CN1876840A - 一种多拷贝的单分子核酸阵列芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的高密度高分辨率的单分子核酸微阵列芯片。该芯片一组含有核酸片段的聚合物高分子随机固定在一块固体基片上，形成一种高密度的单分子核酸微阵列，并使每个阵列点上包含有一个聚合物高分子，每聚合物高分子含有多个相同的核酸片段拷贝。该芯片可以组装成多种可用于功能基因组研究的芯片，进行特定物种的全基因组测序、基因转录和表达效率的检测、以及各种基因组DNA修饰谱(如DNA甲基化谱)的检测。该芯片将为人们生命过程的分子机制研究、基因组DNA信息的解码、个体化医学、疾病的预测和预防、药物的开发和个体化等具有重大的应用价值。

Description

一种多拷贝的单分子核酸阵列芯片
技术领域
本发明涉及一种高密度核酸微阵列芯片，该芯片可用于功能基因组研究，如进行特定物种的基因组测序、基因转录和表达谱的检测、以及各种基因组DNA修饰谱(如DNA甲基化谱)的检测，属于生物医学单分子核酸阵列芯片制造的技术领域。
背景技术
人类基因组(测序)计划已经完成，后基因组计划已步入实施。特别是人类基因组计划完成以后，有关核酸序列数据呈指数增长，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，为比较基因组学的研究提供了丰富的信息资源。如何对大量的生物分子信息进行分析和比较，寻找共同的分子机制，发现新的生物学原理，使生物学由实验上升到理论，另一方面，随着人们更深入地从分子层次上认识生命现象，医学临床实践将产生革命性的变化。在分子层次上进行疾病的预测、诊断和治疗，将根本地认识疾病产生的根源，并将有希望根本认识和治疗包括癌症在内的重大疾病。这些生物学、医学的变革，一个根本的前提是要对大量的个体的基因组信息进行检测，以及对大量未知基因序列的快速测定和鉴定。高效快速地进行大量基因组测列的测定，将加速人类对于基因组信息的基因组应用，从而推动生物学、医学的进一步发展。
虽然在大规模DNA测序方面人类已经取得了巨大的进步。然而，大规模个体全基因组DNA的测序，即对大量的人类个体的基因组DNA(包含有30亿碱基)进行再测序，其成本仍太高。这严重地限制了功能基因组的研究进展，影响到人类基因组计划研究成果的应用。我们知道，功能基因组研究的目的是要认识基因组中每个核酸的生物学含义，发现疾病易感基因。功能基因组的研究途径是比较基因组学，即通过比较和分析不同表型个体之间基因组序列差异，解码基因组中每个核酸的生物学意义，发现功能基因，识别与疾病相关的分子遗传信息。进一步地，根据个体基因组信息，实现疾病的预测、预防和个体化治疗。随着功能基因组研究的发展以及人们对提高医疗健康水平的不懈追求，“个体化医疗”已开始进入人们的生活。为了真正实现“个体化医疗”这一目标，首先要对每个人的基因组进行再测序，找出不同个体在DNA序列上的差异与不同疾病、发育等的相关性。而对于目前的基因组测序成本而言，“个体化医疗”仍然是人类的一个遥远的梦想。因此，如何快速、经济地对大量个体全基因组进行测序将是一个巨大的挑战，同时也蕴藏着巨大的商机。人们急需发展出一些快速、廉价的个体化基因信息检测技术来缩短这个距离。
在对传统基因测序方法进行改进的过程中，以基因芯片为代表的生物芯片技术应运而生。核酸微阵列芯片是一种表面上组装有多种核酸分子的固体基片。常见核酸芯片是由较短的单链DNA探针组成的。它通过与细胞或组织中提取的核酸分子杂交，实现基因信息的高通量检测。这种DNA芯片能够对微量生物样本中的核酸信息进行快速、高通量和低成本的检测和分析，特别是其高通量并行化采集生物信息的特点是目前其它分析技术无法相比的。核酸微阵列芯片在细胞和组织基因表达谱的分析、不同个体基因组差异的筛查、基因突变的检测、以及多种病原体的鉴别等方面已得到了实际的应用，在生物学研究、生物医学检测、药物高通量筛选和基因序列分析等方面有着极其重要的意义。然而，目前的核酸微阵列生物芯片技术一般是在固相载体上制备已知序列的寡核苷酸分子探针阵列，然后使待测基因与寡核苷酸分子探针阵列进行杂交，通过计算机对杂交结果进行分析，获得待测基因序列的信息。其中每个阵列点上包含有成千上万个相同的核酸探针，以提高芯片杂交信号的强度。这一方面限制了芯片探针密度的进一步提高；另一方面，极大地增加了芯片的成本和制备过程的复杂度；同时样品探针的纯度和固定效率也会影响芯片检测的准确度和可靠性。这些因素极大的阻碍了微阵列芯片技术的使用效果，特别是对于高通量的DNA芯片的使用。
