CN1906307A - 纯化百日咳毒素的方法及其中有用的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纯化百日咳毒素(PT)的试剂和方法。

Description

纯化百日咳毒素的方法及其中有用的肽
发明领域
本发明涉及到纯化百日咳毒素(PT)的试剂和方法。
发明背景
百日咳毒素(PT)由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)产生，是所有预防百日咳的疫苗的主要成分，通常情况下，PT与破伤风毒素和白喉毒素联合使用。通常通过在一定的培养基内培养百日咳杆菌，然后分离出上清中的PT，再用已知技术进行纯化来实现PT的工业化生产(即，美国专利号：6,399,076；5,877,298；和Sekura等.J.Biol.Chem.258：14647-14651，1983；Bogdan等.Appl.Env.Micro.69(10)：6272-6279，Oct.2003)。大多数已知的方法都需要用到牛胎球蛋白(BF)或去唾液酸胎球蛋白结合的基质，它们的来源和纯度非常关键。使用牛来源的试剂也带来了对牛相关疾病如牛海绵状脑病(BSE)的担忧。
于是本领域的技术人员期望有一种无需依靠BF的方法来纯化PT，其中Bogdan等描述了一个这样的方法(Appl.Env.Micro.69(10)：6272-6279，Oct.2003)，通过噬菌体展示***确认了具有模拟牛胎球蛋白的糖苷部分与PT结合能力的肽，三个具有共同序列XGSFSGF(X为任何氨基酸)的肽(3GF：NGSGSGF；3G8：NGSFSGC；3G2：DGSFSGF)被确认具有PT结合能力。3G2还被用于亲和层析柱以纯化经部分纯化的PT制剂。
其他设计和使用肽而不用牛来源的产品来纯化PT的方法为本领域技术人员所期待。这里提供的亲和纯化PT的试剂和方法不涉及到任何形式的肽球蛋白的使用。
附图简述
图1.A)匙羹藤抑甜味肽(gurmarin)文库示意图，文库中翻译成氨基酸序列的位置被突出显示，蛋白部分(59个氨基酸长度)的序列用单字母氨基酸码表示，其中X代表任何氨基酸。文库中不被翻译的位置用灰色方框表示。(a)T7启动子，用于文库的体外最适转录，(b)TMV-烟草花叶病毒的翻译启动序列，用于文库的体外理想翻译，(c)His6-tag，用于PROfusionTM文库的有效亲和纯化，(d)结构性的柔性接头，(e)带有两个分别含有5个和9个氨基酸的随机环状结构的匙羹藤抑甜味肽核心，(f)结构性的柔性接头和(g)与嘌呤霉素受体分子有效结合的最佳接头。B)匙羹藤抑甜味肽PROfusionTM文库的构建是一个多步骤的过程，包括以下反应：PCR、体外转录、RNA与嘌呤霉素寡核苷酸接头的化学连接、体外翻译、寡-dT纯化、逆转录和His-tag纯化。
图2.PROfusionTM选择循环示意图。
图3.筛选出的应该进行PT结合活性测试的匙羹藤抑甜味肽变异体。保守基序用有色方框突出表示。
图4.经过PT 4轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。
图5.经过PT(环氧)5a轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。
图6.经过PT(strep)5b轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。
图7.经过PT(strep)6a轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。
图8.经过PT(strep)6b轮筛选的匙羹藤抑甜味肽序列分析。各个变异体的序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区和匙羹藤抑甜味肽支架结构的恒定区被突出标出。随机环状结构1和2的位置被指明。
图9.筛选出的将进行PT结合活性测试的PP26变异体。保守基序被突出标出。
图10.经过PT 4轮筛选的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区被突出标出。
图11.经过PT(环氧)5a轮筛选的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区用淡黄色的方框标示，保守基序被突出标出。
图12.经过PT(strep)5b轮选择的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区用淡黄色的方框标示，保守基序被突出标出
图13.经过PT(strep)6a轮选择的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区用淡黄色的方框标示，保守基序被突出标出。
图14.经过PT(strep)6b轮选择的PP26的序列分析。各变异体的氨基酸序列用单字母氨基酸码表示。文库的恒定侧翼区被突出标出。
图15.生物素标记的合成的核心肽被固化到链霉亲和素琼脂糖凝胶上，求证其与纯化的PT结合。取1/40结合反应后的上清通过12％的NuPage凝胶用MES电泳缓冲液(running buffer)进行分离来对未结合的PT组分进行分析(上面的凝胶)，取50％的洗脱液通过12％的NuPage凝胶用MES电泳缓冲液进行分离来分析与琼脂糖结合的PT(下面的凝胶)，用银染的方法着色显示。一定量的纯化的PT被用作定量的标准，匙羹藤抑甜味肽15和9除外。
图16.从样品A(左凝胶)和样品B(右凝胶)纯化PT。取50％的洗脱液通过12％的NuPage凝胶用MES电泳缓冲液进行分离来分析琼脂糖结合的PT(下面的凝胶)，用银染的方法着色显示。一定量的纯化的PT被用于定量的标准，匙羹藤抑甜味肽9除外。
图17.结合到固定化的肽pp26克隆9和克隆15和匙羹藤抑甜味肽克隆9和匙羹藤抑甜味肽克隆15的来自样品A或B的PT的洗涤条件的优化，用50mM Tris/HCl，pH 7.5或50mM乙酸盐，pH 6进行3次洗涤，PT用12％的Bis Tris凝胶分析并用银染法着色显示。PPM为蛋白完美标记(protein perfect marker)。
图18.结合到固定化的肽pp26克隆9和克隆15的来自样品B的PT的洗涤条件的优化，用50mM Tris/HCl，pH 7.5或50mM乙酸盐，pH 6进行3到20次洗涤，PT用12％的Bis Tris凝胶分析并用银染法着色显示。
图19.用含0.2到2.0M MgCl2的50mM Tris/HCl从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上洗脱PT，肽结合的PT经过用所指定的洗脱缓冲液(每次20μl)连续3次洗脱后从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上置换出，残留的物质继之用凝胶上样缓冲液洗脱。所有洗脱物用12％的Bis Tris凝胶(1x MES电泳缓冲液)分析并用银染法着色显示。
图20.在酸性(50mM甘氨酸，pH2.5)或碱性(100mM碳酸盐缓冲液，pH 10.5)条件下从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上洗脱PT。肽结合的PT经过用所指定的洗脱缓冲液(每次40μl)连续3次洗脱后从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶(20μl含约200pmol的肽)上置换出，残留的物质继之用凝胶上样缓冲液洗脱。所有洗脱物用12％的Bis Tris凝胶(1xMES缓冲液)分析并用银染法着色显示。取1/40体积的肽链霉亲和素琼脂糖凝胶与样品A孵育后的流通液与各个肽在同一凝胶上进行分析。
图21.用固定有pp26肽9的链霉亲和素琼脂糖凝胶作为亲和配体小规模柱纯化样品B中的PT(A)，用凝胶估计的纯化的PT产量(B)。
图22.用固化有匙羹藤抑甜味肽15作为亲和配体从链霉亲和素琼脂糖凝胶小规模柱纯化样品B中的PT(A)，用凝胶估计的纯化的PT产率(B)。
图23.PT与肽链霉亲和素琼脂糖凝胶的结合取决于用于固定化到链霉亲和素琼脂糖凝胶上的肽量的变化(每1ml)。结合的PT的量通过与同一凝胶上的已知量的纯化PT直接比较来决定。例如，将pp26/9对每ml链霉亲和素琼脂糖凝胶的用于固定化的肽量绘图。最大PT结合量估计在100-150pmol。
图24.PT产率作为每μl肽链霉亲和素琼脂糖凝胶或每6.85μl去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶中不同量的加入物质(样品B)的函数。洗脱的PT量根据与同一凝胶上的已知量的纯化了的PT直接比较计算出并列于表2中。
图25.再利用的肽琼脂糖凝胶反复用于PT的结合和洗脱。结合于链霉亲和素琼脂糖凝胶的PT用100mM的pH10.5的碳酸盐缓冲液洗脱4次，柱内基质用10mM HCl进行再生处理。
图26.经过FPLC柱用pp26/9肽链霉亲和素琼脂糖凝胶(0.5ml)对样品B进行纯化得到的PT洗脱组分。该洗脱组分(各500μl中的0.5μl)用PAGE分析(12％Bis-Tris-Gel，MES电泳缓冲液)并用银染着色，已知量的纯化的PT在同一凝胶上电泳用于直接比较。通过测定洗脱组分在280nm的吸收值并与纯化的PT标准(见表)进行比较来确定PT的浓度。
发明概述
本发明涉及到纯化百日咳毒素(PT)的方法。在一个实施方案中，其方法是通过共价连接将一个结合在肽受体(peptide acceptor)上的核酸逆转录引物连接到RNA上，翻译该RNA产生一个蛋白产物与引物共价连接的肽产物，逆转录该RNA形成DNA-蛋白质融合体，测试该融合体产物来确定那些含有PT结合功能的肽，然后通过测序来确认肽的序列。在其他实施方案中，提供具有PT结合能力的肽，用于从复杂生物液体中纯化出PT。还提供结合于固体支持体和/或层析填料用于从复杂生物液体中纯化出PT的肽以及进行这种纯化的方法。
发明详述
本发明提供了一种纯化百日咳毒素(PT)的新方法的试剂和一套思路。如以上所描述，其中一个这样的方法已由Bogdan等所证实，在那一方法中，噬菌体展示试验被用于确认PT结合肽。为了实施本发明的目的，PT包括自然表达的PT、减毒的PT(基因工程或其他)、自然的或其他的PT变异体、重组PT、PT片段或其他形式的PT(见，例如，美国专利号6,399,076；6,168,928；6,018,022；5,977,304；5,965,385；5,856,122；5,877,298；5,433,945；5,358,868；5,332,583；5,244,657；5,221,618；5085,862；4,997,915)。在大多数情况下，化学减毒在PT纯化完成后进行。任何形式的PT均适用于实施本发明，只要这里描述的试剂能够与该特殊形式的PT结合。在本申请中，所有引用的参考文献、专利和专利申请均通过引用结合于本文中。
本发明也涉及到用重组技术来确认PT结合肽，本发明提供的方法优于本领域已知方法。另外，这里还提供用于纯化PT的新肽。在一个实施方案中，通过共价连接将一个连接在肽受体(peptide acceptor)上的核酸逆转录引物连接到RNA上，翻译该RNA产生一个蛋白产物与引物共价连接的肽产物，逆转录该RNA形成DNA-蛋白质融合体，测试该融合体产物来确定那些含有PT结合功能的肽，然后通过测序来确认肽的序列。在某些实施方案中，RNA部分可以通过RNA降解化合物如Rnase H从复合物中去除。光交联试剂和肽受体也适用于实施本发明。该***和相关的试剂在其他地方，如美国专利号6,416,950(Lohse，等)；6,429,300(Kurz，等)；6,436,665(Kuimelis，等)；6,602,685(Lohse，等和6,623,926(Lohse，等)中已有描述。
在实施本发明时，试剂如核酸、肽、融合体、配体、亲和复合物或类似物可以非弥散性地结合或附着在固体支持体上，为了达成非弥散性结合或附着，试剂通过化学或物理的方法结合到固体支持体上，使试剂在有液体存在时不会从试剂的高浓度区域移动到试剂的低浓度区域。固体支持体为任何柱子(灌装或未灌装的层析填料或柱物质)、微珠、试管、微滴定盘、固体颗粒(琼脂糖(agarose)或琼脂糖(sepharose))、微芯片(即，硅、硅玻璃或金芯片)、膜(即，脂质体膜或囊膜)或其他可以供试剂直接或间接(例如，通过其他结合配偶中间体，如抗体、蛋白A、蛋白G、链霉亲和素、生物素)结合或附着的介质。
在优选的实施方案中，试剂是有能力与PT结合的物质或化合物。更优选的是，试剂是能够可逆性地与PT结合的物质或化合物，甚至更优选的是试剂为能够在含有除PT外还有其他成分的液体中至少与PT结合，甚至可逆性结合的肽。与PT可逆性结合的试剂为在一种条件下(吸附)结合PT，在另一种条件下(解吸)释放PT。例如，当暴露于中性pH的条件下时试剂可与PT结合，而暴露于酸性或碱性pH的条件下时将PT释放。这样，试剂与PT的结合能力(即，平衡解离常数或Kd)可以通过改变试剂与PT接触时的条件来调节。其他条件包括温度、离子强度(即，离子盐浓度，如氯化钠或氯化镁)、溶剂浓度、竞争试剂/自由配体/类似物的存在与否、极性也在本领域所知的可改变的条件之中。
在某些实施方案中，亲和基质(即结合在固体支持体上的PT结合肽)用于从生物或其他液体的复杂混合物中分离希望得到的成分(即PT)。在某些情况下，可能会希望从复杂的生物液体如细菌裂解液或其他PT不构成主要成分的液体组合物(如通过SDS-PAGE确定)中纯化出PT。在其他情况下，可能会从已经过部分纯化的、其主要成分主要为PT的组合物(PT含量大于或等于50％的组合物)中分离PT，例如通过SDS-PAGE确定的PT构成了组合物中总蛋白的50％或更多的组合物在大多数情况下被认为是部分纯化的。
为了纯化PT，将含有PT的组合物与PT结合试剂结合，优选与结合在固体支持体上的可逆性的PT结合试剂结合，经过足够时间使PT与PT结合试剂相互结合形成复合物，洗去非PT成分，改变一种或多种条件(即pH)使PT与PT结合试剂的Kd增高，PT即从复合物中释放出来，收集释放出的PT，制备待用。这样的分离可称为亲和纯化，这样的纯化产品被称为经亲和纯化的产品。
被本领域的技术人员普遍认为的选择性较亲和纯化技术差的色谱技术也可用于本发明，正如本领域所知，这样的技术可以包括，例如分子排阻色谱、离子交换色谱、反相色谱和疏水相互作用色谱。任何这些技术(包括亲和纯化)可以使用合适的固体支持体在低压色谱(LPC)、高压液相色谱(HPLC)和快速蛋白液相色谱***进行。用于实施这些技术的合适的固体支持体和设备在本领域广泛可得。在实施本发明时，亲和色谱和更一般的技术可以联合使用，以满足要么部分纯化起始物质(即复杂生物液体如细菌裂解物)、纯化物质，要么进一步纯化经亲和和其他纯化方法纯化后的物质(即亲和纯化的PT)的需要。
能够与PT结合的肽已被确定并在这里进行描述。某些肽被发现能够与PT高强度结合。这些优选的肽包括：
RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDA(pp26-5)；
STMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDA(pp26-6)；
RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(pp26-9)；
RSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDA(pp26-15)；
SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYT8ELYATCG(G-9)；
SGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCG(G-10)；
SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)；
SGCVKKDELCELAIDECCEPLECTKGDLGFRKCG(G-19).
