及 PCR反应参数

目的基因引物反应条件 HPRT 5' GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG 94°C 30 sec, 60°C 30 sec and

3' GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT 72°C 40 sec

IL-2 5' TCCACTTCAAGCTCTACAG 94°C 30 sec, 55°C 30 sec and

3' GAGTCAAATCCAGAACATGCC 72°C 40 sec

IFN-γ 5' CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG 94°C 30 sec, 58。C 30 sec and

3' CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG 72°C 40 sec

IL-4 5' GAAAGAGACCTTGACACAGCTG 94°C 30 sec, 54。C 30 sec and

3' GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG 72°C 40 sec

IL-10 5' CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG 94°C 30 sec, 56°C 30 sec and

₃, TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA 72°C 40 sec

电泳检测 PCR产物结果如图 15所示（泳道 1-7分别为 1-7处理组），将电泳图用 Bio-Rad Image 软件（Quantity One 4. 2. 0)分析作图，结果如图 16-图 18所示，表明 0. 5%或 0. 25%盐酸左旋咪唑佐剂组免疫后可以产生高水平的 IL - 2 和 IFN- γ ( Thl型免疫反应），而低水平的 IL- 4 (Th2型免疫反应）和 IL- 10 (免疫抑制因子）。相反，2%盐酸左旋咪唑佐剂组免疫后产生高水平的 IL- 4和 IL- 10，但低水平的 IL-2和 IFN-_Y。而在注射用白油组佐剂组产生低水平的 Thl和 Th2 细胞因子。但是却产生了高水平的 IL-10。说明注射用白油组佐剂组不仅未能激活 T细胞，反而产生了抑制 T细胞水平的 IL-10。

以上一段合成的 2 μ 1 cDNA为模板 PCR扩增 MHCI、 MHCII、 CD40、 CD80、 CD86、 S0CS1和 S0CS3基因。引物序列及 PCR反应条件如表 4所示，电泳检测结果如图 19所示（泳道 1-7分别为 1-7处理组），将电泳图用 Bio-Rad Image软件（Quantity One 4. 2. 0)分析作图，结果如图 19-图 26所示，表明盐酸左旋咪唑佐剂组免疫后可以产生高水平的 MHC-I 和 MHC-II。相反， MHC- 1 和 MHC- II表达在注射用白油组佐剂组为最低。由于 MHC分子在免疫 T细胞激活过程中起到重要作用，而白油组佐剂在此过程中同样未能起到作用。另外一类共刺激分子 CD40, CD80, 和 CD86在 0. 5%盐酸左旋咪唑组合物组免疫后产生了高水平的表达，说明 0. 5 % 盐酸左旋咪唑在增强 T细胞免疫中，效果较好。而白油组佐剂组最差。由于 S0CS1 和 S0CS3都为 T细胞免疫抑制分子，在实验中证明白油组佐剂组免疫后产生了高水平 S0CS1和 S0CS3的表达，进一步说明，注射用白油组佐剂抑制 T细胞激活。

表 4 MHC、共刺激分子和 S0CS的引物序列及 PCR反应参数基因长度目的 *因引物 PCR反应参数

(bp)

