CN1904066B - 哺乳动物粪便dna提取方法 - Google Patents

Abstract

一种哺乳动物粪便DNA提取方法，包括粪便的采集、保存、取样和DNA提取，本提取首先用含有十六烷基三甲基溴化铵的裂解液使DNA自细胞中释放出来，然后经分离、析出得到DNA沉淀，最后用硫氰酸胍和二氧化硅吸附纯化得到纯度较高的DNA。本方法得到的产物DNA纯度大于1.7(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，高于专业试剂盒，片断大于10Kb，可进行基因扩增和测序。本方法通用性好，广泛适用于各种食性动物的粪便DNA提取，对保存三年以内的样品均有效，仅一次提取即得到高质量的模板DNA，不需要重复实验。

Description

哺乳动物粪便DNA提取方法

一、技术领域

本发明涉及动物DNA的提取方法，特别涉及自非损伤性取样材料中提取DNA的方法，具体地说是自哺乳动物粪便中提取DNA的方法。

二、背景技术

近年来，分子遗传学在保护生物学及行为生态学中的应用受到普遍重视，进行分子遗传学分析的首要工作是分析样品的采集。过去的取样方法主要有两种：一是伤害性取样，即猎杀动物而获取新鲜的肌肉、肝脏和血液等组织样品。这种方法会对动物资源造成极大破坏；二是非伤害性取样，即通过捕获动物来抽取血液、采集毛发或羽毛耳、尾或趾等分析样品。虽然该方法不至于导致动物死亡，但对野生动物特别是珍稀濒危动物的习性和生存能力均会造成影响。

非损伤性取样是在不触及或不伤害野生动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食物残渣(含有口腔脱落细胞)、鹿角、鱼鳞和卵壳等不同形式的分析样品而进行遗传物质的提取和分析。在非损伤性取样材料中，动物粪便是一种理想的分析样品，原因包括：一、动物排便具有节律性，相对于其他非损伤性取样材料来说，样品充足，易于采集；二、粪便样本可以在不接触甚至不看到动物的情况下获得，对动物的干扰和伤害小，同时在研究大型食肉动物时也保护了野外工作者的人身安全；三、在对种群较大物种进行大规模采样时，较捕获动物进行采样而言，采集粪便可以显著降低采样的花费。因此，该方法排除了传统取样方法的种种不利因素，基本上解决了保护遗传学和分子生态学研究中所遇到的取样难题。近年来已被成功运用于物种鉴别(通过对线粒体DNA的扩增)、个体的识别(对微卫星进行扩增)、动物性别鉴定(对Y染色体上的SRY基因进行扩增)、种缘关系的鉴定(对线粒体控制区进行扩增)、母系鉴定(通过对线粒体DNA的扩增)、亲子鉴定(对微卫星进行扩增)、种群数量估计(对微卫星进行扩增)等等(Kohnand Wayne，1997)。

在这些研究中推动了粪便样品的采集及其保存方法和提取前的取样方法的进步。样品采集方法有两种，选择性样品采集(Part Sample Collection，PSC)和整样品采集(WholeSample Collection，WSC)。

PSC即用无菌的一次性刀刮下粪便样品表层黏膜，分装到2ml离心管中，每管约200mg样品。适用于大型哺乳动物新鲜粪便的采集。WSC则是将整个粪便放入50ml—100ml离心管中，确定其重量。

由于核酸内切酶被认为是降解DNA的主要因素，所以样品在采集后须尽快进行保存。大多数保存方法都是对粪便样品进行低温、脱水或将其保存在保存液中以降低核酸内切酶活性。低温处理即冷冻法，一般—20℃；脱水处理即干燥法，有硅胶干燥、二氧化硅干燥、微波干燥等；保存液常用的有无水乙醇、70％乙醇、二甲亚砜(DMSO)、二甲亚砜饱和盐溶液(DETs)等。

不同的采样方法和保存方法适应于不同物种和生境条件下使用。

用PSC法采集的样品可直接对样品进行DNA提取。

用WSC法采集的样品提取前应进行二次取样，即从粪便中取富含细胞而杂质较少部分进行DNA提取。目前常用的主要有4种二次取样方法：①缓冲液洗脱粪便表面细胞；②刮粪便表面；③表层取样；④均质取样。

不同的二次取样方法适应于不同保存方法样品的取样。

以粪便为材料提取动物DNA进行研究的关键是能否提取到高纯度的粪便DNA。自粪便DNA分析技术兴起后，国内外在这方面做出了巨大的成就，发展了多种粪便DNA提取方法(Constable etal.，1995；Savill et al.，2001；钟华等，2003；张保卫等，2004)，充分证实了粪便DNA分析的可行性(Fernando et al.，2003)。但实际应用中仍然存在以下问题：

