CN1878866B - 用于从固定的样品中制备rna的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于RNA分离的改进的方法和组合物。在具体实施方式中，本发明涉及该方法和组合物在从固定的组织样品中分离全长RNA中的应用。本发明提供了从固定的组织样品中消化和抽提RNA的方法。

Description

用于从固定的样品中制备RNA的方法和组合物
发明背景
本申请要求2003年7月25日提交的美国临时专利申请序列号60/490,325的优先权，将其纳入本文作为参考。
1.发明领域
本发明一般涉及分子生物学领域。更具体涉及从固定的组织中以高质量和高产量分离RNA的方法和组合物。
2.相关领域描述
常常从固定的组织中分离RNA，然而，由于组织的固定过程中涉及的方法，如采用甲醛，所以所获RNA是片段化的。为了使对RNA样品的研究有意义，需要维持RNA的完整性。因此，片段化的RNA可能使所分析的RNA的解释水平，如特定基因的表达水平发生偏差。
采用甲醛作为动物组织的防腐剂已经有超过一个世纪的历史。它提供的优点是，通过使组织“硬化”维持组织结构，以及起到抗生素的作用以放置组织自然腐烂。这种双重作用是由它与组织分子，主要是蛋白的迅速发生化学反应而使组织高度交联产生的。这提供了结构刚性并阻止较大分子在细胞间和细胞内扩散。这能有效放置阻止腐烂，因为它阻止了组织本身及其中携带的任何微生物的所有代谢。用可用于采用抽提的RNA和DNA检测基因和基因表达的现有方法，存档样品如动物学和临床标本能够提供可用来进行回顾研究大量材料。不幸的是，保藏组织的相同反应也起到使RNA或DNA难于抽提的作用。科学文献中已经报道了应对这种作用的方法。然而，这些方法受限于它们以非常高的质量或产率获得RNA的能力(通过类似来源的未固定组织的产率来判断)。
甲醛通过在生物大分子的氮原子之间形成亚甲基交联而固定组织。这些化学加合物大多数在蛋白中，小百分数的加合物也涉及核酸碱基。通过形成高度交联的蛋白“笼”，以及核酸本身参与到有限数量的交联中将核酸捕获在固定组织中。从固定组织中回收RNA的公开方法主要集中在通过酶方法去除所有蛋白残余，但一些方法也尝试用化学-物理方法。采用蛋白水解降解的方法主要依赖于蛋白酶K，可以在中等变性条件下起作用的氨基酸特异性很低的蛋白酶。该方法的最常见形式是在存在2％SDS的高温(37℃-65℃)条件下使用它。
文献中报道了许多声称能够从甲醛固定的组织样品中回收和分析RNA的方法(参见Masuda等，1999；Danenberg等，美国专利6,248,535和6,428,963；Fang等，2002；Abrahamsen等，2003；Liu等，2002；Van Deerlin等，2002；Karsten等，2002；Godfrey等，2000；Coombs等，1999；Koopmans等，1993；Specht等，2001)。在大多数这些方法中，通过查看经逆转录的抽提RNA的PCR产物(“RT-PCR”)进行最终分析。不可避免的是，这些方法中扩增的区域(“扩增子”)的最长仅有几百个核苷酸，如果采用这些方法的变化形式，即实时PCR或定量PCR，扩增子通常是100个核苷酸或更小。
当应用这些方法并通过电泳分析抽提的RNA时，显然所获RNA是高度片段化的，其平均大小在几百个核苷酸的范围。估计这些片段提供了RT-PCR分析的模板。通过保证仅去除片段化的RNA，可以容易地实现该结果，其中捕获交联物比所获平均大小片段分离得更开。虽然一些作者主张***固定本身使RNA片段化(Krafft等，1997)，但其他人对此表示反对(Masuda等，1999)。
采用柠檬酸盐和胍盐的方法也能从固定的组织中获得高度片段化的RNA(Bock等，2001)。此外，该方法采用高浓度的蛋白酶K、柠檬酸盐和去污剂，包括还原剂如β-巯基乙醇，这会提高片段化RNA的产生。该方法的缺点是不能维持RNA的完整性(非全长)，也不能以高质量和高产率提供RNA。
趋向于影响细胞中存在的RNA的具体亚组的任何方法均可使RNA的翻译水平发生偏差。显然，在尽可能维持完整性的情况下使产率最大化的方法是分离RNA和DNA所最需要的方法。因此，除了获得高质量的全长和基本全长的RNA外，需要有新的或改进方法以使从固定的组织样品中获得全长RNA的产率最大。
发明概述
本发明涉及从已固定的生物样品中获得核酸-具体是RNA-的方法和组合物。本发明用含有聚阴离子的消化缓冲液或溶液从样品中分离、抽提和富集RNA(包括全长和基本全长的RNA)而有效获得RNA。
因此认为，本发明方法和组合物不仅可用于以更佳产率从样品中获得RNA，还可用于以更佳产率从样品中获得全长RNA。在一些实施方式中，本发明允许从样品中抽提约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或其中任何范围的任何一种RNA。在一些实施方式中，本发明也允许从样品中抽提的RNA中约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或其中任何范围是全长或基本全长。术语“基本全长”指RNA看起来或经测定长度至少为350个核苷酸。也认为，本发明方法和组合物允许所抽提的RNA中至少约50％、60、70％、80％、90％或更多RNA是至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多完整的。
“消化缓冲液或溶液”应理解为含有一种或多种分解或消化生物样品内一种或多种物质(如一种或多种细胞组分)的化合物或试剂的缓冲液或溶液(缓冲液是溶液的一种类型)。在本发明的实施方式中，可将消化缓冲液或溶液用于整个细胞以产生裂解物，裂解物指从裂解细胞中释放的内容物。
以“聚阴离子”的普通和简单含义使用该术语，即有一个以上，如-2、-3、-4或更多负电荷的化合物。
在特定实施方式中，消化缓冲液所含的聚阴离子是多羧化物(polycarboxylate)，多羧化物指具有至少一个羧酸根(COO-)的化合物。本发明的多羧化物包括柠檬酸钠、反式-乌头酸、1，2，4-丁烷三羧酸、1，4-环己烷二羧酸、1，2，3，4，5，6-环己烷六羧酸、异柠檬酸、丙三羧酸、琥珀酸和/或戊二酸。在有一些情况下，消化缓冲液中的多羧化物选自柠檬酸钠、1，4-环己烷二羧酸、1，3，5-环己烷六羧酸、异柠檬酸和琥珀酸。应理解，在溶液中发现的化合物酸形式可以是聚阴离子，因此，称酸形式即相当于称聚阴离子形式的酸。在某些实施方式中，消化缓冲液含有柠檬酸钠(NaCitrate)。认为消化缓冲液可含有一种以上聚阴离子化合物，消化缓冲液中可含有至少1、2、3、4或更多种这种化合物。
在一些实施方式中，聚阴离子在消化缓冲液中的浓度约在1mM和100mM之间，或约在5mM和50mM之间。在消化缓冲液中或作为样品终浓度的聚阴离子浓度约为、至少约为或至多约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多mM，或其中任何范围。
当将消化缓冲液施加于全细胞、组织或器官时，可用其产生细胞裂解物。当细胞被裂解或其完整性被破坏时产生裂解物。消化缓冲液的组分可包括蛋白酶、核酸酶(尤其是非RNA酶)和/或以化学或酶学方式破坏细胞组分的其它化合物。消化缓冲液可包括一种或多种这种组分。在本发明的具体实施方式中，消化缓冲液包括蛋白酶(也称为肽酶或朊酶)，它是一种催化肽键断裂(即蛋白水解)的酶。认为本发明消化缓冲液中蛋白酶的量是能够使样品中的细胞裂解的有效量。在其它实施方式中，蛋白酶是蛋白酶K，但本发明不限于此实施方式。蛋白酶浓度可以约为、至少约为或至多约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000μg/ml或其中任何范围。
本发明消化缓冲液还可包括盐，在本发明的一些实施方式中该盐是钠盐。钠盐的浓度约为、至少约为或至多约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500mM或更高，或其中任何范围。可在缓冲液中提供钠盐，如NaCl。此外，可通过多种途径在缓冲液中提供钠盐，如加入一种以上含有钠的化合物。
认为消化缓冲液的pH，或消化缓冲液的缓冲组分的pH，或含有样品的消化缓冲液的pH约在6.5和9.5之间，但它可约为、至少约为或至多约为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5或其中任何范围。
在本发明的其它实施方式中，消化缓冲液中的缓冲液是TrisCl，它在缓冲液中的浓度可约为、至少约为或至多约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500mM或其中任何范围。尽管也可考虑使用其它缓冲液。
在其它实施方式中，消化缓冲液含有去污剂。去污剂，尤其是非变性温和去污剂可起到溶解样品的作用。去污剂可以是离子型或非离子型的。尤其认为离子型去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)可用于本发明溶液。去污剂在缓冲液中的浓度可以约为、至少约为或至多约为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％或其中任何范围。认为去污剂的浓度可以高达使去污剂在缓冲液中可溶的量。
