CN1899616A - 非受体酪氨酸激酶c－Abl特异性抑制剂的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非受体酪氨酸激酶c－Abl特异性抑制剂的新用途，即在制备抗肿瘤药物或肿瘤治疗辅助药物中的应用。实验证明非受体酪氨酸激酶c－Abl特异性抑制剂通过抑制c－Abl的激酶活性可导致Gal3发生变性聚集并通过溶酶体降解，致使肿瘤细胞中Gal3蛋白水平显著降低，从而使肿瘤细胞发生自噬性细胞凋亡而死亡。以非受体酪氨酸激酶c－Abl特异性抑制剂为活性成分制备抗肿瘤药物具有以下优点：1)疗效显著；2)安全性高；3)主要用药途径为口服，用药方便；4)该抑制剂价格低廉，因而以其制备抗肿瘤药物的成本较低。本发明为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。

Description

非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂的新用途
技术领域
本发明涉及非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂的新用途，特别是涉及非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
根据病人的遗传背景和发病的分子机理进行肿瘤的个体化治疗是肿瘤治疗的发展方向。Galectin 3(Gal3)是β-半乳糖苷结合蛋白，具有多种生物功能，作为一种癌症相关蛋白参与肿瘤细胞的黏附、增殖、分化、血管生成、恶化及转移。临床研究表明，在许多类型的组织细胞中，当细胞发生恶性转化时，Gal3的表达量上调(例如在结肠、甲状腺、中枢神经***、胰腺、膀胱、肾脏、胃等器官的癌症)，而且，肿瘤细胞中Gal3表达水平上调会使肿瘤的恶性程度和转移侵润能力也随之增强。因此认为Gal3是一种癌症相关蛋白，在致癌作用和肿瘤进程中起到重要作用。Gal3的抗凋亡活性表现在能够抑制药物诱导的细胞凋亡和锚着依赖性细胞凋亡从而使细胞存活。研究结果显示，肿瘤细胞能够分泌Gal3，分泌的Gal3通过与T细胞表面受体结合可诱导T细胞的凋亡，从而起到免疫逃避的作用，这样使得肿瘤细胞在发展进程中能够逃避T细胞的捕杀。目前，Gal3作为免疫细胞化学临床检测的一项指标，对肿瘤细胞的良恶性诊断和癌症预后诊断都具有一定价值。因此，在多种类型的癌症诊断和治疗方面，Gal3作为一个新的靶标具有非常好的应用前景。
蛋白酪氨酸激酶是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质，可分为受体型和非受体型两种，它们能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上，使其发生磷酸化。蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞的生长、分化、死亡等一系列生理化过程。
非受体蛋白酪氨酸激酶中的ABL家族包括两个成员：Abl和Ara。Abl基因位于9号染色体长臂(9q34.1)，编码145kD的Abl蛋白。c-Abl蛋白具有酪氨酸激酶活性，含有SH3、SH2、PTK、DNA结合域、肌动蛋白结合结构域等(Blume-Jensen P，HunterT.Oncogenic kinase signalling.Nature，2001，411(6835)：355-65)。
非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂可使普遍存在的Abelson酪氨酸激酶(Abl)失活。
发明内容
本发明的目的是提供非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂的新用途，即在制备抗肿瘤药物或肿瘤治疗辅助药物中的应用。
本发明所述的应用是以非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂为活性成分在制备抗肿瘤药物或肿瘤治疗辅助药物中的应用所述非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂的选择是多种多样的，如STI571、Sunitinib、PKC412、vandetanib、Sorafenib、erlotinib、gefitinib或dasatinib等。
为提高抑瘤效果，在用非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂制备的抗肿瘤药物或肿瘤治疗辅助药物中还可添加化疗药物如顺铂。
研究表明，Galectin 3在肿瘤细胞中广泛表达，因而非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂具有广谱的抑肿瘤作用，包括乳腺癌、***癌，***，肺腺癌，肝癌，结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、神经内分泌肿瘤、膀胱癌、肾癌和胃癌等。