这些肽中，特别优选的有：
RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(PP26-9)；
SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)
进一步考虑的是相关的肽，如至少具有肽的一种特征或活性(即活性或抗原性)的、例如片段、定向同源变异体、同源体和衍生物。片段包含氨基端(有或没有信号序列)和/或羧基端序列有截断的肽。片段也可以包括变异体、定向进化同源体、同源体和其他与亲代肽相比含有一个或多个氨基酸添加或取代或内部删除的变异体。在优选实施方案中，包括一个氨基酸、两个氨基酸、五个氨基酸、10个氨基酸、20个氨基酸、30个氨基酸、40个氨基酸、50个氨基酸或更多氨基酸的截断和/或删除。变异体即是与亲代序列相比含有一个或多个序列的取代、删除和/或添加。变异体可以是自然发生的，也可以是人为构建的。这样的变异体可以用相应的核酸分子来制备。在优选方案中，变异体有1到3、或1到5、或1到10、或1到15、或1到20、或1到25、或1到30、或1到40、或1到50或多于50个的氨基酸被取代、***、添加和/或删除。
取代可以是保守的、或非保守的、或它们的任何组合。对多肽序列进行保守氨基酸修饰(对编码核苷酸的对应修饰)可以产生与亲代多肽功能和化学性状相似的多肽。例如，“保守氨基酸取代”可以涉及到用非天然氨基酸取代天然氨基酸残基，而使该位置上的氨基酸在大小、极性、电荷、疏水性或亲水性方面只受到很小的影响或完全没有影响，尤其是不会降低其免疫原性。合适的保守氨基酸取代见表1。
                    表1
  原始残基   示例性取代物   优选取代物
  Ala   Val，Leu，Ile   Val
  Arg   Lys，Gln，Asn   Lys
  Asn   Gln   Gln
  Asp   Glu   Glu
  Cys   Ser，Ala   Ser
  Gln   Asn   Asn
  Glu   Asp   Asp
  Gly   Pro，Ala   Ala
  His   Asn，Gln，Lys，Arg   Arg
  Ile   Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸   Leu
  Leu   正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe   Ile
  Lys   Arg，1，4-二氨基-丁酸，Gln，Asn   Arg
  Met   Leu，Phe，Ile   Leu
  Phe   Leu，Val，Ile，Ala，Tyr   Leu
  Pro   Ala   Gly
  Ser   Thr，Ala，Cys   Thr
  Thr   Ser   Ser
  Trp   Tyr，Phe   Tyr
  Tyr   Trp，Phe，Thr，Ser   Phe
  Val   Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸   Leu
当PT这样的成分与其有共同来源(即细菌裂解物)的至少约50％的蛋白、脂类、糖类或其他物质相分离时，可以称为被纯化了，优选的是通过SDS-PAGE电泳确定，该成分从至少约95-100％、90-95％、80-90％、70-80％、60-70％或50-60％的组合物总蛋白含量中分离出来。在某些方案中，一种纯化了的成分是单独或与其他因子联合用于宿主后在宿主体内诱导出免疫反应的成分。免疫反应可以包括产生与PT或百日咳杆菌的至少一个表位结合的抗体，和/或产生针对表达PT的细胞的细胞免疫反应。反应可以是对现有免疫反应的强化，例如，通过增加抗体的产量、产生对抗原有更高亲和性的抗体或增强的细胞反应(即增强的T细胞)，其他免疫反应测定法为本领域所知，可适用于确定是否有免疫反应发生。
用这里描述的方法分离得到的PT可用于制备药用组合物。优选的PT药用组合物包括，例如，PT的液体制剂，如混悬液、糖浆或酏剂。优选的注射制剂包括，例如，适用于胃肠外、皮下、皮内、肌肉或静脉给药的如肽无菌混悬液或乳液。例如，PT可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖或类似物混合，制备成组合物。组合物也可以以冻干粉的形式提供，例如用等渗液体、生理盐水缓冲液重建后使用。这样的组合物也可以被用来制备疫苗，正如，例如在美国专利5,877,298和6,399,076(Vose等)和国际申请号PCT/CA96/00278中描述的那样。用这里提到的方法制备的PT也可以与本领域所知的其他病原微生物中的如棒状杆菌(即白喉)、梭杆菌(即破伤风)、脊髓灰质炎病毒(即IPV、OPV)、肝炎病毒、奈瑟氏菌(即脑膜炎)、链球菌、噬血杆菌或其他百日咳抗原(即丝状血凝素、百日咳外膜蛋白和凝集素)联合使用。
通过以下给出的用于阐明的实施例可以对本发明和它的优点有一个更好的理解。
                      实施例
                    材料和方法
A.百日咳毒素(PT)
PT为分子量109kD的杂多聚蛋白(由6个亚单位S1、S2、S3、2x、S4、S5组成)。一种高纯度(＞99.99％)的硫酸铵沉淀物制剂被使用。识别天然六聚复合体的PT特异性的配体(脱唾液酸胎球蛋白)也用于实验，脱唾液酸胎球蛋白有溶液和固定化于琼脂糖凝胶上的两种形式。
B.匙羹藤抑甜味肽文库筛选
匙羹藤抑甜味肽是来自萝藦科藤(Asclepiad vine)匙羹藤(Gymneasylvestre)的一种35个氨基酸残基的多肽。由于能够选择性地抑制大鼠对甜味的神经反应，它被用作研究甜味传导的药理学工具。它对人体没有明显的影响。推测匙羹藤抑甜味肽的味觉抑制效应可能是直接通过与甜味受体结合引起，或者可能是与甜味传导***下游靶相互作用所致(1)。
匙羹藤抑甜味肽属于“Knottins”家族，为一组通常在长度上小于40个氨基酸的结构相关的蛋白。Knottins与靶分子结合的范围很杂，包括蛋白、糖和脂类，但它们都含有一个共同支架结构，该结构包含小三链反向平行β片层和二硫键结合框架结构(2、3)。
一个带有15个随机氨基酸位置的特异的匙羹藤抑甜味肽文库被设计出来，如下所示：
野生型匙羹藤抑甜味肽：
qqCVKKDELCIPYYLDCCEPLECKKVNWWDHKCig
匙羹藤抑甜味肽核心：
CVKKDELCXXXXXXCCEPLECXXXXXXXXXC
在匙羹藤抑甜味肽核心序列中，X为任何氨基酸。该文库被证实产生对蛋白靶的高亲和力的结合序列。该匙羹藤抑甜味肽文库结合了一系列优点，至少有以下原因使其成为了筛选抗PT毒素的最好选择：有限的柔性；弥补了在针对靶的拓扑学变构中的高熵消耗；与线性文库相比，理论上能以较少的氨基酸产生较强的结合力；对蛋白酶有抗性；并且对下游应用中的氧化还原洗脱条件敏感。构建匙羹藤抑甜味肽文库的过程在图1中显示。
1.起始寡核苷酸的PCR
三个凝胶纯化的寡核苷酸被用于构建含有两个随机环状结构的匙羹藤抑甜味肽文库。用1μm 5’端His-tag引物
5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CACCAT CAC CAT CAC CAT AGT GGC TCA AGC TCA GGA TCA-3′
和1μM 3’端引物
5′-TTT TAA ATA GCG GAT GCT ACT AGG CTA GAC CCA GAA CTG CCG CT-3′，在Taq多聚酶的作用下，对1nmole的匙羹藤抑甜味肽模板(≈约6·1014个序列)
                                        5′-AGT GGCTCAAGC TCA GGA TCA GGC TGC GTG AAG AAA GAC GAG CTC TGC NNS NNS NNSNNS NNS NNS TGC TGT GAG CCC CTC GAG TGC NNS NNS NNSNNS NNS NNSNNS NNS NNS TGC GGC AGC GGC AGT TCT GGG TCT AGC-3′，进行扩增，经过6轮PCR扩增(94℃，1min；65℃，1min；72℃，1min)后，在2％的琼脂糖凝胶上进行分析，提示代表性的文库已被建立。
2.体外转录
用Promega的RiboMaX Express体外转录试剂盒将双链DNA转录成RNA，37℃孵育45分钟后，加入DnaseI继续孵育15分钟，然后用酚/氯仿抽提，过量的NTP通过NAP-5凝胶进行过滤去除。用6％的TBU凝胶分析，显示双链DNA已被成功转录。
3.用化学方法连接RNA与嘌呤霉素-寡核苷酸接头
纯化的RNA被退火(85℃，1分钟，以0.3℃/秒的速度冷却到25℃)连接到1.5倍过量的嘌呤霉素-寡核苷酸接头PEG2A18：5’-补骨脂内酯-UAG CGG AUG C A18(PEG18-9)2CC嘌呤霉素(斜体显示的核苷酸代表2’-O-甲基-衍生物，通过紫外光(365nm)在室温下照射15分钟完成共价连接。用6％的TBU凝胶对反应产物进行分析，显示连接反应已有效进行。
4.体外翻译
用Promega的兔网织红细胞裂解物在15μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmole)存在的条件下对已连接好的RNA进行翻译，30℃孵育30分钟后，加入KCl和MgCl2使其终浓度分别为530mM和150mM，取样在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶上进行分析，显示翻译反应成功。
5.寡-dT纯化
分子(mRNA-蛋白融合体)通过在孵育缓冲液(100mM pH 0，10mM EDTA，1mM and 0.25％Triton X-100)中与寡-dT磁珠(Miltenyi)4℃孵育5分钟进行分离。用MiniMACS-柱(Miltenyi)对PROfusionTM分子进行过滤分离，用孵育缓冲液洗柱并用水进行洗脱。取样在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶上进行分析，显示反应成功。
6.逆转录
在供应商推荐的条件下，用SuperScriptII逆转录酶(Gibco BRL)，在5倍过量的3’引物存在的条件下进行逆转录制备相应的cDNA，取样在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶上进行分析，显示反应成功。
7.His-tag纯化
逆转录后的PROfusionTM分子在HBS缓冲液(20mM HEPES pH7.0，150mM 0.025％Triton X-100，100已剪切的鲑精DNA，1mg/mlBSA))中与Ni-NTA-琼脂糖混合(50μl/PROfusionTM)(QIAGEN)，在室温下孵育60分钟并轻轻摇动。然后过滤Ni-NTA，用HBS/5mM咪唑洗涤，并用HBS/150mM咪唑进行洗脱。取样在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶上进行分析，显示纯化成功。每次筛选将用20pmole(≈约1·1013序列)的PROfusionTM。
B.用于筛选的线性肽文库PP26
含有26个随机氨基酸位置的特异性线性肽文库PP26也用以下构建体被设计出来：
T7-TMV-MGRGS-HHHHHH-ARS-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-DANAPK-ASAI蛋白部分的序列(50个氨基酸长度)用单一字母氨基酸码显示，其中X代表任何氨基酸。非翻译的文库部分包括：(a)T7：用于文库体外最佳转录的T7启动子，(b)TMV：用于完成文库体外翻译的烟草花叶病毒翻译起始序列。MGRGS代表结构性柔性接头，HHHHHH代表用于对PROfusionTM文库进行有效亲和纯化的His6-tag，ARS代表第二个结构性柔性接头，DANAPK代表第三个结构性柔性接头，ASAI为优化了的与嘌呤霉素受体分子有效结合的接头。
该文库被证明产生针对蛋白靶的高亲和力结合子，该PP26文库具有两个主要的优点使其成为了亲和层析试剂筛选的极好选择：高柔性：能够根据靶的拓扑学进行变构；结实：由于缺乏保守结构，形成的结合子可经受强烈的生物物理条件。