因此，改进和发展新的核酸微阵列芯片，建立新型基于生物芯片的高通量测序方法对大量的遗传信息进行高效、快速低成本的检测、分析是十分重要的。
发明内容
技术问题：本发明针对目前核酸生物芯片的存在问题，提出了一种多拷贝的单分子核酸微阵列芯片，该芯片具有密度高、制备成本低、方法简单，可用于杂交检测和直接测序检测，具有十分重要的应用前景和使用价值。
技术方案：本发明是涉及一种新型的单分子微阵列芯片。也就是说，在芯片的每个阵列点上只包含有一个聚合物高分子。该聚合物高分子含有多个拷贝的核酸片段，并且该多拷贝核酸片段的序列是相同的。这种新型的单分子微阵列芯片上在不同的位置上的聚合物高分子是随机固定的，在不同位置上的单分子聚合物上的核酸序列是不相同的。该芯片将一组含有核酸片段的聚合物高分子随机固定在固体基片上，形成一种高密度的单分子核酸微阵列，使每个阵列点上包含有一个聚合物高分子，并使聚合物高分子上含有多个相同的核酸片段拷贝。该芯片将为人们生命过程的分子机制研究、基因组DNA信息的解码、个体化医学、疾病的预测和预防、药物的开发等方面具有重大的应用前景。
该微阵列芯片的组成为：在一个固体基片上固定有一组聚合物高分子阵列，该聚合物高分子阵列中每个点上固定一个含有核酸分子单元的聚合物高分子，不同点上的核酸序列不完全相同；上述每个点上固定的聚合物高分子所含有的核酸分子单元是多个拷贝的；上述核酸分子单元是由特定的核酸片段和通用的核酸片段组成的。
聚合物高分子的结构是由核酸分子单元组成的周期性序列的单链核酸。
由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，其聚合物高分子的结构是一段重复核酸片段单元组成的周期性序列的单链核酸，如DNA和RNA和其他人工核酸，如PNA、LNA等。
聚合物高分子的结构是若干相同的核酸分子单元和高分子主链组成的混合聚合物分子，其中，核酸分子单元以分叉的形式连结在高分子主链上。
微阵列芯片上每个聚合物高分子上的特定核酸片段为生物体系中一段基因组DNA序列，该序列的长度在5至10000个碱基；由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片构建一种或多种生物的基因组DNA微阵列芯片。
微阵列芯片上每个聚合物高分子上的特定核酸片段为生物体系中一段基因组DNA序列，该序列的长度在5至10000个碱基，由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，构建一种或多种生物的转录基因DNA微阵列芯片。
由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，其聚合物高分子的结构是若干相同的核酸片段和另一高分子主链(如肽链、聚乙烯醇等)组成的混合聚合物分子，其中，核酸片段以分叉的形式连结在高分子主链上，为单链核酸，如DNA和RNA和其他人工核酸，如PNA、LNA等。
由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，其聚合物高分子的结构是若干核酸片段和另一网状高分子(如琼脂糖、聚丙烯酰胺等)组成的混合聚合物分子，其中，核酸片段连结在高分子主链上，为单链核酸，如DNA和RNA和其他人工核酸，如PNA、LNA等。
由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，其聚合物高分子的结构是若干核酸片段和另微球(如琼脂糖、聚丙烯酰胺等)组成的。其中，核酸片段连结在微球表面上，为单链核酸，如DNA和RNA和其他人工核酸，如PNA、LNA等。
由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片构建一种或多种生物的基因组DNA微阵列芯片，微阵列芯片上每个聚合物高分子上的特定核酸片段为生物体系中一段基因组DNA序列。该序列的长度在5至10000个碱基。
由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，构建一种或多种生物的转录基因DNA微阵列芯片微阵列芯片上每个聚合物高分子上的特定核酸片段为生物体系中一段基因组DNA序列。该序列的长度在5至10000个碱基。
由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，构建基因组DNA微阵列芯片。