需要的时候，在本发明所述应用中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂及色素等。
本发明所述应用除制成口服液外，还可以制成胶囊剂、片剂、粉剂、粒剂、注射液等多种药物形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
该药物的成人口服用量一般为400mg/kg/d，可以一次或多次使用，疗程为20天-30天。
本发明提供了一种非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂的新用途，即在制备抗肿瘤药物或肿瘤治疗辅助药物中的应用。实验证明非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂通过抑制c-Abl的激酶活性可导致Gal3发生变性聚集并通过溶酶体降解，致使肿瘤细胞中Gal3蛋白水平显著降低，从而使肿瘤细胞发生自噬性细胞凋亡而死亡。同时，非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂还可使肿瘤细胞对多种肿瘤治疗药物极为敏感，短时间内低浓度的凋亡诱导剂即可使细胞全部死亡，因而非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂可增强现有细胞毒类化疗药物的治疗效果，并可通过降低化疗药物的使用剂量，使毒副作用大大减轻。以非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂为活性成分制备抗肿瘤药物具有以下优点：1)疗效显著，抑瘤率可达79.34％；2)安全性高；3)主要用药途径为口服，用药方便；4)该抑制剂价格低廉，因而以其制备抗肿瘤药物的成本较低，从而可减轻病人的经济负担。本发明为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为非受体酪氨酸激酶c-Abl对Gal3特异性磷酸化作用的免疫沉淀及免疫印迹检测结果
图2为非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571对c-Abl特异磷酸化抑制作用的免疫沉淀及免疫印迹检测结果
图3为免疫染色法检测经10uM STI571处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白分布情况的结果
图4为免疫染色法检测经5uM STI571、0.5uM凋亡诱导剂STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白量变化的结果
图5为免疫印迹法检测经5uM STI571、0.5uM凋亡诱导剂STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白量变化的结果
图6为经10uM STI571、0.5uM STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞凋亡情况的TUNEL法检测结果
图7为经10uM STI571、0.5uM STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞凋亡情况的Annexin-V-FLUOS法检测结果
图8为不同药物处理的抑瘤率统计结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、检测非受体酪氨酸激酶c-Abl对Gal3特异性磷酸化作用及非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571对c-Abl磷酸化作用的抑制作用
一、Flag-Gal3表达载体的构建
1、重组载体pcDNA 3-Flag的构建
将编码Flag标签的DNA序列(含8个氨基酸的肽段：Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)克隆入载体pcDNA3(Invitrogen公司)多克隆位点的限制性内切酶Kpn I和BamH I酶切位点之间，得到含有Flag标签编码序列的重组载体，命名为pcDNA 3-Flag。
2、Gal3基因的PCR扩增
以Gal3基因(GenBank号：BC001120)为模板，在引物P1(上游引物)：
5’-C GGATCCATGGCAGACAATTTTTCGCTCCA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)和P2(下游引物)：5’-C GGAATTCTTATATCATGGTATATGAAGCA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点)的引导下PCR扩增Gal3基因，并在基因片段的两端分别添加限制性内切酶BamHI和EcoRI识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了753bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该目的片段，测序，测序结果表明获得了序列正确的Gal3基因片段。