在一个具体实施方式中，消化缓冲液包含2％SDS、200mM TrisCl(pH7.5)、200mM NaCl和10mM柠檬酸钠以及500μg/ml的蛋白酶K。在其它实施方式中，尤其考虑到本发明的消化缓冲液和/或任何其它步骤包括变性剂如胍盐(guanidinium)。在一些实施方式中，消化缓冲液包括的变性剂的浓度约为或至多约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5M或更高，或其中任何范围。可以理解本发明方法和组合物将排除导致RNA分子片段化或截短的化合物，或限制它们的量。
可以加入浓缩形式的用于本发明方法的溶液或在试剂盒中以浓缩形式提供它们。该溶液可以是2×、3×、4×、5×、10×或20×。
在一些实施方式中，本发明涉及从固定的组织样品中获得RNA的方法，该方法包括(a)将固定的组织样品与含有聚阴离子和蛋白酶的消化缓冲液接触以产生裂解物；(b)从裂解物中抽提RNA。在具体实施方式中，所述聚阴离子是多羧化物，如柠檬酸钠。这种方法可用于已经固定的生物样品，可以或可以不将生物样品包埋在非反应性物质如石蜡中。术语“接触”应理解为其简单和普通的涵义，即将溶液和样品混合在一起。还应理解，它包括术语“孵育”、“暴露”、“浸没”和“混合”。
在本发明的一些实施方式中，固定的组织样品和消化缓冲液的比例约为1克组织/5毫升消化缓冲液到1克组织/25毫升消化缓冲液，或者约为1克组织/10毫升消化缓冲液到1克组织/20毫升消化缓冲液。认为任何待抽提RNA的生物样品与消化缓冲液的比例约为、至少约为或至多约为1克组织对应1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30毫升或更多的消化缓冲液，或其中任何范围。
可通过任何方法固定组织，可从任何生物来源获得样品。也可将样品包埋在非反应性物质如石蜡中。本发明也包括在产生细胞裂解物之前清除该物质。在一些实施方式中，通过让样品与含有有机溶剂的溶液接触来清除石蜡，这是本领域技术人员熟知的。
将样品与本发明消化缓冲液接触的时间量可约为1-6小时或约为4小时。认为该时间量可约为、至少约为或至多约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多个小时，或其中任何范围。
可以在包括，或者至少或至多约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃或其中任何范围的温度下将样品和消化缓冲液互相接触。在一些实施方式中，该温度约在40℃和55℃之间。在整个孵育期间可以维持或不维持这种温度。
与消化缓冲液孵育后，可通过，如物理或机械装置对裂解物进行匀浆。
本发明其它方法涉及用含醇溶液和/或含有非醇有机溶剂(如酚和/或氯仿)的溶液从裂解物中抽提RNA。认为醇溶液至少含有一种醇。醇溶液的醇浓度可以约为、至少约为或至多约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％，或其中任何范围。在某些实施方式中，将醇加入裂解物中使裂解物中的醇浓度约为、至少约为或至多约为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90％，或其中任何范围。在特定实施方式中，加入裂解物中的醇的量使其醇浓度约为33％。在其它实施方式中，加入含有裂解物的混合物的醇量使混合物中的醇浓度为55％。醇包括，但不限于，乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇和甲醇。特别认为乙醇可用于本发明的某些方面。在本发明的一些实施方式中，从裂解物中抽提RNA包括用醇沉淀RNA。可从美国申请序列号10/667,126中获得分离小RNA分子的方法和组合物，将其纳入本文作为参考。
应理解非醇有机溶剂溶液含有至少一种非醇有机溶剂，但它也可含有醇。上述醇溶液的浓度也可适用于含有非醇有机溶剂的溶液的浓度。在特定实施方式中，将等量的1)裂解物和2)酚和/或氯仿混合。
在一些实施方式中，在消化和/或匀浆裂解物后，但在进一步的分离步骤之前，可加入其它化合物。在具体实施方式中，除醇之外，还向裂解物中加入盐。该盐可以是任何盐，但在某些实施方式中，该盐是胍盐或钠盐，或其组合。加入裂解物混合物的盐的量(在加入醇之前)可以使混合物中一种或多种盐的浓度约为、至少约为或至多约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5M或更高，或其中任何范围。在某些实施方式中，将胍盐加入裂解物中使胍盐的浓度约在0.5和3M之间。因此，匀浆后加入裂解物的胍盐的量使胍盐浓度约为、至少约为或至多约为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0M，或由其衍生的任何范围。在其它实施方式中，匀浆后将钠盐如醋酸钠或氯化钠加入裂解物中使该盐的浓度约为、至少约为或至多约为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5M，或由其衍生的任何范围。在某些实施方式中，在进行进一步分离步骤之前将以下物质加入裂解物：1体积的4M胍盐，0.2体积pH4的醋酸钠，然后是2.75体积(终体积的1.25倍)乙醇。
从裂解物中抽提RNA还可包括使用无机支持物。在一些本发明方法中，将混合了或未混合醇或非醇有机溶剂溶液的裂解物施加于无机支持物上，从支持物上洗脱RNA。无机支持物包括含硅支持物。在一些实施方式中，所称硅是玻璃。支持物包括但不限于：柱和滤器。在其它实施方式中，无机支持物是玻璃纤维滤器或柱。
或者，在一些实施方式中，从裂解物中抽提RNA可包括非硅支持物。该支持物可包括非反应性材料，即不与待分离或待抽提RNA发生化学反应的材料。这种材料包括带有负电性基团的聚合物或非聚合物。在一些实施方式中，该材料是或含有聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氯乙烯、甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸甲酯。
因此，一些本发明方法包括(c)将醇溶液加入裂解物中；(d)将裂解物施加到无机支持物上；和(e)用洗脱液从无机支持物上洗脱RNA。施加裂解物后，可以洗涤该无机支持物1、2、3、4、5或更多次。在一些实施方式中，洗涤溶液包括醇，在一些情况下，它也包括盐。在其它实施方式中，该溶液所含的醇浓度约为或至少约为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％。在特定实施方式中，醇是乙醇。在另外一些实施方式中，洗涤溶液中的盐浓度约为或至少约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0M或更高，或其中任何范围。进行洗涤的温度约为或至少约为15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120℃，或由其衍生的任何范围，包括环境温度。
可用洗脱液从无机支持物上洗脱RNA。在一些实施方式中，洗脱液包括EDTA。洗脱液中EDTA浓度约在0.01mM和1.0mM之间，或者约在0.05mM和0.5mM之间。在特定实施方式中，洗脱液中EDTA的浓度约为0.1mM。当施加洗脱液时，洗脱液和/或无机支持物可以是室温或将其加热到约在80℃和100℃之间的温度。在一些实施方式中，该温度约为或至少约为15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120℃，或由其衍生的任何范围。
抽提RNA之后，可对单个或特定RNA分子和/或RNA分子库(以及分离RNA的整个群体)进行其它反应和/或测定。在有一些情况下，这些反应和/或测定包括扩增RNA或扩增由该RNA产生的DNA分子。例如，可采用RT-PCR产生可以特征鉴定的分子。
在一些实施方式中，可以定量具体RNA分子或RNA群体，尤其是全长RNA。定量包括本领域技术人员已知的任何方法，如包括一种或多种扩增反应或RNA酶保护测定的方法。这些方法包括定量逆转录酶-PCR(qRT-PCR)。在一些实施方式中，对分离的RNA进行特征鉴定。从抽提RNA产生cDNA分子。也考虑到，其它特征鉴定和定量测定也可作为本发明的一部分。本发明方法和组合物允许定量和特征鉴定全长RNA。
也可用RNA进行测定，或用其产生用于测定的cDNA。其它测定包括采用分光光度测定、电泳和测序。
本发明也包括实施上述方法的试剂盒和/或包含上述组合物的试剂盒。在一些实施方式中，本发明试剂盒包括以下物质(与上述组合物一致)的一种或多种：含有多羧化物和蛋白酶的消化缓冲液；玻璃纤维滤器或柱；洗脱缓冲液；洗涤缓冲液；醇溶液；RNA酶抑制剂；和cDNA构建试剂(如逆转录酶)；RNA扩增试剂。
特别认为，关于本发明组合物和/或方法所讨论的任何实施方式，以及实施例中的任何实施方式都可以是试剂盒的一部分。
认为可根据本文所述的任何方法或组合物的任何其它实施方式来实施本文所述的任何方法或组合物的任何实施方式。
虽然本公开支持仅指替代项和“和/或”的定义，但是除非明确指出仅为替代项或替代项是互斥的，权利要求书中的术语“或”指“和/或”。
整个本申请中，术语“约”用来指包括用于确定值的装置或方法的标准差的值。
根据专利法的长期规定，当词语“一个”和“一种”在权利要求书或说明书中与词语“包含”结合使用时，指一种或多种，除非特别注明。
通过下面的详细描述可以明显看出本发明的其它目的、特征和优点。然而应理解，虽然详述和具体实施例指出了本发明的具体实施方式，但是仅以示范性方式给出，因为本领域技术人员从本详述中可以明显看出在本发明精神和范围内的各种改变和修改。