有益效果：
(1)该微阵列芯片上每个阵列点上只有单个的聚合物高分子。因此，每个阵列点的大小理论上可以减小到几十个纳米的范围，这样就大大提高了芯片上核酸片段阵列的密度。而现有的微阵列芯片上每个阵列点一般包含有数千至数百万的核酸分子，每个阵列点的大小目前多在数微米和数百微米之间。例如，生物芯片的世界著名制造商美国埃菲公司用微电子光刻工艺制备的国际最高密度的核酸微阵列芯片，每个阵列点的直径为5微米。用普通点样法制备的微阵列芯片，其每个阵列点的直径一般大于为50微米。用微喷头制备的微阵列芯片，其每个阵列点的直径一般大于为100微米。因此，本发明的核酸微阵列芯片在原理上可具有巨大的核酸微阵列的点阵密度。单位面积的核酸探针密度可以提高百万倍。
(2)该微阵列芯片每个阵列点上虽然只有单个的聚合物高分子，但是，在每个聚合物高分子上包含有大量拷贝的特定核酸片段，单分子上多个拷贝的核酸片段，同样可以获得高的检测灵敏度。实验研究表明：在单个聚合物高分子上可以制备上万个特定核酸片段的拷贝，可以获得与普通微阵列芯片上的阵列点相比拟的核酸杂交信号。再加上目前光学检测技术水平的提高，目前的光学检测技术可以检测到单个的荧光分子，因此，该单分子核酸微阵列芯片能够应用于实际样本的检测。
(3)由于该微阵列芯片的每个阵列点只有一个分子，因此，该微阵列点上的核酸片段不存在纯化或污染的问题。在普通的微阵列芯片中由于在一个阵列点上要固定大量的同一核酸序列的片段作为检测探针，这些核酸片段的纯度，以及在制备过程中的污染将会直接影响的该阵列点的检测质量。在美国埃菲公司用微电子光刻工艺制备的高密度的核酸微阵列芯片，由于核酸原位化学合成的产率较低，在芯片的每个阵列点上将会有大量的合成错误的核酸探针，这将在很大的程度上影响该芯片杂交的检测准确性。
(4)由于普通微阵列生物芯片上阵列点的排布是预先设计好的。因此，核酸序列片段与芯片上的位置是一一对应的。但是，这些芯片的制备工序复杂，耗时、并制备成本高。而在本发明中单分子微阵列芯片上阵列点上的核酸聚合物高分子是在同一时间随机均匀固定上去的，组装在聚合物高分子上的核酸片段为一段已知生物基因组上的DNA序列，通过后续的组合杂交检测方法或合成测序方法进行序列的识别，通过与原始序列比对来建立核酸序列片段与芯片上点阵位置的一一对应关系。因此，本发明提出的单分子微阵列芯片制备时间短，方法简单，成本低。
制备单分子多拷贝的核酸微阵列芯片需用的基片可以是硅，玻璃，陶瓷，金属，聚合物等无机或有机固体材料，以及在这些材料表面上修饰或组装的分子膜，其表面可以是致密的，也可以是多孔的。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明。
图1一种由单链DNA组成的单分子多拷贝微阵列芯片的结构示意图。其中a：基片；b：聚合物高分子阵列；c：核酸分子单元；d：聚合物高分子；e：特定的核酸片段；f：通用的核酸片段。
图2一种由有机聚合物高分子与核酸分子聚合组成的单分子多拷贝微阵列芯片的结构示意图。其中a：基片；b：聚合物高分子阵列；c：核酸分子单元；d：聚合物高分子；e：特定的核酸片段；f：通用的核酸片段；g：高分子主链。
图3是以Nla III内切酶和Dpn II内切酶组合为例，其两条通用接头序列设计图。其中i：Nla III内切酶识别为点；ii：Dpn II内切酶识别为点；iii：通用接头序列；iv：酶切产物；v：磷酸基团；
图4固定化单分子多拷贝DNA芯片的制备过程示意图。其中1：基因组DNA；2：酶切片段；3：通用接头；4：能够与两个通用接头杂交互补的通用引物，其5’端标记一个连接集团(如氨基)；5：环化的内切酶消化片段；6：RCA扩展的多拷贝单链DNA分子；7：固定化的单分子多拷贝单链DNA。I：内切酶消化；II-III：通用接头的连接；IV：标记氨基的通用引物与接头的杂交；V：接头的连接使酶切产物环化；VI：RCA扩展；VII：单分子多拷贝DNA片段的固定。
图5通用引物的并行PCR扩增。图中A：带有通用末端的特异性引物；B：标记有铆钉基团的通用引物；C：可以与高分子聚合物结合的铆钉基团；D：基因组DNA。
图6微乳法制备单分子多拷贝核酸微阵列芯片的制备过程示意图。其中a：基片；b：聚合物高分子阵列；c：核酸分子单元；d：聚合物高分子；e：特定的核酸片段；f：通用的核酸片段；g：高分子主链；h：带有通用末端的特异性引物；i：单分子基因组DNA；j：PCR反应组分(水相)；k：油相(矿物油)；l：微乳液体系。