3、pcDNA 3-Flag-Gal3表达载体的获得
将步骤2克隆的Gal3基因片段用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切，将酶切片段与经相同酶双酶切的步骤1构建的载体pcDNA 3-Flag进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行酶切鉴定，经酶切获得5400bp和753bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为P1和P2，对PCR产物进行测序，检测结果表明Gal3基因片段已***pcDNA 3-Flag的BamHI和EcoRI酶切位点之间，且序列正确，将此重组表达载体命名为Flag-Gal3。Gal3基因可以在CMV启动子的作用下表达带有Flag标签的融合蛋白。
二、Myc-c-Abl、Myc-c-Abl(K290R)表达载体的构建
1、Myc-c-Abl表达载体的构建
1)c-Abl基因的PCR扩增
以野生型c-Abl基因(GenBank号：NM_005157)为模板，在引物Myc-Abl-1(上游引物)： (带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点)和Myc-Abl-2(下游引物)：
Figure A20061008885100062
(带下划线碱基为限制性内切酶BglI识别位点)的引导下PCR扩增c-Abl基因，并在基因片段的两端分别添加限制性内切酶EcoRI和BglI识别位点，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了3393bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该目的片段，测序，测序结果表明获得了序列正确的c-Abl基因片段。
2)Myc-c-Abl表达载体的获得
将步骤1)克隆的c-Abl基因片段用限制性内切酶EcoRI和BglI进行双酶切，将酶切片段与经相同酶双酶切的载体pMyc-CMV(Clotech公司)进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI和BglI进行酶切鉴定，经酶切获得3800bp和3393bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为Myc-Abl-1和Myc-Abl-2，对PCR产物进行测序，检测结果表明c-Abl基因片段已***pMyc-CMV的EcoRI和BglI酶切位点之间，且序列正确，将此重组表达载体命名为Myc-c-Abl。Abl基因可以在CMV启动子的作用下表达带有Myc标签的融合蛋白。
2、Myc-c-Abl(K290R)表达载体的构建
1)Myc-c-Abl(K290R)点突变基因的PCR扩增
以野生型c-Abl基因(GenBank号：NM_005157)为模板，在引物Myc-Abl-1：
Figure A20061008885100071
(带下划线碱基为限制性内切酶EcoRI识别位点)和K290R-II：5’-GGTGTCCTCCTTCAAGGT CCTCACGGCCACCGTCAGGC-3’(带下划线碱基为突变位点)的引导下PCR扩增扩增c-Abl的5’端序列(命名为M1)，再在引物Myc-Abl-2：
Figure A20061008885100073
(带下划线碱基为限制性内切酶BglI识别位点)和K290R-I：5’-GCCGTACGGTGGCCGTG AGGACCTTGAAGGAGGACACC-3’(带下划线碱基为突变位点)的引导下PCR扩增c-Abl的3’端序列(命名为M2)，反应结束后，对上述PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了888bp的M1片段和2405bp的M2片段，与预期结果相符，回收并纯化两个目的片段，然后，取M1和M2各1μl，混合，以此为模板，在引物Myc-Abl-1和Myc-Abl-2的引导下PCR扩增c-Abl突变基因的全序列，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了3393bp的DNA片段，与预期结果相符，回收并纯化该目的片段。
2)Myc-c-Abl(K290R)表达载体的获得