1、各种提取方法通用性不好；在不同实验个案中存在扩增成功率在物种和个体之间的差异。这一直是阻碍粪便DNA提取技术推广的主要障碍，。

2、未考虑到与DNA提取相关环节对结果的影响；由于粪便材料的特殊性，它的提取结果受到多重因素的影响，如样品的采集、保存(Frantzen et al.，1998；Piggott and Taylor，2003)等等，忽视其中任何一个环节，都会给试验结果带来不利影响甚至导致试验失败。目前国内外文献资料均未对这些影响因素予以介绍，因此根据国外已发表论文中提供的方法进行粪便DNA提取时，往往得不到预期的效果。与此同时，对于许多刚开始分子粪便学研究的学者来说，既无法从现有文献资料中获得足够的信息来指导粪便DNA提取试验，也无法从失败中分析原因。

三、发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的不足之处开展的实验研究，旨在提供一种通用性好、可靠性高、成本低廉的哺乳动物粪便DNA提取方法，推进粪便DNA技术的推广。

本发明所称的哺乳动物粪便DNA提取方法，其实质是自粪便中提取排便哺乳动物细胞中的DNA。所要解决的技术问题是使DNA自细胞中释放出来，并在一系列的分离、提取和纯化过程中不被破坏，从而得到纯度较高的哺乳动物DNA样本。

本提取方法包括粪便采集、保存、取样、预处理和DNA提取，其特征在于：所述的DNA提取是自样品中经裂解分离、析出和纯化处理后得到DNA，所述的裂解分离即是在样品中加入由Tris-HCl、EDTA和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)配制成的裂解缓冲液，于50～60℃条件下静置1.5～2.5h，离心分离，取上清液，用混合有机溶剂抽提出DNA所述的析出是向含DNA的抽提液中加入2～4M浓度的NaAc和1～2倍体积的无水乙醇充分混匀后于-10～—30℃条件下静置0.5～1h，离心分离，将析出的DNA沉淀室温下干燥；所述的纯化是向沉淀中加pH6～7的Tris-HCl缓冲液和硫氰酸胍(GuSCN)至沉淀完全溶解，然后加入二氧化硅微珠悬浮液，摇匀，离心分离，用70％乙醇洗涤硅珠沉淀，分离，脱去硅珠中残存的乙醇后加入TE(Tris—EDTA缓冲液)液洗脱，离心分离得到含DNA的TE液；

所述的混合有机溶剂为酚、氯仿和异戊醇按25：24：1的体积比混合得到的混合溶剂。

对样品进行预处理旨在除去样品中残存的保存液。因此对取自非保存液保存的样品则无需进行预处理。预处理的方法就是用磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的生理盐水浸泡、洗涤样品，以除去残存的保存液。

CTAB是一种阳离子型表面活性剂，在本发明中用CTAB裂解动物细胞、释放DNA，同时与粪便中的其他多种杂质形成沉淀与DNA分离。

GuSCN有使核酸水解酶失活的作用，但在本发明中GuSCN的存在使二氧化硅(SiO₂)有特异性吸附DNA的作用，以分离、纯化DNA。

本方法提取的产物DNA纯度大于1.7(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，DNA产物片断大于10Kb，可进行基因扩增和测序。本方法对保存3年以内的样品均有效。

本方法有较好的通用性，广泛适用于各种食性动物的粪便DNA提取，一般不需重复实验。在验证的10种动物(猕猴(Macaca mulatta)、黑麂(Muntiacus crinifrons)、梅花鹿(Cervusnippon)、长颈鹿(Giraffa camelopardalis)、马鹿(Cervus elaphus)、牦牛(Bosgrunniens)、松鼠猴(Saimiri sciureus)、豪猪(Hystrix brachyurus)、北极狐(Alopex lagopus)和貉(Nyctereutesprocy)和粪便DNA提取中，仅一次提取即得到高质量的模板DNA，在对12SrRNA基因的扩增中，所有提取的粪便DNA模板均能成功进行扩增。得到与预计大小相同的450bp产物，且浓度大、特异性强，测序结果证实了提取的真实性。

四、附图说明

图1、从短尾猴粪便抽提到的DNA模板电泳检测图。

用本方法可以从粪便中提取出高质量的粪便DNA，不仅浓度大，且降解少。

图2短尾猴12S rRNA基因的浓度梯度PCR结果，模板为改进型CTAB法提取的粪便DNA。模板浓度依次为10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、1、5、10、15、20单位(1单位＝1μl模板DNA)。M为100bp的DNAladder。

图3短尾猴12S rRNA基因的浓度梯度PCR结果，模板为专用试剂盒提取的粪便DNA。模板浓度依次为10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、1、5、10、15、20单位(1单位＝1μl模板DNA)。M为100bp的DNA ladder。