具体实施方式
实施例1.应用滚环扩增技术制备单分子多拷贝核酸微阵列芯片。
●酶切位点的选择和制备环形的单链基因组DNA片段
基因组DNA的限制性酶切：首先通过生物信息学的方法选择合适的内切酶(如表一)对基因组DNA进行酶切，将基因组切割成50～200bp大小的粘性末端片段。同时根据每个内切酶酶切后的末端序列的特征，设计2条通用接头。图3是以Nla III内切酶和Dpn II内切酶组合为例，其两条通用接头序列设计图。从血液中提取的人类基因组DNA在不同的限制性内切酶下消化后，取1μl的产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测酶切效果。然后用纯化试剂盒将消化产物纯化，溶入TE缓冲液中，-20℃保存备用。
表1内切酶识别位点序列及接头末端序列的设计
P-：标记磷酸集团标记；下划线表示酶切消化的末端序列。
●全基因组的单分子多拷贝DNA片段微阵列芯片的制备
基片的表面氨基硅烷化修饰：(A)选择大小合适的低荧光背景的全反射玻片，在80℃的piranha洗液(浓硫酸与30％的H2O2按体积比7∶3混合)超声洗涤2小时，然后用洗涤剂彻底清洗；用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；(B)硅烷化处理：在上步洗涤干净的载玻片置于含有2％APTES(3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5～10分钟，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，180℃烘烤1～2小时。(C)氨基化处理：将硅烷化处理的玻片置于含5％的戊二醛(50％水溶液，Amresco)磷酸缓冲液(0.1M批H7.4)中浸泡2小时，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各3次，氮气吹干，4℃保存备用。(D)每处理一张玻片后都必须在高灵敏度光学显微镜上进行荧光背景检测，以防处理效果不好所导致的荧光背景对后继单荧光分子检测的干扰。
基因组DNA片段的接头连接：基因组DNA的限制性酶切及接头引物的连接的方法如图4所示：(I)提取的基因组DNA(1)经过上述的不同限制性内切酶分别进行消化成50～200bp长度的DNA片段(2)；(II)在T4DNA连接酶反应体系中分别加入50nM已经复性成双链结构的接头引物(3)和酶切产物(2)，(III)16℃连接反应10分钟后，通过短时电泳的方法去除未连接的接头引物，割胶纯化连接产物；(IV)在连接产物中加入100nM 5’标记氨基基团的通用引物(4)，95℃变性5分钟，冷却至室温，该通用引物可以与两端的接头(3)完全互补，复性后使酶切产物形成一个环状DNA；(V)将上步得到的复性产物在T4DNA连接酶的连接作用下形成环型DNA分子(5)；(VI)将上步的连接产物以通用引物(4)为引物，以环状DNA(5)为模版，在Φ29DNA聚合酶反应体系中进行DNA环化扩增反应(Rolling Cycle Amplification，RCA)，得到单链DNA(6)，该DNA链为环状DNA(5)的重复序列。
单分子多拷贝基因组DNA片段微阵列芯片的制备(图4VII)：(A)用DNA纯化试剂盒纯化RCA反应产物，然后溶入碳酸盐缓冲液(pH 9.0)，用紫外分光光度计确定每个稀释梯度的DNA分子浓度；(B)将溶入RCA产物的碳酸盐缓冲液均匀平铺到处理过的全反射玻片中间1cm×1cm的表面上，自然晾干后37℃水化过夜；最后将玻片用2×SSC/0.1％SDS及去离子蒸馏水分别彻底清洗2遍，便制备成单分子多拷贝基因组DNA片段微阵列芯片(7)。
实施例2，应用微乳液技术制备单分子多拷贝核酸微阵列芯片
微乳状液系指一种或几种液体以微粒(液滴或液晶)形式分散在另一不相混溶的液体中构成具有相当稳定性的多相分散体系，由于它们外观往往呈乳状，所以称之为乳状液。其主要特点就是热力学稳定，各向同性，外观透明或半透明，粒径均匀纳米到微米级。微乳液相关技术在化学中是非常普遍的，我们正是应用其热力学稳定等特点将PCR扩增等生物化学反应至于微乳液的小滴中，从而是反应可以高效快速的进行。
具体的实施方案如下：
●微乳液中的单分子并行PCR
