CN1887342A - 治疗奶牛***炎的药物制剂及其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于治疗奶牛***炎的药物制剂及其制备方法。该制剂是一种含有乳酸链球菌素的无菌粉末,将其溶解于生理盐水后,即可用于***内灌注治疗奶牛***炎。本发明的优点和积极意义在于:(1)粉剂比液体剂型更加稳定,可以在室温下长时间贮藏;(2)该制剂用于治疗奶牛***炎,不会在牛奶中形成对人体有害的残留,用药后无停药期,无需弃奶;(3)该制剂质量可控制,适合***内注入。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物制剂及其制备方法,以及该药物制剂用于制备治疗奶牛***炎药物的用途。
背景技术
乳腺炎是危害奶牛养殖业最严重的一类疾病。全世界约有50%的奶牛患各种类型的乳腺炎。患乳腺炎的奶牛,奶产量和质量下降。美国每年因奶牛乳腺炎造成的直接经济损失达20亿美元。奶牛乳腺炎造成的损失约70%是由隐性乳腺炎引起的产奶量下降,中国每年仅隐性乳腺炎造成的损失至少是1.35亿元人民币。引起奶牛***炎的主要原因是病原微生物感染。因此,目前治疗***炎的主要药物是抗生素。由于抗生素长期、广泛、大剂量用于治疗奶牛疾病已经导致一系列不良后果。首先是食品公共卫生问题:用抗生素治疗之后,潜在着牛奶中药物残留的危险,对人的健康产生不利影响;其次是耐药菌株增加:致病菌产生耐药性,使***炎变得越来越难治愈,牛场兽医不得不加大抗生素的使用剂量,这又加重药物残留的危险;药残的其他危害还包括乳制品生产中的发酵过程受到抑制,导致产品的产量和质量降低。因此,长期以来人们一直在寻找比抗生素更加安全有效的奶牛乳腺炎治疗药物。
有关这方面的研究,目前以中草药和溶菌酶等制剂较多。
在长期的实践中,中兽医学对防治奶牛乳腺炎积累了丰富的临床经验及大量的中草药方剂,但这些方剂的有效成分及其含量不确定,质量难以得到有效控制;传统中草药直接采用原药材,用药量大,药效不显著;而且草药成分复杂,应用于***内灌注,具有刺激性。
溶菌酶能通过裂解细胞壁,溶解及杀灭多种致病菌,以达到防治疾病的目的。但酶的渗透作用不强,当细菌在乳腺组织深部或寄生在细胞内时,溶菌酶是没有作用的。另外酶制剂的稳定性较差,质量不易控制。
根据报道,1970年Gross和Morell阐明了乳酸链球菌素(Nisin)分子的结构。Nisin是一种新型低聚肽,存在6种类型,分别为A、B、C、D、E和Z。其中对Nisin A和Nisin Z两种类型的研究最活跃,两者仅在27位氨基酸残基有差别,其抗菌特性几乎无差别。Nisin一级结构由34个氨基酸组成,分子末端有氨基和羧基,还有5个硫桥构成内环,其分子式是C143H228N42O37S7,平均分子量为3510。Nisin活性分子常为二聚体和四聚体,分子量分别为7000和14000。
Nisin对微生物的作用机理有大量研究,Nisin能吸附G+菌的细胞膜,然后在细胞膜上形成空洞,使胞内物质排出,导致细胞解体死亡。Nisin主要抑制大部分G+菌的生长。常见的奶牛***炎致病菌主要是G+菌,如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和***链球菌等,研究表明,Nisin对这些致病菌的活性很高,而且对耐青霉素的致病菌也有较强的杀灭作用。
Nisin是乳制品中所含的天然产物,若干年来,它随着食品被人们摄入,并没发现毒性问题。现在已对Nisin的安全性问题进行了***的研究,大鼠经口服LD50约为7000mg/kg体重。研究表明,Nisin对蛋白水解酶(如胰蛋白酶等)特别敏感,因此食用后在消化道中即可很快被蛋白水解酶水解成氨基酸。人在摄入10min后,在唾液中就检测不到Nisin的活性,故不会在体内残留,也不会改变肠道正常菌群,是一种安全的防腐剂。1969年FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为食品添加剂使用;1990年3月29日我国***将其列入GB2760-86的1990年增补品种中,可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品。目前已有50多个国家和地区批准Nisin可以作为一种纯天然食品防腐剂使用。
