CN1869216A - 一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法。包括目的基因hBMP-2的合成;用Nde I和BamH I双酶切hBMP-2基因与载体,连接构建重组载体,转化宿主菌,构建hBMP-2基因工程菌;培养hBMP-2基因工程菌,分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液;纯化包涵体;复性;超滤、透析、冻干得到重组人骨形成蛋白-2。本发明工艺简便,成本低,产量高,活性好,复性率可达到60%左右,在产业化生产上具有优势,适于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体地说涉及一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法。
背景技术
人骨形成蛋白-2(human bone morphorgenetic protein-2,hBMP-2)是骨形成蛋白家族一员,属于TGF-β超家族,有活性成熟的hBMP-2是由两个114个氨基酸残基构成的同源二聚体。hBMP-2在人体的生理功能广泛,在调节细胞的生长、分化、趋化作用及凋亡等方面均发挥着重要的作用,结合人体相容性组织工程材料可促进大面积骨损伤愈合,并可大量应用于牙齿修复、美容整形,因而在临床上具有广泛的应用前景。
国外以动物细胞表达***为主生产rhBMP-2,成本高,产量低,活性好,可正常糖基化。美国FDA已批准上市,用于脊椎融合。国内华东基因研究所用大肠杆菌表达rhBMP-2,其是在包涵体阶段先复性后纯化,这样复性效率较低,活性不好。
发明内容
本发明的目的是克服现有人骨形成蛋白-2生产方法存在的问题,提供一种成本低、复性效率高、活性好的人骨形成蛋白-2的表达方法。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法,包括如下步骤:
(1)目的基因hBMP-2的合成;
(2)双酶切hBMP-2基因与载体,连接构建重组载体,转化宿主菌,构建hBMP-2基因工程菌;
(3)培养hBMP-2基因工程菌,分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液;
(4)纯化包涵体;
(5)复性;
(6)超滤、透析、冻干得到重组人骨形成蛋白-2。
上述步骤(1)所述目的基因的合成为:设计上游引物ATCGCATATGGGCCTAACCTTCTTTTGAAGCTTATTCAA,下游引物ACGTGGATCCCTATTAGCAACACCCACAACCCT;以人胚胎cDNA文库为模板,RT-PCR扩增hBMP-2基因,RT-PCR的条件是94℃,5min,94℃,30s,60℃,30s,72℃,30s,35个循环,72℃,10min。
上述步骤(2)所述载体为pET35b(+)或PBV220。载体为pET35b(+)时,双酶切所用限制性内切酶为Nde I,BamH I;载体为PBV220时,双酶切所用限制性内切酶为BamH I,EcoR I。
上述步骤(2)所述宿主菌为大肠杆菌。
上述步骤(3)所述培养hBMP-2基因工程菌的培养基为LB培养基,载体为pET35b(+)时培养温度为30~32℃;载体为PBV220时培养温度为30℃,诱导温度为42℃。
上述步骤(3)所述分离、清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎,离心收集沉淀,用溶液1清洗,用溶液2溶解;所述溶液1为2%Triton X-100,50mmol Tris-HCl、pH7.4,1mmol EDTA;所述溶液2为8M尿素,50mmol Tris、pH7.0,1mmol EDTA,0.1Mβ-巯基乙醇。
上述步骤(4)所述纯化包涵体是采用阴离子交换层析纯化,所需填料为DEAE、PEI或QAE;吸附条件为pH在7~9之间;洗脱条件为加盐或改变pH,盐浓度为0.1~0.4mol/LNaCl,pH为7~9之间。
上述步骤(5)所述复性是采用稀释法复性,复性液为:pH10.5,50mmol/L碳酸钠,1mol/L氯化钠,20%甘油,0.5μmol/LCuCl2和1mmol/L二硫苏糖醇。
上述步骤(6)所述超滤是采用分子量10000道尔顿的超滤膜超滤,所述透析是采用半透膜对质量百分数0.1%醋酸透析。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
大肠杆菌表达的rhBMP-2以包涵体形式存在,成熟的有活性的hBMP-2结构比较复杂,对其进行体外变复性比较困难,本发明在通过大肠杆菌高效表达rhBMP-2的基础上,对影响其复性效率的各种因素进行了定性定量研究,确定了重组人骨形成蛋白-2体外变复性的较为合适的方法,使其复性效率达到50%~60%左右,复性后rhBMP-2的ED50最高为0.71μg/ml,适合进行产业化。本发明工艺简便,成本低,产量高,活性好,复性率可达到60%左右,在产业化生产上具有优势,适于大规模生产。
附图说明
图1为pET/hBMP-2表达质粒的构建图;
图2为rhBMP-2的表达及纯化图;
图3为复性后rhBMP-2二聚体非还原及还原的SDS-PAGE图;
图4为复性后rhBMP-2在C2C12细胞中碱性磷酸酶活性的测定图。
其中,图1中,1为pET35b(+),2为NdeI+BamHI,3为PCR产物,M为λ-Hind III;图2中,1为未诱导的菌体总蛋白,2为诱导后菌体总蛋白,3为复性前经纯化的rhBMP-2,M为蛋白marker;图3中,1为非还原电泳,2为还原电泳,3为纯化后的rhBMP-2二聚体,4为对照品,M为蛋白marker。
具体实施方式
实施例1
(1)设计上游引物ATCG
CATATGGGCCTAACCTTCTTTTGAAGCTTATTCAA,下游引物ACGT