由于PCR扩增需一定浓度的模板才可顺利进行，因此通过模板稀释PCR梯度试验可以比较两种方法提取出产物的浓度大小。在模板浓度递增试验中，由于PCR体系中所含的抑制物浓度随着模板量的增加而增加，最终会达到抑制Taq酶活性的浓度，因此比较可顺利进行PCR扩增的各模板的临界浓度，则可比较两种方法所提取产物的纯度。如图2和图3所示，在模板浓度递增试验中，本专利方法提取出的模板可以加至15单位而不影响扩增的正常进行，而试剂盒提取出的模板只能加至10单位，添加至15单位模板时，则会因PCR反应体系中抑制物量过多而阻碍PCR扩增正常进行。因此可以得出结论：本方法提取出的粪便DNA与专业试剂盒相比，虽然产物浓度相当，但纯度高于专业试剂盒。本方法是种高纯度粪便DNA提取方法。

五、具体实施方式

现以短尾猴为例，非限定实施例叙述如下：

1、粪便采集：采集短尾猴在野外排便、暴露不超过24小时的粪便样品；

采用选择性样品采集，用无菌的一次性刀片刮下粪便样品表层黏膜，分装到2ml离心管中，每管180—220mg样品；除此之外采用整样采集，整个粪便样放入50ml—100ml离心管中，确定其重量；

2、样品保存：对样品进行保存的方法包括低温保存、或脱水处理后保存，或在高盐浓度缓冲液中保存；所述低温保存采用冷冻法，冷冻温度—20℃～—70℃；所述脱水处理是采用无水乙醇脱水或二氧化硅干燥保存；所述高盐处理是采用二甲亚砜的饱和盐溶液(DETs)保存样品。

3、取样及与预处理：

对于所保存的样品直接进行DNA提取，或通过二次取样再进行DNA提取；所述二次取样为下述四种方式之一：以缓冲液洗脱粪便表面细胞；刮取粪便表面；表层取样；均质取样；

所述预处理是去除样品中的保存液；

4、DNA提取：

实验准备：

准备好量程分别为1ml、200μl、50μl的微量移液器；水浴锅温度调至55℃；高速离心机离心力要能达到10000g；确保1.5ml和2ml离心管均已灭菌；确保所有溶液无沉淀、无结晶，若有沉淀或结晶，可用70℃水浴让其溶解；将无水乙醇置于—20℃冷冻；将TE加热到65℃以利于DNA的溶解或洗脱。

试验步骤：

①取200mg粪便于2ml离心管中，加入1ml CTAB裂解液中，混匀后55℃水浴2小时，每隔半小时取出摇匀一次；所述的裂解液为pH7.5～8.5、80～200m mol/L Tris-HCl中加入1～3wt％CATB、15～40m mol/L EDTA和1～2mol/L NaCl；

②12000rpm离心5min，离心结束后移出700μl上清至一无菌1.5ml离心管中，弃沉淀。向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，震荡10min后10000rpm离心10min；吸出上清至另一无菌1.5ml离心管中，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)重新抽提，直至离心后水相和有机相之间不再有白色沉淀；

③向上清中加入0.1倍体积的3M NaAc，在旋涡混合器上混匀后加入1.5倍体积(加入盐之后计算的体积)预冷的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置0.5～1h。

④12000rpm离心10min，吸弃上清，沉淀在室温中凉干；

⑤在沉淀中加入1ml GuSCN洗液，摇匀至沉淀完全溶解；所述的洗液为pH6～7、80～200m mol/L Tris-HCl中加入5～8mol/L GuSCN；

⑥加入100μl硅珠悬液，缓慢摇匀吸附DNA10min，10000rpm离心5min，吸弃上清保留硅珠沉淀；

⑦用500μl GuSCN洗液和500μl70％乙醇分别洗涤沉淀2次；

⑧离心弃上清，将1.5ml离心管置于55℃烘箱内5min烘干残余乙醇，再向硅珠沉淀中加入100μlTE，震荡混匀5min洗脱DNA，最后12000rpm离心5min，移出约80μl上清至一无菌200μl或1.5ml离心管中保存。

Claims (2)

1.一种哺乳动物粪便DNA提取方法，包括粪便采集、保存、取样、预处理和DNA提取，其特征在于：所述的DNA提取是自样品中经裂解分离、析出和纯化处理后得到DNA，所述的裂解分离即是在样品中加入由Tris-HCl、EDTA和十六烷基三甲基溴化铵配制成的裂解缓冲液，于50～60℃条件下静置1.5～2.5h，离心分离，取上清液，用混合有机溶剂抽提出DNA；所述的析出是向含DNA的抽提液中加入2～4M浓度的NaAc和1～2倍体积的无水乙醇充分混匀后于—10～—30℃条件下静置0.5～1h，离心分离，将析出的DNA沉淀室温下干燥；所述的纯化是向沉淀中加pH6～7的Tris-HCl缓冲液和硫氰酸胍至沉淀完全溶解，然后加入二氧化硅微珠悬浮液，摇匀，离心分离，用70％乙醇洗涤硅珠沉淀，分离，脱去硅珠中残存的乙醇后加入TE液洗脱，离心分离得到含DNA的TE液；

所述的混合有机溶剂为酚、氯仿和异戊醇按25：24：1的体积比混合得到的混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的预处理就是用磷酸盐缓冲液或0.9％的生理盐水浸泡、洗涤样品。

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