将步骤1)克隆的c-Abl点突变基因片段用限制性内切酶EcoRI和BglI进行双酶切，将酶切片段与经相同酶双酶切的载体pMyc-CMV进行连接，将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI和BglI进行酶切鉴定，经酶切获得3800bp和3893bp片段的为阳性克隆，再对阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步鉴定，所用引物为Myc-Abl-1和Myc-Abl-2，对PCR产物进行测序，检测结果表明c-Abl点突变基因片段已***pMyc-CMV的EcoRI和BglI酶切位点之间，且序列正确，将此重组表达载体命名为Myc-c-Abl(K290R)。Abl点突变基因可以在CMV启动子的作用下表达带有Myc标签的融合蛋白。
三、检测非受体酪氨酸激酶c-Abl对Gal3的特异性磷酸化作用
c-Abl作为非受体酪氨酸激酶，主要通过使蛋白质酪氨酸磷酸化调节细胞的生命过程。现用免疫沉淀和免疫印迹(Western blot)的方法验证Gal3可被c-Abl特异磷酸化，并避免另一种细胞内源性非受体酪氨酸激酶Arg的磷酸化干扰，具体方法包括以下步骤：
1、共转染
将pcDNA 3-Flag-Gal3分别与pCMV-Myc-c-Abl、pCMV-Myc空载体、c-Abl负显性突变体的表达载体pCMV-Myc-c-Abl(K290R)共转染Abl、Arg双敲除的小鼠成纤维细胞MEF(Abl/Arg double knockout mouse embryo fibroblast cells，DKO细胞，表型为Abl-/-Arg-/-，Koleske AJ，Essential roles for the Abl and Arg tyrosine Kinasesin neurulation，Neuron 1998 Dec；21(6)：1259-72)。
2、用抗-Flag抗体进行免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)
转染36-48小时后裂解转染细胞，用抗-Flag抗体(M5，Sigma公司)进行免疫沉淀，该过程的所有操作应严格在冰浴或低温条件进行，具体方法为：收集细胞，1000g离心3分钟，弃尽培养基。用5mL冰预冷的1×PBS洗涤细胞，1000g离心2分钟，弃上清，相同方法洗三次。Φ100mm的每皿细胞需加入600μl单去污剂裂解液(50mmol/LTris·Cl，150mmol/L NaCl，0.02％叠氮钠，1％NP-40以及蛋白酶抑制剂(Roche，Inc)1片/25mL)，Φ60mm的每皿细胞加入200μl单去污剂裂解液。将细胞与裂解液混匀，冰浴5-10分钟，16000g离心10分钟。小心吸取细胞裂解上清，加入10-15μl抗-Flag抗体交联的琼脂糖珠(Sigma)，在4℃旋转孵育2小时，进行免疫沉淀反应。2小时后，1000g离心30秒，小心弃去上清，将IP产物用250μl裂解液洗涤三次，尽量将洗液吸净。向IP产物中加入40μl 1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃水浴5分钟，10000g离心2分钟。取离心上清及5μl蛋白质预染Marker(Invitrogen，Inc)进行SDS-PAGE凝胶电泳，电压设定为80-100伏。
3、转膜
电泳结束后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，具体方法为：将两张2.5mm厚的滤纸(Bio-Rad，Inc.)及一张硝酸纤维素膜裁剪成凝胶大小，在1×转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％ SDS以及20％甲醇)中浸泡30分钟。随后，自上而下按照滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-滤纸的顺序在半干转移仪(Bio-Rad，Inc.)上放置好，尽量赶尽夹层中的气泡。转膜电压15V，2-2.5小时后将NC膜取出，加入5mL封闭液(含有5％脱脂奶粉的1×PBST)，放在平缓摇动的水平摇床上室温温育1小时。封闭后，用1×PBST洗膜三次，每次5-10分钟。
4、免疫杂交
用含有0.2‰叠氮钠的PBST配制靶蛋白特异性的非标记抗磷酸化酪氨酸抗体作为一抗(anti-P-Tyr，4G10，Upstate Biotechnology，Inc.)；用含5％脱脂奶粉和0.2‰叠氮钠的PBST配制辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠抗体(HRP-mouse Ig G)作为二抗(Amersham Pharmacia Biotech，Inc)。将步骤3封闭后的NC膜与一抗在室温温育1小时后，用1×PBST洗膜三次，每次5-10分钟；随后加入酶标二抗，同样在室温温育1小时后，用1×PBST洗膜三次，每次5-10分钟。上述温育过程均在水平摇床上进行。
5、显色
最后进行化学发光反应，方法为：将含有辣根过氧化物酶底物3，3’-二氨基联苯胺的显色液WESTERN LIGHTNING(PerkinElmer Life Sciences，Inc.)均匀地滴在NC膜上，反应1分钟后将显色液吸干，用X光片进行曝光(X光片及显影液、定影液均购自Kodak公司)。