附图简要说明
下述附图构成了本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步说明本发明的某些方面。通过与本文具体实施方式的详述结合，参照这些附图的一幅或多幅，可以更好地理解本发明。
图1.显示了用两种不同的电泳方法-琼脂糖凝胶***(OD)和毛细管电泳***(Aglient)估计的质量的缓慢增加。
图2.用qRT-PCR测定样品的GAPDH、FAS、Recc1和DDPK，循环数阈值(cyclethreshold)没有显示降低。绘制各样品的循环数阈值与消化时间图。
图3.生物分析仪电泳图谱显示了方法之间的比较，用Masuda等(1999)所述的精确方法在柠檬酸钠的存在下对固定了14周的小鼠肝进行蛋白水解消化，然后用固相抽提步骤终止反应。
图4.不同温度下柠檬酸盐与Mg++的作用。
图5.在不同温度下消化的效果。
图6.NaCl对消化的影响。用OD260估算法来定量所有样品，推导出每克组织的RNA质量产率。
图7.根据qRT-PCR测定的Recc1和FAS RNA水平显示出0.2和0.4M NaCl在2、3和4小时时间点上对所获RNA质量的影响。
图8.在Agilent生物分析仪2100RNA芯片上分析得到的RNA样品并测定28rRNA的百分数。′Y′柱显示四个肝的平均数和′S′柱显示标准差。在这些条件下，优化的柠檬酸盐浓度是约50mM(log＝1.7)，而在这些条件下SDS的优化浓度为约3.5％。
示例性实施方式的说明
本发明克服了本领域已知的现有RNA分离方法的缺陷，提供了在聚羧酸的存在下用蛋白酶K以高质量(如全长RNA)和高产率从固定组织中分离RNA的优化方法。
I.固定含有RNA的组织样品
本发明方法所考虑的组织样品是固定的组织样品。可以采用的固定剂包括但不限于：沉淀性或非沉淀性固定剂。两种常用固定剂是甲醛和多聚甲醛。然而，也可将其它固定剂用于固定组织样品，这些固定剂包括但不限于：醋酸、***、四氧化锇、重铬酸钾、三氧化铬、乙醇、氯化汞、甲醇、戊二醛和苦味酸。固定剂及其用途的例子可见于Sambrook等(2000)；Maniatis等(1989)；Ausubel等(1994)；Jones等(1981)；美国专利5,260,048、4,946,669、5,196,182，各自纳入本文作为参考。
可固定组织样品约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时或更多小时；或者约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周、约2周、约3周；或者约1月、约2月、约4月、约6月、约8月、约10月；或者约1年或更多年。
固定的组织样品的例子包括但不限于：心、脑、睾丸、肺、骨骼肌以及脾、肝和肾。
而且，可以或可以不将固定组织包埋在非反应性物质如石蜡中。可将本发明方法和组合物施用于任何固定细胞或组织样品，无论其是否被包埋。
II.消化缓冲液
采用消化缓冲液分解细胞组分。本发明认为，在抽提和分析RNA之前可消化固定的组织样品。为完成此步骤，可采用各种消化缓冲液，可将各种浓度和pH的各种组分用于消化缓冲液以产生裂解物。
用于产生缓冲液如消化缓冲液的各种碱是本领域熟知的。消化缓冲液可包含Tris、TrisHCl、Tris硼酸、Hepes或磷酸盐缓冲的碱，但不限于此。这种碱的浓度可约为10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250mM或更高。这种碱可以是不同pH。
消化缓冲液或其组分的pH可约为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或更高。
可将盐，例如但不限于NaCl、LiCl或KCl，用于消化缓冲液中。消化缓冲液中也可以至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000mM或更高的不同浓度包括这些盐。在一些情况下可以不用盐。例如，参见Harlow和Lane(1988)；Sambrook等(2000)；Maniatis等(1989)中一系列制成消化缓冲液的合适缓冲液和方法。
认为可将各种去污剂用于从固定的组织样品中产生裂解物的消化缓冲液中。去污剂可以是离子型去污剂，包括阴离子和阳离子去污剂，或者是非离子型去污剂。非离子型去污剂的例子包括曲通如Triton X系列(Triton X-100、Triton X-100R、TritonX-114、Triton X-450、Triton X-450R)、辛基葡糖苷、聚氧乙烯(9)十二烷基醚、洋地黄皂苷、IGEPAL CA630、正辛基-β-D-葡糖吡喃糖苷(βOG)、正十二烷基-β、C12EO7、吐温20、吐温80、聚多卡醇、正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)、NP-40、C12E8(八乙二醇正十二烷基单醚)、六乙二醇单正十四烷基醚(C14EO6)、辛基-β-硫代葡糖吡喃糖苷(辛基硫葡糖苷，OTG)、Emulgen和聚氧乙烯10月桂基醚(C12E10)。离子型(阴离子或阳离子)去污剂的例子包括脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌苷酸和溴化十六烷三甲基铵(CTAB)。在一些实施方式中，可在消化缓冲液中与或不与另一去污剂或表面活性剂一起加入脲。去污剂可以是各种浓度，如至少0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、10％、20％或更高。可用于消化缓冲液的去污剂的例子可见于Harlow和Lane(1988)；Sambrook(2000)；Maniatis等(1989)，各自纳入本文作为参考。
消化还可包括具有多个酸基团的聚阴离子，以提高裂解物的质量。这种聚阴离子可包括但不限于：多羧化物如反式-乌头酸；1，2，4-丁烷三羧酸；1，4-环己烷二羧酸；1，2，3，4，5，6-环己烷六羧酸；1，3，5-环己烷三羧酸；异柠檬酸；丙三羧酸；琥珀酸；和戊二酸。
消化缓冲液还可包含蛋白酶或肽酶以裂解细胞，从而分离细胞中的核酸。蛋白酶或者是从蛋白质链末端切下氨基酸的外肽酶，或者是在蛋白质内切割肽键的内肽酶。一般地，通过作用机理可将蛋白酶进一步分类，如丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶K)；半胱氨酸(硫羟)蛋白酶(如菠罗蛋白酶、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶、寄生生物蛋白酶和细菌毒力因子)；天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶、组织蛋白酶、肾素、真菌和病毒蛋白酶)；以及金属蛋白酶(如嗜热菌蛋白酶)。市售的蛋白酶K即可用于核酸分离和抽提步骤，因为认为它是切割特异性非常低的高度热稳定的蛋白酶。采用市售的蛋白酶K制剂，终浓度一般在0.05-1.0mg/ml的范围内。认为蛋白酶K在待裂解样品中的终浓度可约为、至多约为或至少约为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50或更多毫克/毫升。
III.RNA抽提方法
本发明还提供了从石蜡包埋组织中分离RNA的方法。分离总RNA的许多方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如，Chomczynski和Sacchi(1987)。完成该任务的方法可采用Trizol试剂(Gibco Life Technologies)抽提总RNA。Trizol方法包括在搅拌机中匀浆样品，然后用酚基Trizol试剂抽提。然后，用异丙醇沉淀RNA，用乙醇洗涤，然后再溶解于不含RNA酶的水或0.5％SDS中。
其它方法可采用本领域已知的产品，如RNAzol(Gibco BRL)、TriReagentTM(Molecular Science)、Qiagen的RNEasy总RNA分离试剂盒(Qiagen)、QuickprepTM总RNA抽提试剂盒(Amersham Bioscience)或分离RNA的任何其它生产方法。抽提RNA的其它方法包括但不限于：硫氰酸胍和三氟乙酸铯(CSTFA)方法、盐酸胍方法或氯化锂-SDS-脲方法。参见Sambrook等(2000)；Maniatis等(1989)；Ausubel等(1994)中RNA抽提方法的例子。
可从各种固定的组织样品中抽提RNA。这种组织样品可包括脑、头、颈、胃肠道、肺、肝、胰、乳腺、睾丸、子宫、膀胱、肾、心的组织，但不限于这些组织。
也可将固体支持物用于从固定的组织样品中抽提RNA，和用于维持或储存所抽提的RNA。这种固体支持物可包括但不限于：离心柱、离心滤器、小瓶、试管、烧瓶、罐、洗脱柱或装置、过滤柱或装置、注射器和/或其它容器。这种支持物还可包括塑料或玻璃珠或聚合物如纤维素。例如参见Sambrook等(2000)或Maniatis等(1989)。
IV.来自固定的组织样品的RNA的用途
A.来自固定的组织样品的RNA的定量
可用各种方法分析或定量获自固定的组织样品的RNA，以确定获得了全长产物。本文提供了定量和分析RNA的方法。定量或分析RNA的总方法可见于Sambrook等(2000)或Maniatis等(1989)。下面提供了采用来自固定的组织样品的RNA的例子，然而，这些例子并非旨在限制。