美国专利US5762948和中国专利CN1186413公开了一种预防和治疗奶牛乳腺炎的湿巾,其成分为乳酸链球菌素。但该制剂仅能用于奶牛乳区外部的消毒,并不能用于***内注射,中国专利CN03115388公开了一种用于预防奶牛乳腺炎的杀菌制剂,其主要成分为一种合成的抗菌肽和溶葡萄球菌酶,但目前尚未有任何国家批准将该抗菌肽用于奶牛***炎治疗。我们前期申报了用乳酸链球菌素制成***灌注液用于治疗奶牛***炎的国家发明专利,但我们的后来研究发现乳酸链球菌素的水溶液贮藏数月后,抗菌效价会大幅度下降。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定且便于临床应用,无残留的用于治疗奶牛***炎的以Nisin为主要成分的药物制剂。
本发明的另一个目的是提供上述药物制剂的制备方法。
用于治疗奶牛***炎的药物制剂按如下方法制备:
用无菌方法将乳酸链球菌素和维生素C、柠檬酸或者苹果酸或者几种酸混合,制备成一种无菌的粉末。
该混合粉末完全溶解于20~50毫升的水或生理盐水时,乳酸链球菌素的效价为10000-250000单位/毫升,溶液的pH值为2-3。
本发明的再一目的在于提供该药物制剂用于制备治疗奶牛***炎药物的用途。
本发明的Nisin粉剂的优点和积极效果在于:(1)本发明的Nisin粉剂在常温下保存一年,效价不会显著降低;(2)由于粉剂含维生素C等酸性物质,在水或者生理盐水中,Nisin很容易溶解,便于临床应用;(3)制剂的主要成分是乳酸链球菌素,用于治疗奶牛***炎,不会在牛奶中形成对人体有害的残留,治疗之后无停药期,无需弃奶。
具体实施方式
关于“乳酸链球菌素的效价”的说明:“乳酸链球菌素的效价”用于衡量Nisin抗菌活性的大小,用国际单位表示。WHO的生物标准化专家委员会(The World Health Organization Expert Committee inBiological Standardization)规定了一种标准物质,每克该物质含纯品Nisin 25毫克,相当于100万国际单位。在检测Nisin活性时,用该标准物质作为对照品。
实施例1:制备效价为300万单位/瓶的乳酸链球菌素粉剂的方法包括如下步骤:
(1)以无菌操作方法将10克维生素C和10克效价为15000单位/毫克乳酸链球菌素充分混合;
(2)将(1)中的混合粉末,以每份400毫克,用无菌操作方法分装于50个容量为5~20毫升的灭菌玻璃安瓿中,即得。
实施例2:制备效价为200万单位/瓶的乳酸链球菌素粉剂的方法包括如下步骤:
(1)以无菌操作方法将14克维生素C和10克效价为15000单位/毫克的乳酸链球菌素充分混合;
(2)将(1)中的混合粉末,以每份320毫克,用无菌操作方法分装于75个容量为5~20毫升的灭菌玻璃安瓿中,即得。
实施例3:制备效价为400万单位/瓶的乳酸链球菌素粉剂的方法包括如下步骤:
(1)以无菌操作方法将100克维生素C和100克效价为20000单位/毫克的乳酸链球菌素充分混合;
(2)将(1)中的混合粉末,以每份400毫克,用无菌操作方法分装于500个容量为5~20毫升的灭菌玻璃安瓿中,即得。
实施例4:制备效价为400万单位/瓶的乳酸链球菌素粉剂的方法包括如下步骤:
(1)以无菌操作方法将100克柠檬酸和100克效价为20000单位/毫克的乳酸链球菌素充分混合;
(2)将(1)中的混合粉末,以每份400毫克,用无菌操作方法分装于500个容量为5~20毫升的灭菌玻璃安瓿中,即得。
实施例5:制备效价为400万单位/瓶的乳酸链球菌素粉剂的方法包括如下步骤:
(1)以无菌操作方法将100克苹果酸和100克效价为20000单位/毫克的乳酸链球菌素充分混合;
(2)将(1)中的混合粉末,以每份400毫克,用无菌操作方法分装于500个容量为5~20毫升的灭菌玻璃安瓿中,即得。
观察例1不同Nisin***炎灌注剂的稳定性观察
(一)实验目的
观察不同nisin***灌注剂1号、2号、3号和4号在4℃,25℃和室温下贮藏的稳定性。
表1.不同***灌注剂配方
编号 | 成分 | 剂型 |
1号 | 盐酸+nisin+蒸馏水 | 液体剂型 |
2号 | 维生素Vc+nisin+蒸馏水 | 液体剂型 |
3号 | 柠檬酸+nisin+蒸馏水 | 液体剂型 |
4号 | 维生素Vc+nisin | 粉剂 |
(二)贮藏条件