结果如图1所示(“+”表示转染，“-”表示未转染)，与pCMV-Myc空载体转染结果相比，Flag-Gal3转染细胞的表达产物可以被Myc-c-Abl的表达产物磷酸化，但是Myc-c-Abl(K290R)转染细胞的表达产物不能被Myc-c-Abl的表达产物磷酸化，原因是Abl的K290位点是c-Abl激酶结构域中ATP结合位点的关键氨基酸，被突变为精氨酸后使c-Abl丧失酪氨酸激酶活性，上述检测结果表明Gal3可特异性地被c-Abl磷酸化。
四、检测非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571对c-Abl磷酸化作用的抑制作用
检测非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571对c-Abl磷酸化作用的抑制作用，检测方法为：将Flag-Gal3质粒转染293细胞，24小时后用10μmol/L STI571对转染细胞处理12小时，以用等量DMSO(STI571的溶剂)处理的转染细胞为对照，裂解细胞，用与步骤三相同的方法进行免疫沉淀及免疫印迹检测。
结果如图1所示(“+”表示经STI571处理，“-”表示未经STI571处理)，等量DMSO处理的转染细胞中Flag-Gal3的表达产物Gal3可以被酪氨酸磷酸化，但是经10μmol/L STI571处理的转染细胞中表达的Gal3的酪氨酸磷酸化被抑制。该结果证明Gal3可以特异性的被细胞内源性c-Abl磷酸化，同时STI571对c-Abl的磷酸化作用具有抑制作用。
实施例2、检测经STI571处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白的变化
一、检测经10uM STI571处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白的分布情况
用免疫染色法检测经STI571处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白的分布情况，具体方法为：将人乳腺癌细胞MCF-7接种到2个培养皿(Glass Bottom Culture Dishes，购自军事医学科学院仪器分析测试中心)中，接种量102个/皿，细胞贴壁24h后进行下述处理：第一组细胞不处理，第二组细胞用10uM STI571处理18h，然后对两组细胞进行线粒体探针(Invitrogen公司)标记：将细胞培养皿中的DMEM培养液(Gibco公司)换成预热好的已加入0.2uM mito-probe溶液的DMEM培养液，在37℃培养箱中孵育15min，然后用新鲜的DMEM培养液对细胞进行清洗，用含3.7％多聚甲醛的DMEM液固定细胞，在37℃培养箱中孵育15min，用PBS洗三次，每次5min。加入0.1％TritonX-100，室温孵育5min，再用PBS洗三次，每次5min。然后用1％的BSA封闭1h，再用PBS洗三次，每次5min。Gal3蛋白染色和溶酶体染色一抗为分别为galectin-3(H-160)(santa cruzbiotechnology.inc)抗体和LAMP-2抗体(santa cruz biotechnology.inc)，使用时按1∶200比例进行稀释，室温孵育1h，用PBS洗三次，每次5min。Gal3蛋白染色二抗为FITC-rabbit(北京中杉金桥公司)，使用时按1∶200比例进行稀释，室温孵育1h，再用PBS洗三次，每次5min。最后进行细胞核染色，核染料Hochest33342(购自鼎国生物技术公司)的使用浓度为1ug/mL，室温孵育30min，用PBS洗三次，每次5min。置荧光显微镜下观察。
未经STI571处理的MCF-7细胞的免疫染色结果见图3中的图A，红色为线粒体，绿色为Gal3，蓝色为细胞核，Gal3分布于全细胞，并与线粒体有共定位；经10uM STI571处理18h后的MCF-7细胞的免疫染色结果见图3中的图B和图C，Gal3蛋白发生点状聚集，此时Gal3蛋白的聚集体与线粒体没有共定位，而是与溶酶体共定位，即进入溶酶体。上述检测结果表明非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571可通过抑制c-Abl的激酶活性而导致Gal3发生变性聚集并通过溶酶体降解。
二、检测经5uM STI571、0.5uM凋亡诱导剂STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白量的变化
1、免疫染色检测
用免疫染色法检测经5uM STI571、0.5uM凋亡诱导剂STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞中Gal3蛋白量的变化，实验分为四组：第一组细胞不处理；第二组细胞经5uM STI571处理18h；第三组细胞经0.5uM凋亡诱导剂STS(strurosporine)处理150min，第四组细胞经5uM STI571处理18h后加入0.5uM STS再处理150min。免疫染色方法与步骤一相同。