1.定量PCR
本发明依赖于定量PCR-更具体说是定量RT-PCR-对样品中的RNA进行定量。该方法可以是半定量或完全定量的。
两种方法，竞争性定量PCRTM和实时定量PCRTM通过与由连续稀释的标准RNA的扩增所建立的标准曲线进行比较都能估算出样品中的靶基因浓度。然而，它们在这些标准曲线产生方法方面具有很大不同。在竞争性QPCR中，将已知浓度的内部竞争者RNA加入连续稀释的标准样品和未知(环境)样品中。共同扩增后，计算标准稀释度和未知样品中内部竞争者RNA和靶PCRTM产物的比例，通过用竞争者RNA-靶PCRTM产物比例对标准稀释度的起始RNA浓度作图建立标准曲线。假定竞争者RNA和RNA的扩增效率相等，从该标准曲线即可推知后者在环境样品中的浓度。
在实时QPCR中，标准稀释度的RNA和含有未知量的RNA的样品中连续测定扩增产物的累积。将标准样品中的起始模板浓度与产生特定阈值浓度产物所必需的PCRTM循环数(Ct)关联建立标准曲线。在测试样品中，在达到相同Ct后测量靶PCRTM产物累积，它允许从标准曲线内插得到靶RNA浓度。虽然实时QPCR允许在常规分析期间更快速和更容易地测定RNA，但是竞争性QPCR仍然是在环境样品中定量的重要替代方法。由于存在显然从标准稀释度中无法看出的抑制底物和大量背景RNA，已知量的竞争者RNA与靶RNA的共同扩增是校正样品之间扩增效率的差异的直观方式。
另一类型QPCR是应用定量PCRTM。常常称为“相对定量PCR”，此方法测定了特定核酸的相对浓度。在本发明内容中，对分离自固定的组织样品的RNA进行RT-PCR。
在PCRTM中，每个反应循环中，扩增的RNA的分子数以接近2的因子增加，直到一些试剂变得有限。然后，扩增速率越来越低，直到循环之间扩增靶不再增加。如果以循环数作为X轴并以扩增RNA浓度的对数作为Y轴作图，通过连接这些绘制点即可形成具有特征形状的曲线。从第一个循环开始，该线的斜率为正并保持不变。这被称为曲线的线性部分。某个试剂变得有限后，该线的斜率开始降低，最终变成零。在该点上，扩增RNA的浓度变得渐近于某个固定值。这被称为曲线的平台部分。
在PCRTM扩增的线性部分中，RNA浓度与起始靶浓度在反应开始前成正比。通过测定在完成相同循环数量并在其线性范围内的PCRTM反应中RNA扩增产物的浓度，能够确定具体靶序列在初始RNA混合物中的相对浓度。如果RNA混合物是由分离自不同组织的RNA合成的cDNA，可针对各组织测定从中获得靶序列的特定mRNA的相对丰度。PCRTM产物浓度和RNA相对丰度之间的这种正比关系仅存在于PCRTM反应的线性范围中。
在该曲线的平台部分，RNA终浓度是由反应混合物中试剂的可用性测定的，并且不依赖靶DNA的初始浓度。因此，在用RT-PCR测定RNA群体中RNA种类的相对丰度之前，必须满足的第一条件是当PCRTM反应在曲线的线性部分时必须得到扩增PCRTM产物浓度。
对于用定量RT-PCR实验成功测定具体RNA种类的相对丰度而言，必须满足的第二条件是必须将可扩增cDNA的相对浓度标准化到某个独立标准上。RT-PCR实验的目的是测定具体RNA种类相对于样品中所有RNA种类的平均丰度的丰度。
大多数竞争性PCRTM方法采用几乎与靶丰度相同的内部PCRTM标准。如果在其线性相期间取样PCR扩增产物，那么这些方案是有效的。如果在反应接***台相时取样产物，那么相对过多代表了较低丰度的产物。当检测RNA样品的不同表达时，对许多不同RNA样品的相对丰度的比较有所扭曲，这使RNA相对丰度的不同看起来比它们的实际不同小。如果内标比靶的丰度高得多，这就不是主要问题了。如果内标比靶的丰度高，那么可在RNA样品之间进行直接线性比较。
上述讨论描述了将RT-PCR测定用于从临床上获得的材料的理论想法。临床样品固有的问题是它们数量不同(标准化成问题)，而且它们质量不同(必须共同扩增一个可靠的内部对照，优选比靶大)。如果以带有内标的相对定量RT-PCR进行RT-PCR，这两个问题都可以克服，其中内标是大于靶cDNA片段的可扩增cDNA片段，其中编码内标的RNA的丰度约比编码靶的RNA高5-100倍。该测定测量各RNA种类的相对丰度，而不是绝对丰度。
可用具有外部标准操作步骤的更常规的相对定量RT-PCR测定进行其它研究。这些测定它们扩增曲线的线性部分取样PCRTM产物。必须凭经验测定各靶cDNA片段的取样最佳的PCRTM循环数。此外，必须仔细地将从各种组织样品中分离的各RNA群体的逆转录酶产物标准化到可扩增cDNA的相同浓度。这种考虑非常重要，因为该测定测量了mRNA绝对丰度。RNA绝对丰度仅可用作标准化样品中不同基因表达的测量手段。虽然经验式地确定扩增曲线的线性范围和cDNA制剂的标准化是烦琐和耗时的方法，但是产生的RT-PCR测定比获自带有内标的相对定量RT-PCR测定优越。
此优点的一个原因是没有内标/竞争者的话，可以在扩增曲线的线性范围中将所有试剂转化为单PCRTM产物，从而提高该测定的灵敏性。另一原因是仅用一个PCR产物，在电泳凝胶上展示产物或另一显示方法的复杂性变得更低，背景更低并更容易解释。
2.变性琼脂糖凝胶电泳
可用变性凝胶***的琼脂糖凝胶电泳定量抽提自固定的组织样品的RNA。凝胶上应包括阳性对照，使任何不寻常结果可归因于凝胶问题或所分析RNA的问题。可将RNA分子量标记，已知是完整的RNA样品，或二者用于此目的。包括富集步骤中所用启动RNA样品也是一个好主意。
用于Northern印迹的Ambion的NorthernMaxTM试剂包括了变性琼脂糖凝胶电泳所需的所有试剂。优化这些产品，使其易于使用、安全和背景低，它们包括详细的使用说明书。采用NorthernMaxTM试剂的替代方式是采用《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第4.9部分(Ausubel等，1994)中所述的方法，纳入本文作为参考。它比Northern-Max方法更加困难和费时，但它给出相似结果。
3.Agilent 2100生物分析仪
也可通过采用毛细管电泳***的电泳方法分析从固定的组织样品中抽提的RNA。在本发明中，采用了Caliper RNA 6000LabChip试剂盒和Agilent 2100生物分析仪。该***与浓度在50和250纳克/微升之间的RNA溶液一起使用最好。通常，加入1微升典型的富集RNA样品足以获得良好性能。按照RNA 6000LabChip试剂盒提供的说明书进行RNA分析。
4.通过UV吸光度评价RNA产率
可通过在TE(10mM Tris-HCl pH8，1mM EDTA)或水中稀释等分的制备物(通常是1∶50-1∶100的稀释度)，用分光光度计在260nm和280nm处读吸光度来测定RNA的浓度和纯度。
A260值中1等于40微克RNA/毫升。因此，用A260×稀释倍数×40微克/毫升来计算RNA浓度(微克/毫升)。下面是一个典型例子：
10微克总RNA的典型产量是3-5微克。如果将样品重悬于25微升，这意味着浓度将在120纳克/微升和200纳克/微升之间变化。用49微升TE以1∶50稀释一微升制备物。A260＝0.1。RNA浓度＝0.1×50×40微克/毫升＝200微克/毫升或0.2微克/微升。由于用1微升测定浓度后，剩下24微升制备物，所以剩余RNA的总量是24微升×0.2微克/微升＝4.8微克。
5.用
Figure S04825133920060316D000161
评价RNA产率
也可采用基于荧光的测定法定量RNA。例如，可采用用于RNA定量的MolecularProbes的
Figure S04825133920060316D000162
基于荧光的测定法测量RNA浓度。RiboGreen试剂对结合核酸显示出＞1000倍的荧光增强和高量子产率(0.65)，其激发和发射最大值接近荧光素。未结合染料基本上没有荧光并且具有大消光系数(67,000cm-1M-1)。RiboGreen测定允许在标准荧光计、滤光片荧光计或荧光小板阅读仪中检测低至1.0纳克/毫升的RNA-其灵敏性超过溴化乙锭200倍。RiboGreen试剂的线性定量范围延伸在三个数量级的RNA浓度中。
B.来自固定的组织样品的RNA的其它用途
可用微阵列技术分析获自固定组织的RNA。例如，阵列，如基因阵列是将一群基因特异性探针打点到其规定位置上的固体支持物。该探针通过杂交定位于来自核酸样品如RNA样品群体的互补标记靶上。基因阵列的最常见的用途之一是比较RNA群体的整体表达模式。一般地，可采用分离自两种或多种组织样品的RNA。用标记的核苷酸和靶特异性、寡聚dT或随机序列引物逆转录RNA产生标记的cDNA群体。由模板RNA变性得到cDNA，并杂交于相同阵列上。检测和定量各阵列中的杂交信号。在各个群体之间比较从各基因特异性斑点发射的信号。在样品中以不同水平表达的基因产生不同量的标记cDNA，这导致阵列上的斑点产生的信号量不同。
广泛采用从RNA群体到标记cDNA的直接转化，因为它简单并基本不受酶偏差的影响。然而，为了使中等稀少的靶能够被阵列分析检测，直接标记需要大量RNA来产生足够的标记产物。大部分阵列操作程序推荐将2.5克聚A或50克总RNA用于逆转录(Duggan，1999)。对于不能从他们的样品中分离这么多RNA的工作人员而言，可采用整体扩增步骤。