1.起始寡核苷酸的PCR
三个凝胶纯化的寡核苷酸被用于构建含有两个随机环状结构的匙羹藤抑甜味肽文库，用1μM 5’端His-tag引物5′-TAA TAC GACTCA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GGA CGTGGC TCA CAT CAT CAT CAT CAT CAT GCT AGA TCT-3′和1μM 3’端引物5′-AA TTA AAT AGC GGA TGC CTT CGG AGC GTT AGC-3′在Taq多聚酶的作用下，对1nmol的PP26模板(≈约6·1014序列)5′-AGC GGA TGC CTT CGG AGC GTT AGC GTC SNN SNN SNN SNNSNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNNSNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN AGA TCT AGC ATGATG ATG ATG A-3′，进行扩增，经过6轮PCR扩增(94℃，1min；65℃，1min；72℃，1min)后，在2％的琼脂凝胶上进行分析。
2.体外转录
用Promega的RiboMax Express体外转录试剂盒将双链DNA转录成RNA，37℃孵育45分钟后，加入DnaseI继续孵育15分钟，然后用酚/氯仿抽提，过量的NTPs通过NAP-5凝胶(Pharmacia)进行过滤去除。通过6％的TBU凝胶分析来确认RNA的转录。
3.用化学方法连接RNA与嘌呤霉素-寡核苷酸接头
纯化的RNA被退火(85℃，1分钟，以0.3℃/秒的速度冷却到25℃)连接到1.5倍过量的嘌呤霉素-寡核苷酸接头PEG2A18：5’-补骨脂内酯-UAG CGG AUG C A18(PEG18-9)2CC嘌呤霉素(斜体显示的核苷酸代表2’-氧-甲基-衍生物，通过紫外光(365nm)在室温下照射15分钟完成共价连接。在6％的TBU凝胶上对反应产物进行分析来确认反应。
4.体外翻译
用Promega的兔网织红细胞裂解物在15μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmole)存在的条件下对已连接好的RNA进行翻译，30℃孵育30分钟后，加入KCl和MgCl2使其终浓度分别为530mM和150mM，在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶上进行分析以确认翻译。
5.寡-dT纯化
分子(mRNA-蛋白融合体)通过在孵育缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA，1mMNaCl和0.25％Triton X-100)中与寡-dT磁珠(Miltenyi)4℃孵育5分钟进行分离。用MiniMACS-柱(Miltenyi)对PROfusionTM分子进行过滤分离，用孵育缓冲液洗柱并用水进行洗脱。取样通过4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶分析以确认反应。
6.逆转录
在供应商推荐的条件下，用SuperScriptII逆转录酶(Gibco BRL)，在5倍过量的3’引物存在的条件下进行逆转录制备相应的cDNA，取样在4-20％Tris/glycine-SDS-PAGE凝胶上进行分析以确认转录。
7.His-tag纯化
逆转录后的PROfusionTM分子在HBS缓冲液(20mM HEPES pH7.0，150mM 0.025％Triton X-100，100μg/ml剪切的鲑精DNA，1mg/ml BSA))中与Ni-NTA-琼脂糖混合(50μl/PROfusionTM)(QIAGEN)，在室温下孵育60分钟并轻轻摇动。然后过滤Ni-NTA，用HBS/5mM咪唑洗涤，并用HBS/150mM咪唑进行洗脱。取样在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶上进行分析以确认反应。每次筛选将用20pmole(≈约1·1013序列)的PROfusionTM分子。
C.靶物质的制备
在PROfusionTM技术中，含有多至1013不同PROfusionTM(mRNA-蛋白质融合体)分子的高度多样性的文库被用来筛选针对所需靶(蛋白、糖类或脂类)的高亲和力结合。在这一过程中，靶物质通常被固定到固体相，这些固体相最好是在筛选过程中能够快速有效地操作且背景低的磁珠。
1.测试靶物质的核酸酶活性
5μg PRP和0.5μg PT的靶物质分别在室温和4℃与0.12pmole的放射性标记的PROfusiongTM文库分子共孵育1小时和16小时。孵育完毕用4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶确认PROfusionTM的完整性并进行放射自显影。未发现PROfusionTM降解，即表明靶物质中不含核酸酶。
2.测试靶物质的蛋白酶活性
5μg PRP和0.5μg PT的靶物质分别在室温和4℃与1μg的纯化的GST-蛋白共孵育1小时和16小时。孵育完毕用4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶确认GST-蛋白的完整性并用考马氏亮蓝染色，未发现GST-蛋白降解，即表明靶物质中不含蛋白酶。
D.PT的固定化
1.重配制PT
500μl由Aventis Pasteur公司送来的沉淀物(2,26mg/ml)在室温下经21.400xg室温离心45分钟，弃去上清，将离心后的沉淀物溶于1100μlCTW缓冲液(0.286gNaHCO3、0.170g Na2CO3，50 Tween-80，加入到50ml MilliQ水中)，为了检查PT制剂的质量，在4-12％BisTris-SDS-PAGE凝胶上对系列稀释的PT制剂(250ng、500ng、1μg、2.5μg、5μg、15μg)用MES缓冲液中进行电泳，至少有4个代表亚单位S1(28kD)、S2(23kD)、S3(22kD)和S4(11.7kD)条带被清晰地分离出来。PT复合物中的最小的蛋白S5(9.3KD)未能显示，也许在本凝胶***中，该条带与只比其略大的S4分不开。
2.连接策略
几种不同的方法被用来将蛋白结合到磁珠上，主要使用两个策略：其一，靶蛋白的一级氨基和巯基通过形成稳定的酰胺键或硫醚键共价连接到环氧活化的磁珠(Dynal)上，该反应在硫酸铵存在下进行以促进反应，通常有很高的靶蛋白连接效果，然而，某些蛋白在这样的条件下会发生结构改变，从而导致一个非天然和/或失活了的构型连接。其二，靶蛋白的一级氨基和巯基通过共价连接到NHS-酯活化的生物素衍生物(Pierce)上，继而将该生物素标记的蛋白固定到链霉亲和素磁珠上(Dynal)。
通常，如果对已知靶物质来说条件合适，优选将靶蛋白共价连接到环氧活化的磁珠的方法，因为该方法保证磁珠上只有靶物质呈现，在生物素/链霉亲和素连接的磁珠上还带有链霉亲和素，可能会在筛选过程中导致抗链霉亲和素的结合子的富集，因此，Phylos建立了一种事前清除ProfusionTM文库的链霉亲和素结合子的方法，以获得针对已知靶物质的高质量的结果。总的来说，共价连接通常能够快速富集靶物质特异性结合子。在PT这样的特殊例子中，最合理的是用共价连接的策略，因为已知与硫酸铵孵育对PT蛋白的官能团无影响。
3.环氧磁珠(Dynal)的连接条件的优化
在几个独立的实验中对PT的连接条件进行了优化(不同的硫酸铵浓度(0.5-2.0M)和不同的磁珠/靶比率被考查，同时对时间和温度(2分钟-16小时；8℃至室温)的依赖也进行了研究)，观察到的最好结果为以下反应条件：终体积300μl，含100μg PT，3.3×108磁珠，在2ml的Eppendorf管中与终浓度为1M的硫酸铵室温下孵育2分钟到60分钟，孵育完毕，将管放置到磁铁上4分钟，使磁珠沉降下来，保留上清做继后的凝胶分析。磁珠用1ml HEPES-缓冲液(20mMHEPES pH 7.0，150mMNaCl，0.025％TritonX100)洗涤一次，取一等份磁珠(5％的磁珠)在4-12％BisTris-SDS-PAGE凝胶上进行分析，以确定蛋白的连接量，结果发现，即使仅反应两分钟PT也能够高效地连接到环氧磁珠上。
4.PT与环氧磁珠连接的半制备
2.6mg环氧活化的干磁珠(M-270，Dynal)(～1.7×108磁珠)被重悬于1ml磷酸盐缓冲液(19mM NaH2PO4，81mMNa2HPO4，pH7.4)中，平衡10分钟，用新鲜的磷酸盐缓冲液重复平衡2次。继而直接用该磁珠与480pmole重配制好的PT(1μg/μl于CTW缓冲液)在1M硫酸铵(终体积157μl)中进行连接反应。经过室温15分钟连续振摇孵育后，用300μlHBS缓冲液洗涤磁珠3次，最后将磁珠重悬于240μlHEPES缓冲液中，分装后4℃保存。在SDS-PAGE凝胶上分析所有洗涤流分、连接反应上清和用SDS上样缓冲液从磁珠上洗下来的PT流分以检查连接反应的效率。
5.环氧活化的磁珠固定的PT与去唾液酸胎球蛋白结合的分析
40μl的PT-衍生化的磁珠与320pmole去唾液酸胎球蛋白在HEPES缓冲液(20mM HEPES pH7.0，150mM NaCl，0.025％Triton-X100)中室温孵育1小时(最终反应体积为200μl)，用200μl HEPES缓冲液洗涤2-7次，最后重悬于30μlHEPES缓冲液。取50％的磁珠在SDS-PAGE凝胶上进行分析以确认反应。
对在4℃贮存1周后的PT-衍生化的磁珠进行测试发现，其对去唾液酸胎球蛋白的结合力降低，提示长期贮存会影响其效力。因此，PT-衍生化的磁珠必须在每次筛选时新鲜制备并进行质量控制，由于该过程相当费时，所以对取代性的生物素化PT固定策略进行了评价。
6.生物素化PT的半制备
通过将配制的0.4mg(～3.65nmol)PT(1μg/μl于CTW缓冲液)与25μgEZ-连接-sulfo-NHS-LC-LC-生物素(PIERCE)在终体积为740μl的50mM HEPES、150mM NaCl、0.2％-X100中孵育，经过2小时不间断摇动冰浴后，加入74μl1M Tris/HCl pH7.0终止生物素化反应。继之在4℃用Slide-a-lyzer盒(PIERCE，3500MWCO 0.5-3ml)将该蛋白置于HEPES缓冲液(20mM HEPES pH7.0，150mM NaCl，0.025％Triton-X100)中透析，去除多余的生物素化试剂，从透析盒中取出生物素化的PT，分装后于-20℃保存。
7.用BIAcore仪对生物素化PT进行质量控制
通过BIAcore仪(BIA2000)分析生物素化PT与BIAcore链霉亲和素芯片的相互作用来对生物素化反应进行质量控制，也可以检测去唾液酸胎球蛋白与固定有生物素化PT的芯片的结合(～400RU结合到固定的PT的信号；～100RU非特异性结合到对照细胞)。
F.生物素化PT与链霉亲和素化磁珠和与去唾液酸胎球蛋白结合的分析
1.生物素化PT与链霉亲和素化的磁珠的结合
20μl链霉亲和素化磁珠(Dynal)与20pmole生物素化PT在1xHBS缓冲液中(20mM HEPES pH7.0、150mM NaCl、1mg/ml BSA、100μg/ml鲑精DNA、0.025％Triton-X100)室温孵育1小时，用HEPES缓冲液(20mM HEPES pH7.0、150mMNaCl、0.025％Triton-X100)洗涤3次，并重悬于16μlSDS凝胶上样缓冲液中，取8μl在SDS-PAGE凝胶上进行分析确认结合。在一个同等条件的阴性对照实验中，游离PT(非生物素化)不与链霉亲和素化的磁珠相互作用。
2.去唾液酸胎球蛋白与固定有生物素化PT的磁珠的结合
20μl链霉亲和素磁珠(Dynal)与20pmole生物素化PT在1xHBS缓冲液中室温孵育1小时，用HEPES缓冲液(20mM HEPES pH7.0、150mMNaCl、0.025％Triton-X100)洗涤4次，继之，固定有生物素化PT的磁珠与40pmole的去唾液酸胎球蛋白在HEPES缓冲液中室温孵育1小时，用HEPES缓冲液洗涤磁珠4次后将其重悬于16μlSDS凝胶上样缓冲液中，取8μl在SDS-PAGE凝胶上进行分析确认结合。将生物素化的PT和去唾液酸胎球蛋白同时而不是分期与链霉亲和素化磁珠孵育，也可引起去唾液酸胎球蛋白与生物素化PT的结合。在对照实验中证实，去唾液酸胎球蛋白不与链霉亲和素磁珠非特异性相互作用。对生物素化的PT的类似质量控制中看到，-20℃贮存1周后其与链霉亲和素和/或去唾液酸胎球蛋白的结合力无明显降低，因此，生物素化PT在继后的筛选实验中被用作标准靶物质。