结果如图4所示(左上图：未经处理细胞，右上图：经0.5uM凋亡诱导剂STS处理150min细胞，左下图：经5uM STI571处理18h细胞，右下图：经5uM STI571处理18h后加入0.5uM STS处理150min细胞)，红色为线粒体，绿色为Gal3，蓝色为细胞核，细胞单独用凋亡诱导剂STS处理时，细胞中Gal3没有发生明显变化；当用STI571处理时，细胞中Gal3发生聚集；当用STI和STS共同处理细胞时，Gal3蛋白量明显减少。
2、免疫印迹检测
将MCF-7细胞接种到4个100mm细胞培养皿中，与上述免疫染色实验相同的处理分为四组，用免疫印迹Western blot法对细胞中Gal3蛋白量的变化作进一步检测，Gal3检测一抗为galectin-3(B-2)(santa cruz biotechnology.inc)，二抗为HRP-mouse Ig G(santa cruz biotechnology.inc)，以β-actin作为内参(一抗为β-actin单克隆抗体(santa cruz biotechnology.inc)，二抗为HRP-mouse Ig G(santa cruzbiotechnology.inc)，以上抗体均购自友谊中联生物科技有限公司。
结果如图5所示(“+”表示添加，“-”表示未添加)在β-actin平衡的情况下检测到，用STI571处理后，细胞中Gal3含量下降；用STS和STI571共同处理后Gal3蛋白几乎全部消失；而单独使用STS处理时，细胞中Gal3含量几乎没有改变。检测结果与步骤1的免疫染色结果相符。
上述实验结果表明，非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571通过对c-Abl激酶活性的抑制使Gal3蛋白的激酶依赖性稳定性丧失而发生降解，失去了Gal3作为癌症相关蛋白的功能，从而可以抑制肿瘤细胞的黏附、增殖、分化、血管生成、恶化及转移。
实施例3、检测经10uM STI571、0.5uM STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞的凋亡情况
实验分为四组：第一组MCF-7细胞不处理；第二组MCF-7细胞经10uM STI571处理18h；第三组MCF-7细胞经0.5uM凋亡诱导剂STS处理4-5h，第四组MCF-7细胞经10uM STI571处理18h后加入0.5uM STS再处理4-5h。
一、TUNEL法检测经10uM STI571、0.5uM STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞的凋亡情况
用TUNEL-FLUOS试剂盒(购自Roche公司)并参照试剂盒说明书检测上述经不同处理的四组MCF-7细胞的凋亡情况，具体方法为：用新配制的4％多聚甲醛在室温下对细胞固定30min，PBS洗片后与阻断剂(H2O2甲醇溶液)在室温下孵育30min，PBS洗片，加入0.1％的Triton X-100在冰浴中孵育2min。PBS洗两次，滴加50μl TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃孵育60min，PBS洗三次，然后进行Gal3蛋白免疫染色和细胞核染色，免疫染色方法见实施例2，染色后在荧光显微镜下观察。
结果如图6所示(红色为Gal3蛋白，绿色为FITC标记酶标记抗体显示的细胞凋亡情况，蓝色为细胞核)，如图6中的图1所示，正常的MCF-7细胞检测不到细胞凋亡，即细胞核中没有绿色荧光，但可以看到红色的Gal3蛋白分布于全胞质；如图6中的图2所示，细胞经10uM STI571处理18h后有细胞凋亡，可以看到细胞核中有绿色荧光，红色的Gal3蛋白呈点状聚集；如图6中的图3所示，细胞经0.5uM STS处理4-5h后也有细胞凋亡，可以看到细胞核中有绿色荧光，红色的Gal3蛋白依然分布于全胞质；如图6中的图4所示，细胞经10uM STI571处理18h后加入0.5uM STS再处理4-5h后，可以看到很强的绿色荧光在细胞核中表达，而且细胞核变小皱缩，此时红色的Gal3蛋白表达极弱，细胞凋亡显著。
上述检测结果表明非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571可使Gal3蛋白降解从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。
二、Annexin-V-FLUOS法检测经10uM STI571、0.5uM STS单独处理及两者共同处理的MCF-7细胞的凋亡情况