这些整体扩增方案中最常引用的是反义RNA(aRNA)扩增(美国专利5,514,545和5,545,522)。反义RNA扩增包括用5′端具有转录启动子如T7RNA聚合酶共有启动子序列的寡聚dT引物逆转录RNA样品。第一条链的逆转录产生单链cDNA。第一条cDNA链合成后，与cDNA杂交的模板RNA被部分降解，产生RNA引物。然后RNA引物延伸产生具有转录启动子的双链DNA。用合适的RNA聚合酶转录该群体产生具有来自cDNA的序列的RNA群体。因为转录导致从各DNA模板产生成百上千RNA，所以基本上可实现扩增。在转录期间RNA可被标记并直接用于阵列分析，或者可用标记的dNTP逆转录未标记的aRNA，产生用于阵列杂交的cDNA群体。在另一情况下，标记靶的检测和分析是本领域熟知的。可采用的其他扩增方法包括但不限于：聚合酶链反应(称为PCRTM；参见美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159，以及Innis等，1988)；和连接酶链反应(“LCR”)，公开于欧洲申请号320308，美国专利4,883,750、5,912,148。PCT申请号PCT/US87/00880中所述的Qβ复制酶也可用作扩增方法。扩增核酸如RNA的其他方法公开于美国专利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、5,932,451、5,935,825、5,939,291、5,916,779和5,942,391，GB申请号2202328，PCT申请号PCT/US89/01025、PCT申请WO 89/06700、PCT申请WO 88/10315、欧洲申请号329822，Kwoh等，1989；Frohman，1994；Ohara等，1989；和Walker等，1992，各自全文纳入本文作为参考。
也可构建cDNA文库，并用于分析抽提自固定的组织样品的RNA。这种文库的构建并用这种文库分析RNA可见于Sambrook等(2001)；Maniatis等(1990)；Efstratiadis等(1976)；Higuchi等(1976)；Maniatis等(1976)；Land等(1981)；Okayama等(1982)；Gubler等(1983)；Ko(1990)；Patanjali等(1991)；美国专利申请20030104468，各自纳入本文作为参考。
可将本方法和试剂盒用于大量筛选。可用本发明方法和组合物产生RNA文库或DNA文库。然后可将该文库用于高通量测定，包括微阵列。本发明者尤其考虑了基于芯片的核酸技术如Hacia等(1996)和Shoemaker等(1996)所述的技术。简要说，这些技术包括用于快速和准确分析大量基因的定量方法。通过用固定探针阵列，可以采用芯片技术隔离靶分子作为高密度阵列，并根据杂交筛选这些分子(也参见Pease等，1994和Fodor等，1991)。本文所用术语“阵列”指核酸的顺序排列。例如，将代表所需来源(如成年人脑)的核酸群体分成可采用所需筛选步骤检测或耗尽靶基因的最小数量的库，并可将该库分布到单个多孔板中。阵列可以是可获自所需mRNA来源的核酸群体水性悬液，包含：包含多个单孔的多孔板，各单孔含有不同核酸群体内容的水性悬液。在美国专利号6,329,209、6,329,140、6,324,479、6,322,971、6,316,193、6,309,823、5,412,087、5,445,934和5,744,305中发现了阵列、它们的用途和它们的实施的例子，将其纳入本文作为参考。
微阵列是本领域已知的，它包含在已知位置上特异性杂交或结合了其序列与基因产物(如cDNA、mRNA、cRNA、多肽及其片断)相对应的探针的表面。在一个实施方式中，微阵列是其中各位置代表用于基因编码产物(如蛋白或RNA)的独立结合位点的阵列(即基质)，其中结合位点对应于生物体基因组中大部分或几乎所有基因的产物。在优选实施方式中，“结合位点”(以下称为“位点”)是可与特定关联cDNA特异性杂交的核酸或核酸类似物。结合位点的核酸或类似物可以是，例如：合成寡聚物、全长cDNA、比全长短的cDNA或基因片段。
将核酸或类似物连接到可由玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维素或其他材料制成的固体支持物上。将核酸连接到表面上的优选方法是印刷在玻璃板上，总地由Schena等，1995a所述。也参见DeRisi等，1996；Shalon等，1996；Schena等，1995b。也可采用制作微阵列地其他方法，如通过掩蔽(Maskos等，1992)制作。原则上可采用任何类型的阵列，例如尼龙杂交膜上的斑点印迹(参见Sambrook等，2001，将其全文纳入用于所有目的)。但是正如本领域技术人员所知，优选非常小的阵列，因为杂交体积会更小。
也考虑到采用生物芯片，它涉及标记分子或分子库与固定在生物芯片上的靶的杂交。
V.试剂盒
在本发明的其它实施方式中，提供了从固定的组织样品中分离全长RNA的试剂盒。试剂盒中可包含本文所述的任何组合物。在非限制性例子中，试剂盒中可包括固定的组织样品、从固定的组织样品中消化和抽提RNA，以及分析或定量所获RNA的试剂。因此，该试剂盒在合适的容器中包含本文所公开的任何试剂。它也可包括一种或多种缓冲液，如消化缓冲液或抽提缓冲液，以及用于分离得到的RNA的组分。该试剂盒中也可包含用于固定组织的试剂和用于包埋组织的试剂。
可将试剂盒组分包装在含水介质或冻干形式中。试剂盒的容器通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、罐、注射器或其它容器，将一个组分，优选为合适等分的一个组分置入其中。当试剂盒中组分多于一种时(可将它们包装在一起)，该试剂盒通常也包含第二个、第三个或其它附加容器，其中分别置入附加组分。然而，一个小瓶中可含有各种组分组合。本发明试剂盒一般也包括装RNA的容器，和禁止用于商业出售的任何其它试剂容器。这种容器可包括注射成模或吹模塑料容器，其中保留了所需小瓶。当以一种和/或多种溶液的形式提供试剂盒组分时，溶液是含水溶液，尤其优选无菌含水溶液。
然而，可以干燥粉末的形式提供试剂盒组分。当以干燥粉末的形式提供试剂和/或组分时，可通过加入合适溶剂而重建粉末。预计也可在另一容器中提供溶剂。该容器通常包括至少一个小管、试管、烧瓶、罐、注射器和/或其它容器，其中置入了核酸制剂，优选合适分装的核酸制剂。该试剂盒也可包含第二个容器，含有无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它稀释剂。
这种试剂盒也可包括有助于分离抽提的RNA的组分。它也可包括保藏或维持RNA的组分或保护RNA不降解的组分。这种组分可以是不含RNA酶或抗RNA酶的组分。这种试剂盒通常包含适用于各个试剂或溶液的不同容器。
试剂盒也包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包括的任何其它试剂的说明书。说明书可包括可实施的改变。
VI.实施例
包括以下实施例是为了说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表了本发明者发现在本发明实践中起到良好作用的技术，因此可认为这些技术构成了本发明实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开应理解，对所公开的具体实施方式进行许多改变仍能获得相似或类似的结果，而不背离本发明精神和范围。
实施例1
方法
固定含有RNA的组织
测试了两种固定剂，甲醛和多聚甲醛。多聚甲醛用磷酸缓冲盐水(PBS，50mM磷酸盐缓冲液，pH7.5，150mM NaCl)配成终浓度为4％的溶液使用，甲醛用类似的缓冲液(“10％中性缓冲***”，NBF，Fisher Diagnostics，Middletown，VA的Protocol(TM)***(目录号305-510))配成终浓度为3.7％的溶液使用。对任何一种固定剂而言，所用固定程序必须将刚刚从处死的小鼠剪下的组织样品浸入其中，在0-8℃放置一段特定时间。根据各个例子确定固定时间。将样品保存在固定剂中或在对标准方法中的乙醇和二甲苯进行一些变化之后将样品转移到石蜡块中。在以下溶液中使组织样品脱水：
i)70％乙醇1小时，
ii).80％乙醇1小时，
iii).90％乙醇1小时，
iv).100％乙醇(I)2小时，
v).100％乙醇(II)2小时，
vi).100％乙醇(III)过夜。
该步骤之后是清洁组织和将组织置入以下溶液中的步骤：
i).乙醇/二甲苯(1∶1)1小时
ii).二甲苯2小时，
iii).二甲苯2小时，
iv).二甲苯/石蜡(1∶1；55-60℃)2小时，
v).石蜡；55-60℃2小时，
vi).石蜡；55-60℃2小时，
vii).石蜡；55-60℃1小时。
最后一个步骤包括在石蜡模子中用石蜡包埋该样品块。这使样品至少在半年中是稳定的。
RNA抽提
对于从石蜡中抽提而言，将组织浸入两种不同的二甲苯中，50℃5分钟，然后将样品置入消化缓冲液中。对于仍贮存在固定剂中的组织而言，将样品浸入一系列乙醇溶液中，如下所述：将样品置入2-5毫升(较大组织需要5毫升)冰上预冷的30％乙醇中，在冰上孵育10分钟，然后转移到相同体积冰上预冷的40％乙醇中，再在冰上孵育10分钟。重复该过程，每次增加10％乙醇，直到达到100％。将组织浸入100％乙醇中，4℃至少过夜。在最后的步骤中，从溶液(乙醇、***或二甲苯)中取出组织，在纸巾上干燥。然后将组织样品转移到含有200mM TrisCl，pH7.5，200mMNaCl，10mM柠檬酸钠，2％SDS和0.5mg/mlPK的消化缓冲液中。