                       实施例2
                    PT选择性肽的分离
匙羹藤抑甜味肽PROfusionTM文库和固定化到磁珠的PT在严格控制的严格性条件下相互接触，在这样的条件下，主要允许文库中与PT有较高亲和力的变异体与靶结合。通过大量洗涤稀释了那些不需要的非特异性结合的变异体后，将结合的PROfusionTM分子从磁珠上洗脱下来，进入新一轮的PROfusionTM生成，正如图2所示。通过一连串的筛选和再扩增以及对严格性条件的适应，一组与靶物质高特异性结合的分子群被富集(10)，继之，该群体的DNA部分被克隆进入大肠杆菌质粒载体，分离出的单一变异体通过序列测定进行详细分析。
用匙羹藤抑甜味肽PROfusionTM文库进行6轮针对固定化PT的筛选，基于以上所述原因，固定到链霉亲和素磁珠上的生物素化PT被用于这些筛选(表1)。在第4轮筛选中，观察到匙羹藤抑甜味肽池与链霉亲和素磁珠的低背景的结合，这可能提示磁珠和/或链霉亲和素结合匙羹藤抑甜味肽变异体开始富集。所以，在接下来的第5轮中，用靶形式的生物素/链霉亲和素固定化的PT和环氧活化磁珠结合的PT分别进行了筛选，在两者中均看到有着清晰背景的校正了的靶结合富集(表1)。在第6轮用生物素/链霉亲和素固定化的PT进行的筛选中清晰地提示PT结合变异体的富集(表1)，从而证实了这一趋势。
A.筛选出的匙羹藤抑甜味肽结合池的克隆
用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将从R4、R5、R6轮筛选出的匙羹藤抑甜味肽DNA池克隆进入pCR2.1-TOPO-载体中。匙羹藤抑甜味肽DNA在不同浓度下与pCR2.1-TOPO-载体连接，对6μl的反应物，分别使用0.5μl、2μl和4μl的匙羹藤抑甜味肽池DNA，反应根据供应商提供的方法进行。
2μl这些连接产物被转化入20μl大肠杆菌Top 10F’感受态细胞(Invitrogen)，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB培养皿上，从各转化中挑选150个单个菌落转种到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的主培养皿上，抑制T7依赖的蛋白表达；同时也转种到另一个含有X-Gal和IPTG的平皿上用于蓝、白菌落筛选。对于各转化，来自抑制的主平皿上的96个对应于蓝白菌落测试的白色菌落的菌落被用于接种96孔LB琼脂板和500μl液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB)中，96孔琼脂板送外进行商业测序，液体培养物与500μl 40％的甘油混合，在液氮下冷冻后贮存于-80℃。
从各个克隆提取质粒DNA，用一个M13引物5’-TGT AAA ACGACG GCC AGT-3’进行自动DNA测序。如图3-8所示，单一序列的匙羹藤抑甜味肽变异体在第4轮筛选中开始富集，第6轮后单一序列占总序列的90％以上，这清楚地表明该变异体可能是对PT结合力最强的变异体。除了这一最主要的序列变异体外，许多其他部分具有共同基序的匙羹藤抑甜味肽序列也被富集，这一发现提示这些其他序列对PT也有结合力。
B.针对固定化的PT的PP26筛选
与针对固定化的PT的6轮匙羹藤抑甜味肽筛选相平行，同时进行了对PP26 PROfusionTM文库的筛选，固定有生物素化的PT的链霉亲和素磁珠在筛选中被使用(表2)，在第4轮筛选中，观察到匙羹藤抑甜味肽池与链霉亲和素磁珠的低背景的结合，这可能提示磁珠和/或链霉亲和素结合PP26变异体开始富集。所以，在接下来的第5轮中，筛选一方面用生物素/链霉亲和素固定化的PT作为靶物质进行，另一方面用环氧活化磁珠结合的PT进行，在两者中均看到有着清晰背景的校正了的靶结合富集(表2)。在第6轮用生物素/链霉亲和素固定化的PT进行的筛选中证实了这一趋势，清晰地提示PT结合变异体的富集(表2)。
C.筛选出的PP26结合子池的克隆
用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将从R4、R5、R6轮筛选出的PP26DNA池克隆进入pCR2.1-TOPO-载体中。不同浓度PP26 DNA与pCR2.1-TOPO-载体连接，对6μl的反应物，分别使用0.5μl、2μl和4μl的匙羹藤抑甜味肽池DNA，反应根据供应商提供的方法进行。2μl这些连接产物被转化入20μl大肠杆菌Top 10F’感受态细胞(Invitrogen)，并涂布到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB培养皿上，从各转化中挑选150个单个菌落转种到含有50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的主培养皿上，抑制T7依赖的蛋白表达，同时将其转种到另一个含有X-Gal和IPTG的平皿上用于蓝、白菌落筛选。对于各转化，来自抑制的主平皿上的96个对应于蓝白菌落测试的白色菌落的菌落被用于接种96孔LB琼脂板和500μl液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和0.5％葡萄糖的LB)中，96孔琼脂板送外进行商业测序，液体培养物与500μl40％的甘油混合，在液氮下冷冻后贮存于-80℃。
D.各单一结合变异体的序列测定
从各个克隆提取质粒DNA，用一个M13引物5’-TGT AAA ACGACG GCC AGT-3’进行自动DNA测序。如9-14所示，在轮番筛选中，两个主要变异体被富集，它们都具有一个共同的保守序列基序。这一发现提示普遍认为的该保守氨基酸的侧链与某些PT表面区域建立有相互直接作用的关系。此外，至少4个其他变异体也被低程度的富集。由于这些变异体不含有以上提到的保守的序列基序，可以得出结论这些变异体可能与PT表面的不同区域结合。
E.筛选出的PT结合匙羹藤抑甜味肽和PP26变异体的确认
由于筛选时用PROfusionTM分子-mRNA-肽融合体，有必要在筛选后的第一步分析测试游离肽对靶的结合力，在下一步骤中，那些已经确认通过肽而不是核酸与靶结合的变异体在AP加工液体存在的条件下进行特异性测试，通过这一过程，那些最适合AP过程的肽应该能被确认。
1.测试游离肽对PT的结合力
单个富集的匙羹藤抑甜味肽和PP26结合变异体的游离肽的定性结合试验用TNT T7偶联的Reticolocyte Lysat System(Promega #5540)进行，方法如下，通过克隆PCR将单一候选结合子DNA从结合子克隆的甘油菌种中扩增出来，为避免PCR过程中的突变，使用了校正性的多聚酶(Pwo)，PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上进行分析，根据供应商的说明，在53μl终反应体积内，5.0μlPCR产物被用作模板通过TNT***用于偶连的体外转录/翻译反应。表达出的候选结合子继而用Ni-NTA鳌合层析(QIAGEN)进行纯化。放射性标记的His-tag纯化的候选结合子(各肽～40-70fmol)与固定于链霉亲和素磁珠的生物素化的PT在室温下孵育1小时，磁珠用HBS缓冲液洗涤3次，重悬于水中并进行液体闪烁计数分析。对照实验候选结合子只与链霉亲和素磁珠(无PT)孵育。PP26结合匙羹藤抑甜味肽的最佳候选结合子(表3和表4)被确认，并用于以下的特异性测试。
2.在有加工液体存在的条件下对匙羹藤抑甜味肽和PP26变异体的特异性测试
为了进行游离匙羹藤抑甜味肽和PP26肽的半定量结合和特异性检测，在有Aventis Pasteur加工液存在的条件下肽首先被生成PROfusionTM形式，再进行纯化，然后用S1核酸酶消化成游离肽。为了扩增出足够量的筛选出的结合子变异体的DNA(10个匙羹藤抑甜味肽克隆和7个PP26克隆)，用TNT表达的PCR产物作为模板进行PCR扩增(94℃，30秒；60℃30秒；72℃，30秒)，10个循环后，取样在2％的琼脂糖凝胶上进行分析。用RiboMax Express体外转录试剂盒将dsDNA(PCR产物)转录成RNA，37℃孵育45分钟后，加入DnaseI37℃继续孵育15分钟，用酚/氯仿抽提该混合物，过量的NTPs用NAP-5凝胶过滤(Pharmacia)去除，用6％的TBU凝胶对RNA进行分析。
纯化的RNA被退火(85℃，1分钟，以0.3℃/秒的速度冷却到25℃)连接到1.5倍过量的嘌呤霉素-寡核苷酸接头PEG2A18：5’-补骨脂内酯-UAG CGG AUG C A18(PEG18-9)2CC嘌呤霉素(斜体显示的核苷酸代表2’-氧-甲基-衍生物，通过紫外光(365nm)在室温下照射15分钟完成共价连接。在6％的TBU凝胶上对反应产物进行分析来确认反应。用Promega的兔网织红细胞裂解物在15μCi35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmole)存在的条件下对已连接好的RNA进行翻译，30℃孵育30分钟后，加入KCl和MgCl2使其终浓度分别为530mM和150mM，取样用4-20％的Tris/甘氨酸-SDS-PAGE进行分析。mRNA-蛋白融合体(PROfusionTM)通过在孵育缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，1mMNaCl，0.25％Triton X-100)中与寡-dT磁珠(Miltenyi)4℃孵育5分钟进行分离。PROfusionTM分子用MiniMACS-柱(Miltenyi)进行过滤分离，用孵育缓冲液洗柱并用水进行洗脱。取样在4-20％Tris/甘氨酸-SDS-PAGE凝胶上进行分析。
为了去除mRNA-蛋白融合体的mRNA部分，根据供应商提供的方法，用S1核酸酶消化经寡dT纯化的分子(S1核酸酶切除嘌呤霉素接头的DNA部分)，S1酶消化前后的PROfusionTM分子在4-12％的Bis/Tris SDS-PAGE凝胶上进行分析。链霉亲和素化磁珠(M280 Dynal)用HBS洗涤，4℃孵育过夜。生物素化PT(900pmole)与900μl链霉亲和素磁珠(已用HBS缓冲液封闭)在室温下孵育1小时。固定化PT后，磁珠用生物素(HBS配制的2mM生物素)封闭1分钟，立即用HBS缓冲液洗涤4次以去除生物素残留。用同样的方法封闭对照磁珠(无PT)。
为了分析筛选出来的肽的结合，设立了几个平行反应，如：阴性对照仅为生物素封闭的链霉亲和素磁珠；阳性对照为固定有PT的链霉亲和素磁珠；背景对照为生物素封闭的磁珠与1/4体积的AventisPasteur样品溶液C(流过1.AF柱)；PT与1/4体积的Aventis Pasteur样品溶液C的混合物；背景对照与生物素封闭的磁珠与1/4体积的Aventis Pasteur样品溶液E(培养基)；PT与1/4体积的Aventis Pasteur样品溶液E的混合物；反应3-6用于观察在Aventis Pasteur提供的样品存在的条件下，筛选出的肽与PT的特异性结合能力。结合反应在有蛋白酶抑制剂混合物存在的条件下室温进行1小时(完全miniTMROCHE)，以避免肽的降解。将磁珠用HBS溶液洗涤后用闪烁计数进行分析。
正如表3所示，10个受试的匙羹藤抑甜味肽变异体中的3个(#9、10、19)显示了PT的靶结合，且不受任何AP加工液体的影响。这些变异体为最有前景的用于AP加工流程的亲和层析的候选者。
正如表4所示，7个受试的PP26变异体中的3个(#5、6、9)显示了对PT的靶结合，且不被AP加工液减少。这些变异体为最有前景的用于AP加工流程的亲和层析的候选者。
                            表3
                匙羹藤抑甜味肽-变异体*的筛选后分析
  #   序列号#   肽序列   试验1   试验2
  1   194227   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCAGSVGHCCEPLECLRRFLNLRWCGSGSSGSS   -   n.d.