再用Annexin-V-FLUOS试剂盒(购自Roche公司)并参照试剂盒说明书检测上述经不同处理的四组MCF-7细胞的凋亡情况，具体方法为：500g离心5min收集细胞，用PBS重悬细胞，洗一次，将细胞重悬于200μl的binding buffer(试剂盒自带)中，加入10μl Annexin-V-FITC和5μl PI，轻轻混匀，避光室温孵育15min，用流式细胞检测仪检测。
结果如图7所示(左上图：正常的MCF-7细胞，右上图：经0.5uM凋亡诱导剂STS处理4-5h的MCF-7细胞，左下图：经10uM STI571处理18h的MCF-7细胞，右下图：经10uM STI571处理18h后加入0.5uM STS再处理4-5h的MCF-7细胞)，用STI571和STS单独处理均可使MCF-7细胞发生一定程度的凋亡，当用STI571和STS共同处理时细胞凋亡显著，进一步证明非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂STI571可诱导肿瘤细胞发生凋亡。
实施例4、检测STI571对裸鼠移植性肿瘤生长的抑制情况
以BABL/C裸鼠(雄性，18-20g，购自军事医学科学院实验动物中心)为实验动物。取对数生长期的MCF-7细胞，胰酶消化后按每只1×106的细胞数接种裸鼠，5天后将裸鼠随机分成7组：空白对照组、对照药物环磷酰胺(CTX)组，顺铂组、STI571组、STI571加顺铂联合用药组、Sutent组、Sutent加顺铂联合用药组、每组6只，按以下方式给药：
对照组：接种后未予任何药物治疗；
CTX组：每只裸鼠使用剂量100mg/kg，隔天给药一次，每天固定时间给药；
顺铂(CDDP)组：每只裸鼠使用剂量7mg/kg，每周腹腔注射1次，于接种移植瘤的次日开始注射，隔周给药；
STI组：每只裸鼠每天口服STI571 50mg/kg，每天固定时间给药；
STI571加顺铂联合用药组：STI571和顺铂同时应用，方法与单独用药相同。
Sutent组：每只裸鼠每天口服Sutent 12.5mg/kg
Sutent加顺铂联合用药组：Sutent和顺铂同时应用，方法与单独用药相同。
给药4周后用脱颈法处死裸鼠，解剖取瘤块，称瘤重，根据以下公式计算肿瘤生长抑瘤率：
IR＝(1-治疗组瘤重/对照组瘤重)×100％
不同药物处理对裸鼠肿瘤的抑制效果见表1，其中抑瘤率统计结果的柱状图如图8所示，与对照药物环磷酰胺给药组相比，联合用药组的肿瘤生长抑制率虽然低，但是联合用药组的裸鼠未见任何异常，体重也和生理盐水组的裸鼠差不多，处死后，解剖裸鼠发现，环磷酰胺组的裸鼠脾脏明显萎缩，重量也明显轻于生理盐水组和联合用药组，联合用药组各脏器未见异常；另外，环磷酰胺给药组组裸鼠肝脏肿大，色泽较苍白，并布满肿瘤转移灶，生理盐水组和联合用药组组肝脏均色泽红润，只有2-3个肿瘤转移灶。上述结果表明STI571加顺铂联合用药及Sutent加顺铂联合用药组对MCF-7肿瘤的生长具有显著的抑制作用，并能有效的抑制肿瘤细胞的转移，且毒副作用微弱。
                           表1不同药物处理组肿瘤的抑制效果
组别   剂量(mg/kg)   动物数   动物体重(g) 瘤重(g)±SD 抑瘤率％
  始  终   始      终
  对照组(生理盐水) 25mL/kg 6  6 20.36  23.79 1.2173±0.2764
  CTX   100   6  6   20.52  19.98 0.22±0.052**   81.93
  CDDP   7   6  6   20.07  21.69   0.561±0.100**   53.87
  STI   50   6  6   20.60  21.67   0.4757±0.1939**   60.92
  STI+CDDP   7+50   6  6   20.03  21.36   0.2514±0.2424**   79.34
  Sutent   12.5   6  6   20.68  21.55   0.4579±0.1124**   62.38
  Sutent+CDDP   7+12.5   6  6   20.46  21.23   0.2432±0.1222**   80.02
与生理盐水组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

Claims (3)

1、非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂在制备抗肿瘤药物或肿瘤治疗辅助药物中的应用。
2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为表达Galectin 3的肿瘤。
3、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述非受体酪氨酸激酶c-Abl特异性抑制剂为STI571、Sunitinib、PKC412、vandetanib、Sorafenib、erlotinib、gefitinib或dasatinib。
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