组织与消化缓冲液的比例(克/毫升)在1∶10-20的范围中。匀浆样品，直到样品完全分散，通常需要10-30秒。最方便的是用转子-定子匀浆器高速匀浆进行该操作。然后在50-52℃孵育样品4小时，有效范围是1-6小时，使蛋白酶K能够消化掉大多数蛋白。这次孵育后，通过加入一半体积的100％乙醇使裂解物中乙醇的浓度为33％。或者，孵育后，将胍盐和钠盐如醋酸钠(pH4)加入裂解物，产生约2M的胍盐浓度(将400微升4M GuSCN加入400微升裂解物)和约0.1-0.2M的醋酸钠浓度(将80微升pH4的2M醋酸钠加入400微升裂解物)；然后，加入乙醇(1.1毫升乙醇)，使溶液的乙醇浓度为55％，然后将裂解物混合物施加到玻璃纤维滤器上。
混合样品，然后将其施加于RNA水溶性玻璃纤维滤器中，在室温(RT)下以最大转速(13,200rpm)离心1分钟。弃去流出物。将700微升洗涤液1(1.6M硫氰酸胍，0.2％N-月桂酰肌氨酸，10mM柠檬酸钠，40mM 2-巯基乙醇，0.3M醋酸钠pH7.2)施加于滤器，然后在室温(RT)下以最大转速(13,200rpm)离心1分钟。将500微升洗涤液2/3(80％乙醇，0.1M NaCl，4.5mMM EDTA，10mM Tris pH7.5)施加于滤器，在室温(RT)下以最大转速(13,200rpm)离心1分钟。将500微升洗涤液2/3施加于滤器并在室温(RT)下以最大转速(13,200rpm)离心1分钟。弃去各次洗涤的流出物，以最大速度离心含有样品的滤器1分钟。然后将滤器转移到新的收集管中。将30微升加热到95-100℃的0.1mM EDTA施加于滤器。样品在室温下以最大速度离心30秒。重复该洗脱步骤(施加30微升热的0.1mM EDTA溶液，以最大离心速度离心30秒)，立即分析洗脱物或储存于-20℃直到分析。如以下部分所述进行分析。没有看出延长在-20℃的储存时间有任何不同。
实施例2
电泳分析RNA
通过两种不同的电泳方法检测RNA样品。第一种是琼脂糖凝胶***(NorthernMax Gly，Ambion)，它提供乙非啶染色图，并能够建立Northern印迹以探测特定mRNA(具体是GAPDH和β-肌动蛋白)判断条带的存在。第二种是毛细管电泳***(RNA芯片，Caliper Technologies Corp.，用于2100Bioanalyzer，Agilent)。根据以下讨论的实施例进行此分析。
实施例3
用定量RT-PCR(实时或QRT-PCR)分析RNA
用定量或实时RT-PCR(Higuchi等，1993；Bustin，2000)定量存在的特定mRNA。通过监测在实际扩增反应期间存在的起初以特定mRNA为模板的PCR产物，能够确定这些特定mRNA在不同样品中的相对水平。对本研究而言，靶向四种mRNA：GAPDH、Recc1、FAS和DDPK。对各mRNA使用下述RT-PCR引物和探针。
GAPDH-小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapd)，mRNA。登录号-NM_008084；扩增子-60nt；mRNA大小-1.23kb；mRNA中的靶区域：396-455；探针415-434[5’FAM-TGCCGATGCCCCCATGTTTG-3’TAMRA](SEQ ID NO：1)；引物-正向：5’TCATCATCTCCGCCCCTT(SEQ ID NO：2)和反向：5’TCTCGTGGTTCACACCCATC(SEQ ID NO：3)。Recc1-小鼠复制因子C(Recc1)，mRNA；登录号-NM_011258；扩增子-83nt；mRNA大小-4.68kb；mRNA中的靶区域：2122-2204；探针-2156-2176[5’FAM-CCTTCCGTGAGTGCGAGGCAC-3’TAMRA](SEQ ID NO：4)；引物-正向：5’CAGCATCAAAGGCTTTTATACAAGTG(SEQ ID NO：5)和反向：5’TGCCATCGACCTCATCCA(SEQ ID NO：6)。FAS-小鼠脂肪酸合酶(Fasn)，mRNA；登录号-NM_007988；扩增子-122nt；mRNA大小-8.36kb；mRNA中的靶区域：6857-6978；探针-6915-6937[5’FAM-CCTGAGGGACCCTACCGCATAGC-3’TAMRA](SEQ ID NO：7)；引物-正向：5’CCTGGATAGCATTCCGAACCT(SEQ ID NO：8)和反向：5’AGCACATCTCGAAGGCTACACA(SEQ ID NO：9)。DDPK-小鼠蛋白激酶，活化DNA，催化多肽(Prkdc)，mRNA；登录号-NM_011159；扩增子-127nt；mRNA大小-12.65kb；mRNA中的靶区域：3101-3227；探针-3157-3179[5’FAM-AGCAAGTCACTTTTCAAGCGGCT-3’TAMRA](SEQ ID NO：10；引物-正向：5’TCAAATGGTCCATTAAGCAAACAA(SEQ ID NO：11)和反向：5’GCTGCACCTAGCCTCTTGAAA(SEQ ID NO：12)。
为了比较样品，将10微升RNA样品(由等量组织制备的)与2微升RandomDecamers(来自RetroScript试剂盒，Ambion)混合，并在80℃孵育3分钟。孵育后，加入8微升主要RT混合物(每8微升：2微升10×RT缓冲液，4微升dNTP混合物(各2.5mM)，1微升(10U)RNA酶抑制剂(RIP)，和1微升(100U)莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT；全部来自RetroScript试剂盒，Ambion))，并在50℃孵育1小时使所有RNA转录为cDNA。qPCR之前，通过在92℃孵育10分钟或储存于-20℃使MMLV-RT失活。
对qPCR而言，将2微升这种cDNA混合物，以及用于待定量特定mRNA的引物和探针加入采用SuperTaq RealTimeTM试剂盒(Ambion)中所提供组分的18微升PCR主要混合物中[每18微升，2微升10×RealTime缓冲液，2微升dNTP混合物(各2.5mM)，3微升25mM MgCl2，0.4微升50×ROX，0.2微升SuperTaq(1U)，0.4微升探针(终浓度5μM、100nM)，1微升特定引物组(各10μM，终浓度各500nM)，和9微升水]。然后用ABI 7000实时机器监测PCR期间的过程，下面是热循环条件：95℃10分钟；然后是40轮95℃ 15秒接60℃60秒的循环。
实施例4
固定的小鼠肝脏的消化时程
对固定了27天的小鼠肝样品进行消化。根据标准条件在50℃下进行消化，在不同时间点上取出200微升等分，如前所述抽提RNA。然后通过在Agilent生物分析仪2100RNA芯片上电泳和分光光度法定量来分析从各时间点上采集的等量RNA样品。2100RNA芯片数据允许定量总RNA质量，将它与由各样品的OD260所计算的质量比较。图1显示了由这两种方法估计的质量的缓慢增加。样品质量在2小时前迅速增加，然后在3-5小时时增加速度大大放慢。7小时和过夜(o/n)消化时间似乎能够提供额外量的RNA。然而，当对等量的这些样品(代表增加的质量输入)进行qRT-PCR，测定其GAPDH、FAS、Recc1和DDPK时，循环数阈值并不因此而降低，如图2所示，其中将循环数阈值对各样品的消化时间作图。显然，在消化过程中，3小时后活性模板mRNA的产率仅有少量增加。在此平台相期间，注意到基因之间的ΔCt相对保持不变，说明消化时间对各种基因的群体代表性影响很小。
实施例5
方法比较
Masuda等(1999)报道，能够用他们的方法从固定样品中获得全长RNA(如通过电泳凝胶上rRNA条带的存在所判断的)，该方法包括含有MgCl2的蛋白酶K消化溶液，用有机抽提和乙醇沉淀终止。因此，将在柠檬酸钠的存在下进行蛋白酶水解消化和用如上所述的固相抽提步骤终止的本发明方法与Masuda等(1999)所述用于固定了14周的小鼠肝的准确方法比较。将组织分离，并在消化溶液中匀浆，消化条件按照各方法的说明：Masuda法中是45℃1小时，本发明中是50℃4小时。消化后，用各方法所述的有机或固相抽提来抽提RNA，将Masuda制备中产生的乙醇沉淀物再溶解于相同体积(60微升)中本发明方法中用于洗脱的溶液中。在乙非啶染色的凝胶上和通过Agilent生物分析仪2100RNA芯片电泳方法用等量(来自等量组织)重复检测各样品。图3中显示了生物分析仪电泳图。也显示了来自由RNA水溶性方法获得的非固定组织样品的RNA的性质，以提供参考。从未固定和本发明样品中能够明显看出存在较高分子量范围的物质，可以看出，样品中有类似于在标准性质中看到的rRNA峰的峰。
除此直接定量评价外，Agilent 2100RNA芯片方法也用于定量总RNA质量，将它与由各样品的OD260计算的质量比较。从这些方法中，由Masuda法通过OD测得的产率是0.187±0.027微克RNA/毫克组织，由生物分析仪测得的产率是0.083±0.025，而由本发明方法用相同方法测得的产率是0.183±0.064和0.191±0.047。从Masuda法获得的生物分析仪数据较小说明有大量片段化，含有的单-和二核苷酸在生物分析仪分析中不可见。用qRT-PCR分析FAS水平进一步支持了这一推测。通过此方法，Masuda样品的循环数阈值是35.1±2.4，但本发明样品仅有26.8±2.1，说明本发明样品中可扩增FAS mRNA的量约高出2^(35.1-26.8)＝315倍。