将上述四种配方的样品分别置于温度25±2℃、4℃及室温(即放置室内)下进行考察,当月考察一次后,逐月考察一次,3个月后每3个月考察一次,共考察2年。
(三)检测项目及方法
检测项目:nisin效价、pH值。
检测方法:根据国标GB2760-86乳酸链球菌素效价检查方法检测nisin效价,用普通pH计检测溶液PH值。
(四)考察结果
表2.各配方的PH值
表3.各配方的效价(单位:IU/ml)
(五)结论
粉剂无论是PH值还是效价在三种保存条件下都较稳定,而液体剂型无论采用何种助溶剂,都存在nisin效价降低,PH值升高等不稳定的现象,揭示粉剂在各种制剂中性质最稳定。
观察例2 Nisin***炎灌注剂治疗奶牛临床型***炎的疗效观察
1材料与方法
1.1试验药物
***灌注2号(粉针)
试验牧场常规抗生素制剂:均为市售产品。
1.2试验动物及其分组
杭州市近郊奶牛场临床型***炎自然发病病例54头,分为试验组和对照组。
1.3试验方案
1.3.1治疗前 无菌操作采集患病乳区奶样,进行细菌分离鉴定。具体操作程序如下:
①奶样接种血琼脂平板,37℃恒温培养24h~48h,观察细菌生长情况并进行菌落计数。
②挑取疑似致病菌的单个菌落接种普通肉汤,37℃恒温培养18~24h,观察细菌生长情况。
③对步骤②中的肉汤培养物涂片、革兰氏染色镜检。
④根据以上3步的结果可以初步判定细菌的种属:葡萄球菌、链球菌、肠杆菌。
⑤肉汤培养物接种于营养琼脂平板,37℃恒温培养24h后进行生化鉴定,按照有关文献判定细菌种类。
1.3.2治疗实验 试验组***内灌注***灌注2号,1瓶/次,2次/天;注射前用20mL灭菌生理盐水溶解,摇匀。对照组用牧场常规抗生素药物进行治疗,主要有青霉素、链霉素、庆大霉素、红霉素和磺胺嘧啶。
1.3.3治疗后 治疗后第1、2周,对试验组和对照组奶牛乳区无菌操作采集奶样,分别进行HMT(杭州奶牛***炎诊断试剂)检测、牛奶体细胞计数和细菌学检查。
1.3.4药敏试验 对奶样中分离到的金黄色葡萄球菌,用青霉素G药敏纸片(批号20040218,为杭州天和微生物试剂有限公司产品)进行药敏试验。
1.4判定标准
1.4.1治疗效果判定标准
①完全治愈:患病乳区红肿热痛等临床症状完全消失,泌乳基本恢复正常,奶样中未检出致病菌;
②临床治愈:患病乳区红肿热痛等临床症状完全消失,泌乳基本恢复正常,奶样中可检出致病菌;
③无效:患病乳区临床症状无明显改善或加重,或者治疗后两周内再次发病,两者均视为无效。
1.4.2奶样HMT检测结果判定标准
①阴性(-):均匀混和,不出现任何沉淀;
②可疑(±):有微量沉淀出现,摇动后消失;
③弱阳性(+):有少量沉淀出现,摇动后消失;
④阳性(++):有多量胶状出现,摇动后向中心凝集;
⑤强阳性(+++):迅速形成胶状沉淀,摇动时中心凸起,粘着盘底。
2结果和讨论
2.1Nisin治疗***炎的临床治愈率高于常规抗生素 结果见表1。
用***灌注2号治疗39头奶牛(43个乳区),平均每个乳区治疗次数3.8次,用药后未发现不良反应,完全治愈23个乳区,治愈率53.5%,临床治愈38个乳区,临床治愈率88.4%;对照组治疗15头(19个乳区),平均每个乳区治疗次数5.1次,完全治愈10个乳区,治愈率52.6%,临床治愈12个乳区,临床治愈率63.2%。经统计学分析,两组的治愈率无显著性差异(P>0.05),但试验组的临床治愈率显著高于对照组(P<0.05)。
表1临床型***炎治疗结果
药物 | 乳区数 | 平均治疗次数 | 完全治愈 | 临床治愈 | ||
乳区数 | 治愈率(%) | 乳区数 | 临床治愈率(%) | |||
***灌注2号 | 43 | 3.8 | 23 | 53.5 | 38 | 88.4 |
常规抗生素 | 19 | 5.1 | 10 | 52.6 | 12 | 63.2 |
2.2感染乳区治疗前后的细菌学变化 对43个感染了细菌的乳区在治疗前和治疗后1、2周进行奶样细菌学检查,其中试验组32个乳区,对照组11个乳区,见表2。试验组的细菌转阴率低于对照组,其原因可能是用nisin治疗的病例临床症状消失快,很快停止用药,治疗次数少(平均3.8次),但致病菌并未从患病乳区清除。
表2治疗前后检出细菌的乳区数
细菌 | 治疗后周数 | |||||
试验组 | 对照组 | |||||
0* | 1 | 2 | 0* | 1 | 2 | |