  2   194238   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCIVMRAPCCEPLECLRRYMLKHMCGSGSSGSS   -   n.d.
  3   194239   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCKAFRYSCCEPLECLRKWLKARFCGSGSSGSS   -   n.d.
  4   19.4251   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCLRSSIDCCEPLECLYKWMQRRLCGSGSSGSS   -   n.d.
  5   194210   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCWPRRHKCCEPLECLLEMLERKRCGSGSSGSS   -   n.d.
  6   194261   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCMSMACVCCEPLECKYHGYFWLCGSGSSGSS   -   n.d.
  7   194214   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCAVWFDVCCEPLECTYQSGYYWLCGSGSSGSS   -   n.d.
  8   194226   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCEPWYWRCCEPLECVYTSGYYYSCGSGSSGSS   -   n.d.
  9   194259   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCGSGSSGSS   √   √
  12   194297   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCVFYFPNCCEPLECRWVNDNYGWCGSGSSGSS   √   -
  13   194330   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCMSMACVCCEPLECKYHGYFWLCGSGSSGSS   √   -
  14   194479   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCTTASKSCCEPLECKWTNEHFGTCGSGSSGSS   √   -
  15   194511   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGSGSSGSS   √   -
  16   194533   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCGSGSSGSS   √   -
  17   194486   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCARWDLVCCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS   -   n.d.
  18   194668   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCMWSREVCCEPLECYYTGWYWACGSGSSGSS   -   -
  10   194264   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCGSGSSGSS   √   √
  19   194737   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAVDECCEPLECTKGDLGFRKCGSGSSGSS   √   √
  20   194716   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAIDVCCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS   √   n.d.
  21   194720   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAIDVCCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS   -   -
  11   194328   MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCNWVTPMRCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS   √   n.d.
*试验1代表游离肽的靶结合能力(0)，试验2代表在有AP加工液存在的条件下变异体结合的特异性(0)。在两个试验中均呈阳性的有9、10和19。
                            表4
                    PP26-变异体*的筛选后分析
  #   序列号#   肽序列   试验1   试验2
  1   197569   MGRGSHHHHHHARSDWELSPPHVAITTRHLINCTDGPLLRDANAPKASAI   -   n.d.
  2   197536   MGRGSHHHHHHARSLNGESTSNILTTSRKVTEWTGYTASVDANAPKASAI   -   n.d.
  3   197611   MGRGSHHHHHHARSQVTWHHLADTVTTKNRKCTDSYIGWNXANAPKASAI   -   n.d.
  4   197530   MGRGSHHHHHHARSIIVIHNAIQTHTPHQVSIWCPPKHNRDANAPKASAI   -   n.d.
  5   197557   MGRGSHHHHHHARSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDANAPKASAI   √   √
  6   197596   MGRGSHHHHHHARSTMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDANAPKASAI   √   √
  7   197552   MGRGSHHHHHHARSLSALRRTERTWNTIHQGHHLEWYPPADANAPKASAI   -   n.d.
  8   197541   MGRGSHHHHHHARSWTSMQGETLWRTDRLATTKTSMSHPPDAMAPKASAI   -   n.d.
  9   197588   MGRGSHHHHHHARSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDANAPKASAI   √   √
  10   197635   MGRGSHHHHHHARSCLATRNGFV.MNTDRGTYVKRPTVLQDANAPKASAI   √   -
  11   197797   MGRGSHHHHHHARSWGLSGTQTWKITKLATRLHHPEFETNDANAPKASAI   -   n.d.
  12   197888   MGRGSHHHHHHARSWRWHNWGLSDTVASHPDASNSLNMMYDANAPKASAN   -   n.d.
  13   197897   MGRGSHHHHHHLDLWGPPSGSPRTRSTTGTSTTSSPSTPGTLTLRRHPH   -   n.d.
  14   197825   MGRGSHHHHHHARSWQPEVKMSSLVDTSQTVGAAVETRTTDANAPKASA   √   -
  15   198000   MGRGSHHHHHHARSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDANAPKASAI   √   -
  16   197983   MGRGSHHHHHHARSWTSMQGETLWRTDRLATTKTSMSHPPDANAPKASAI   -   n.d.
  17   197998   MGRGSHHHHHHHARSPLWYHYNCWDTICLADWLKDRPHGVYDANAPKASA   -   n.d.
  18   197947   MGRGSHHHHHHARSVGTTIRIAQDTEHYRNVYHKLSQYSRDANAPKASAI   √   -
  19   197954   MGRGSHHHHHHARSVGTTIRIAQDTEHYRNVYHKLSQYSRDANAPKASAI   -   n.d.
  20   197971   MGRGSHHHHHHARSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDANAPKASAI   -   n.d.
*试验1代表游离肽的靶结合能力(0)，试验2代表在有AP加工液存在的条件下变异体结合的特异性(0)。在两个试验中均呈阳性的有5、6和9。
F.通过化学合成的方法制备肽
8个N末端有生物素标记的肽由化学方法合成，该生物素基团通过一个短的亲水接头(PGE2＝8-氨基-3，6-二氧杂辛酸)隔开。这8个肽中的两个(PP26-5c和匙羹藤抑甜味肽-9c)还另外合成了C末端带有生物素化的肽形式(通过一个附加的C末端赖氨酸)。肽根据Sheppard用Fmoc/But策略自动合成，用HPLC纯化后冻干。纯化出来的所有肽的质量都用质谱仪进行确定。合成的各个肽的目标量为5mg纯化肽。纯化后的合成肽的量和纯度在表5中显示。
                            表5
                    百日咳毒素结合肽*的肽合成
  选择   克隆   #   序列   纯度(％)   产率(mg)
  pp26   5c   197557   RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDAK   90-95   7,7
  pp26   5n   197557   RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDA   90-95   7,6
  pp26   6n   197596   RSTMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDA   90-95   6,3
  pp26   9n   197588   RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA   90-95   5,8
  pp26   15n   198000   RSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDA   90-95   4,8
  gurmarin   9c   194259   SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCGK   70   1,0
  gurmarin   9n   194259   SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCG   80-90   4,0
  gurmarin   10n   194264   SGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCG   90-95   4,9
  gurmarin   15n   194511   SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS   90-95   6,3
  gurmarin   19n   194737   SGCVKKDELCELAIDECCEPLECTKGDLGFRKCG   90-95   6,7
*克隆名字内的简写c表示C末端生物素标记肽，简写n表示N末端生物素标记肽。gurmarin表示匙羹藤抑甜味肽。
所有pp26肽溶解于100mM HEPES，pH7.4，200mM NaCl中，终浓度为100μM。所有匙羹藤抑甜味肽溶解于100mM HEPES pH7.4，200mM NaCl、2mM GSH、1mM GSSG中，终浓度为100μM，继之于氮气中孵育至少48小时以使其进行结构折叠。
G.通过细菌表达的肽制备
被确认为百日咳毒素结合子的肽被亚克隆进谷胱甘肽-S-转移酶(GST)框架内用细菌进行表达。GST标记加强了肽的可溶性并且允许用谷胱甘肽琼脂糖凝胶来纯化。被加入的特异性PreScissionTM蛋白酶识别的基因工程酶切位点使GST-标记物能够被除去而释放出肽。PreScissionTM蛋白酶本身是一种GST与14型人鼻病毒(HRV)的融合蛋白，特异性地识别Leu-Phe-Gln*Gly-Pro序列，并在Gln和Gly残基间进行切割。切割反应后，可以用谷胱甘肽琼脂糖凝胶从切割反应物中去除未被切割的产物和蛋白酶。
H.表达载体的构建
1.PP26变异体的GST融合体的构建
作为PCR模板的pCR2.1载体含有被确认的对PT的pp26结合子的序列，用寡核苷酸#467(5’-CATGCCATGGGACGTGGCTCACATCATC-3’)和#468(5’-磷酸化的GGGTTAAATAGCGGATGCCTTCGGAGCGTTAGCGTC-3’)及PwoDNA多聚酶(Roche)进行PCR，其产物用NcoI(New EnglandBiolobs)进行消化，一个改造过的载体(pGEX6P(Amersham/Pharmacia)含有一个附加的NcoI位点)用NcoI/SmaI(New England Biolobs)进行酶切，PCR产物被直接克隆进该载体的NcoI/SmaI位点。在转化进TOP10(Invitrogen)后，用菌落PCP鉴别阳性克隆，再用测序进行确认。