而且，Masuda法对每毫克组织提供0.101微克RNA，峰值大小为131nt，仅有1％的曲线下面积的大小范围大于350nt。这是为了与从未固定(“冷冻”)组织制备的制备物作对比，虽然其产率相似(0.153微克/毫克组织)，但是它约在1830和3130nt处显示出两个峰，代表18S和28S rRNA(28S的实际大小应该约为5000nt)，并且区域中86％的曲线下面积大于350nt。用我们的技术处理的样品也给出相似产率(0.191+/-0.047微克/毫克组织)，但79.1+/-1.3％的面积大于350nt，峰显示在约2060和约3390处，修饰rRNA的合理大小(小峰甚至更大)。
实施例6
在不同温度下柠檬酸盐与MG++的作用
制成具有相同组分(200mM TrisCl，pH 7.5；200mM NaCl；2％SDS；0.5毫克/毫升PK)的两种消化缓冲液，他们还含有1.5mM的MgCl2或10mM的柠檬酸钠。将同一固定的小鼠肝脏的不同块分别置入这些缓冲液中并匀浆，然后各自以三种途径分开，并在42℃、50℃和65℃这三种不同温度下孵育4小时。消化步骤后，用上述固相方法抽提RNA。
在琼脂糖凝胶和生物分析仪2100上电泳检测样品。由生物分析仪和260纳米处吸光度定量的结果说明样品基本相等，OD260测定每克组织中约含有0.8毫克RNA，生物分析仪测定的结果约为它的一半。表象是可变的，在65℃孵育的样品显然被降解。将等量的42℃和50℃样品进行qRT-PCR，测定其GAPDH mRNA，在这两种温度下，柠檬酸钠孵育的样品中存在更多的活性mRNA(较低Ct，图4)。
实施例7
不同pH的消化作用
制成另外两种消化缓冲液，除了TrisCl外所有组分都与标准缓冲液相同(200mM TrisCl，pH 7.5；200mM NaCl；10mM柠檬酸钠，2％SDS；0.5毫克/毫升PK)。这两种缓冲液中用200mM pH9.0的TrisCl或200mM pH6.0的MES(Na+)代替了200mM pH7.5的TrisCl，提供pH6、7.5或9的替代消化缓冲液。将同一固定小鼠肾样品的三块切分，各自在这三种消化缓冲液中匀浆，然后在50℃孵育。孵育4小时和过夜后取出样品，如上所述在玻璃纤维滤器中抽提RNA。通过琼脂糖凝胶、生物分析仪2100RNA芯片和OD260估算质量产率来检测样品。pH6样品迅速降解，但pH7.5和9样品在孵育4小时时相当，但pH9样品在孵育过夜后明显降解得更多。由OD260和Agilent生物分析仪数据得到的质量产率也说明pH7.5最佳(图5)。
实施例8
NaCl对消化的影响
制成另外三种消化缓冲液，除了NaCl外所有组分都与标准缓冲液相同(200mMTrisCl，pH7.5；200mMNaCl；10mM柠檬酸钠，2％SDS；0.5毫克/毫升PK)。这三种缓冲液用100mM、400mM或无盐代替了200mM NaCl。在这些消化缓冲液中分别匀浆四块固定的小鼠肝脏样品(最终组织：缓冲液比相同)，50℃孵育这些样品。在特定时间，从各消化物中取出等分，如上所述在玻璃纤维滤器中抽提RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测样品，样品之间RNA的质量似乎变化不大，但是没有见到零盐样品的产物。用OD260估算法定量所有样品，推倒出每克组织的RNA质量产率。此结果见图6，说明有一些NaCl是良好地抽提RNA所必需的，但任一含盐缓冲液的产率之间差异很小。为了看到对所获RNA质量的可能影响，选择了两个最佳浓度，0.2M和0.4MNaCl，在2、3和4小时时间点上观察由如上所述qRT-PCR测定的Recc1和FAS RNA水平。此数据见图7，显示出在这两种浓度之间影响很小，但是0.2M可能稍优。
实施例9
柠檬酸盐的替代物
柠檬酸钠是三羧酸柠檬酸的钠盐。也测试了含有多个酸基团的其它常用试剂，以检测他们是否也具有这种增强效果。选择了九种化合物：反式乌头酸；1，2，4-丁烷三羧酸；1，4-环己烷二羧酸；1，2，3，4，5，6-环己烷六羧酸；1，3，5-环己烷三羧酸；异柠檬酸；丙三羧酸；琥珀酸和戊二酸。制成一种不含柠檬酸钠的消化溶液(200mM TrisCl，pH7.5；200mM NaCl；2％SDS；0.5毫克/毫升PK)，将一块固定的小鼠肝脏在此溶液中匀浆。然后将匀浆分解成10等分，向各分的1/10体积中加入1M待测试多酸母液。将所有样品在50℃孵育4小时，然后用正常方法制备RNA。检测这些样品各自的产率和在生物分析仪2100上的表现。下表给出了对它们相对于柠檬酸盐样品的表现的评价，以及各自的质量产率。
 化合物   表现   产率(微克RNA/毫克小鼠肝)
 柠檬酸钠   0   0.749
 反式乌头酸   --   0.384
 1，2，4-丁烷三羧酸   ---   0.232
 1，4-环己烷二羧酸   +   1.24
 1，2，3，4，5，6-环己烷六羧酸   ---   0.152
 1，3，5-环己烷三羧酸   -   0.358
 异柠檬酸   +   1.08
 丙三羧酸   ---   0.179
 琥珀酸   0   0.762
 戊二酸   --   0.613
(0＝与柠檬酸钠相当；+＝优于柠檬酸钠；-至---＝逐步差于柠檬酸钠)
化合物1，4-环己烷二羧酸和异柠檬酸在本方法中都表现出良好的作用，预计其它多羧化物也是如此。
实施例10
石蜡包埋的组织
将固定了3个月的小鼠肝和肾组织的样品如上所述地放入石蜡块中。用剃刀将这些样品切片，并以三种不同方式在消化溶液中匀浆：直接匀浆石蜡镶嵌块；匀浆在50℃的二甲苯中浸没两次、每次5分钟并经过脱蜡的块；以及匀浆在50℃的二甲苯中浸没20分钟然后转移到乙醇中并在纯乙醇中浸没3次每次3分钟并经过脱蜡的块。所有这三种方法都能提供各组织的服从分析的RNA。本方法中已经成功采用了小鼠心、脑、睾丸、肺、骨骼肌和脾，以及如上述实施例所述的肝和肾的固定样品。
实施例11
柠檬酸盐浓度和SDS的作用
收获四(4)个小鼠肝，在NBF中固定24小时，根据标准方法包埋在石蜡中。包埋在石蜡中一周后，刮掉各肝上过多的石蜡，然后在液氮中完全磨碎。对石蜡/组织粉末进行两次二甲苯浸没和两次乙醇浸没，以完全去除石蜡，然后将第二次乙醇浆分到九个试管中，每管约100毫克，让组织沉淀，去除过多乙醇，然后加入消化介质。以含有0.5mg/ml蛋白酶K的各上述缓冲液加上200mM TrisCl pH7.5，50℃消化3小时。
消化后，加入等体积的4M异氰酸胍(GuSCN)和十分之一体积的2M pH4的醋酸钠，然后与1.25体积的乙醇混合。将其施加于玻璃纤维滤器装置(Ambion试剂盒)上，用1.7M GuSCN/70％乙醇洗涤一次，然后用洗液2和3洗涤，如操作程序和上述实施例1中所述地洗脱。在Agilent生物分析仪2100RNA Chip上分析产生的RNA样品，测定28rRNA百分数(图8)。‘Y’柱表示四个肝的平均值，‘S’柱表示标准差。在这些条件下，柠檬酸盐的最佳浓度为约50mM(log＝1.7)，而在这些条件下SDS的最佳浓度为约3.5％。
 因子组#  ％SDS   log[柠檬酸钠]，mM   Y柱   S
  1   1   0   1.0225   0.115578
  2   1   1   1.365   0.165227
  3   1   2   1.6425   0.170563
  4   3   0   1.365   0.257488
  5   3   1   1.855   0.235301
  6   3   2   1.8175   0.163987
  7   5   0   1.5475   0.098107
  8   5   1   1.745   0.081035
  9   5   2   1.8125   0.292504
                         *******************
根据本公开，无需进行额外实验即可制成和实施本文所公开和要求权利的所有组合物和/或方法和/或装置。虽然按照优选实施方式描述本发明组合物和方法，但是本领域技术人员能够明显看出，可对本文所述组合物和/或方法和/或装置以及方法中的步骤或步骤顺序进行改变，而不背离本发明概念、精神和范围。更具体说，显然可用某些化学和生理学相关的试剂替代本文所述的试剂，而实现相同或相似的结果。本领域技术人员明白，所有这种相似替代和修饰注定在如所附权利要求书所限定的本发明精神、范围和概念内。
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序列表
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E.策林格(ZERINGER，EMILY)
<120>从固定的样品中制备RNA的方法和组合物
<130>AMBI：088CN
<140>PCT/US2004/024155
<141>2004-07-26
<150>10/899,386
<151>2004-07-26
<150>60/490,325
<151>2003-07-25
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>1
tgccgatgcc cccatgtttg                        20
<210>2
<211>18
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<220>