无乳链球菌 | 14 | 4 | 4 | 7 | 2 | 1 |
金黄色葡萄球菌 | 6 | 4 | 4 | 1 | 1 | 1 |
CNS | 4 | 6 | 4 | 1 | 0 | 0 |
G-杆菌 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
G+杆菌 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
停乳链球菌 | 2 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
无乳链球菌和CNS混合感染 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
停乳链球菌和CNS混合感染 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
停乳链球菌和金黄色葡萄球菌混合感染 | 2 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
合计 | 32 | 15 | 12 | 11 | 3 | 2 |
*为治疗前检查。
2.3治疗后奶样杭州***炎诊断试剂检测结果 见表3。两组阳性(++)和强阳性(+++)乳区比例无显著差异。
表3治疗后乳区奶样隐性***炎检查结果,单位:检测乳区数(%)
HMT等级 | 试验组 | 对照组 | ||
1周 | 2周 | 1周 | 2周 | |
- | 10(27.8) | 6(16.7) | 1(8.3) | 2(16.7) |
± | 2(5.6) | 4(11.1) | 1(8.3) | 1(8.3) |
+ | 2(5.6) | 3(8.3) | 1(8.3) | 2(16.7) |
++ | 5(13.9) | 5(13.9) | 0(0) | 0(0) |
+++ | 17(47.2) | 18(50.0) | 9*(75.0) | 7(53.3) |
*其中有2个乳区出现临床型***炎。
2.4治疗后奶样体细胞数(SCC)检测结果 见表4。两组体细胞含量在50万/毫升以上的乳区比例无显著差异。
表4治疗后乳区奶样体细胞数检测结果,单位:检测乳区数(%)
体细胞数(×104个/mL) | 试验组 | 对照组 | ||
1周 | 2周 | 1周 | 2周 | |
0~50 | 15(41.7%) | 13(36.1%) | 3(25%) | 5(41.7%) |
50~100 | 3(8.3%) | 7(19.4%) | 2(16.7%) | 0 |
>100 | 18(50%) | 16(44.4%) | 7*(58.3%) | 7(58.3%) |
合计 | 36 | 36 | 12 | 12 |
*其中有2个乳区出现临床型***炎;括号内表示占总治疗乳区的百分数。
2.5青霉素G敏感性试验 对分离到的金黄色葡萄球菌进行青霉素G药敏试验,结果显示:所有分离到的金黄色葡萄球菌对青霉素均耐药。
3结论
用nisin治疗奶牛临床型***炎,临床治愈率高于用常规抗生素治疗,但在清除致病菌和降低牛奶体细胞数方面,两者无多大差异。
Claims (7)
1.一种治疗奶牛***炎的药物制剂,其特征在于其是一种含有乳酸链球菌素的无菌粉末。
2.根据权利要求1所述的药物制剂,其特征在于该粉末完全溶解于20~50毫升的水或生理盐水时,乳酸链球菌素的效价为10000-250000单位/毫升。
3.根据权利要求2所述的乳酸链球菌素溶液,其特征在于该溶液的pH值为1~4。
4.根据权利要求3所述的溶液,其特征在于该溶液的pH值为2-3。
5.根据权利要求1所述的药物制剂,其特征在于所述的无菌粉末中含维生素C、柠檬酸、苹果酸中的一种或几种,但不仅限于这几种酸。
6.一种用于制备如权利要求1所述的药物制剂的方法,其特征在于包括如下步骤:用无菌方法将乳酸链球菌素和维生素C、柠檬酸、苹果酸中的一种或几种酸混合,该混合粉末完全溶解于20~50毫升的水或生理盐水时,乳酸链球菌素的效价为10000-250000单位/毫升,溶液的pH值为2-3。
7、权利要求1所述的药物制剂的用途,其特征在于制备用于治疗奶牛***炎的药物。
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GR01 | Patent grant |