5' TGGAACGGCAGACCTAGACT 3' 94°C 40 sec, 60°C 30 sec

MHCI GCTGAAGACTGACCTCAGGG and 72°C 40 sec 402

5' AACAAGGAGAAGACGGCTCA

94°C 40 sec, 60°C 30 sec

MHCI I

and 72°C 40 sec 319 3' CGGGTTCTGCTCTAATGC

5' ACTCAGGCGAATTCTCAGC

94°C 40 sec, 60°C 30 sec

CD40

and 72°C 40 sec 252 3' CCAGGGATGACAGACGGTA

5' AGTGGCTTTTGCTCTTTGGA 3' 94°C 40 sec, 60。C 30 sec

CD80

GATTCTGGTCCCGTTGAGAA and 72°C 40 sec 362

CD86 5' GTCTGGAGAATGCTGTGCAA 3' 94°C 40 sec, 60°C 30 sec

GCTCAGACCTGCCAAAGTTC and 72°C 40 sec 467

5' GAGCCCTCCTCGTCCTCGTCT

94°C 40 sec, 64°C 30

S0CS 1

3' GATGCGCTGGCGACACAG sec and 72°C 40 sec 480

5' GCGCCACTTCTTCACGTTG

94°C 40 sec, 59°C 30

S0CS3

3' TGATCCAGGAACTCCCCAATG sec and 72°C 40 sec 432 二、牛抗***抗体的检测

将 6个月龄的公牛，分为五组，每组 2只，第一组为对照组，不注射任何物质；第二组肌肉注射含 50微克 146S抗原和 50 %注射用白油的组合物 100微升；第三组肌肉注射含 50微克 146S抗原和 5 %左旋咪唑的组合物 100微升；第四组肌肉注射含 50微克 VP1蛋白和 50 %注射用白油的组合物 100微升；第五组肌肉注射含 50微克 VP1蛋白和 5 %左旋咪唑的组合物 100微升。在第 14天再以同等剂量加强免疫一次。第二次免疫后第 14天取血清测定其抗体滴度，结果如表 5所示：

牛抗***抗体滴度

表 5 表明，用左旋咪唑作为牛抗***疫苗的佐剂比传统的矿物油作佐剂抗体滴度有明显提高。

三、鸡免疫实验

下述步骤中将购自于北京生物制品厂的 Lasota新城疫病毒抗原经甲醛灭活后作为免疫用的 Lasota新城疫病毒抗原。 1、鸡抗新城疫抗体时效的检测：

将 SPF鸡，分为六组，每组六只，第一组为空白对照组，只注射 100微升 0. 9%的 NaCl水溶液；第二组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原， 2% 盐酸左旋咪唑和 0. 1 %双十八垸基二甲基溴化铵的组合物 100微升；第三组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原， 2%盐酸左旋咪唑和 0. 5 %双十八烷基二甲基溴化铵的组合物 100微升；第四组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原， 2%盐酸左旋咪唑和 1 %双十八烷基二甲基溴化铵的组合物 100微升；第五组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原， 2%盐酸左旋咪唑和 2 %皂素的组合物 100微升；第六组肌肉注射鸡抗新城疫的注射用白油佐剂商品苗（含 50% 的注射用白油，北京生物制品厂购买） 100微升。在第 14天再以同等剂量加强免疫一次，第二次免疫后第 14天取血清测定其抗体血凝价，结果如表 6所示：鸡抗新城疫抗体滴度

表 6 表明，用盐酸左旋咪唑、盐酸左旋咪唑 +双十八烷基二甲基溴化铵、盐酸左旋咪唑 +皂素作为鸡抗新城疫疫苗的佐剂，与传统的矿物油佐剂相比抗体滴度相似。

其中，鸡抗体血凝抑制效价（HI ) 检测方法如下：在微量凝集板上两排孔中，都从第 1-12孔或根据抗血清效价需的孔数，每孔加进 0. 025ml生理盐水；第 1排第 1孔分别加进未知血清 0. 025ml，依次倍量稀释到最后一孔，每孔加进含有 4个凝集单位的已知病毒液。第 2排第 1孔分别加进 PBS 0. 025ml，依次倍量稀释到最后一孔，每孔加进含有 4 个凝集单位的已知病毒液。震荡混匀，室温下 30min后，能被未知血清抑制，判断为血清中的 HI滴度。

2、鸡抗新城疫抗体时效的检测

将 SPF鸡，分为六组，每组六只，第一组为阴性对照组，只注射 100微升 0. 9 %的 NaCl水溶液；第二组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原的水溶液 100微升；第三组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原和 2%左旋咪唑的免疫组合物 100微升；第四组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原和 4%左旋咪唑的免疫组合物 100微升；第五组肌肉注射鸡抗新城疫的注射用白油佐剂商品苗（含 50%的注射用白油，北京生物制品厂购买） 100微升，第六组肌肉注射 4°/。左旋咪唑 100微升。在第 14天再以同等剂量加强免疫一次，第二次免疫后第 28、 60天取血清测定其抗体血凝价，结果如表 7所示：