GGATCCCTATTAGCAACACCCACAACCCT;以人胚胎cDNA文库为模板,PCR扩增BMP-2基因,PCR条件是:94℃,5min,94℃,30s,60℃,30s,72℃,30s,35个循环,72℃,10min。1.5%的琼脂糖凝胶电泳,在342bp处可见一明显条带,与预计产物大小相吻合。(图1)
(2)切胶回收经PCR扩增后的hBMP-2基因,用NdeI+BamHI双酶切后的hBMP-2和pET35b(+)后,按照常规方法连接,并转化到DH5α感受态细胞。在平板上随机挑选几个克隆,抽提质粒,用NdeI+BamHI酶切鉴定重组子,同时重组子通过公司测序确定序列的准确度,测序结果与设计一致。
(3)挑选表达量最高的重组子,按1%接种量将其接入装有5mlLB培养基的培养瓶中,过夜,次日按1%转接至500ml LB培养基中,培养至OD600=0.2,加IPTG至终浓度1mM,继续培养4小时。8000转/分30min离心收集菌体,PBS重悬,超声破碎菌体,8000转/分30min离心收集包涵体。
(4)将包涵体用溶液1清洗,8000转/分30min离心,收集沉淀,并用溶液2溶解。所述溶液1为2%Triton X-100,50mmol/Ltris-HCl,1mmol/LEDTA,pH7.0;所述溶液2为8mol/L尿素,50mmol/Ltris-HCl,1mmol/LEDTA,0.1mol/L β-巯基乙醇。
(5)用DEAE-Sephorase(Pharmacia公司产品)填料装柱(30cm×3cm),用20mmol/LPBS+8M尿素(pH 8.0)平衡,将待纯化样品上样,上样量为30mL,上样完成后用平衡液冲洗至基线,再用0.25mol/LNaCl+8M尿素+20mmol/LPBS(pH 7.0)洗脱柱子,收集洗脱峰。(图2)
(6)将上述洗脱峰收集液通过稀释法复性,复性液为:pH10.5,50mnol/L碳酸钠,1mol/L氯化钠,20%甘油,0.5μmol/LCuCl2及1mmol/L二硫苏糖醇。复性时蛋白终浓度为0.2mg/ml,复性时间为48小时。
(7)复性后的蛋白通过分子量为10000道而顿的超滤膜超滤,然后对质量百分数0.1%醋酸透析后,冻干。(图3)
(8)细胞法测定对C2C12细胞诱导表达ALP的生物活性,方法参照有关文献。经复性的rhBMP-2活性高于对照。复性后的rhBMP-2活性分别是0.71μg/ml,对照品(R&D systems)为1.2μg/ml。(图4)
试验表明,本发明通过独特的工艺,简便的方法,使BMP-2的大规模生产成为现实。大肠杆菌表达BMP-2,成本低,产量高,由于我们的工艺复性率可达到60%左右,因此,在产业化生产上具有优势。
Claims (9)
1、一种重组人骨形成蛋白-2的表达方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)目的基因hBMP-2的合成;
(2)双酶切hBMP-2基因与载体,连接构建重组载体,转化宿主菌,构建hBMP-2基因工程菌;
(3)培养hBMP-2基因工程菌,分离、清洗、溶解包涵体得到包涵体溶解液;
(4)纯化包涵体;
(5)复性;
(6)超滤、透析、冻干得到重组人骨形成蛋白-2。
2、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述目的基因的合成为:设计上游引物ATCGCATATGGGCCTAACCTTCTTTTGAAGCTTATTCAA,下游引物ACGTGGATCCCTATTAGCAACACCCACAACCCT;以人胚胎cDNA文库为模板,RT-PCR扩增hBMP-2基因,RT-PCR的条件是94℃,5min,94℃,30s,60℃,30s,72℃,30s,35个循环,72℃,10min。
3、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(2)所述载体为pET35b(+)或PBV220;载体为pET35b(+)时,双酶切所用限制性内切酶为Nde I,BamH I;载体为PBV220时,双酶切所用限制性内切酶为BamH I,EcoR I。
4、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(2)所述宿主菌为大肠杆菌。
5、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(3)所述培养hBMP-2基因工程菌的培养基为LB培养基;载体为pET35b(+)时培养温度为30~32℃;载体为PBV220时培养温度为30℃,诱导温度为42℃。
6、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(3)所述分离、清洗、溶解包涵体是将工程菌超声破碎,离心收集沉淀,用溶液1清洗,用溶液2溶解;所述溶液1为2%Triton X-100,50mmol Tris-HCl、pH7.4,1mmol EDTA,所述溶液2为8M尿素,50mmol Tris、pH7.0,1mmol EDTA,0.1M β-巯基乙醇。
7、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(4)所述纯化包涵体是采用阴离子交换层析纯化,所需填料为DEAE、PEI或QAE;吸附条件为pH在7~9之间;洗脱条件为加盐或改变pH,盐浓度为0.1~0.4mol/LNaCl,pH为7~9之间。
8、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(5)所述复性是采用稀释法复性,复性液为:pH10-11,50mnol/L碳酸钠,1mol/L氯化钠,5-20%甘油,0.1-1μmol/LCuCl2及1-10mmol/L二硫苏糖醇。
9、如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(6)所述超滤为采用分子量10000道尔顿的超滤膜超滤,所述透析是采用半透膜对0.1%醋酸透析。
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