2.匙羹藤抑甜味肽-变异体与GST融合体的构建
作为PCR模板的pCR2.1载体含有被确认的PT的匙羹藤抑甜味肽结合子的序列，用寡核苷酸#464(5’-GGAGATCTCATATGCACCATCACCATCACCATAGTGGC-3’)和#465(5’-磷酸化的GGGTTAAATAGCGGATGCTACTAGGC-3’)及PwoDNA多聚酶(Roche)进行PCR，其产物用NdeI(New EnglandBiolobs)进行消化，一个改造过的载体(pGEX6P(Amersham/Pharmacia)含有一个附加的NcoI位点)用NdeI/SmaI(New England Biolobs)进行酶切，PCR产物被直接克隆进该载体的NcoI/SmaI位点。在转化TOP10(Invitrogen)后，在转化TOP10(Invitrogen)后，用菌落PCR鉴别阳性克隆，再用测序进行确认(表6)。
                        表6
                用于细菌表达的载体
  质粒数   pp26
  pS840   Pgex6P-(His)6-pp26 K5
  pS850   Pgex6P-(His)6-pp26 K6
  pS841   Pgex6P-(His)6-pp26 K9
  pS842   Pgex6P-(His)6-pp26 K15
  匙羹藤抑甜味肽
  pSg36   Pgex6P-(His)6-匙羹藤抑甜味肽K9
  pS837   Pgex6P-(His)6-匙羹藤抑甜味肽K10
  pS838   Pgex6P-(His)6-匙羹藤抑甜味肽K15
  pS839   Pgex6P-(His)6-匙羹藤抑甜味肽K19
3.GST-pp26融合体的表达和纯化
细菌株Rosetta(DE3)pLysS(Novagen)用质粒DNA(见表)转化，该pp26变异体的转化子在37℃ 250rpm生长至OD600约等于0.5时，加入1mM IPTG进行4小时诱导。对于匙羹藤抑甜味肽-GST融合体，诱导条件为0.33mM IPTG 2.5小时。收获细菌后，细胞被重悬于含有1mM 2-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂和1mM溶菌酶的PBS-KMT(10mM磷酸钠，pH7.5、130mM NaCl、3mM KCl、1mM MgCl2、0.1％Tween-20)中，室温孵育30分钟后用超声法破碎细菌。离心后将可溶性上清转入GSH琼脂糖凝胶柱上进行纯化，用10倍柱体积的20mM的Hepes，pH7.5，15mM NaCl洗柱，GST融合蛋白用20mM GSH洗脱，并在SDS凝胶上分析以确定表达。
4.PreScissionTM蛋白酶切除GST-tag而生成肽
PreScissionTM蛋白酶从GST-肽融合体上切割肽的例子如下，GST-tag通过与PreScissionTM蛋白酶孵育(Amersham Pharmacia)切除：2.5mg融合蛋白与160U PreScissionTM孵育，在封闭的含有结合的GST融合蛋白的GSTrap FF柱5℃消化16小时。经过过夜孵育后，第二个GSTrap FF柱被连接上以去除GST-标记的蛋白酶PreScissionTM。以0.2ml的流速上样，流出液以小分装量进行样品收集后在SDS凝胶上电泳，肽含量通过测定OD280计算(约700μg)。
                      实施例3
                    PT的亲和层析
A.在变性凝胶上分析发酵上清
两种加工液被考虑用做亲和层析过程的起始物：
样品A浓缩的培养过滤物，含10-50μg/ml(～0.09-0.45μM)粗PT，发酵上清
样品B含9-45μg/ml(～0.08-0.4μM)粗PT的吸附层析上清为了了解这些加工液的复杂成分，两种样品均用变性聚丙烯酰胺凝胶进行了电泳，样品A中的主要高分子量成分通过吸附层析后被去除(样品B)。
B.将合成的生物素化核心肽固定化到链霉亲和素琼脂糖上并证明与纯化后的PT结合
1.肽固定到链霉亲和素琼脂糖凝胶
为了使生物素化肽与链霉亲和素琼脂糖凝胶(Amersham HighPerFormance 71-5004-40)结合，200μl 50％的经过洗涤的链霉亲和素琼脂糖凝胶匀浆与1nmole的肽(100μM肽溶液的10μl)在1ml HEPES缓冲液中(20mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，0.025％TritonX-100)4℃孵育，在该种使用条件下，高结合力的链霉亲和素琼脂糖凝胶应该能使100％的生物素化肽(10pmole 肽/μl包装的琼脂糖凝胶)固定化。
2.纯化的PT结合到固定化的肽
200μl结合有肽的琼脂糖凝胶(10％ige匀浆，含约～200pmol固定化肽)被转移到Mobicol柱(MoBitec 10μM滤器)，2000rpm离心1分钟去除上清，用HEPES缓冲液洗涤4次后，琼脂糖凝胶被重悬于含有100pmol的纯化了的百日咳毒素的200μl HEPES缓冲液中，在转轮上室温孵育1小时。未结合的组分通过离心分离(结合后的上清，用于凝胶分析)，继之，肽-链霉亲和素琼脂糖凝胶用冷HEPES缓冲液洗涤3次(各200μl)，重悬于20μl上样缓冲液中(30mM Tris，pH6.8，1％SDS，1％-β-巯基乙醇，12.5％甘油，0.005％溴酚蓝)洗脱结合的PT，经过95℃5分钟孵育，离心收集上样缓冲液，继而用于凝胶分析(图15)。作为对照，不带肽的链霉亲和素琼脂糖凝胶在同等条件下与PT结合，在本使用条件下，百日咳毒素肽结合子克隆pp26 5n、5c、9n、15n和匙羹藤抑甜味肽克隆10n、19n、15n、9n清晰地显示出与纯化的PT结合，所有阳性候选结合子都能与完整的六聚体PT结合。
C.将合成的生物素核心肽固定到链酶亲和素琼脂糖凝胶并证实其与发酵上清中的PT结合
肽固定到链酶亲和素琼脂糖凝胶并结合到发酵上清中的PT的分析用0章中描述的方法进行，但不同的是肽链霉亲和素琼脂糖凝胶与200μl样品A(发酵液上清)或与200μl样品B(吸附层析上清柱，见0章)孵育，继之用HEPES缓冲液室温洗涤4次。结合分析的结果见图16。在该使用条件下，百日咳毒素pp26结合子克隆9n、15n和匙羹藤抑甜味肽克隆9n、15n能够非常有效地与发酵上清样品A和样品B中的完整PT六聚体结合，注意在该使用条件下，pp26结合子克隆5和匙羹藤抑甜味肽结合子克隆10和19可能与PT的结合力较低，虽然在该使用条件下，未见PT与样品A和样品B中的这些肽结合，这些结合子可能仍然可以用作亲和层析柱的配体(柱子通过再结合效应允许保留PT，这样可以将Koff值问题降到最低)。
D.固定化肽的热动力数据
为了估计肽的结合力，20pmol的琼脂糖固定的肽与过量的100pmolPT在200μl HEPES缓冲液(相当于500nM PT)中孵育。经洗涤后，肽-链霉亲和素琼脂糖凝胶结合PT组分通过凝胶进行定量，这可以直接计算在该使用条件下(推测PT/肽结合比率为1∶1)的结合活性肽的组分。经推测，500nM PT的浓度已足以达到与所有肽的Bmax，分析结果在表7中显示。这里显示的数值是对这些肽的预期结合能力的估计值。对最合适的结合子的结合能力(Bmax)和解离常数(KD)的确切评估也可以进行。
                        表7
        在该使用条件下的结合活性肽的组分一览
  肽名称  pp26 5n   pp26 9n   pp26 15n   gurm 9n   gurm 10n   gurm 15n   gurm 19n
  结合活性肽的组分  ＞5％1   ＞50％   ＞12.5％   ＞12.5％   ＞5％1   ＞50％   ＞5％1
1表示计算困难，因为信号接近能检测到的低限。
E.纯化的百日咳毒素六聚体在已知缓冲液条件下(pH，盐浓度、去污剂)的稳定性分析，用可接受的质量等级的原材料对照卫生当局的要求进行
在一个广泛的pH和盐条件的范围内，用BIAcore2000仪检测百日咳毒素六聚体的稳定性。为了这一目的，生物素化PT的～2000RU被上样到链霉亲和素芯片上，继之，不同的缓冲液以30μl/分钟的流速加入固定有PT的芯片2分钟，各缓冲液注射完毕后，芯片用HBS/EP电泳缓冲液(0.01MHEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％聚山梨酯20(v/v)进行平衡，流速30μl/分钟至少2分钟)。缓冲液注入前和后测到的RU信号的变化与芯片上的PT六聚体的降低相关。这种降低被解释为在该缓冲液条件下PT六聚体的稳定性的丧失。
分析的PH范围为pH2-10.5，用以下缓冲液进行：10mM甘氨酸缓冲液(BIAcore，pH2、2.5、3)，10mM醋酸缓盐冲液(BIAcore，pH4、4.5、5、5.5)，和100mM碳酸盐缓冲液(pH9.6、10.5)。产生的BIAcore传感图显示了pH对PT六聚体稳定性的影响，BIAcore分析的结果总结于表8中。在该使用条件下，百日咳毒素六聚体在pH2.5到10.5的宽泛范围内是稳定的。
                            表8
            在不同pH条件下百日咳六聚体的稳定性
  pH   2   2.5   3   4   4.5   5   5.5   8.5   9.6   10.5
  PT六聚体稳定性(％)   93   98   100   100   100   100   100   100   98   95
通过对比实验，用BIAcore 2000仪分别对pH 5.0(10mM醋酸盐缓冲液)和pH 8.5(50mM Tris/HCl)条件下不同浓度的NaCl、KCl和MgCl2对PT六聚体的稳定性的影响进行了研究。在该使用条件下盐浓度对PT六聚体的影响在表9中显示。在含高达2.5M NaCl或高达2M KCl的缓冲液(pH5和8.5)中，六聚体是稳定的。对MgCl2来说，PT六聚体在含高达2M MgCl2的缓冲液中是稳定的。
                表9
在不同盐条件下百日咳毒素六聚体的稳定性
  PT六聚体稳定性   pH 5   pH 8.5
  NaCl   0-2.5M   0-2.5M
  KCl   0-2.0M   0-2.0M
  MgCl2   ND   0-2.0M
F.从发酵上清中特异性亲和纯化PT的洗涤和洗脱条件(pH、盐浓度、去污剂)的建立
在确定百日咳六聚体在什么条件下稳定后，下一步即是研究百日咳毒素结合到固定化的肽pp26克隆9和15和匙羹藤抑甜味肽克隆9和15的洗涤和洗脱条件
1.用BIAcore2000仪评价PT/肽稳定性
在已知不会影响PT六聚体稳定性的不同的pH和盐条件下，用BIAcore 2000仪测定PT/肽复合物稳定性。500-1000RU的合成肽被固定到链霉亲和素芯片上，为了使PT结合到固定的肽上，20nM在HEPES中的纯化PT在1分钟内注入。用HBS/Ep电泳缓冲液(0.01MHEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％聚山梨酯20(v/v))平衡后，PT/肽复合物通过注入以下液体洗涤。
(a)100mM碳酸盐缓冲液pH 10.5和9.5
(b)10mM醋酸盐缓冲液pH 5.5，5.0，4.5和4.0
(c)10mM甘氨酸缓冲液pH 3.0和2.5
(d)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的10mM醋酸盐缓冲液pH 6.0，
(e)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的50mMTris/HCl缓冲液，pH8.5，
(f)含0.5、1.0、1.5、2.0M KCl的10mM醋酸盐缓冲液pH 6.0，
(g)含0.5、1.0、1.5、2.0M KCl的50mM Tris/HCl缓冲液，pH8.5，
(h)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的10mM醋酸盐缓冲液，pH 6.0，
(i)含0.5、1.0、1.5、2.0M NaCl的50mM Tris/HCl缓冲液，pH8.5.
在各种缓冲液注入完毕后，用BBS/Ep电泳缓冲液平衡芯片，在该使用缓冲液条件下(注射前后测定RU信号的不同)芯片上PT六聚体的丧失反应出PT/肽复合物的稳定性。所有PT/肽复合物的pH稳定范围和盐稳定范围总结于表10中。所有PT/肽复合物在100mM碳酸盐pH10.5和10mM甘氨酸pH2.5的条件下完全不稳定。对于匙羹藤抑甜味肽9，含有2.5M NaCl或至少0.5M MgCl2的缓冲液会干扰PT/肽复合物的稳定性。PT与匙羹藤抑甜味肽15的复合物在至少1.5MMgCl2的50mM Tris/HCl缓冲液(pH8.5)存在下尤其不稳定。
                                表10
                  不同pH和盐条件对PT/肽复合物的影响效应
  pp26肽9   pp26肽15   匙羹藤抑甜味肽9 匙羹藤抑甜味肽15
  pH范围复合物稳定性   3-9稳定，在pH2.5或10.5不稳定   3-9稳定，在pH2.5或10.5不稳定   3-9稳定，在pH2.5或10.5不稳定 3-9稳定，在pH2.5或10.5不稳定
  pH6   pH8.5   pH6   pH8.5   pH8.5 pH6   pH8.5
  NaCl复合物稳定性   2M稳定   2M稳定   2M稳定   2M稳定   对盐非常敏感 对盐敏感
  KCl复合物稳定性   2M稳定   2M稳定   2M稳定   2M稳定   对盐非常敏感 对盐敏感
  MgCl2复合物稳定性   稳定   从125mM敏感，完全洗脱≥2M   直到2M稳定   洗脱≥1.5，但不完全   洗脱≥0.5M 洗脱≥1M，完全洗脱≥2M   洗脱≥1M，完全洗脱≥2M
2.评估纯化肽链霉亲和素琼脂糖上的PT的洗涤条件使用的洗涤条件尽可能与已建立的用于纯化去唾液酸胎球蛋白的百日咳毒素的条件近似(用50mM Tris/HCl pH7.5洗涤，加或不加1M NaCl)，对肽pp26克隆9和15及匙羹藤抑甜味肽克隆9和15的百日咳毒素的纯化方法进行了优化，200pmol的各种肽固定于20μl的琼脂糖凝胶与100μl的50mM Tris/HCl pH7.5和100μl的样品A或样品B孵育，使其与PT结合，继而用以下3种不同的洗涤条件对结合了PT的琼脂糖肽组分进行洗涤：