鸡抗新城疫抗体时效的检测结果

表 7 表明，用左旋咪唑作为鸡抗新城疫疫苗的佐剂，与传统的矿物油佐剂相比抗体滴度在时效上下降不明显。

3、鸡新城疫免疫后 Τ细胞的检测

将 SPF鸡，分为六组，每组六只，第一组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原， 2%盐酸左旋咪唑和 0. 5%双十八垸基二甲基溴化铵的组合物 100微升；第二组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原， 2%盐酸左旋咪唑和 2 %皂素的组合物 100微升；第三组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原；第四组肌肉注射含 2%盐酸左旋咪唑和 0. 5 %双十八垸基二甲基溴化铵的组合物 100微升；第五组肌肉注射含 2%盐酸左旋咪唑和 2 %皂素的组合物 100微升；第六组肌肉注射鸡抗新城疫的注射用白油佐剂商品苗（含 50 %的注射用白油，北京生物制品厂购买） 100微升。第一次免疫后第 14天再以同等剂量加强免疫一次，并于第二次免疫后第 14天取脾脏 T细胞测定其 T细胞扩增活性，具体方法为：在无菌条件下，取脾制成单个细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，然后用 PBS液洗三次，离心并进行细胞计数，调整细胞浓度到 I X 10⁶个 /ml，将每组细胞悬液分 4份加入 96孔培养板中。其中一份加入 ΙΟΟμΙ Con A至终浓度为 5μ_β/ιτι1 , 一份加入相应的特异性抗原（Lasota灭活病毒抗原）作为刺激物至终浓度为 2 g/ml，一份加入 lOO l BSA至终浓度为 2 g/ml作为无关抗原，另一份不加刺激物， 24 小时后，每孔加入 ΙΟΟμΙ MTT至终浓度为 5mg/ml， 48h后，每孔加入 ΙΟΟμΙ SDS- DMS0 (20% SDS溶于 50%DMSO， pH2. 0) , 使其完全溶解，孵育 4h后，在酶标仪上读取 570nm处的 0D值，计算刺激指数 SI。结果如图 27所示，表明利用 2%盐酸左旋咪唑和 0. 5%双十八烷基二甲基溴化铵或 2%盐酸左旋咪唑和 2 %皂素的组合物作为 Lasota灭活病毒疫苗的佐剂，与其相应的油佐剂疫苗相比， T细胞扩增活性明显提高于其油佐剂灭活疫苗。图 27中纵坐标为 SI刺激指数，横轴上， 1表示 ConA刺激组为阳性对照； 2表示第一组免疫后的 T细胞扩增活性； 3表示第二组免疫后的 T细胞扩增活性； 4表示第三组免疫后的 T细胞扩增活性； 5表示第四组免疫后的 T细胞扩增活性； 6表示第五组免疫后的 T 细胞扩增活性； 7表示第六组免疫后的 T细胞扩增活性。

4、鸡新城疫攻毒保护实验

将 SPF鸡，分为六组，每组四只，第一组为阴性对照组，只注射 100微升 0. 9 %的 NaCl水溶液；第二组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原和 1% 磯酸左旋咪唑的免疫组合物 100微升；第三组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原和 2%磷酸左旋咪唑的免疫组合物 100微升；第四组肌肉注射含 20微克 Lasota新城疫病毒抗原和 4%磷酸左旋咪唑的免疫组合物 100微升；第五组肌肉注射鸡抗新城疫白油佐剂的商品苗（含 50%的注射用白油，北京生物制品厂购买） 100微升，第六组肌肉注射 4%磷酸左旋咪唑 100微升。在第 14天再以同等剂量加强免疫一次，第二次免疫后第 14天取血清测定其抗体血凝价并用 1000 个半致死量的新城疫 Lasota毒株 0. 2ml (即稀释 2 X 10—⁹病毒）对鸡进行攻毒，攻毒 7天后统计结果，如表 8所示：

表 8 鸡新城疫攻毒保护实验结果

表 8 表明，用磷酸左旋咪唑作为鸡抗新城疫疫苗的佐剂比传统的矿物油佐剂保护率高，都为 100%，而白油佐剂商品苗只为 50%。其中，保护率 = (成活数 /总数） Χ 100%。

5、鸡抗禽流感 H5N1抗体时效的检测

将 SPF鸡，分为三组，每组 6只，第一组为阴性对照组，只注射 100微升生理盐水；第二组肌肉注射灭活禽流感病毒 H5N1疫苗（含 50%的注射用白油，购自于哈尔滨兽医研究所） 100微升；第三组肌肉注射含 5微克除去乳剂的灭活禽流感病毒 H5N1疫苗和 5 %盐酸左旋咪唑的组合物 100微升。在第 21天再以同等剂量加强免疫一次。第一次和第二次免疫后第 7天取血清测定其抗体滴度，结果如表 9所示：