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tctcgtggtt cacacccatc              20
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<220>
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<400>4
ccttccgtga gtgcgaggca c            21
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<220>
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<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
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tgccatcgac ctcatcca                          18
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<220>
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<210>8
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<400>8
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<400>9
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<212>DNA
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<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>12
gctgcaccta gcctcttgaa a                      21

Claims (36)

1.一种从固定的组织样品中分离RNA的方法，所述方法包括：
(a)将固定的组织样品与含有聚阴离子、选自NaCl、LiCl和KCl的盐、和蛋白酶的消化缓冲液接触一段时间以产生裂解物，其中所述缓冲液不含胍盐；
(b)将胍盐和钠盐加入裂解物中以得到最高为2M的胍盐浓度；
(c)从包含胍盐和钠盐的裂解物中抽提RNA，
其中，所述固定的组织样品是动物学或临床标本。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子是多羧化物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多羧化物选自柠檬酸钠、1，4-环己烷二羧酸、1，3，5-环己烷三羧酸、异柠檬酸和琥珀酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子是柠檬酸钠。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消化缓冲液含有至多5％的SDS、200mM pH 7.5的TrisCl、200mM NaCl和至多100mM的柠檬酸钠、和500μg/ml的蛋白酶K。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子在消化缓冲液中的浓度在1mM和100mM之间。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚阴离子在消化缓冲液中的浓度为50mM。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐是氯化钠。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化缓冲液中的蛋白酶是蛋白酶K。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化缓冲液的pH在7.0和9.5之间。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定的组织样品和所述消化缓冲液的比例为1克组织/5毫升消化缓冲液到1克组织/25毫升消化缓冲液。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述固定的组织样品和所述消化缓冲液的比例为1克组织/10毫升消化缓冲液到1克组织/20毫升消化缓冲液。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述固定的组织样品与所述消化缓冲液接触1-6小时。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，将所述固定的组织样品与所述消化缓冲液接触4小时。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，接触温度在40℃和55℃之间。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，抽提的RNA包括全长RNA。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述抽提的RNA中至少20％是全长的。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述抽提的RNA中至少50％是全长的。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述抽提的RNA中至少70％是全长的。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤从含有胍盐和钠盐的裂解物中抽提RNA：
(c1)将醇溶液加入含有胍盐和钠盐的裂解物中；
(c2)将含有醇的裂解物施加到无机支持物上；和，
(c3)用洗脱液从无机支持物上洗脱RNA。
21.如权利要求20所述的方法，其还包括在施加裂解物后洗涤所述无机支持物。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述无机支持物是玻璃纤维滤器或柱。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述洗脱液含有EDTA。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，EDTA的浓度为0.01mM-1.0mM。
25.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述洗脱液的温度在80℃和100℃之间。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用含有非醇有机溶剂的溶液从裂解物中抽提RNA。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述非醇有机溶剂是酚。
28.如权利要求1所述的方法，其还包括对从裂解物中抽提出的RNA定量。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，用扩增反应定量RNA。
30.如权利要求1所述的方法，其还包括从抽提的RNA产生cDNA分子。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定的组织样品是包埋在石蜡中的。
32.如权利要求31所述的方法，其还包括从样品中清除石蜡。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，从样品中清除石蜡包括使包埋的样品接触有机溶剂。
34.一种从固定的组织样品中确定全长RNA的量的方法，所述方法包括：
(a1)将固定的组织样品与含有多羧化物、选自NaCl、LiCl和KCl的盐、和蛋白酶的消化缓冲液接触一段时间以产生裂解物，其中所述缓冲液不含胍盐；
(a2)将胍盐和钠盐加入裂解物中以得到最高为2.0M的胍盐浓度；
(b)将醇溶液加入含有胍盐和钠盐的裂解物中；
(c)将含有醇的裂解物施加到无机支持物上；
(d)用洗脱液从无机支持物上洗脱全长RNA；和，
(e)扩增洗脱的RNA。
35.一种从固定的组织样品中分离全长RNA的试剂盒，它包含：
(a1)含有多羧化物、选自NaCl、LiCl和KCl的盐、缓冲液、去污剂、和蛋白酶的消化缓冲液，用来产生裂解物，其中所述缓冲液不含胍盐；和
(a2)胍盐和钠盐，
(b)玻璃纤维滤器或柱，
其中所述多羧化物选自柠檬酸钠、1，4-环己烷二羧酸、1，3，5-环己烷三羧酸、异柠檬酸和琥珀酸。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其特征在于，所述消化缓冲液含有：至多5％的SDS、200mM pH 7.5的TrisCl、200mM NaCl、至多100mM的柠檬酸钠和500μg/ml的蛋白酶K。
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