(a)200μl 50mM Tris/HCl pH7.5洗涤3次
(b)200μl 50mM醋酸盐 pH6.0洗涤3次
(c)200μl 50mM醋酸盐 pH6.0洗涤6次
洗涤后，用20μl上样缓冲液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巯基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚蓝)将残留在琼脂糖凝胶上的物质洗脱下来，所有洗脱物在12％的Bis-Tris-凝胶(MES电泳缓冲液)电泳并银染显色进行分析(图17)。
用50mM醋酸盐pH6.0洗涤比用50mM Tris/HCl pH7.5更严格，对于减少高分子杂质背景更有效。但在这样的洗涤条件下PT/肽复合物不太稳定，特别是匙羹藤抑甜味肽9用150mM醋酸盐pH6.0(洗涤6次)时。与50mM Tris/HCl pH7.5相比，用50mM醋酸盐pH6.0重复洗涤10至20次后，固定有PT的肽的丧失更加突出(以pp26肽9为例于图18中显示)。
3.评估肽链霉亲和素琼脂糖上PT的纯化的洗脱条件
在与六聚体稳定性相容的条件下测试从肽琼脂糖凝胶上洗脱PT。
a.通过MgCl2进行洗脱
正如以上BIAcore2000测定所示，所有PT/肽复合物对2M的MgCl2是敏感的，但PT六聚体的稳定性并不受其太大影响。一定浓度的MgCl2对通过固定化的4个合成肽之一结合于链霉亲和素琼脂糖凝胶上的PT的洗脱效率进行了评估。被固定化到20μl琼脂糖凝胶上的400pmol各种肽与100μl50mM Tris/HCl pH7.5和100μl样品A孵育使其与PT结合。在用50mM Tris/HCl pH7.5(每次200μl)洗涤4次后，结合了PT的组分用连续的3次20μl下列溶液洗脱：
(a)含0.2M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或
(b)含0.5M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或
(c)含1.0M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或
(d)含1.5M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，或
(e)含2.0M MgCl2的50mM Tris/HCl pH8.5，
残留的物质随后用20μl上样缓冲液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巯基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚蓝)洗脱。所有洗脱液在12％的Bis-Tris-Gels(MES电泳缓冲液)电泳并银染显色进行分析(图19)。正如实验所示，用MgCl2进行洗脱对匙羹藤抑甜味肽比pp26肽更为有效，尽管大量的PT仍然滞留在肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上。
b.通过改变pH进行洗脱
BIAcore测定显示PT可以在对PT六聚体的稳定性无严重影响的酸性(pH2.5)或碱性(pH10.5洗脱)缓冲条件下从所有肽中洗脱(50mM甘氨酸，pH2.5较100mM碳酸盐pH10.5缓冲液对PT六聚体更温和，见xxx)。各种200pmol固定于20μl琼脂糖凝胶的肽与100μl 50mMTris/HCl pH7.5和100μl样品A孵育，使其与PT结合。在用50mMTris/HCl pH7.5(每次200μl)洗涤4次后，连续3次用40μl 50mM甘氨酸pH2.5或100mM碳酸盐pH10.5缓冲液从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上洗脱PT。残留的物质随后用20μl上样缓冲液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巯基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚蓝)从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上洗脱。所有洗脱液通过PAGE在12％的Bis-Tris-Gels(MES电泳缓冲液)电泳并银染显色进行分析(图20)。使用50mM甘氨酸pH2.5以及100mM碳酸盐缓pH10.5缓冲液，几乎所有的PT都能从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上洗脱下来。
4.将优化后的条件用于小规模纯化方案，确认结合力
a.在优化后的洗涤和洗脱条件下从样品B中纯化PT(4μl柱)
优化后的洗涤和洗脱条件结合在一起用于从样品B中纯化肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上的PT。为了降低PT的非特异性结合，先前就对各种肽的肽与链霉亲和素琼脂糖凝胶的比率进行了优化，继之，根据PT的高收率与预测的每肽的高(适中)投入之比对样品B与肽链霉亲和素琼脂糖凝胶比率也进行了优化，这些条件被用于以下小规模柱纯化。
对于pp26肽9和匙羹藤抑甜味肽15，用16μl链霉亲和素琼脂糖凝胶与1600pmol肽孵育将其固定于链霉亲和素琼脂糖凝胶上，对pp26肽15，16μl链霉亲和素琼脂糖凝胶与6000pmol肽(pp26/15与链霉亲和素琼脂糖凝胶结合效率较低，可能是因为肽生物素化不完全)孵育，对匙羹藤抑甜味肽9，8000pmol被固定到80μl链霉亲和素琼脂糖凝胶上，继之，洗过的肽链霉亲和素琼脂糖凝胶被均分到4个Mobilcom柱(用10μM滤器)。
各柱(含4μl带有400pmol的pp26/9和gur/15琼脂糖凝胶；4μl带有不定量的结合肽pp26/15；20μl带有2000pmol的肽gur/9)与400μl样品B(加入HCl调节pH7.0-7.5)孵育使其与PT结合。用50mMTris/HCl pH7.5(每次100μl)洗涤5次后，PT从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶通过连续洗脱被洗脱下来(pp26/9和gur/15洗脱3次，pp26/15和gur/19洗脱4次)，洗脱液如下：
(a)1号柱用50mM甘氨酸pH2.5(每次20μl)，或
(b)2号柱用100mM碳酸盐缓冲液pH10.5(每次20μl)，或
(c)3号柱用含2M MgCl2的50mMTris，pH10.5(每次20μl)
1-3号柱和4号柱的残留物质用上样缓冲液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巯基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚蓝)从肽链霉亲和素琼脂糖上洗脱。所有洗脱液通过PAGE在12％的Bis-Tris-Gels(MES电泳缓冲液)电泳并银染显色进行分析(图21、22)。为了计算从肽链霉亲和素琼脂糖凝胶上纯化得到的PT产率，将洗脱液1-3合并后用PAGE凝胶电泳并银染，然后对比同一凝胶上的已知量的PT来进行估计(图21B和22B)。根据凝胶估计值，纯化的PT产率在表11中显示。
                                    表11
用pp26肽9或匙羹藤抑甜味肽15作为亲和配体小规模纯化样品B后百日咳毒素的产率计算
  肽   洗脱所用   从图13B和14B估计   PT总收率   相对于样品B*中PT投入的收率   相对于琼脂糖结合肽量的收率
  pp26肽9   甘氨酸pH2.5   在3/120合并的洗脱液中含2pmol PT   80pmol   ＞48％   20％
  碳酸盐pH10.5洗脱液   在3/120合并的洗脱液中含2pmol PT   80pmol   ＞48％   20％
  MgCl2   在3/120合并的洗脱液中含1pmol PT   20pmol   ＞12％   5％
  匙羹藤肽15   甘氨酸pH2.5   在3/120合并的洗脱液中含2pmol PT   80pmol   ＞48％   20％
  碳酸盐pH10.5洗脱液   在3/120合并的洗脱液中含2pmol PT   80pmol   ＞48％   20％
  MgCl2   在3/120合并的洗脱液中含1pmol PT   40pmol   ＞48％   10％
根据PT相关的资料，预计的样品B的PT浓度为9-45μg/ml，相应于0.8-0.41pmol/μl。根据下式计算：400μl的样品B×0.41pmol/μl＝164pmol投入PT
b.用不同肽密度的链霉亲和素琼脂糖凝胶进行亲和纯化确定PT产量
在不同浓度的固定有链霉亲和素琼脂糖凝胶作为亲和配体的肽的条件下对PT与肽链霉亲和素琼脂糖凝胶的结合进行了研究，1μl链霉亲和素琼脂糖凝胶与递增量的pp26/9肽或匙羹藤抑甜味肽/15(100、200、300、400、500、1000pmol)进行孵育以固定化。未结合的肽组分通过用50mM Tris/HCl pH7.5洗涤(柱上)3次从琼脂糖凝胶上去除。继而，各种肽链霉亲和素基质与600μl样品A孵育以结合PT。80分钟后各种基质用50mM Tris/HCl pH7.5洗涤4次(每次200μl)，随后用20μl凝胶上样缓冲液(30mM Tris pH6.8、1％SDS、1％β-巯基乙醇、12.5％甘油、0.005％溴酚蓝)95℃孵育10分钟进行洗脱，洗脱液通过PAGE用12％的Bis-Tris-Gels(MES电泳缓冲液)电泳并银染显色进行分析(图23)。结合到肽链霉亲和素琼脂糖凝胶的PT的量通过密度测量进行评估并将其绘制为用于固定到链霉亲和素琼脂糖凝胶的肽起始用量的函数(图23显示pp26/9的情况)。当300-400pmol肽用于固定到1μl链霉亲和素琼脂糖凝胶时，PT的结合达到最大。肽量继续增加，PT的结合不随之增高，这可能反应了PT的立体阻碍效应。
用上样缓冲液洗脱(95℃加热10分钟)后，通过PAGE用12％的Bis-Tris-Gels(MES电泳缓冲液)进行电泳并银染显色，评估了400pmol肽用于固定到1μl链霉亲和素时肽(pp26/9或匙羹藤抑甜味肽/15)的有效结合组分，洗脱的肽量直接与同一凝胶上的已知量的纯化的PT进行比较来估计(数据未显示)：pp29/9：100-150pmol；匙羹藤抑甜味肽/15：50pmol。
c.用不同量的样品B在恒定浓度的肽琼脂糖凝胶进行亲和纯化时确定PT产率
用400pmol pp26/9或匙羹藤抑甜味肽/15与1μl链霉亲和素琼脂糖凝胶室温孵育1小时以使肽固定，用200μl50mM Tris/HCl pH7.5洗涤肽琼脂糖凝胶3次，继之与不同量的样品B(50、66、100、200、400、600μl，通过加入HCl调节pH至7.0-7.5)室温孵育1小时，用100μl50mM Tris/HCl pH7.5洗涤亲和基质4次，然后用100mM碳酸盐缓冲液pH10.5连续洗脱4次(每次20μl)。5μl合并的洗脱液(共80μl)通过PAGE用12％的Bis-Tris-Gels(MES电泳缓冲液)电泳并银染显色，洗脱的PT量通过与确定量的同一凝胶上的作为分子量标准的纯化后的PT进行直接比较来计算(图24，表12)。
                          表12
  投入肽16K9(pmol)   投入PT(pmol)   肽∶PT比率   PT结合量(pmol)   相对于PT投入量的PT产率
  100   300   1∶3   ～100   33％
  100   200   1∶2   ～88   44％
  100   100   1∶1   ～40   40％
  100   50   2∶1   ～4   48％
  100   33,3   3∶1   ～16   48％
  100   25   4∶1   ～24   96％
  投入肽17K15pmol)   投入PT(pmol)   肽∶PT比率   PT结合量(pmol)   相对于PT投入量的PT产率
  100   300   1∶3   ～80   27％
  100   200   1∶2   ～64   32％
  100   100   1∶1   ～56   56％
  100   50   2∶1   ～16   32％
  100   33,3   3∶1   ～16   32％
  100   25   4∶1   ～8   32％
  投入脱唾液酸胎球蛋白(pmol)   投入PT(pmol)   肽∶PT比率   PT结合量(pmol)   相对于PT投入量的PT产率
  100   200   1∶2   ～8   4％
  100   100   1∶1   ～16   16％
  100   85,6   20∶17   ～8   9％
  100   50   2∶1   ～8   16％
  100   33,3   3∶1   ～8   24％
  100   25   4∶1   ～8   35％
为了对比肽链酶亲和素琼脂糖凝胶与去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶的纯化效率，在可比条件下用去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶进行了平行的滴定实验(每次反应时同样量的亲和配体固定到琼脂糖凝胶，相当于约100pmol亲和配体有效地结合到琼脂糖凝胶上)。该实验通过6.85μl去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶(批号：FA053198：密度1.1mg/ml，14.6pmol/μl)与不同量的样品B(50、66、100、173.3、200、400μl，用HCl将pH调节到7.0-7.5)室温孵育1小时完成。继之，对去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶进行洗涤，将结合的PT洗脱，并如以上所描述的那样进行分析。在所用纯化条件下，肽链酶亲和素琼脂糖凝胶的结合效率明显高于去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶。