表 9 抗禽流感 H5N1抗体滴度的时效变化

血清 IgG抗体（2ⁿ )

免疫组别

初免后 7天二免后 7天生理盐水〈1. 0 < 1. 0 禽流感病毒 H5N1矿物油

13. 7 ± 1. 2 16. 0 ± 1. 0 商品疫苗

疫苗 +5 %盐酸左旋咪唑 16. 7 ± 0. 6 20. 3 ± 1. 2 表 9表明，用盐酸左旋咪唑作为禽流感病毒 H5N1疫苗的佐剂与传统矿物油作佐剂的抗体滴度相似。

6、禽流感 H5N1攻毒保护实验

禽流感病毒 H5N1经甲醛灭活后，分成两份，一份与 5 %注射用白油乳化后制成传统的矿物油油疫苗；另一份与 5 %的盐酸左旋咪唑为佐剂混合后制成疫苗。将 SPF鸡，分为三组（每组 10只鸡），第一组肌肉注射 100微升上述禽流感病毒 H5N1矿物油疫苗；第二组肌肉注射含 5微克灭活禽流感病毒 H5N1抗原和 5 %盐酸左旋咪唑的组合物 100微升；第三组为对照组，注射 100微升 5 %盐酸左旋咪唑。 70 天后，用 100倍的病毒半致死量的禽流感病毒即 0. 1毫升 2 X 10— ⁹稀释的病毒对鸡进行攻毒，结果如表 10所示：

表 10 禽流感 H5N1攻毒保护实验结果

表 10表明，用盐酸左旋咪唑作为鸡抗禽流感 H5N1 疫苗的佐剂比传统的矿物油佐剂保护率高。

工业应用

本发明的免疫佐剂能够有效地提高蛋白质疫苗，核酸疫苗，多肽疫苗和灭活疫苗激发机体完全免疫反应的能力，增强机体 T细胞的免疫效果，延长保护期；本发明免疫佐剂的制备方法简单无需复杂的设备和操作步骤，易于实施，在医学领域中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。

Claims

权利要求

1、一种免疫佐剂，是左旋咪唑，或左旋咪唑的衍生物，或左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与下述至少一种物质组成的组合物：白油、甘油、油酸、双十八垸基二甲基溴化铵或皂素。

2、根据权利要求 1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物。

3、根据权利要求 1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与白油的组合物。

4、根据权利要求 1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与甘油的组合物。

5、根据权利要求 1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与油酸的组合物。

6、根据权利要求 1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与双十八烷基二甲基溴化铵的组合物。

7、根据权利要求 1所述的免疫佐剂，其特征在于：所述免疫佐剂是左旋咪唑或左旋咪唑衍生物与皂素的组合物。

8、根据权利要求 1-7中任一所述的免疫佐剂，其特征在于：所述左旋咪唑衍生物为盐酸左旋咪唑或磷酸左旋咪唑。

9、根据权利要求 1-7中任一所述的免疫佐剂，其特征在于：所述白油为食品用白油或注射用白油。

10、根据权利要求 3的免疫佐剂，其特征在于：所述白油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 20:1至 1:20。

11、根据权利要求 10的免疫佐剂，其特征在于：所述白油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 10:1至 1:1。

12、根据权利要求 4的免疫佐剂，其特征在于：所述甘油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 5:1至 1:5。 '

13、根据权利要求 12的免疫佐剂，其特征在于：所述甘油与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 2:1至 1:2。

14、根据权利要求 5的免疫佐剂，其特征在于：所述油酸与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 5:1至 1:5。

15、根据权利要求 14的免疫佐剂，其特征在于：所述油酸与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 2:1至 1:2。 16、根据权利要求 6的免疫佐剂，其特征在于：所述双十八烷基二甲基溴化铵与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 20:1至 1:20。

17、根据权利要求 16的免疫佐剂，其特征在于：所述双十八垸基二甲基溴化铵与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 10:1至 1:5。

18、根据权利要求 7的免疫佐剂，其特征在于：所述皂素与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 20:1至 1:20。

19、根据权利要求 18的免疫佐剂，其特征在于：所述皂素与左旋咪唑或左旋咪唑衍生物的质量比为 10： 1至 1： 5。