油包水型微乳液的制备首先选择适合的油相(矿物油等)和表面活性剂(Tween，SDS，Triton等)，以并行PCR扩增体系为水相，油相与水相按20∶1到1∶1的比例混合，通过振荡或者超声等方式制备微乳液。制备的微乳液在显微镜下观察其粒径大小和均匀度等。通过控制水相和油相的比例以及制备方式，制备温度，表面活性剂的浓度等条件，从而获得粒径大小均一的微乳液体系，进一步优化制备的微乳液粒径适合以高聚物分子微基础的单分子多拷贝扩增体系。
通用引物并行PCR扩增为了在微乳液体系中进行并行PCR，我们设计合成了一对通用引物序列(图5)，可以与每一对特异性的引物序列的末端相结合，体系中的特异性引物的结合序列的退火温度基本一致，上下不超过10℃。该通用引物的一端是通过某种化学基团(NH2，丙稀酰胺，等)固定于高分子聚合物的末端基团上的。高分子化合物是用来制备芯片时固定于基地表面的连接分子。将高分子化合物连接上标记有铆定基团的通用引物，在微乳液体系中加入特异性引物进行并行扩增，微乳液扩增体系的热循环参数与普通PCR相似，但其变性退火等时间均可以缩短到5-10秒，这样就微乳液体系中进行扩增可以实现高效灵敏的单分子多拷贝核酸的制备。
●单分子多拷贝核酸微阵列芯片的制备
基片的表面氨基硅烷化修饰：(A)选择大小合适的低荧光背景的全反射玻片，在80℃的piranha洗液(浓硫酸与30％的H2O2按体积比7∶3混合)超声洗涤2小时，然后用洗涤剂彻底清洗；用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；(B)硅烷化处理：在上步洗涤干净的载玻片置于含有2％APTES(3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5～10分钟，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，180℃烘烤1～2小时。(C)氨基化处理：将硅烷化处理的玻片置于含5％的戊二醛(50％水溶液，Amresco)磷酸缓冲液(0.1M批H7.4)中浸泡2小时，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各3次，氮气吹干，4℃保存备用。(D)每处理一张玻片后都必须在高灵敏度光学显微镜上进行荧光背景检测，以防处理效果不好所导致的荧光背景对后继单荧光分子检测的干扰。
点样制备单分子多拷贝核酸微阵列芯片  首先将上述利用微乳方法制备的单分子多拷贝核酸产物从微乳液体系中分离出来，在一定的例子浓度和表面活性剂存在的情况下，10000～15000g离心5分钟，分离水相和油相，水相经过纯化后用碳酸盐缓冲液稀释，然后均匀的分配到修饰好的基地表面(图6)。从而制备成了单分子多拷贝核酸微阵列芯片。

Claims (5)

1.一种多拷贝的单分子核酸微阵列芯片，其特征在于该微阵列芯片的组成为：在一个固体基片(a)上固定有一组聚合物高分子阵列(b)，该聚合物高分子阵列(b)中每个点上固定一个含有核酸分子单元(c)的聚合物高分子(d)，不同点上的核酸序列不完全相同；上述每个点上固定的聚合物高分子(d)所含有的核酸分子单元(c)是多个拷贝的；上述核酸分子单元(c)是由特定的核酸片段(e)和通用的核酸片段(f)组成的。
2.根据权利要求1所述的多拷贝的单分子核酸微阵列芯片，其特征在于：聚合物高分子(d)的结构是由核酸分子单元(c)组成的周期性序列的单链核酸。
3.根据权利要求1所述的多拷贝的单分子核酸微阵列芯片，其特征在于：聚合物高分子(d)的结构是若干相同的核酸分子单元(c)和高分子主链(g)组成的混合聚合物分子，其中，核酸分子单元(c)以分叉的形式连结在高分子主链上。
4.根据权利要求1或2或3所述的多拷贝的单分子核酸微阵列芯片，其特征在于：微阵列芯片上每个聚合物高分子(d)上的特定核酸片段(e)为生物体系中一段基因组DNA序列，该序列的长度在5至10000个碱基；由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片构建一种或多种生物的基因组DNA微阵列芯片。
5.根据权利要求1所述的多拷贝的单分子核酸微阵列芯片，其特征在于：微阵列芯片上每个聚合物高分子(d)上的特定核酸片段(e)为生物体系中一段基因组DNA序列，该序列的长度在5至10000个碱基，由单分子多拷贝的核酸片段组成的微阵列芯片，构建一种或多种生物的转录基因DNA微阵列芯片。
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