d.再利用的肽琼脂糖凝胶用于PT的多次结合和洗脱
为了研究载有肽的琼脂糖凝胶(pp26/9和匙羹藤抑甜味肽/15)多次反复用于PT的结合和洗脱的再利用情况，将该琼脂糖凝胶用于PT的结合、洗脱和再生的重复循环中(总共4次)。将600pmol pp26/9或匙羹藤抑甜味肽/15与2μl链酶亲和素琼脂糖凝胶室温孵育过夜进行固定，继而用HEPES缓冲液洗涤3次。为了结合PT，各肽链酶亲和素琼脂糖凝胶与400μl样品B(通过加入HCl调节pH至7.0-7.5)室温孵育1小时，然后用50mM Tris/HCl pH7.5洗涤4次(每次200μl)，PT用100mM碳酸盐缓冲液连续4次洗脱(每次20μl)。继之，该柱基质用10mM HCl(1×20μl，2×100μl)洗涤3次再生，再用200μl 50mMTris/HCl pH7.5洗涤2次进行中和。这种结合、洗脱和再生过程在同一肽链酶亲和素琼脂糖凝胶上再进行3次。4μl合并的洗脱液(共80μl)和7μl来自各结合/洗脱/再生循环的首次再生缓冲液通过PAGE在12％的Bis-Tris-Gels(MES电泳缓冲液)上进行电泳并银染显色，提示肽链酶亲和素琼脂糖凝胶可以再利用(图25)。
5.扩大规模的FPLC纯化PT
优化后的PT结合和洗脱条件用于扩大规模FPLC纯化(0.5ml柱)，如以下所示：
A)生物素化肽固定到链酶亲和素琼脂糖凝胶上：200nmol肽pp26/9与含于10ml HEPES缓冲液中的1ml 50％的链酶亲和素琼脂糖凝胶在摇轮上室温孵育1小时30分钟，孵育后琼脂糖凝胶用50mMTris/HCl pH7.5洗涤3次。
B)结合PT(从样品B中)：估计有效固定于500μl琼脂糖凝胶上的肽量为50nmol，该肽琼脂糖凝胶与25ml样品B在head over tail摇床上室温孵育1小时30分钟(推测PT浓度为约0.5pmol，相当于25ml中有12.5nmol，相当于固定的肽与PT量的比率为4∶1)。
C)FPLC柱：孵育后，琼脂糖凝胶被转移到柱中(Pharmacia HR5/5)，在装柱过程中，琼脂糖凝胶用50mM Tris/HCl pH7.5(2-3ml)洗涤，继之将柱子连接到液流通道上用20倍柱体积(10ml)的50mM Tris/HClpH7.5洗涤。固定化的PT用11ml 100mM碳酸盐缓冲液pH10.5洗脱，收集500μl的洗脱组分(Pharmacia Fraction Collector FRAC-100)，通过紫外280nm的吸收值来评估洗脱图谱。洗脱完成后，柱子用1.5ml50mM Tris/HCl pH7.5洗涤，然后用2.5ml 10mM HCl进行再生处理并用10ml 50mM Tris/HCl pH7.5进行中和。
D)分析洗脱组分并计算产率：洗脱组分用PAGE凝胶(2％的Bis-Tris-Gels，MES电泳缓冲液)进行分析并银染显色(图26)，PT的浓度根据测定洗脱组分在280nm时的吸收值并与用纯化PT绘制的校正曲线进行对比来确定(见图26中的表)。
PT的量根据与在同一凝胶上的已知量的纯化的PT的分子量标准进行直接比较而另外计算。通过凝胶估计得到的结果是PT产率为8100pmol。这一结果与用A280得到的浓度结果有很好的相关性。假如推测25ml样品B含有1125μgPT，在这些条件下，69-72％的PT被洗脱下来。这一结果在用再生的相同的肽琼脂糖凝胶结合25ml样品中的PT的FPLC纯化时得到了证实，在这个实验中，803μgPT被纯化出来(A280)(表13)。
                   表13
 根据A280确定洗脱组分中(FPLC批次#2)的PT浓度
  A280   μg/ml
  Elu1   0   0
  Elu2Elu3Elu4Elu5Elu6Elu7Elu8Elu9Elu10Elu11Elu123-12总和   00.0910.41850.3540.28350.2120.1480.09750.05850.03150.025   08539133126519813891552923＝803μg
                                    表14
                                PT纯化结果总结
12×0.5ml(6ml)组分中PT产率   相对于PT加入量的相对产率(25ml含1125μg)(pmol/pmol或μg/μg) 纯度
1.纯化批次 772-813μg 69％-72％   与去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶纯化相比100％
2.纯化批次 803μg 71％   与去唾液酸胎球蛋白琼脂糖凝胶纯化相比100％
6.评估pp26肽9/百日咳毒素复合物形成的平衡和速率常数
pp26K9/PT复合物形成的平衡常数和速率常数通过BIAcore2000仪在室温下用HBS/EP电泳缓冲液(0.01HEPES pH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005％(v/v)聚山梨酯20)来评估。不同浓度的pp26-K9(浓度在2.5nM到100nM之间)与固定到CM5芯片上的PT结合(通过胺连接法固定6000RU)，在30μl/分钟的流速条件下进行分析。结合于肽上的PT的定量洗脱用3mM HCl，pH2.5来获得。推论的平衡和速率常数用BIA评估软件来进行分析，结果显示如下：
解离平衡常数KD→7.5×10-9M
缔合平衡常数KA→1.3×10-8M-1
缔合速率常数Kon→1.3×105M1×s-1
解离速率常数Koff→10-3s-1
本发明是以优选方案的角度来进行描述的，可以理解本领域的技术人员可能对其进行改变或修改。因此，所附的权利要求有意覆盖所有在本发明要求保护的范围内的这些等价的改变。

Claims (50)

1.一种有能力结合百日咳毒素的肽，所述肽选自：
RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDA(pp26-5)；
RSTMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDA(pp26-6)；
RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(pp26-9)；
RSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDA(pp26-15)；
SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCG(G-9)；
SGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCG(G-10)；
SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)；和
SGCVKKDELCELAIDECCEPLECTKGDLGFRKCG(G-19).。
2.权利要求1的肽，其中所述肽是：
RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(pp26-9)；或
SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-15)
3.一种产生DNA-肽融合体的方法，所述方法包括：
(a)将核酸逆转录引物共价结合到编码肽的RNA上，所述逆转录引物与肽受体结合；
(b)翻译所述RNA产生肽，该肽与逆转录引物共价结合；
(c)逆转录所述RNA形成DNA-肽融合体；
其中所述肽对百日咳毒素有结合亲和力。
4.一种产生DNA-肽融合体的方法，所述方法包括：
(a)产生RNA-肽融合体；
(b)将核酸逆转录引物与所述融合体杂交；
(c)将所述引物共价结合到所述融合体上；
(d)逆转录所述RNA-肽融合体中的RNA形成DNA-肽融合体；
其中所述肽对百日咳毒素有结合亲和力。
5.一种产生DNA-肽融合体的方法，所述方法包括以下步骤的组合：
(a)提供共价结合到肽受体上的RNA分子；
(b)将核酸逆转录引物共价结合到步骤(a)中的分子上；
(c)翻译所述RNA分子生成肽，并
(d)逆转录所述RNA分子形成DNA-肽融合体；
其中所述肽对百日咳毒素有结合亲和力。
6.一种DNA-肽融合体，所述融合体用权利要求3、4或5中的方法制备。
7.一种对百日咳毒素具有亲和力的肽，所述肽用权利要求3、4或5的方法鉴别。
8.权利要求1、2或7中任一项的肽，其中所述肽被生物素化。
9.一种纯化百日咳毒素的方法，所述方法包括用结合到固体支持体上的权利要求1、2或7中至少一项的肽与含有百日咳毒素的生物溶液接触而形成百日咳毒素-肽复合物并将该复合物从生物溶液中的其他成分中分离出来。
10.权利要求9的方法，其中百日咳毒素从复合物中释放出来并被分离。
11.权利要求10的方法，其中通过改变复合物周围环境的pH值而将百日咳毒素从该复合物中释放出来。
12.权利要求11的方法，其中复合物被暴露于具有酸性pH的溶液中。
13.权利要求11的方法，其中复合物被暴露于具有碱性pH的溶液中。
14.权利要求10的方法，其中通过改变复合物周围环境的离子强度而将百日咳毒素从该复合物中释放出来。
15.权利要求14的方法，其中通过将复合物暴露于具有高浓度的一种或多种离子盐的溶液而改变离子强度。
16.权利要求15的方法，其中离子盐为氯化钠或氯化镁中的至少一种。
17.权利要求16的方法，其中离子盐为氯化镁。
18.权利要求9-17中任一项的方法，其中所述固体支持体为微珠。
19.权利要求9-17中任一项的方法，其中所述固体支持体包含琼脂糖凝胶。
20.权利要求19的方法，其中所述固体支持体由链霉亲和素琼脂糖凝胶构成。
21.权利要求20的方法，其中肽被生物素化，并且肽通过肽上的生物素部分与链霉亲和素琼脂糖凝胶上的链霉亲和素部分相互作用而结合到所述固体支持体上。
22.一种分离DNA-肽融合体的方法，其中肽对百日咳毒素有结合亲和力，所述方法包括以下步骤的组合：
(a)将核酸逆转录引物共价结合到编码肽的RNA上，所述逆转录引物结合到肽受体上；
(b)翻译RNA生成肽，该肽共价结合于逆转录引物，并且
(c)逆转录RNA形成DNA-肽融合体；
(d)将该DNA-肽融合体与结合到固体支持体上的百日咳毒素接触形成DNA-肽融合体-百日咳毒素复合物；
(e)将该复合物从那些未与百日咳毒素形成复合物的DNA-肽融合体中分离出来；并且
(f)从DNA-肽融合体-百日咳毒素复合物中分离DNA-肽融合体。
23.一种鉴别具有百日咳毒素结合亲和力的肽的方法，该方法包括实施权利要求22的方法，并且进一步确定该DNA-肽融合体的肽部分的氨基酸序列。
24.一种鉴别编码具有百日咳毒素结合亲和力的肽的DNA的序列的方法，该方法包括实施权利要求22的方法，并且进一步确定该DNA-肽融合体的DNA部分的核苷酸序列。
25.一种免疫组合物，含有通过权利要求10的方法分离的百日咳毒素。
26.一种具有与百日咳毒素结合能力的肽，该肽的氨基酸序列显示于图3-14任一幅中。
27.权利要求3-5或9-24中任一项的方法，其中百日咳毒素结合肽的氨基酸序列包括衍生自匙羹藤抑甜味肽或PP26的氨基酸序列。
28.权利要求3-5或9-24中任一项的方法，其中编码百日咳毒素结合肽的核苷酸序列包括衍生自匙羹藤抑甜味肽或PP26的核苷酸序列。
29.一种具有与百日咳毒素结合能力的肽，包含氨基酸序列LGHGLGYAY。
30.权利要求29的肽，进一步包含氨基酸序列ELAVD、ELAID或ARWDLV。
31.一种具有与百日咳毒素结合能力的肽，包含氨基酸序列TTASKS或KWTNEHFGT中的至少一种。
32.权利要求31的肽，包含氨基酸序列TTASKS和KWTNEHFGT。
33.一种具有百日咳毒素结合能力的肽，包含选自以下的氨基酸序列：
NVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDD，
VGTTIRIAQDTEHYRNVYHKLSQYSR，
WTSMQGETLWRTDRLATTKTSMSHPP，
LSALRRTERTWNTIHQGHHLEWYPPA，
LSRLARTERTWDRIHQGHHLEWHPPA，
TMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSI，
LSALMRTERTWNTIHQGHHLEWYPPA，
CLATRNGFVMNTDRGTYVKRPTVLQ，
CLATRNGFVQMNTDRGTYVKRPTVLQ
35.一种具有百日咳毒素结合能力的肽，包含氨基酸序列
XXAXRXXXXXXNTXXXXXXXXXT或
XXAXRXXXXXXNTXXXXXXXXXY，其中X为任何氨基酸。
36.一种具有百日咳毒素结合能力的肽，包含VXXXXXXXXDTXXXXRXXXXXLS的氨基酸序列，其中X为任何氨基酸。
37.权利要求29-36中任一项的肽，其中至少一个氨基酸被保守性替代。
38.权利要求29-37中任一项的肽，其中肽被生物素化。
39.一种纯化百日咳毒素的方法，该方法包括用结合到固体支持体上的权利要求29-38中至少一项的肽与含有百日咳毒素的生物溶液接触而形成百日咳毒素-肽复合物，并且将该复合物从生物溶液中的其他成分中分离出来。
40.权利要求39的方法，其中百日咳毒素从复合物中释放出来并分离。
41.权利要求40的方法，其中通过改变复合物周围环境的pH值而将百日咳毒素从复合物中释放出来。
42.权利要求41的方法，其中复合物被暴露于具有酸性pH的溶液中。
43.权利要求41的方法，其中复合物被暴露于具有碱性pH的溶液中。
44.权利要求40的方法，其中通过改变复合物周围环境的离子强度而将百日咳毒素从复合物中释放出来。
45.权利要求44的方法，其中通过将复合物暴露于具有高浓度的一种或多种离子盐的溶液中来改变离子强度。
46.权利要求45的方法，其中离子盐是氯化钠或氯化镁中的至少一种。
47.权利要求46的方法，其中离子盐是氯化镁。
48.权利要求39-47中任一项的方法，其中所述固体支持体是微珠。
49.权利要求39-47中任一项的方法，其中所述固体支持体包含琼脂糖凝胶。
50.权利要求49的方法，其中所述固体支持体由链霉亲和素琼脂糖凝胶构成。
51.权利要求50的方法，其中肽被生物素化，并且肽通过肽上的生物素部分与链霉亲和素琼脂糖凝胶上的链霉亲和素部分相互作用而结合到固体支持体上。
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